專利名稱：植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因、蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離的環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因和多肽。本發(fā)明也提供使用環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因、多肽和合酶產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
植物油不僅用于食品工業(yè)，而且越來越多地用于化學(xué)工業(yè)。任何具體的油的應(yīng)用均依賴于該油的化學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)，這取決于成分脂肪酸的組成。為了滿足工業(yè)要求，通常修飾植物油。植物油的這種修飾一般通過化學(xué)方法實現(xiàn)(分級分離、酯交換、氫化或其它化學(xué)衍化)，但是越來越多地使用遺傳方法產(chǎn)生新型的油類原料。
特別重要的一類是含有三碳碳環(huán)的脂肪酸類別，包括環(huán)丙烷脂肪酸(CPA-FAs)和環(huán)丙烯脂肪酸(CPE-FAs)。環(huán)丙烯環(huán)使得這些脂肪酸和油具有兩個獨特的性質(zhì)。首先，氫化作用產(chǎn)生大量的甲基分支的脂肪酸。這將導(dǎo)致相當(dāng)于不飽和脂肪酸及其酯的低溫特性，沒有雙鍵的易氧化性，因此可以用于潤滑及相關(guān)領(lǐng)域(Kai，Y.(1982)J.Am.Oil Chem.Soc.59300-305)。另外，甲基分支的脂肪酸也可以被視為產(chǎn)生二聚酸中形成的異硬脂酸的替代物，異硬脂酸是油化學(xué)工業(yè)的一種商品，用作化妝品和潤滑劑添加劑。其次，環(huán)丙烯環(huán)高度拉緊，在與親電子試劑的放熱反應(yīng)中該環(huán)容易打開。含有高水平環(huán)丙烯脂肪酸的油，如臭蘋婆(Sterculia foetida)油，在升高的溫度下自聚合。這種特性特別適用于包衣和聚合物的生產(chǎn)。在臭蘋婆油中，蘋婆酸與乙酸反應(yīng)，產(chǎn)生多種乙酰酯，以及與短鏈或中鏈飽和脂肪酸反應(yīng)，產(chǎn)生單不飽和交酯(estolide)產(chǎn)物(Kircher(1964)J.Org Chem.291979-1982)；所有這些產(chǎn)物都能被進一步氫化、皂化或水解，形成羥基脂肪酸。油與二價羧酸反應(yīng)產(chǎn)生聚合物。另外，蘋婆酸也可以在脂肪酸皂性制劑中用作殺生物劑。
另一方面，CPE-FAs被認為是食用油中的一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。含有CPE-FAs的許多種子脂類被人類大量消費，特別是在熱帶地區(qū)(Ralaimanarivo等人(1982)Lipids 17(1)1-10)。已經(jīng)證實，飲食中的CPE-FAs在動物中導(dǎo)致硬脂的積累和其它生理紊亂(Phelps等人(1965)Poultry Science 44358-394；Page等人(1997)ComparativeBiochemistry And Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology118(1)79-84)。CPE-FAs是動物中多種去飽和酶的強抑制劑(Cao等人(1993)Biochimica et Biophysica Acta 1210(1)27-34；Fabrias等人(1996)Journal of Lipid Research 37(7)1503-1509；Fogerty等人(1972)Lipids 7(5)335-338)，可能是至少某些疾病的病因。由于這些健康上的擔(dān)心，含有CPE-FAs的植物油在消費前必須高溫處理或者氫化。這些處理增加了油料加工的成本，也導(dǎo)致存在一定比例的氫化產(chǎn)生的反式脂肪酸；這些反式脂肪酸的存在也是不希望的。因此，希望獲得CPE-FAs水平大大降低的植物油，因為這些油的可用性將顯著降低加工成本，減少不希望的氫化脂肪酸的存在，提高油在食品消費中的價值。除去CPE-FAs也將提高未加工的種子或種子粉(如棉籽)作為動物飼料的價值。
當(dāng)前，富含CPE-FAs的油還沒有商業(yè)來源?？梢哉J為，植物CPE-FAs由CPA-FAs通過去飽和作用合成。大腸桿菌和其它細菌能夠合成含有環(huán)丙烷環(huán)的脂肪酸。該反應(yīng)由環(huán)丙烷脂肪酸合酶(也被稱為環(huán)丙烷合酶或不飽和磷脂甲基轉(zhuǎn)移酶；E.C.2.1.1.16)催化，包括對磷脂十六烷?；蚴送轷；p鍵的來自S-腺苷甲硫氨酸的亞甲基的加成。CPA-FAs(CFAs)，如二氫蘋婆酸(DHS)的特征在于一個飽和的三碳環(huán)，如下列結(jié)構(gòu)所示，其中對于游離脂肪酸而言X＝OH，或者對于酯是一個醇基。
環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因已經(jīng)在大腸桿菌中克隆并測序(Grogan等人(1997)J.Bacteriol.158286-295，Wang等人(1992)Biochemistry3111020-11028)。細菌中未報告有CPE-FAs。
CPA-FAs(CPA-FA)和CPE-FAs(CPE-FA)在高等植物中并非廣泛分布，但是發(fā)現(xiàn)它們存在于有限的科的種子油中，包括錦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、木棉科(Bombaceae)、Tilaceae、含羞草科(Mimosaceae)和無患子科(Sapindaceae)(Smith(1970)《脂肪和其它脂類化學(xué)的進展》(Progress in the Chemistry of Fats and OtherLipids)(Pergamon PressNew York)第11卷，139-177頁；Christie(1970)《脂類化學(xué)主題》(Topics in Lipid Chemistry)(GunstoneFD編著；Logos PressLondon)第一卷，1-49頁；Badami和Patil(1981)Prog.Lipid Res.19119-153)。CPA-FAs和CPE-FAs不限于種子中。Kuiper和Stuiver((1972)Plant Physiol.49307-309)描述了初春植物葉子的不同極性脂類中的長鏈CPA-FAs。Yano等人((1972)Lipids 730-34)和Schmid和Patterson((1988)Phytochem.272831-2834)報告，CPA-FAs和CPE-FAs在錦葵科植物的根、葉、莖和愈傷組織中發(fā)現(xiàn)。
在少數(shù)植物種中，CPA-FAs能夠達到高水平，換句話說，在荔枝(Litchi chinensis)中可達40％(Vickery等人(1980)J.Am.Oil Chem.Soc.5787-91；和Gaydou等人(1993)J.Ag.Food Chem.41886-890)。然而，尤其是在錦葵目(Maivales)中，發(fā)現(xiàn)CPE-FAs是很普通的(例如，Bohannon和Kleiman(1978)Lipids 13270-273報告)，Yano等人((1972)Lipids 735-45)假定了一種CPE-FAs通過CPA-FAs的生物合成途徑。因此，在植物中，CPE-FAs主要以蘋婆酸和錦葵酸的形式存在，錦葵酸是蘋婆酸的一碳同系物，是通過-氧化在羧基端縮短鏈獲得的。CPE-FAs通常伴隨有少量的相應(yīng)的CPA-FAs、二氫蘋婆酸和二氫錦葵酸。然而，還沒有證實鑒定和分離的編碼能夠合成CPA-FAs的蛋白質(zhì)的植物基因。而且，含有高水平環(huán)丙烯的植物還沒有商業(yè)培育。
