專利名稱：一種化學(xué)-生物酶法組合制備2′-脫氧尿苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種化學(xué)-生物酶法組合制備2，-脫氧尿苷的方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
2，-脫氧尿苷屬于核苷類似物，它在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與天然核苷有著不同程度的相似之處，在體內(nèi)有以假亂真之效，從而干擾或直接作用于核酸的代謝過程，阻斷蛋白質(zhì)、核酸的生物合成，在抗腫瘤，抗病毒藥物中具有非常重要的地位。同時是其他核苷類藥物的重要中間體。合成2,-脫氧尿苷的方法主要包括以下三種
I、從天然產(chǎn)物中獲得核苷，再經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到。但這種方法存在著原料不足的缺點，無法滿足市場的需求。2、化學(xué)全合成法，但此方法合成得到的往往是α/β混合構(gòu)型的產(chǎn)物，而具有良好藥效的往往是β構(gòu)型的產(chǎn)物，同時化學(xué)合成過程中的糖苷化過程使用了大量昂貴有毒的化學(xué)試劑，環(huán)境污染嚴重。3、核苷磷酸化酶生物轉(zhuǎn)化法，此方法是采用其他天然的脫氧核苷為底物，在核苷磷酸化酶的作用下加入尿嘧啶與天然核苷的堿基進行交換，得到2'-脫氧尿苷。這種方法雖然條件溫和，反應(yīng)選擇性高，但是同樣存在原料不足的問題，且成本較高。結(jié)晶誘導(dǎo)不對稱轉(zhuǎn)化技術(shù)是ー項控制化學(xué)立體異構(gòu)體的前沿技術(shù)。最早報道的例子是含有不對稱構(gòu)型的立體異構(gòu)體的平衡體系轉(zhuǎn)化成最穩(wěn)定的非對映體近體形式。許多例子都顯示結(jié)晶誘導(dǎo)不對稱轉(zhuǎn)化技術(shù)能得到最穩(wěn)定的非對映異構(gòu)體晶體，不管平衡體系中的含量如何，以混合物為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化率可接近100%。結(jié)晶誘導(dǎo)不對稱轉(zhuǎn)化技術(shù)是熱力學(xué)相平衡的結(jié)果，它是一個有效控制單一異構(gòu)體的有效技木。它需要的ー個重要條件是非對映體的轉(zhuǎn)化速率比結(jié)晶速率快，另ー個條件是其中一個對映體必須在合適的溫度結(jié)晶。不對稱合成的背景是結(jié)構(gòu)包含對映異構(gòu)體，而結(jié)晶誘導(dǎo)技術(shù)是ー種得到単一異構(gòu)體的直接實用的方法。誘導(dǎo)結(jié)晶立體異構(gòu)轉(zhuǎn)化(CIST)根據(jù)原理可以分為兩類誘導(dǎo)結(jié)晶對映結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)化(CIET)和更平常的誘導(dǎo)結(jié)晶非對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化(CIDT)。CIST的發(fā)現(xiàn)大部分基于意外。直到20世紀后期CIST才開始在不對稱合成中被應(yīng)用為一個設(shè)計因素。對應(yīng)異構(gòu)體和非對應(yīng)異構(gòu)體的混合物表現(xiàn)出來不同的結(jié)晶行為是由于鏡像的立體異構(gòu)體能夠結(jié)晶成聚集物(每個細胞有ー個單的對映異構(gòu)體的純的對應(yīng)異構(gòu)體的機械混合物)，外消旋化合物(每種對映異構(gòu)體在単元中以I : I存在)，和立體(固體)溶液(有時候也叫假的外消旋物；兩種對映異構(gòu)體都是以非固定的比例存在于濃縮相中)。這些結(jié)晶行為的根本不同表現(xiàn)在這些固體的物理性質(zhì)的不同(如熔點的不同和溶解度的不同)。同樣地，非對映異構(gòu)體可以以三種類似的形式結(jié)晶。通常，非對映異構(gòu)體產(chǎn)生共晶混合物(這些化合物作為單獨存在的實體結(jié)晶，像聚集物行為)。然而，非對映異構(gòu)體有時候會結(jié)晶成外消旋類似物(兩個結(jié)構(gòu)相似的和形態(tài)上類似對應(yīng)體過量的化合物)或者作為固體溶液(也經(jīng)常叫做混合晶體；一種非對映異構(gòu)體代替另ー種沒有很大地影響晶體結(jié)構(gòu))。CIDT僅在非對映異構(gòu)體作為共晶混合物的時候是可行的。