專利名稱：一種新的分枝桿菌菌種快速鑒定方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用核酸擴(kuò)增及其檢測(cè)體系，在臨床檢查中檢測(cè)和/或鑒定分枝桿菌菌種的方法和試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，尤其是在發(fā)展中國(guó)家。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)世界人口的1/3有結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染,是全世界感染性疾病中的第一大殺手。我國(guó)是全世界22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。目前我國(guó)全年齡組結(jié)核菌感染率為44. 5%，全國(guó)約5. 5億人受到結(jié)核菌感染。同時(shí)，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)病也呈逐年上升趨勢(shì)，2000年，衛(wèi)生部組織的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，NTM菌株分離率上升至11. 1%, NTM病臨床表現(xiàn)與結(jié)核病相似，在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，經(jīng)常被誤診為結(jié)核病。大量研究及臨床治療病例表明非結(jié)核分枝桿菌對(duì)大多數(shù)一線抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性，采用目前標(biāo)準(zhǔn)的化療方案治療無效。目前，非結(jié)核分枝桿菌病通常依據(jù)傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定來確診，然而，傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定繁瑣、費(fèi)時(shí)，需I 2個(gè)月的時(shí)間，不能滿足臨床開展早期有效治療的需要，使非結(jié)核分枝桿菌病人通常被作為結(jié)核病人按常規(guī)治療，病人經(jīng)長(zhǎng)期常規(guī)治療而療效不佳，療程延長(zhǎng)，成為難治、復(fù)治病人，細(xì)菌在局部播散。因此，分枝桿菌菌種的快速鑒定對(duì)結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病的早期診斷、鑒別診斷、有效治療和控制傳播都有重要意義。傳統(tǒng)診斷臨床標(biāo)本的分枝桿菌感染是基于鏡下抗酸染色，進(jìn)而特殊培養(yǎng)及生化實(shí)驗(yàn)鑒定菌種，最后檢測(cè)藥物敏感性?？顾崛旧荒荑b別屬與屬外的特征，且只有在標(biāo)本帶菌量在104/ml以上時(shí)才能看見。由于多數(shù)分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，鑒別到種的水平需要耗時(shí)4 8周，且影響因素多，重復(fù)性差。近年來，一直在開發(fā)于基因水平鑒定分枝桿菌菌種的技術(shù)，主要是利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)等核酸擴(kuò)增技術(shù)的診斷技術(shù)。目前利用PCR鑒定分枝桿菌菌種的方法主要是通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段后，通過膜雜交或基因芯片檢測(cè)，但這些方法普遍存在一些問題，不適合在臨床上開展。(I)PCR菌種鑒定法。用各種分枝桿菌特異性引物對(duì)標(biāo)本DNA進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增或多重PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性片段進(jìn)行鑒定；或先用分枝桿菌屬特異的外部引物擴(kuò)增，然后再用菌種特異的內(nèi)部引物進(jìn)行巢氏擴(kuò)增鑒定。該法靈敏、快速，但目前能夠鑒定的菌種尚不多，主要有結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌，而且鑒定未知的感染菌，需采用一系列種特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。(2)PCR-直接測(cè)序鑒定法。用分枝桿菌屬特異的引物對(duì)標(biāo)本的16SrRNA或16S-23S rRNA間隔區(qū)序列或65kD或32kD抗原基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后直接測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，比較其核苷酸的差異來鑒定菌種。但該方法無法鑒別少數(shù)分枝桿菌，而且技術(shù)要求高，需昂貴的特殊儀器，而難以推廣。(3)PCR-DNA探針鑒定法用分枝桿菌屬特異的引物對(duì)標(biāo)本中分枝桿菌16S或16S-23S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后與各種分枝桿菌特異的寡核苷酸探針進(jìn)行反向、斑點(diǎn)雜交或微孔板反向雜交鑒定菌種。該法較靈敏、快速，但目前只能鑒定部分菌種。(4)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)鑒定法。