因此，希望能夠生產(chǎn)含有高含量環(huán)丙烷和CPE-FAs的植物油。一種方法是鑒定和分離能夠合成CPA-FAs的植物基因。然后用這種基因轉(zhuǎn)化油料作物。這種基因的鑒定也能夠用來通過基因沉默技術(shù)降低CPE-FAs的水平。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有環(huán)丙烷脂肪酸合酶(″CPA-FAS″)基因和多肽的組合物。本發(fā)明不限于任何具體的核酸或氨基酸序列。本發(fā)明也提供使用CPA-FAS基因和多肽的方法。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供含有一種分離的核酸序列的組合物，該序列編碼一種植物CPA-FAS或其部分。在有些實施方案中，該植物來自錦葵目；在其它一些實施方案中，該植物是一種蘋婆屬植物或棉花植物。在有些具體實施方案中，該核酸序列編碼蘋婆CPA-FAS或其部分；在其它一些具體實施方案中，該蘋婆是臭蘋婆，在另外一些具體實施方案中，分離的核酸序列含有SEQ ID NO1。在其它具體實施方案中，該核酸序列編碼棉花CPA-FAS或其部分；在其它具體實施方案中，該棉花是樹棉(Gossypium arboreum)，在其它具體實施方案中，分離的核酸序列至少含有SEQ ID NOs3、4、5或6之一。在其它實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的核酸序列，其含有一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因。在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有一種分離的核酸序列的組合物，該序列含有編碼一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的氨基端的核酸序列；在有些具體實施方案中，一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的氨基端含有一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的約前420-470個氨基酸；在其它具體實施方案中，一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的氨基端含有SEQ ID NO2的大約前440個氨基酸或SEQ IDNO7的氨基酸序列；在其它具體實施方案中，該編碼序列含有SEQ IDNO1的大約前1410個核苷酸或者含有SEQ ID NO3。在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有一種分離的核酸序列的組合物，該序列含有編碼與一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶氨基端同源的氨基酸序列的核酸序列；在有些具體實施方案中，一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的氨基端含有一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的前面約420-約470個氨基酸；在其它具體實施方案中，一種植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的氨基端含有SEQ IDNO2的大約前440個氨基酸或SEQ ID NO7的氨基酸序列。
本發(fā)明不限于編碼植物CPA-FAS的核酸序列；實際上，預(yù)期本發(fā)明包括編碼一種植物CPA-FAS的同源物、變體和部分或片段的分離的核酸序列。因此，在有些實施方案中，本發(fā)明提供含有一種分離的核酸序列的組合物，該序列在低到高嚴(yán)格條件下可與含有SEQ IDNOs1、3、4、5或6的核酸序列雜交。在一些具體實施方案中，分離的核酸在高嚴(yán)格條件下可與含有SEQ ID NOs1、3、4、5或6的核酸序列雜交。在其它實施方案中，雜交的序列編碼一種多肽，該多肽催化對不飽和脂肪酸不飽和中心的亞甲基加成。在其它實施方案中，分離的核酸序列在低到高嚴(yán)格條件下可與含有SEQ ID NO1的大約前1410個核苷酸或含有SEQ ID NO3的核酸序列雜交。在一些具體實施方案中，分離的核酸在高嚴(yán)格條件下可與含有SEQ ID NO1的大約前1410個核苷酸或含有SEQ ID NO3的核酸序列雜交。在其它實施方案中，雜交的序列編碼一種多肽，該多肽催化對不飽和脂肪酸不飽和中心的亞甲基加成。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有一種分離的核酸序列的組合物，該序列編碼一種植物CPA-FAS，其中該合酶與含有SEQ ID NOs1或至少SEQ ID NOs3、4、5或6之一的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)競爭結(jié)合不飽和脂肪酸底物；在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有一種分離的核酸序列的組合物，該序列編碼一種植物CPA-FAS，其中該合酶與含有氨基酸序列SEQ ID NOs2或至少SEQ ID NOs7、8、9或10之一的蛋白質(zhì)競爭結(jié)合不飽和脂肪酸底物。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有一種反義序列的組合物，該序列對應(yīng)于如上所述編碼一種植物CPA-FAS的任何核酸序列。在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有靶向于上述任何一種植物CPA-FAS編碼序列的核酶和發(fā)夾環(huán)的組合物；在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有一種核酸序列的組合物，該序列編碼靶向于上述任何一種植物CPA-FAS編碼序列的核酶和發(fā)夾環(huán)。在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有siRNAs的組合物，該siRNA靶向于由編碼如上所述植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的任何一種核酸序列轉(zhuǎn)錄的mRNA的序列；在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有編碼一種siRNA的核酸序列的組合物，該siRNA靶向于由編碼如上所述植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的任何一種核酸序列轉(zhuǎn)錄的mRNA的序列。
在本發(fā)明的一些實施方案中，上述核酸序列與一個異源啟動子有效連接。在其它實施方案中，與異源啟動子有效連接的上述序列包含于一種載體內(nèi)。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有一種純化多肽的組合物，該多肽由上述任何一種核酸序列編碼，當(dāng)該序列轉(zhuǎn)錄并翻譯時，導(dǎo)致一種多肽的表達；在有些實施方案中，該多肽從一種重組生物中純化，這種生物用上述任何一種核酸序列轉(zhuǎn)化，當(dāng)該序列轉(zhuǎn)錄并翻譯時，導(dǎo)致一種多肽的表達。在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有純化的植物CPA-FAS或其部分的組合物。在有些實施方案中，植物CPA-FAS從錦葵目的植物中純化；在其它實施方案中，植物CPA-FAS從蘋婆中純化；在其它實施方案中，CPA-FAS從臭蘋婆中純化；在其它實施方案中，植物CPA-FAS含有氨基酸序列SEQ ID NO2。在其它實施方案中，植物CPA-FAS從棉花中純化；在其它實施方案中，植物CPA-FAS至少含有氨基酸SEQ ID NOs7、8、9或10之一。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供用上述任何一種核酸序列轉(zhuǎn)化的生物。在其它實施方案中，本發(fā)明提供用編碼植物CPA-FAS或其部分的異源基因轉(zhuǎn)化的生物；在有些實施方案中，該基因來自一種錦葵目植物；在其它實施方案中，該基因是一種蘋婆基因；在其它實施方案中，該基因是一種臭蘋婆基因；在其它實施方案中，該基因編碼SEQ ID NO2。在其它實施方案中，該基因是一種棉花基因；在其它具體實施方案中，該基因編碼至少含有氨基酸SEQ ID NOs7、8、9或10之一的CPA-FAS。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供用編碼植物CPA-FAS的第一種異源基因和編碼脂肪酸去飽和酶的第二種異源基因共轉(zhuǎn)化的生物。在其它實施方案中，本發(fā)明提供用一種異源基因共轉(zhuǎn)化的生物，該基因編碼含有植物CPA-FAS和脂肪酸去飽和酶的融合蛋白。
