專(zhuān)利名稱(chēng)：高催化活力脂肪酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及酶活力提高的華根霉脂肪酶突變體。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC 3. I. I. 3)不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、 酸解等反應(yīng)，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業(yè)中。微生物是脂肪酶的一個(gè)重要來(lái)源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產(chǎn)菌。如今，已有超過(guò)30種根霉脂肪酶實(shí)現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。根霉脂肪酶大都具有高度1，3-位置選擇性，因此常用于油脂加工中。此外，根霉脂肪酶還具有穩(wěn)定性佳，轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于芳香酯、生物柴油、手性化合物的生產(chǎn)中。目前為止，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了多個(gè)根霉脂肪酶的基因序列。日本、德國(guó)對(duì)米根霉脂肪酶(TPAizozw1S oryzae lipase, / )的基因序列和表達(dá)做了比較深入的研究，并先后用大腸桿菌、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母成功表達(dá)了脂肪酶基因(Minning S et al. J Biotechnol, 1998, 66 : 147-156; Beer HD et al. Biochim Biophys Acta, 1998, 1399 :173-180; Ueda M et al. J Mol Catal B: Enzym, 2002，17 : 113-124)。發(fā)明人在前期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶的華根霉(熱辦印狀 chinensis CCTCC M 201021)菌株，并從該菌株中克隆得到脂肪酶基因序列(Genbank登錄號(hào)EF405962)，并實(shí)現(xiàn)該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母G0ZcAia中的高水平分泌表達(dá) (Yu Xiao-ffei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311)。定向進(jìn)化屬于非理性設(shè)計(jì)，是指通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室中模擬達(dá)爾文自然進(jìn)化過(guò)程，針對(duì)某一蛋白質(zhì)酶的基因，通過(guò)改進(jìn)的誘變技術(shù)改造的酶的基因，然后根據(jù)特定的改造目的，篩選有價(jià)值的天然酶。近10年來(lái)，定向進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)在酯酶和脂肪酶性質(zhì)改造領(lǐng)域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反應(yīng)活性，改進(jìn)底物特異性，提高熱穩(wěn)定性，對(duì)映立體選擇性等方面(Johannes Tff et al. Curr. Opin. Microbiol, 2006, 9: 261-267)。酶活力的提高可以用酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)尤&值來(lái)表示。尤at又稱(chēng)轉(zhuǎn)化數(shù)，指每分子酶或每個(gè)酶活性中心在單位時(shí)間內(nèi)能催化的底物分子數(shù)(TN)，也稱(chēng)為催化常數(shù)。因此，尤^值的提聞即代表了酶活的提聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供酶活力提高的華根霉脂肪酶。本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)定向進(jìn)化構(gòu)建的活力提高的脂肪酶突變體，由華根霉 (.Rhizopus chinensis) CCTCC M 201021 脂肪酶基因(Genbank 登錄號(hào) EF405962)，運(yùn)用易錯(cuò)PCR方法，通過(guò)多輪重組和定點(diǎn)突變，經(jīng)定向進(jìn)化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨基酸序列中，包含氨基酸突變 Alal29Ser、Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly> Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)突變的組合；以轉(zhuǎn)換數(shù)尤at表示， 脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高；突變體的測(cè)序結(jié)果及其尤at提高的倍數(shù)為
權(quán)利要求
1.高催化活力脂肪酶突變體，其特征是由華根霉(熱辦印狀chinensis) CCTCC M 201021脂肪酶基因，其Genbank登錄號(hào)EF405962，運(yùn)用易錯(cuò)PCR方法，通過(guò)多輪重組和定點(diǎn)突變，經(jīng)定向進(jìn)化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨基酸序列中，包含氨基酸突變 Lys322Arg ;以轉(zhuǎn)換數(shù)尤at表示，脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高；突變體的測(cè)序結(jié)果及其尤at提高的倍數(shù)為突變ft 3-6 夾寶體2-5 爽變體3-2 纖體 -5 突變沐 -6 突變體J-I麵酵代.位置Lys 2 2 Arg Lys 161 Al g I y $322Ar I Alai9Sei- AkUk. Lvdg Lvs 16IArg YzllS I Gly Lys ^ Arg Alt-Z 3OThr Lys522Arg Ser5"3Asn Aial29Set lv$|SIAi-f Ab30Tlii Lvs 2Kot( min 5 njS 1566 rcrKcat ft fli 約 IRIS LO I Au
全文摘要
高催化活力脂肪酶突變體，是由華根霉(Rhizopuschinensis)CCTCCM201021脂肪酶基因，其Genbank登錄號(hào)EF405962，運(yùn)用易錯(cuò)PCR方法，通過(guò)多輪重組和定點(diǎn)突變，經(jīng)定向進(jìn)化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨基酸序列中，包含氨基酸突變Lys322Arg；以轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat表示，脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高。
文檔編號(hào)C12N9/20GK102604910SQ20121008390
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者喻曉蔚, 徐巖, 王睿 申請(qǐng)人:江南大學(xué)