核苷磷酸化酶廣泛分布于動植物器官和微生物中，它參與胞內(nèi)核苷代謝，在補救途徑中催化核苷或脫氧核苷可逆磷酸化反應(yīng)，提供核糖-I-磷酸，并釋放出堿基，加入其他堿基可導(dǎo)致形成另ー種新的核苷。酶法合成核苷類藥物的原理是利用微生物中產(chǎn)生的核苷磷酸化酶催化核苷、堿基轉(zhuǎn)換反應(yīng)，即由廉價供應(yīng)的天然核苷為原料，將其核糖基進行化學(xué)修飾后作為核苷及供體，利用核苷磷酸化酶或脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶為酶源，天然的雜環(huán)堿基為核糖基受體，通過酶催化合成核苷及其類似物。此反應(yīng)過程包括兩個過程(脫氧)核苷1+磷酸=(脫氧)核糖-I-磷酸+堿基2(脫氧)核糖-I-磷酸+堿基I=(脫氧)核苷2+磷酸
其中堿基I可以是嘌呤、嘧啶或其類似物。酶的來源可以是天然菌株，也可以是基因工程菌株。利用此反應(yīng)可以合成多種核苷類似物，在實際工作中也可以僅通過第二部反應(yīng)來合成所需物質(zhì)。酶的高效率、專ー性及溫和的反應(yīng)條件使酶在生物體新陳代謝中發(fā)揮了巨大的作用，酶活力的調(diào)控使生命活動中各種反應(yīng)得以有條不紊的進行。因此酶被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)和化工產(chǎn)品的生產(chǎn)及研究。酶在合成過程中具有高度的化學(xué)、區(qū)域和對映體選擇性，生產(chǎn)過程一般無毒、無污染、低耗能，是ー種環(huán)境友好的合成方法，將為綠色化學(xué)作出貢獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是化學(xué)法合成2'-脫氧尿苷是存在的無法得到単一異構(gòu)體的問題，以及生物酶法合成過程中存在的原料不足以及高成本問題。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ー種化學(xué)-生物酶法組合制備2'-脫氧尿苷的方法，所述方法包括(I)以α/β混合構(gòu)型的3' 5' _0_ ニ對氯苯甲酰基-2_脫氧_D_核糖-1-氯化物為原料，加入磷酸和4A分子篩，以三丁基胺為催化劑，-10 0°C (最佳反應(yīng)溫度為-5 -2°C )于氮氣保護下反應(yīng)16 24小時；本過程中需應(yīng)嚴格控制水的含量，反應(yīng)溶劑需先干燥除水。(2)步驟(I)反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去分子篩，濾液蒸干得到糖漿狀物質(zhì)用四甲基ニ戊酮溶解后，水洗，取有機相在-15°C 10°C下加入環(huán)己胺攪拌反應(yīng)(I 3h)至析出白色沉淀，過濾，濾餅依次用四甲基ニ戊酮和丙酮洗滌，真空干燥(45 60°C，4小時以上)得到3，5-0- ニ(4-苯甲酰氯)-2-脫氧-a -D-核糖_1_磷酸ニ環(huán)己基胺鹽；四甲基ニ戊酮用量以10mL/lg糖漿狀物質(zhì)為宜，水的用量為有機相的I I. 5倍最佳，萃取次數(shù)最好是3次。(3)3,5-0-ニ(4-苯甲酰氯)-2_脫氧-a-D-核糖-1-磷酸ニ環(huán)己基胺鹽在弱堿溶液中于25°C 100°C下攪拌反應(yīng)12h 72h脫除保護基，反應(yīng)液濃縮、こ醇洗滌，真空干燥得到2-脫氧- a -D-核糖-I-磷酸鹽；所述弱堿溶液為下列之一環(huán)己胺甲醇溶液，氫氧化鈉甲醇溶液，氫氧化鉀水溶液或氫氧化鈉水溶液；反應(yīng)溫度越高，其脫保護基的時間越短。⑷2-脫氧-a -D-核糖-ト磷酸鹽與尿嘧啶在尿苷磷酸化酶(UridinePhosphorylase, U Paes, EC 2. 4. 2. 4)催化下,在 pH 值為 6 8 的憐酸鹽緩沖液中、45 65°C下反應(yīng)3 24小時，制得所述2'-脫氧尿苷。核苷憐酸化酶(Nucleoside Phosphorylase, N Pase)廣泛存在于動植物器官和微生物中，在機體的核苷代謝尤其是在補救途徑中起著十分重要的作用，在進行核苷及其類似物的合成時，它能催化核苷或脫氧核苷的可逆磷酸化反應(yīng)，能以核糖-I-磷酸為中間產(chǎn)物進行堿基交換，形成另一種新的核苷。核苷磷酸化酶分為3類嘌呤核苷磷酸化酶(Pyrimidine Nucleoside Phosphorylase,PN Pase,EC 2.4.2. I)、尿苷憐酸化酶(UridinePhosphorylase, U Paes, EC 2.4.2.4)和胸苷憐酸化酶(Thymidine Phosphorylase, TPaes, EC 2. 4. 2. 3)。本發(fā)明中主要利用的是大腸桿菌中含有的尿苷磷酸化酶(UridinePhosphorylase, U Paes, EC 2. 