在本發(fā)明的其它實施方案中，如上所述的轉(zhuǎn)化生物是一種植物或微生物。在一個優(yōu)選實施方案中，該生物是一種植物。在其它實施方案中，植物細胞用上述任何一種核酸序列轉(zhuǎn)化。在其它實施方案中，植物種子用上述任何一種核酸序列轉(zhuǎn)化。在其它實施方案中，本發(fā)明提供來自如上所述轉(zhuǎn)化的植物的油。在其它實施方案中，如上所述轉(zhuǎn)化的生物是一種細菌；在其它實施方案中，本發(fā)明提供來自這樣轉(zhuǎn)化的細菌的油。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供在植物中表達植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的方法，包括提供一種載體和植物組織，其中該載體含有編碼植物CPA-FAS或其部分的上述任何一種核酸序列；在使得合酶表達的條件下，用該載體轉(zhuǎn)染該植物組織。在其它實施方案中，本發(fā)明提供減少植物中CPA-FAS表達的方法，包括提供一種載體和植物組織，其中該載體含有編碼一種反義序列的核酸序列，該反義序列對應(yīng)于編碼植物CPA-FAS或其部分的上述任何一種核酸序列；在使得該反義序列表達且CPA-FAS表達減少的條件下，用該載體轉(zhuǎn)染該植物組織。在其它實施方案中，本發(fā)明提供減少植物中CPA-FAS表達的方法，包括提供一種載體和植物組織，其中該載體編碼靶向于編碼植物CPA-FAS或其部分的上述任何一種核酸序列的siRNA；在使得該siRNA表達且CPA-FAS表達減少的條件下，用該載體轉(zhuǎn)染該植物組織。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)植物CPA-FAS的一種變體的方法，包括提供編碼植物CPA-FAS的核酸序列，誘變該核酸序列，以產(chǎn)生一種變體；在其它實施方案中，該方法還包括根據(jù)活性篩選變體。在有些實施方案中，該變體是具有CPA-FAS活性的CPA-FAS的片段。在其它實施方案中，該變體是一種突變的CPA-FAS，與未突變的CPA-FAS相比，它具有改變的CPA-FAS活性。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供在體外生產(chǎn)含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如脂肪環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種純化的植物CPA-FAS和該酶的至少一種脂肪酸底物，在致使產(chǎn)生含三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，該合酶與該底物溫育。在具體實施方案中，植物CPA-FAS的底物是一種不飽和脂肪酸，具有可變的鏈長，不含或者含有一個或多個另外的功能基團，包括乙炔鍵、共軛乙炔鍵和乙烯鍵、丙二烯基、環(huán)戊烯和呋喃環(huán)，或環(huán)氧基、羥基和酮基，其中該底物是游離脂肪酸或摻入較大分子中的脂肪酸；在其它具體實施方案中，該底物是油酸或棕櫚油酸。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供在體外生產(chǎn)含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種編碼植物CPA-FAS的分離的核酸序列和該酶的至少一種脂肪酸底物；在導(dǎo)致該序列表達且產(chǎn)生環(huán)丙烷脂肪酸的條件下，該序列與該底物在一種轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中溫育。在具體實施方案中，植物CPA-FAS的底物選自如上所述。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供在體外生產(chǎn)含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種純化的植物CPA-FAS、一種純化的脂肪酸去飽和酶和該去飽和酶的至少一種脂肪酸底物；在致使產(chǎn)生含三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，CPA-FAS和去飽和酶與該底物溫育。在優(yōu)選實施方案中，去飽和酶的脂肪酸底物是能夠添加另外一個雙鍵的任何一種脂肪酸，該雙鍵可以是CPA-FAS加成亞甲基的位點。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供通過發(fā)酵生產(chǎn)含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供用編碼植物CPA-FAS的異源基因轉(zhuǎn)化的一種微生物和植物CPA-FAS的至少一種底物；在致使產(chǎn)生含三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，該微生物與該底物溫育。在具體實施方案中，CPA-FAS的脂肪酸底物選自如上所述。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供通過發(fā)酵生產(chǎn)含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種微生物和去飽和酶的至少一種底物，該微生物用編碼植物CPA-FAS的第一種異源基因和編碼脂肪酸去飽和酶的第二種異源基因共轉(zhuǎn)化；在致使產(chǎn)生含三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，該微生物與該底物溫育。在優(yōu)選實施方案中，去飽和酶的脂肪酸底物選自如上所述。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供通過發(fā)酵生產(chǎn)含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種微生物和去飽和酶的至少一種底物，該微生物用編碼含有植物CPA-FAS和脂肪酸去飽和酶的融合多肽的異源基因轉(zhuǎn)化；在致使產(chǎn)生含三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，該微生物與該底物溫育。在具體實施方案中，去飽和酶的脂肪酸底物選自如上所述。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供在植物中產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種植物和編碼植物CPA-FAS的一種異源基因；用該異源基因轉(zhuǎn)化該植物，以產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸，如環(huán)丙烷脂肪酸。在其它實施方案中，本發(fā)明提供在植物中產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括在致使產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，種植用編碼植物CPA-FAS的異源基因轉(zhuǎn)化的植物。