PCR-RFLP菌種鑒定法是以分枝桿菌屬特異性引物對(duì)標(biāo)本中分枝桿菌65KD蛋白編碼基因、16S或16-23S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后用不同的限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增片段，通過電泳分析酶切圖譜來鑒定菌種。目前只能鑒定部分菌種，重復(fù)性還不夠理想。(5)PCR-基因芯片鑒定法。基因芯片技術(shù)是指將大量核酸分子以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在載體上，檢測(cè)帶標(biāo)記的待測(cè)樣品DNA，是一種大規(guī)模分析遺傳差異的新方法。但這種方法操作復(fù)雜，易造成交叉污染，所需的點(diǎn)樣系統(tǒng)和熒光分析系統(tǒng)昂貴，而難以推廣應(yīng)用。近年來出現(xiàn)的實(shí)時(shí)突光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。本發(fā)明利用熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)結(jié)合雙標(biāo)記探針熔解曲線技術(shù)進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，實(shí)現(xiàn)了快速、簡(jiǎn)單、靈敏、高效、廉價(jià)的分枝桿菌菌種鑒定的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏、高效、廉價(jià)的分枝桿菌菌種鑒定的方法，以及利用所述方法同時(shí)鑒定多種分枝桿菌菌種的試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案本發(fā)明所述方法的基本原理為基于熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)，結(jié)合多重不對(duì)稱PCR技術(shù)和熔解曲線技術(shù)，并運(yùn)用多個(gè)熒光檢測(cè)通道在一個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)多種不同熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物所形成的熔解峰，利用熔解峰所示的Tm值來鑒定分枝桿菌菌種。一方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒別臨床常用分枝桿菌的鑒別試劑I，其中包括兩對(duì)引物和三條探針，所述兩對(duì)引物包括引物TBleftl、TBleft2、TBrightl和TBright2，其核苷酸序列分別如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 所示，所述三條探針TBProbeI、TBProbe2、TBProbe3的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID N0:15所示。在本發(fā)明中，所述的“臨床常見分枝桿菌”是指臨床上常見的分枝桿菌，包括但不限于結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、瘰疬分枝桿菌(M. scrofulaceum)、猿猴分枝桿菌(M. simiae)、胃分枝桿菌(M. gastri)、海分枝桿菌(M. marmum)、潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M. nonchromogenicum)、愛知分枝桿菌(M. aichiense)、鳥分枝桿菌(M. avium)、迪氏分枝桿菌(M. diernhoferi)、次要分枝桿菌(M. triviale)、偶然分枝桿菌(M. fortuitum)、土地分枝桿菌(M. terrae)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)、戈登分枝桿菌(M. gordonae)、蟾蜍分枝桿菌(M. xenopi)、龜分枝桿菌龜亞種(M. chelonae subsp. chelonae)、龜分枝桿菌胺腫亞種(M. chelonae subsp.abscessus)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)、抗熱分枝桿菌(M. thermoresistibile)、田野分枝桿菌(M. agri)、母牛分枝桿菌(M. vaccae)、草分枝桿菌(M. phlei)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述三條探針TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5’端分別用報(bào)告熒光染料FAM、HEX、ROX標(biāo)記，3’端分別用淬滅熒光染料BHQl或BHQ2
T 己 O、
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒別臨床常用分枝桿菌的鑒別試劑II，其中包括四對(duì)引物和三條探針，所述四對(duì)引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其核苷酸序列分別如 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO -J、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12所示，所述三條探針TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18所
