專利名稱：高催化活力脂肪酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及酶活力提高的華根霉脂肪酶突變體。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC 3. I. I. 3)不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、 酸解等反應(yīng)，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業(yè)中。微生物是脂肪酶的一個重要來源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產(chǎn)菌。如今，已有超過30種根霉脂肪酶實現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。根霉脂肪酶大都具有高度1，3-位置選擇性，因此常用于油脂加工中。此外，根霉脂肪酶還具有穩(wěn)定性佳，轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于芳香酯、生物柴油、手性化合物的生產(chǎn)中。目前為止，國內(nèi)外已報道了多個根霉脂肪酶的基因序列。日本、德國對米根霉脂肪酶(TSizo/WAs oryzae lipase, / )的基因序列和表達(dá)做了比較深入的研究，并先后用大腸桿菌、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母成功表達(dá)了脂肪酶基因(Minning S et al. J Bio techno I, 1998, 66 : 147-156; Beer HD et al. Biochim Biophys Acta, 1998, 1399 :173-180; Ueda M et al. J Mol Catal B: Enzym，2002，17 : 113-124)。發(fā)明人在前期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶的華根霉(熱辦印狀 chinensis CCTCC M 201021)菌株，并從該菌株中克隆得到脂肪酶基因序列(Genbank登錄號EF405962)，并實現(xiàn)該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母G0ZcAia中的高水平分泌表達(dá) (Yu Xiao-ffei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311)。定向進(jìn)化屬于非理性設(shè)計，是指通過在實驗室中模擬達(dá)爾文自然進(jìn)化過程，針對某一蛋白質(zhì)酶的基因，通過改進(jìn)的誘變技術(shù)改造的酶的基因，然后根據(jù)特定的改造目的，篩選有價值的天然酶。近10年來，定向進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)在酯酶和脂肪酶性質(zhì)改造領(lǐng)域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反應(yīng)活性，改進(jìn)底物特異性，提高熱穩(wěn)定性，對映立體選擇性等方面(Johannes Tff et al. Curr. Opin. Microbiol, 2006, 9: 261-267)。酶活力的提高可以用酶的動力學(xué)參數(shù)尤&值來表示。尤at又稱轉(zhuǎn)化數(shù)，指每分子酶或每個酶活性中心在單位時間內(nèi)能催化的底物分子數(shù)(TN)，也稱為催化常數(shù)。因此，尤^值的提聞即代表了酶活的提聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供酶活力提高的華根霉脂肪酶。本發(fā)明的技術(shù)方案通過定向進(jìn)化構(gòu)建的活力提高的脂肪酶突變體，由華根霉 (Mhizopus chinensis) CCTCC M 201021 脂肪酶基因(Genbank 登錄號 EF405962)，運用易錯PCR方法，通過多輪重組和定點突變，經(jīng)定向進(jìn)化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨基酸序列中，包含氨基酸突變 Alal29Ser、Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly> Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸兩個、三個或四個突變的組合；以轉(zhuǎn)換數(shù)尤at表示， 脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高；突變體的測序結(jié)果及其尤at提高的倍數(shù)為
權(quán)利要求
1.高催化活力脂肪酶突變體，其特征是由華根霉(熱辦印狀chinensis) CCTCC M 201021脂肪酶基因，其Genbank登錄號EF405962，運用易錯PCR方法，通過多輪重組和定點突變，經(jīng)定向進(jìn)化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨基酸序列中，包含氨基酸突變 Ser373Asn ;以轉(zhuǎn)換數(shù)尤at表示，脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高；突變體的測序結(jié)果及其尤at提高的倍數(shù)為*纖_夾變體藥基酸擎代位.靈Kcaif miii; Kcat wsmmk出發(fā)菌銖繼肪酶丨丨丨丨11 SI 0突雛SeiT14511ncr:..突挪-6Lys 161 ArfSer "7 3 Asn04SI S夾變體AUOTlirSer3~5AsiiroTI 5夾雜:-S\al261Givber: ' Asrr26I ■"% :,突雜卜？LysieiArg ιτ195Τ>τ Ser Asn26Γ: 煙體 -4Lys 161 Arg Ala2 OTIir Sei 3 "3AsnnI突變體 -6Ah250TU LysJ ZArg Ser 3Asn2S4:2J
全文摘要
高催化活力脂肪酶突變體，是由華根霉(Rhizopuschinensis)CCTCC M201021脂肪酶基因，其Genbank登錄號EF405962，運用易錯PCR方法，通過多輪重組和定點突變，經(jīng)定向進(jìn)化而獲得的脂肪酶突變體，在突變體的氨基酸序列中，包含氨基酸突變Ser373Asn；以轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat表示，脂肪酶突變體的酶活較出發(fā)菌株得到了提高。
文檔編號C12R1/845GK102604908SQ20121008390
公開日2012年7月25日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者喻曉蔚, 徐巖, 王睿 申請人:江南大學(xué)