在其它實施方案中，本發(fā)明提供在植物中產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種植物，編碼植物CPA-FAS的第一種異源基因，和編碼去飽和酶的第二種異源基因；用第一種異源基因和第二種異源基因共轉(zhuǎn)化該植物，以產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸，如環(huán)丙烷脂肪酸。在其它實施方案中，本發(fā)明提供在植物中產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括在致使產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，種植用編碼植物CPA-FAS的第一種異源基因和編碼去飽和酶的第二種異源基因轉(zhuǎn)化的一種植物。在其它實施方案中，本發(fā)明提供在植物中產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括提供一種植物，和編碼含有植物CPA-FAS和脂肪酸去飽和酶的融合多肽的異源基因；用該異源基因轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸，如環(huán)丙烷脂肪酸。在其它實施方案中，本發(fā)明提供在植物中產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的方法，包括在致使產(chǎn)生含有三碳碳環(huán)的脂肪酸(如環(huán)丙烷脂肪酸)的條件下，種植用一種異源基因轉(zhuǎn)化的植物，該基因編碼含有植物CPA-FAS和脂肪酸去飽和酶的融合多肽。
在其它具體實施方案中，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的上述任何一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，其中該核酸序列處于控制該核酸序列在植物靶組織中表達或在植物靶發(fā)育階段表達的啟動子的控制之下，或者處于誘導(dǎo)型啟動子控制之下。預(yù)期這些轉(zhuǎn)基因植物可以用于上述任何方法，用于在植物中生產(chǎn)環(huán)丙烷脂肪酸。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供篩選植物CPA-FAS的方法，包括提供候選植物CPA-FAS，分析候選CPA-FAS中氨基酸序列是否存在S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合基序和催化半胱氨酸；優(yōu)選地，該基序和催化半胱氨酸存在于植物CPA-FAS的羧基端。
附圖描述

圖1顯示提出的蘋婆酸生物合成途徑。
圖2顯示蘋婆種子發(fā)育過程中脂肪酸積累的概況。
圖3顯示沿來自克隆R50D5和R15C3的推斷的蘋婆環(huán)丙烷合酶cDNA，蘋婆種子ESTs的分布。起始密碼子位于98bp處，終止密碼子位于2690bp處。在所有盒中，第一個數(shù)字是EST的編號，第二個數(shù)字是EST開始的位點。箭頭表示給定EST的方向和覆蓋的區(qū)域。
圖4顯示蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶(SCPA-FAS)的核酸序列(SEQ IDNO1)。
圖5顯示圖4所示的蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶(SCPA-FAS)的推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖6顯示FAMEs的GC/MS分析，該FAMEs來源于在補充200mg/L油酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時的酵母。圖(A)顯示來自對照轉(zhuǎn)基因酵母的FAMEs的總離子層析譜，酵母中含有構(gòu)建體pYES2/CT-LaeZ。圖(B)顯示來自含有構(gòu)建體pYES2/CT-SCPAS的酵母的FAMEs的總離子層析譜，該構(gòu)建體含有蘋婆環(huán)丙烷合酶的編碼序列。在該層析譜中能夠看到保留時間為34.44min的另一個峰。圖(C)顯示在來自圖(B)的FAMES的層析譜中觀察到的另一個獨特峰的質(zhì)譜。該質(zhì)譜與二氫蘋婆酸標(biāo)準(zhǔn)相同(見圖8(A))。插圖是含有另一個峰的放大圖像。
圖7顯示來自轉(zhuǎn)基因煙草細胞的FAMEs的總離子層析譜。圖(A)顯示來自用空構(gòu)建體pE1776轉(zhuǎn)化的對照轉(zhuǎn)基因煙草細胞的飽和FAMEs。圖(B)顯示來自用含有蘋婆環(huán)丙烷合酶編碼序列的構(gòu)建體pE1776-SCPAS轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草細胞的飽和FAMEs。在該樣品中能夠看到保留時間為35.69min的另一個主要峰。圖(C)顯示保留時間為35.69min的二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)。
圖8顯示二氫蘋婆酸標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜和用蘋婆環(huán)丙烷合酶編碼序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細胞中發(fā)現(xiàn)的另一個峰的比較。圖(A)顯示二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)的總離子層析譜。圖(B)顯示二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜。有幾個離子是二氫蘋婆酸甲酯所特有的，包括分子離子m/z＝310，M-32為278，M-74為236。圖(C)顯示來自轉(zhuǎn)基因煙草細胞的飽和FAMEs的總離子層析譜，該細胞用含有蘋婆環(huán)丙烷合酶編碼序列的構(gòu)建體pE1776-SCPAS轉(zhuǎn)化。圖(D)顯示圖(C)中所見的保留時間為35.69min的峰的質(zhì)譜。該峰的質(zhì)譜與二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)幾乎相同，分子離子特征(signature)為310，M-32為278，M-74為236。
圖9顯示用蘋婆環(huán)丙烷合酶編碼序列轉(zhuǎn)化的15個獨立轉(zhuǎn)基因煙草系的二氫蘋婆酸含量。
圖10圖(A)顯示蘋婆環(huán)丙烷合酶與其它環(huán)丙烷合酶和環(huán)丙烷合酶樣酶的羧基端部分的氨基酸比對。---線表示S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點，*是重要的催化半胱氨酸。圖(B)顯示這些酶之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。
圖11顯示蘋婆與細菌環(huán)丙烷脂肪酸合酶之間的氨基酸比對。使用約氨基酸470-氨基酸864的部分(保守羧基端)制備抗蘋婆酶抗體。
圖12顯示引物相對于蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶編碼序列的位置(引物在編碼序列之上顯示)，其中該引物用于保守羧基端編碼序列的PCR擴增。
圖13顯示在BL21中表達的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO11)。突出的部分來源于載體，其含有6-組氨酸尾以便于純化。
圖14顯示通過用蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶的氨基酸序列blastingNCBI數(shù)據(jù)庫，在棉花(樹棉)中發(fā)現(xiàn)的三個EST的核酸序列。圖A顯示EST1(SEQ ID NO3)，圖B顯示EST2(SEQ ID NO4)，圖C顯示EST3(SEQ ID NO5)。