/Jn ο在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述三條探針TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端分別用報(bào)告熒光染料FAM、ROX、HEX標(biāo)記，3’端分別用淬滅熒光染料BHQl或BHQ2標(biāo)記用本發(fā)明所述鑒定試劑I進(jìn)行多重不對(duì)稱熒光定量PCR。實(shí)驗(yàn)證明，根據(jù)熒光顏色和熔解曲線中Tm值的不同，本發(fā)明所述的鑒定試劑I能夠鑒別分枝桿菌屬中的結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、愛知分枝桿菌、田野分枝桿菌、草分枝桿菌、母牛分枝桿菌、恥垢/抗熱分枝桿菌。在本發(fā)明中，表述菌種鑒定結(jié)果時(shí)使用的“/”表示“或”的意思，例如“恥垢/抗熱分枝桿菌”意指菌株可鑒定為恥垢分枝桿菌或抗熱分枝桿菌，排除二者之外的其他分枝桿菌，可視需要進(jìn)一步鑒定獲知所述菌株確切是恥垢分枝桿菌還是抗熱分枝桿菌。在使用本發(fā)明所述鑒定試劑I鑒定后，進(jìn)一步用本發(fā)明所述的鑒定試劑II進(jìn)行多重不對(duì)稱熒光定量PCR。根據(jù)熒光顏色和熔解曲線中Tm值的不同，本發(fā)明所述的鑒定試劑II能夠?qū)⒎种U菌屬中海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、堪薩斯/胃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、鳥分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、次要分枝桿菌、偶然分枝桿菌、土地分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種區(qū)分開來。因此，本發(fā)明提供了一種用于鑒定臨床常見分枝桿菌的試劑盒，該試劑盒包括所述鑒別試劑I，即包括兩對(duì)引物和三條探針，所述兩對(duì)引物包括引物TBleftl、TBleft2、TBrightl 和 TBright2，其核苷酸序列分別如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所示，所述三條探針TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQID NO 15 所示。所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括所述鑒定試劑II，即鑒別試劑II，其中包括四對(duì)引物和三條探針，所述四對(duì)引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其核苷酸序列分別如 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12 所示，所述三條探針TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18所示。本發(fā)明所述試劑盒，還可以進(jìn)一步包括核酸序列擴(kuò)增所需的其它各種試劑，包括但不限于DNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等，其中DNA聚合酶優(yōu)選為熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，以便探針在反應(yīng)全過程中能夠保持完整，其可以是但不限于是aTaq 酶。另一方面，本發(fā)明還提供了一種鑒定臨床常見分枝桿菌的方法，該方法包括
(I)樣本處理及DNA提?。?2)配制PCR反應(yīng)體系；(3)在熒光定量PCR儀上PCR擴(kuò)增靶序列；(4)PCR擴(kuò)增結(jié)束后,進(jìn)行熔解曲線(Melting curve)分析。本發(fā)明中，步驟(I)中所述的樣本包括但不限于痰液、病理組織切片或細(xì)菌培養(yǎng)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述樣本為痰液，所述樣本處理及DNA提取包括取痰液2ml，加入2. 5倍體積4% Na0H，37°C溫育30min。將液化后的痰液，離心，去上清，向沉淀中加入裂解液100 μ I,沸水中煮lOmin, 4°C下12000rpm離心IOmin,取上清液進(jìn)行檢測(cè)或_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述樣本為病變組織切片，所述樣本處理及DNA提取包括取病變組織切片2-5片加入I. 5ml離心管中，向管中滴加300 μ I提取液，100°C煮沸IOmind11C下12000rpm離心IOmin,取上清液進(jìn)行檢測(cè)或_2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆?。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述樣本為細(xì)菌培養(yǎng)物，所述樣本處理及DNA提取包括取經(jīng)培養(yǎng)后臨床樣本分離株，高溫滅活，用溶菌酶和蛋白酶K處理后，再用苯酚/氯仿提取DNA。將獲得的基因組DNA直接用于菌種鑒定檢測(cè)或_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。本發(fā)明中，步驟(2)配制的PCR反應(yīng)體系優(yōu)選使用一種熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，以便探針在反應(yīng)全過程中能夠保持完整。另外，所加各引物對(duì)的上游弓I物和下游引物濃度不同。擴(kuò)增探針互補(bǔ)鏈的引物的濃度高于與之配對(duì)的另一條引物濃度。一對(duì)PCR引物濃度的比例為不超過2 1，或者不超過3 1，或者不超過4 1，或者不超過5 1，最佳的PCR引物濃度比例取決于具體的實(shí)驗(yàn)。在本發(fā)明的一個(gè)具體優(yōu)選實(shí)施方案中，所配制的PCR反應(yīng)體系為
成分濃度加入量
PCR緩沖液10倍濃縮2μ1
MgCl225mM1.6μ1