4. 2. 4)。本發(fā)明中生物轉(zhuǎn)化可采用市購商品酶，也可以采用含有該酶的菌株如大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等的濕菌體，生物轉(zhuǎn)化的最佳PH值是7，其轉(zhuǎn)化溫度優(yōu)選55°C 65°C，反應(yīng)時間優(yōu)選為5h 8h，轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液采用高效液相色譜法檢測2'-脫氧尿苷的含量，計算轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明采用“結(jié)晶誘導(dǎo)不對稱轉(zhuǎn)化”技術(shù)合成得到了單一 a構(gòu)型的核苷類藥物中間體2-脫氧-a -D-核糖-I-磷酸，為生物酶法合成提供了一個廉價，供應(yīng)穩(wěn)定的原料。再利用這個中間體為底物，加入尿嘧啶，在大腸桿菌核苷磷酸化酶的作用下生物轉(zhuǎn)化合成得到2'-脫氧尿苷。其合成路線如下
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)-生物酶法組合制備2'-脫氧尿苷的方法，所述方法包括 (1)以α/β混合構(gòu)型的3'5' -O-二對氯苯甲?；?2-脫氧-D-核糖-I-氯化物為原料，加入磷酸和4Α分子篩，以三丁基胺為催化劑，-10 0°C于氮氣保護下反應(yīng)16 24小時； (2)步驟(I)反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去分子篩，濾液蒸干得到糖漿狀物質(zhì)用四甲基二戊酮溶解后，水洗，取有機相在-15°C 10°C下加入環(huán)己胺攪拌反應(yīng)至析出白色沉淀，過濾，濾餅依次用四甲基二戊酮和丙酮洗滌，真空干燥得到3，5-0- 二(4-苯甲酰氯)-2-脫氧-a -D-核糖-I-磷酸二環(huán)己基胺鹽； (3)3，5-0- 二(4-苯甲酰氯)-2-脫氧-a -D-核糖_1_磷酸二環(huán)己基胺鹽在弱堿溶液中于25°C 100°C下攪拌反應(yīng)12h 72h脫除保護基，反應(yīng)液濃縮、乙醇洗滌，真空干燥得到2-脫氧-a -D-核糖-I-磷酸鹽；所述弱堿溶液為下列之一環(huán)己胺甲醇溶液，氫氧化鈉甲醇溶液，氫氧化鉀水溶液或氫氧化鈉水溶液； (4)2-脫氧-a -D-核糖-I-磷酸鹽與尿嘧啶在尿苷磷酸化酶催化下，在pH值為6 8的磷酸鹽緩沖液中、45 65°C下反應(yīng)3 24小時，制得所述2'-脫氧尿苷。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)反應(yīng)溶劑為乙腈，四甲基二戊酮或丙酮。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中三丁基胺為正三丁基胺，3' 5' -O-二對氯苯甲?；?2-脫氧-D-核糖-I-氯化物與正三丁基胺的摩爾用量之比為I 2 6。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種化學(xué)-生物酶法組合制備2′-脫氧尿苷的方法，該方法采用“結(jié)晶誘導(dǎo)不對稱轉(zhuǎn)化”技術(shù)合成得到了單一α構(gòu)型的核苷類藥物中間體2-脫氧-α-D-核糖-1-磷酸，再利用這個中間體為底物，加入尿嘧啶，在尿苷磷酸化酶的作用下生物轉(zhuǎn)化合成得到2′-脫氧尿苷。本發(fā)明化學(xué)-生物組合技術(shù)的應(yīng)用，結(jié)合了化學(xué)法與生物法的優(yōu)點，避免了各自的缺陷，收率高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，其中采用“結(jié)晶誘導(dǎo)不對稱轉(zhuǎn)化技術(shù)”可以得到供應(yīng)充足，構(gòu)型單一的2-脫氧-α-D-核糖-1-磷酸中間體，無需再進行分離純化；生物轉(zhuǎn)化過程采用高效、專一的尿苷磷酸化酶催化一步完成，其專一性強，轉(zhuǎn)化率高，條件溫和，環(huán)境友好。
文檔編號C12P19/38GK102827902SQ20121008349
公開日2012年12月19日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者應(yīng)國清, 錢捷, 彭美紅, 王鴻, 蒲通, 易喻, 梅建鳳, 陳建澍 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)