圖15顯示圖14所示的三個棉花EST的重疊群分析的結(jié)果，證實EST2和3是重疊的EST。圖A用圖示顯示結(jié)果；圖B顯示EST2、EST3和重疊群1的核酸序列排比，圖C顯示重疊群1的核酸序列(SEQID NO6)。
圖16顯示蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶(圖A，SEQ ID NO2)、棉花EST1(圖B，SEQ ID NO7)、棉花EST2(圖C，SEQ ID NO8)、棉花EST3(圖D，SEQ ID NO9)和棉花重疊群1(EST2_3，圖E，SEQ IDNO10)的預(yù)測的氨基酸序列。
圖17顯示蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2)與兩種棉花EST序列——EST1(SEQ ID NO7)和重疊群1(EST2_3，SEQ ID NO10)的預(yù)測的氨基酸序列的比對。
圖18顯示使用抗蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶(CPSA-FAS)抗體，來自棉花的不同組織(胚、葉、莖和根)和來自蘋婆的胚組織的Western印跡分析。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有植物環(huán)丙烷脂肪酸(CPA-FAS)基因和多肽的組合物。本發(fā)明包括含有該酶的天然和重組形式以及突變體和變體形式的組合物，其中有些具有不同于野生型的特征。本發(fā)明也提供使用植物CPA-FAS基因、多肽和合酶產(chǎn)物的方法。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供分離的編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的新型核酸序列。在其它實施方案中，本發(fā)明提供分離的編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的突變體、變體、同源物、嵌合體和融合體的核酸序列。在其它實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生這些序列的方法。在其它實施方案中，本發(fā)明提供克隆和表達這些序列的方法，以及純化和測定這些序列的表達產(chǎn)物的方法。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供純化的植物CPA-FAS多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明提供植物CPA-FAS的突變體、變體、同源物、嵌合體和融合蛋白。在有些實施方案中，本發(fā)明提供純化并測定環(huán)丙烷脂肪酸合酶多肽野生型以及突變體、變體、同源物、嵌合體和融合體的生物化學(xué)活性的方法，以及產(chǎn)生針對這些蛋白質(zhì)的抗體的方法。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供使用分離的編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的新型核酸序列產(chǎn)生具有合酶活性的產(chǎn)物的方法。在有些實施方案中，該方法包括將該序列添加到含有合酶底物的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中，使得合酶產(chǎn)物可以回收。在其它實施方案中，該方法包括用該序列轉(zhuǎn)化生物，使得該序列表達，產(chǎn)生合酶的產(chǎn)物。在具體實施方案中，回收產(chǎn)物。在其它實施方案中，產(chǎn)物保留在原位。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供使用重組植物CPA-FAS多肽產(chǎn)生具有合酶活性的產(chǎn)物的方法。在有些實施方案中，該方法包括將該多肽添加到含有合酶底物的體外系統(tǒng)中，使得合酶產(chǎn)物可以回收。
在其它實施方案中，該方法包括用分離的編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的新型核酸序列轉(zhuǎn)化一種植物，致使產(chǎn)生合酶的產(chǎn)物。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的異源基因轉(zhuǎn)化的一種生物。在有些實施方案中，該生物是一種微生物。在其它實施方案中，該生物是一種植物。
在有些實施方案中，本發(fā)明也提供用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的異源基因轉(zhuǎn)化的一種細胞。在有些實施方案中，該細胞是一種微生物。在其它實施方案中，該細胞是一種植物細胞。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的核酸序列轉(zhuǎn)化的一種植物種子。在其它實施方案中，本發(fā)明提供來自用植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶轉(zhuǎn)化的植物的油。
定義為了便于理解本發(fā)明，下面定義了此處使用的大量術(shù)語和短語。
術(shù)語“植物”最廣義地使用。包括但不限于木本、裝飾、作物或谷類、水果或蔬菜植物和光合綠藻(例如萊因哈德衣藻(Chlamydomonasreinhardtii))的任何種。也指大多分化為在植物發(fā)育任一階段存在的結(jié)構(gòu)的多種植物細胞。這些結(jié)構(gòu)包括但不限于果實、芽、莖、葉、花瓣等。術(shù)語“植物組織”包括分化的和未分化的植物組織，包括根、芽、葉、花粉、種子和腫瘤中存在的組織，以及培養(yǎng)的細胞(例如單細胞、原生質(zhì)體、胚、愈傷組織等)。植物組織可以在植物中，在器官培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或細胞培養(yǎng)物中。如此處所用的術(shù)語“植物部分”是指一種植物結(jié)構(gòu)或植物組織。
術(shù)語“作物”或“作物植物”最廣義地使用。該術(shù)語包括但不限于人類食用或用作動物飼料或人類使用或消費的任何植物或藻類種，或工業(yè)或商業(yè)上使用的任何植物或藻類。
術(shù)語“產(chǎn)油種”是指在特定器官(主要在種子)中產(chǎn)生并貯存三酰基甘油的植物種。這些種包括但不限于大豆(Glycine max)、油菜籽和蕓苔(包括蕓苔(Brassica napus)和野油菜(B.campestris))，向日葵(Helianthus annus)，棉花(陸地棉(Gossypiurn hirsutum))、玉米(玉蜀黍(Zea mays))，可可(Theobroma cacao)，紅花(Carthamus tinctorius)，油椰(Elaeis guineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亞麻(linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和落花生(Arachis hypogaea)。也包括可用于研發(fā)適當(dāng)表達載體的非農(nóng)業(yè)種，如煙草、快循環(huán)蕓苔屬的種，和擬南芥(Arabidopsis thaliana)，和可以作為獨特脂肪酸來源的野生種。
術(shù)語“蘋婆”是指來自錦葵目梧桐科蘋婆屬的植物。蘋婆的非限制性例子包括來自臭蘋婆、西非黃蘋婆(S.oblongata)、象鼻黃蘋婆(S.Rhinopetala)、刺激蘋婆(S.urens)、絨毛蘋婆(S.vi1losa)種的植物。該術(shù)語也指從中分離核酸序列SEQ ID NO1的臭蘋婆植物。