dNTPsIOmM0.4μ1
引物1(限制性引物)IOmMΟ. μ
引物 2IOmM0.6μ1
探針I(yè)OmM0.4μ1
aTaq DNA 聚合酶5υ/μ1Ο. μ
、 模板2μ1
無菌超純水補(bǔ)足至20μ1通常，首先使用本發(fā)明所述的鑒定試劑I代替上述反應(yīng)體系中的引物和探針。另外可能視情況需要在使用鑒定試劑I后，用本發(fā)明所述鑒定試劑II代替上述反應(yīng)體系中的引物和探針配制PCR反應(yīng)體系。本發(fā)明中，步驟(3)中PCR擴(kuò)增所采用的程序?yàn)?5°C預(yù)變性Imin ;40 50個(gè)循環(huán) 95 變性 6sec，58°C退火 30sec，72°C 延伸 10sec，58°C退火 15sec，72°C延伸 5sec ；95°C變性30sec ;40°C保溫20sec ；40 85°C做熔解曲線分析，每步升溫1°C，保溫5 30sec，選擇FAM、HEX、ROX通道檢測(cè)熒光。PCR反應(yīng)開始后，在最初的10 15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。在溶液中，雙標(biāo)記寡核苷酸探針未與靶序列雜交時(shí)通常呈“線團(tuán)”狀的單鏈構(gòu)象，此時(shí)由于報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離很近，猝滅基團(tuán)能夠猝滅報(bào)告基團(tuán)所發(fā)出的熒光。當(dāng)探針與單鏈PCR產(chǎn)物退火形成雙鏈時(shí)，由于報(bào)告基團(tuán)的熒光不能夠被猝滅，從而產(chǎn)生可以檢測(cè)到的熒光信號(hào)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)。在本發(fā)明中，“報(bào)告基團(tuán)”和“報(bào)告熒光染料”具有相同涵義，可交互使用，包括但不限于 FAM、ROX、HEX、JOE 等。 “猝滅基團(tuán)”和“淬滅熒光染料”具有相同涵義，可交互使用，包括但不限于BHQ1、BHQ2、Eclipse、TAMRA 等。本發(fā)明中，步驟⑷中所述熔解曲線(Melting curve)分析是指，由于不同菌種的序列間存在區(qū)別，探針與不同菌種的序列雜交產(chǎn)生不同Tm值的熔解峰，用實(shí)際獲得的Tm值與表I中Tm值比對(duì),從而鑒定分枝桿菌菌種。表I中probe I、probe2和probe3是試劑I檢測(cè)后各分枝桿菌菌種在3個(gè)檢測(cè)通道中的Tm值；probe4、probe5和probe6是試劑II檢測(cè)后各分枝桿菌菌種在3個(gè)檢測(cè)通道中的Tm值。在實(shí)際應(yīng)用中首先使用試劑I檢測(cè)，將獲得的Tm值與表中probel、probe2和probe3對(duì)應(yīng)的Tm值比對(duì),若為唯一分枝桿菌菌種，則完成鑒定，否則需用試劑II進(jìn)一步檢測(cè)，并與probe4、probe5和probe6的Tm值比對(duì),從而完成鑒定。表I
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中包括兩對(duì)引物和三條探針，所述兩對(duì)引物包括引物TBleftu TBleft2、TBrightl和TBright2，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO I、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 所示，所述三條探針 TBProbeI、TBProbe2、TBProbe3的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 所示。
2.權(quán)利要求I所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其進(jìn)一步還包括另外四對(duì)引物和三條探針，所述四對(duì)引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其核苷酸序列分別如 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12 所示，所述三條探針TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光 染料標(biāo)記，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18所示。
3.權(quán)利要求I或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的報(bào)告熒光染料選自 FAM、ROX、HEX 或 JOE。
4.權(quán)利要求I或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的淬滅熒光染料選自 BHQ1、BHQ2、Eclipse 或 TAMRA。
5.權(quán)利要求I或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中探針TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5’端分別用報(bào)告熒光染料FAM、HEX、ROX標(biāo)記，3’端分別用淬滅熒光染料BHQl或BHQ2標(biāo)記。
6.權(quán)利要求1、2或5所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中探針TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端分別用報(bào)告熒光染料FAM、ROX、HEX標(biāo)記，3’端分別用淬滅熒光染料BHQl或BHQ2標(biāo)記。