術(shù)語“棉花”是指來自錦葵目錦葵科棉屬的棉花植物，至少包括39個種。棉花的非限制性例子包括來自樹棉、陸地棉、草棉(G.herbaceum)和海島棉(G.barbadense)種的植物。該術(shù)語也指產(chǎn)生核酸序列SEQ IDNOs3、4和6的樹棉植物。
術(shù)語植物細胞的“區(qū)室或細胞器”最廣義地使用。該術(shù)語包括但不限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、跨高爾基網(wǎng)絡(luò)、質(zhì)體、肌質(zhì)網(wǎng)、乙醛酸循環(huán)體、線粒體、葉綠體和核膜等。
術(shù)語“宿主細胞”是指能夠復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄和/或翻譯異源基因的任何細胞。
術(shù)語“加成亞甲基的脂肪酸”是指向烴鏈加成一個亞甲基，產(chǎn)生甲基或亞甲基分支的或三碳碳環(huán)結(jié)構(gòu)的脂肪酸。
術(shù)語“三碳碳環(huán)脂肪酸”是指含有環(huán)丙烷或環(huán)丙烯環(huán)的脂肪酸。
術(shù)語“環(huán)丙烷脂肪酸”(CPA-FA)是指特征在于一個飽和三碳環(huán)的脂肪酸。術(shù)語“環(huán)丙烯脂肪酸”(CPE-FA)是指特征在于一個不飽和三碳環(huán)的脂肪酸。
術(shù)語“環(huán)丙烷脂肪酸合酶”(CPA-FAS)或“環(huán)丙烷合酶”是指能夠合成含有環(huán)丙烷環(huán)的脂肪酸的多肽。當(dāng)含有順式單不飽和脂肪酸之外的底物時，或者在只有幾個氨基酸的修飾后，該多肽預(yù)計作為三碳碳環(huán)脂肪酸合酶或作為加成亞甲基的脂肪酸合酶更廣泛地起作用。這種基本反應(yīng)包括對雙鍵加成亞甲基。因此，該多肽催化對不飽和脂肪酸的不飽和中心加成亞甲基，包括對?；碾p鍵加成亞甲基。甲硫氨酸能夠從S-腺苷甲硫氨酸獲得。酰基一般是十六烷?；蚴送轷；?，但是預(yù)計不同鏈長和不飽和程度的其它脂肪?；部梢宰鳛榈孜铩?jù)認為脂肪?；货セ癁榱字?；這些磷脂底物包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。術(shù)語“重組環(huán)丙烷脂肪酸合酶”(重組CPA-FAS)是指編碼CPA-FAS的重組核酸分子或異源基因的表達產(chǎn)物。具有“CPA-FAS活性”是指具有CPA-FAS的功能性，或者能夠合成含有環(huán)丙烷環(huán)的脂肪酸，或者催化上述反應(yīng)?！爸参顲PA-FAS”是最初從植物來源獲得的一種酶；該酶可以被修飾，這種修飾包括但不限于截短、氨基酸缺失、添加和置換，以及糖基化，其中產(chǎn)生的修飾酶具有CPA-FAS活性。
術(shù)語“競爭結(jié)合”用于具有酶活性的第一種多肽，它結(jié)合與具有酶活性的第二種多肽相同的底物，其中第二種多肽是第一種多肽的變體或相關(guān)的或不同的多肽。第一種多肽的結(jié)合效率(例如動力學(xué)或熱力學(xué))可能等于或高于或低于第二種多肽的底物結(jié)合效率。例如，對于兩種多肽，與底物結(jié)合的平衡結(jié)合常數(shù)(KD)可能不同。
術(shù)語“嵌合體”當(dāng)用于多肽時是指從不同基因獲得的兩種或多種編碼序列的表達產(chǎn)物，這些序列克隆在一起，翻譯后作為一種多肽序列。嵌合多肽也被稱為“雜種”多肽。編碼序列包括從相同或不同生物種獲得的序列。
術(shù)語“融合”當(dāng)用于多肽時是指一種嵌合蛋白，它含有與外源蛋白質(zhì)片段(融合配偶體)連接的目的蛋白質(zhì)。融合配偶體可以行使多種功能，包括提高目的多肽的溶解度，以及提供“親和標(biāo)簽”，以允許從宿主細胞或上清液或這兩者中純化重組融合多肽。如希望，可以在純化之后或過程中從目的蛋白質(zhì)中除去融合配偶體。
術(shù)語“同源物”或“同源的”當(dāng)用于多肽時是指兩種多肽之間的高度序列同一性，或者三維結(jié)構(gòu)之間的高度相似性，或者活性部位與作用機制之間的高度相似性。在一個優(yōu)選實施方案中，同源物與參照序列有高于60％的序列同一性，更優(yōu)選地高于75％的序列同一性，再更優(yōu)選地高于90％的序列同一性。
術(shù)語“變體”或“突變體”當(dāng)用于多肽時是指與另一種通常相關(guān)的多肽有一個或多個氨基酸不同的氨基酸序列。變體可能含有“保守”改變，其中置換的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)(例如亮氨酸置換為異亮氨酸)。更少見的是，變體可能含有“非保守”改變(例如甘氨酸置換為色氨酸)。類似的微小變異也可包括氨基酸缺失或插入(即添加)或這兩種。確定哪種和多少氨基酸殘基可以被置換、插入或刪除而不消除生物活性的指南，可以用本領(lǐng)域公知的計算機程序發(fā)現(xiàn)，例如DNAStar軟件。變體能夠用功能測定法檢測。優(yōu)選的變體含有不到10％、優(yōu)選地不到5％、更優(yōu)選地不到2％的改變(置換、缺失等)。
術(shù)語“基因”是指一種核酸(例如DNA或RNA)序列，其包含產(chǎn)生RNA或多肽或其前體(例如胰島素原)所必需的編碼序列。一種功能多肽能夠由全長編碼序列編碼，或者由該編碼序列的任一部分編碼，只要該多肽保留希望的活性或功能性質(zhì)(例如酶活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)。術(shù)語“部分”當(dāng)用于基因時是指該基因的片段。這些片段的大小范圍是從幾個核苷酸到完整基因序列減一個核苷酸。因此，“至少含有基因的一部分的核苷酸”可以包含該基因的片段或整個基因。
術(shù)語“基因”也包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)，包括5”端和3’端上與編碼區(qū)相鄰的序列，在每一端上距離約為1kb，使得該基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)5’且存在于mRNA上的序列被稱為5’非翻譯序列。位于編碼區(qū)3’或下游且存在于mRNA上的序列被稱為3’非翻譯序列。術(shù)語“基因”包括一種基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有被稱為“內(nèi)含子”或“間插區(qū)”或“間插序列”的非編碼序列中斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄為核RNA(hnRNA)的基因片段；內(nèi)含子可能含有調(diào)節(jié)元件如增強子。內(nèi)含子從核或一級轉(zhuǎn)錄物上去除或“剪接下來”；因此信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中不含內(nèi)含子。mRNA在翻譯過程中用來指定新生多肽中氨基酸的序列或順序。
除了含有內(nèi)含子外，基因的基因組形式也可含有位于RNA轉(zhuǎn)錄物上存在的序列的5’和3’端的序列。這些序列被稱為“側(cè)翼”序列或區(qū)(這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄物上存在的非翻譯序列的5’或3’)。5’側(cè)翼區(qū)可含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列，如啟動子和增強子。3’側(cè)翼區(qū)可含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和聚腺苷酸化的序列。
術(shù)語“異源基因”是指編碼在自然環(huán)境中不存在(即人工改變)的因子的基因。例如，異源基因包括導(dǎo)入另一個種的來自一個種的基因。異源基因也包括用某些方法改變的(例如突變的、以多個拷貝添加的、與非天然啟動子或增強序列連接的，等等)對于一種生物而言是天然的基因。異源基因可含有植物基因序列，包括植物基因的cDNA形式；cDNA序列可以以有義(產(chǎn)生mRNA)或反義方向(產(chǎn)生與mRNA轉(zhuǎn)錄物互補的反義RNA轉(zhuǎn)錄物)表達。異源基因與內(nèi)源植物基因的不同在于異源基因序列一般與含有調(diào)節(jié)元件(如啟動子)的核苷酸序列連接，發(fā)現(xiàn)這些核苷酸序列不與異源基因編碼的蛋白質(zhì)的基因自然結(jié)合，或者不與染色體中的植物基因序列結(jié)合，或者與未在自然中發(fā)現(xiàn)的染色體部分結(jié)合(例如在通常不表達該基因的基因座中表達的基因)。
術(shù)語“寡核苷酸”是指由兩個或兩個以上、優(yōu)選地3個以上、通常10個以上的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的分子。準(zhǔn)確大小取決于許多因素，并取決于寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以用任何方法產(chǎn)生，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄或其組合。
術(shù)語“含有編碼一種基因的核苷酸序列的寡核苷酸”或“編碼一種具體多肽的核酸序列”是指含有一種基因的編碼區(qū)的核酸序列，或者換句話說，是指編碼一種基因產(chǎn)物的核酸序列。編碼區(qū)可以是cDNA、基因組DNA或RNA形式。當(dāng)以DNA存在時，寡核苷酸可以是單鏈(即有義鏈)或雙鏈的。如果需要適當(dāng)啟動一級RNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄和/或正確加工，合適的控制元件，如增強子/啟動子、剪接點、聚腺苷酸化信號等，可以緊密靠近基因的編碼區(qū)。此外，在本發(fā)明的表達載體中使用的編碼區(qū)也可含有內(nèi)源增強子/啟動子、剪接點、間插序列、聚腺苷酸化信號等，或內(nèi)源和外源控制元件的組合。
術(shù)語“互補的”和“互補”是指根據(jù)堿基配對原則關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”與序列“T-C-A”互補?；パa可能是“部分的”，其中只有一些核酸堿基根據(jù)堿基配對原則匹配?；蛘撸赡苁呛怂嶂g“完全”或“總體”互補。核酸鏈之間的互補程度對核酸鏈之間雜交的效率和強度有顯著影響。這在擴增反應(yīng)以及以核酸結(jié)合為基礎(chǔ)的檢測方法中特別重要。
術(shù)語“同源性”當(dāng)用于核酸時是指互補程度。可能是部分同源性或完全同源性(即同一性)?！靶蛄型恍浴笔侵竷煞N或多種核酸之間相關(guān)性的量度，表示為相對于總對比長度的百分比。同一性計算考慮在各自的較大序列中相同的和位于相同相對位置的核苷酸殘基。同一性的計算可以用計算機程序如“GAP”(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)和“ALIGN”(DNAStar，Madison，Wis.)中所含的算法進行。部分互補的序列至少部分抑制(或競爭)完全互補的序列與靶核酸雜交，使用功能術(shù)語“基本同源”。完全互補的序列與靶序列雜交的抑制可以用雜交試驗(Southern或Northern印跡法、溶液雜交等)在低嚴(yán)格條件下檢測?；就吹男蛄谢蛱结樤诘蛧?yán)格條件下將競爭并抑制與靶標(biāo)完全同源的序列的結(jié)合(即雜交)。這并不是說低嚴(yán)格條件允許非特異性結(jié)合；低嚴(yán)格條件需要兩種序列彼此之間的結(jié)合是一種特異的(即選擇性)相互作用。利用甚至缺乏部分互補性的第二種靶標(biāo)可以檢測非特異性結(jié)合的缺乏(例如不到約30％)；在沒有非特異結(jié)合時，探針將不與第二種非互補靶標(biāo)雜交。
當(dāng)用于雙鏈核酸序列，如cDNA或基因組克隆時，術(shù)語“基本同源的”是指在如下文所述的低嚴(yán)格條件下能夠與雙鏈核酸序列的一條鏈或兩條鏈雜交的任何探針。
當(dāng)用于核酸雜交時，低嚴(yán)格條件包括相當(dāng)于下列的條件當(dāng)使用長度約為500個核苷酸的探針時，在含有5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/lNaH2PO4×H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH調(diào)節(jié)為7.4)，0.1％ SDS，5×Denhardt′s試劑[50×Denhardt′s，每500ml含有5g Ficoll(Type400，Pharmacia)，5g BSA(組分V；Sigma)]和100μg/ml變性鮭精DNA的溶液中，在42℃下結(jié)合或雜交，隨后用含有5×SSPE，0.1％ SDS的溶液在42℃下洗滌。
當(dāng)用于核酸雜交時，高嚴(yán)格條件包括相當(dāng)于下列的條件當(dāng)使用長度約為500個核苷酸的探針時，在含有5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/lNaH2PO4×H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH調(diào)節(jié)為7.4)，0.5％SDS，5×Denhardt′s試劑和100μg/mi變性鮭精DNA的溶液中，在42℃下結(jié)合或雜交，隨后用含有0.1×SSPE，1.0％SDS的溶液在42℃下洗滌。
眾所周知，可以使用大量相當(dāng)?shù)臈l件，包括低嚴(yán)格條件；要考慮許多因素，如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)，和靶標(biāo)的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中或固定，等等)，以及鹽和其它成分的濃度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在與否)，雜交溶液可以不同，產(chǎn)生不同于但是相當(dāng)于上述條件的低嚴(yán)格雜交條件。另外，本領(lǐng)域知道在高嚴(yán)格條件下促進雜交的條件(例如，提高雜交溫度和/或增加洗滌步驟，在雜交溶液中使用甲酰胺等)。
當(dāng)用于雙鏈核酸序列，如cDNA或基因組克隆時，術(shù)語“基本同源的”是指在如上所述的低到高嚴(yán)格條件下能夠與雙鏈核酸序列的任一條鏈或兩條鏈雜交的任何探針。
當(dāng)用于單鏈核酸序列時，術(shù)語“基本同源的”是指在如上所述的低到高嚴(yán)格條件下能夠與單鏈核酸序列雜交(即互補)的任何探針。
術(shù)語“雜交”是指互補核酸的配對。雜交和雜交強度(即核酸之間結(jié)合的強度)受如下因素影響核酸之間的互補程度，有關(guān)條件的嚴(yán)格性，形成的雜種的Tm，核酸內(nèi)的G∶C比。在結(jié)構(gòu)內(nèi)含有互補核酸配對的單個分子被稱為是“自雜交的”。
術(shù)語“Tm”是指核酸的“解鏈溫度”。解鏈溫度是一群雙鏈核酸分子有一半解離為單鏈時的溫度。計算核酸Tm的公式在本領(lǐng)域公知。如標(biāo)準(zhǔn)參照所示，當(dāng)一種核酸在1M NaCl的水溶液中時，對Tm值的簡單估計可以用下列公式計算Tm＝81.5+0.41(％G+C)(參見，例如Anderson和Young，“定量過濾雜交”(1985)《核酸雜交》(Nucleic AcidHybridization)。計算Tm的其它參考包括考慮結(jié)構(gòu)以及序列特征的更復(fù)雜的計算。
如此處所用的術(shù)語“嚴(yán)格性”是指溫度、離子強度和其它化合物(如有機溶劑)的存在等條件，在此條件下進行核酸雜交。在“高嚴(yán)格”條件下，核酸堿基配對將只在含有高頻率互補堿基序列的核酸片段之間發(fā)生。因此，來源于遺傳多樣性生物的核酸通常需要“低”嚴(yán)格條件，因為互補序列的頻率通常較低。