7.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的分枝桿菌為臨床常見分枝桿菌，包括但不限于結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、瘰疬分枝桿菌(M. scrofulaceum)、猿猴分枝桿菌(M. simiae)、胃分枝桿菌(M. gastri)、海分枝桿菌(M. marinum)、潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M. nonchromogenicum)、愛知分枝桿菌(M. aichiense)、鳥分枝桿菌(M. avium)、迪氏分枝桿菌(M. diernhoferi)、次要分枝桿菌(M. triviale)、偶然分枝桿菌(M. fortuitum)、土地分枝桿菌(M. terrae)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)、戈登分枝桿菌(M. gordonae)、蟾蜍分枝桿菌(M. xenopi)、龜分枝桿菌龜亞種(M. chelonae subsp. chelonae)、龜分枝桿菌胺腫亞種(M. chelonae subsp. abscessus)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)、抗熱分枝桿菌(M. thermoresistibiIe)、田野分枝桿菌(M. agri)、母牛分枝桿菌(M. vaccae)、草分枝桿菌(M. phlei)。
8.權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，進(jìn)一步還包括熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列擴(kuò)增所需的其它各種試劑。
9.一種用于鑒定分枝桿菌菌種的方法，該方法包括(1)樣本處理及DNA提??；(2)配制包括權(quán)利要求I或2所述試劑盒中引物對(duì)和探針的PCR反應(yīng)體系；(3)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)PCR擴(kuò)增結(jié)束后,進(jìn)行熔解曲線(Meltingcurve)分析。
10.權(quán)利要求9所述的鑒定分枝桿菌菌種的方法，其中步驟(2)配制的PCR反應(yīng)體系優(yōu)選使用一種熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，以便探針在反應(yīng)全過程中能夠保持完整。另外，所加各引物對(duì)的上游引物和下游引物濃度不同。擴(kuò)增探針互補(bǔ)鏈的引物的濃度高于與之配對(duì)的另一條引物濃度。一對(duì)PCR引物濃度的比例為不超過2 1，或者不超過3 I,或者不超過4 I,或者不超過5 I。
11.權(quán)利要求9所述的鑒定分枝桿菌菌種的方法，其中步驟(2)中配制的PCR反應(yīng)體系為成分濃度加入量PCR緩沖液10倍濃縮2μ1 MgCl225mM1.6μ1dNTPsIOmM0.4μ1引物1(限制性引物) IOmMΟ. μ 引物 2IOmM0.6μ1探針I(yè)OmM0.4μ1aTaqDNA 聚合酶5υ/μ1Ο. μ 模板2μ1無菌超純水補(bǔ)足至20μ1通常，使用本發(fā)明所述的鑒定試劑I代替上述反應(yīng)體系中的引物和探針，另外可能視情況需要在使用鑒定試劑I后，用本發(fā)明所述鑒定試劑II代替上述反應(yīng)體系中的引物和探針配制PCR反應(yīng)體系。
12.權(quán)利要求9中步驟(3)中PCR擴(kuò)增所采用的程序?yàn)?5°C預(yù)變性Imin;40 50個(gè)循環(huán) 95 變性 6sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 10sec，58°C退火 15sec，72°C延伸 5sec ；95°C變性30sec ;40°C保溫20sec ；40 85°C做熔解曲線分析，每步升溫1°C，保溫5 30sec，選擇FAM、HEX、ROX通道檢測(cè)熒光。
13.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒在制備用于鑒定分枝桿菌的各類產(chǎn)品或試劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分枝桿菌菌種鑒定的雙標(biāo)記探針檢測(cè)和溶解曲線分析方法，以及利用所述方法同時(shí)鑒定多種分枝桿菌的試劑盒。本發(fā)明中的試劑盒包括針對(duì)分枝桿菌16S rRNA基因設(shè)計(jì)的引物和能夠鑒定分枝桿菌菌種的雙標(biāo)記寡核苷酸探針，以及一種熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。本發(fā)明中的檢測(cè)方法和試劑盒能檢測(cè)和/或鑒定24種常見分枝桿菌。根據(jù)探針與不同菌種的序列雜交產(chǎn)生不同Tm值的熔解峰判讀結(jié)果，可同時(shí)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)分枝桿菌，鑒別分枝桿菌與非分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌，鑒定分枝桿菌菌種，3-4小時(shí)即可報(bào)告結(jié)果，從而輔助臨床診斷、指導(dǎo)臨床開展早期有效的化療。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102634575SQ20121008266
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者吳雪瓊, 孫偉民, 富國(guó)良, 張俊仙, 梁艷, 陽(yáng)幼榮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三O九醫(yī)院, 無錫銳奇基因生物科技有限公司