“擴增”是與模板特異性有關(guān)的核酸復(fù)制的一種特殊情況。它與非特異性模板復(fù)制(即，依賴于模板但是不依賴于特異模板的復(fù)制)完全不同。模板特異性在此不同于復(fù)制的保真度(即，適當(dāng)多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖或脫氧核糖)的特異性。模板特異性常常用“靶”特異性描述。靶序列是設(shè)法從其它核酸中選出的“靶標(biāo)”。擴增技術(shù)主要用于這種分選。
模板特異性在大多數(shù)擴增技術(shù)中通過酶的選擇實現(xiàn)。擴增酶是在使用條件下只處理異源核酸混合物中的特定核酸序列的酶。例如，對于 復(fù)制酶，MDV-1 RNA是該復(fù)制酶的特異模板(Kacian等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，693038)。其它核酸不被這種擴增酶復(fù)制。類似地，對于T7 RNA聚合酶，這種擴增酶具有對其自身啟動子的嚴(yán)格特異性(chamberlin等人(1970)Nature，228227)。對于T4 DNA連接酶，該酶不連接兩個寡核苷酸或多核苷酸，在連接點處在寡核苷酸或多核苷酸底物與模板之間有一個錯配(Wu和Wallace(1989)Genomics，4560)。最后，發(fā)現(xiàn)Taq和Pfu聚合酶由于在高溫下起作用的能力，顯示對引物結(jié)合的因而限定的序列有高特異性；高溫導(dǎo)致有利于引物與靶序列雜交而不與非靶序列雜交的熱力學(xué)條件(H.A.Erlich(編著)(1989)《PCR技術(shù)》Stockton Press)。
術(shù)語“可擴增的核酸”是指可以用任何擴增方法擴增的核酸。預(yù)期“可擴增的核酸”通常包括“樣品模板”。
術(shù)語“樣品模板”是指來自于一種樣品的核酸，分析其中是否存在“靶標(biāo)”(下文定義)。相反，“背景模板”是指樣品模板之外的核酸，在樣品中可能存在或者不存在。背景模板大多是由疏忽引起的?？赡苁寝D(zhuǎn)移(carryover)的結(jié)果，或者可能是由于存在試圖從樣品中純化掉的核酸污染物。例如，來自生物的不可檢測的核酸可能作為背景存在于待測樣品中。
術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，無論它在純化的限制酶消化物中自然存在還是合成產(chǎn)生，當(dāng)置于可誘導(dǎo)與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時(即，在核苷酸和誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶存在下，在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H時)，都能夠作為合成的起點。為達到最高擴增效率，引物優(yōu)選的是單鏈，但是也可以是雙鏈。如果是雙鏈，在用來制備延伸產(chǎn)物之前，首先處理引物，分開雙鏈。優(yōu)選地，引物是一種寡脫氧核苷酸。引物必須足夠長才能在誘導(dǎo)劑的存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度取決于許多因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。
術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCR”)是指K.B.Mullis的美國專利號4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，其中描述了不需克隆或純化，提高基因組DNA混合物中靶序列片段濃度的一種方法。這種擴增靶序列的方法包括向含有希望的靶序列的DNA混合物中加入大大過量的兩種寡核苷酸引物，隨后在DNA聚合酶存在下進行順序精確的熱循環(huán)。兩種引物與雙鏈靶序列的對應(yīng)鏈互補。為了實現(xiàn)擴增，變性混合物，然后引物與靶分子內(nèi)的互補序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物，形成新的一對互補鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟能夠重復(fù)多次(即，變性、退火和延伸組成一個“循環(huán)”；可以是多個“循環(huán)”)，以獲得希望的靶序列的高濃度擴增片段。希望的靶序列的擴增片段的長度取決于引物彼此的相對位置，因此，該長度是一個可控參數(shù)。由于該方法是重復(fù)的，該方法被稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”(下文稱“PCR”)。由于希望的靶序列的擴增片段成為混合物中的優(yōu)勢序列(在濃度方面)，它們被稱為“PCR擴增的”。
通過PCR能夠?qū)⒒蚪MDNA中一個拷貝的特異靶序列擴增到用幾種不同的方法都能檢測的水平(例如與標(biāo)記探針雜交；摻入生物素化引物，隨后進行親和素-酶偶聯(lián)物檢測；向擴增的片段中摻入32P-標(biāo)記的脫氧核苷酸三磷酸如dCTP或dATP)。除了基因組DNA之外，用適當(dāng)?shù)囊锓肿咏M能夠擴增任何寡核苷酸或多核苷酸序列。具體而言，PCR方法產(chǎn)生的擴增片段本身就是隨后的PCR擴增的有效模板。
術(shù)語“PCR產(chǎn)物”、“PCR片段”和“擴增產(chǎn)物”是指在完成兩個或多個循環(huán)的變性、退火和延伸的PCR步驟后獲得的化合物的混合物。這些術(shù)語包括擴增一個或多個靶序列的一個或多個片段的情況。
術(shù)語“擴增試劑”是指除了引物、核酸模板和擴增酶之外，擴增所需的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩沖液等)。擴增試劑以及其它反應(yīng)成分一般都置于或包含于一個反應(yīng)容器中(試管、微孔等)。
術(shù)語“反轉(zhuǎn)錄酶”或“RT-PCR”是指初始材料是mRNA的PCR類型。使用一種反轉(zhuǎn)錄酶，將初始mRNA酶促轉(zhuǎn)化為互補DNA或“cDNA”。然后該cDNA作為“PCR”反應(yīng)的“模板”。
術(shù)語“基因表達”是指一種基因內(nèi)編碼的遺傳信息通過基因“轉(zhuǎn)錄”(即通過RNA聚合酶的酶促作用)轉(zhuǎn)化為RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)和通過mRNA“翻譯”轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_能夠在該過程的多個階段調(diào)節(jié)。“正調(diào)節(jié)”或“激活”是指提高基因表達產(chǎn)物(例如RNA或蛋白質(zhì))產(chǎn)量的調(diào)節(jié)，而“負調(diào)節(jié)”或“抑制”是指降低產(chǎn)量的調(diào)節(jié)。參與正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)的分子(例如轉(zhuǎn)錄因子)通常分別被稱為“激活劑”和“抑制劑”。
術(shù)語“有效組合”、“有效順序”和“有效連接”是指核酸序列以一種方式連接，致使產(chǎn)生能夠指導(dǎo)特定基因轉(zhuǎn)錄和/或希望的蛋白質(zhì)分子合成的核酸分子。該術(shù)語也指氨基酸序列以這種方式連接，致使產(chǎn)生一種功能蛋白質(zhì)。
術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”是指控制核酸序列表達的某些方面的遺傳元件。例如，啟動子是促進有效連接的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)元件。其它調(diào)節(jié)元件包括剪接信號、聚腺苷酸化信號、終止信號等。
真核生物中的轉(zhuǎn)錄控制信號包括“啟動子”和“增強子”元件。啟動子和增強子由可與參與轉(zhuǎn)錄的細胞蛋白質(zhì)特異相互作用的DNA序列短陣列組成(Maniatis等人，Science 2361237，1987)。啟動子和增強子元件已經(jīng)從多種真核生物來源中分離，包括酵母、昆蟲、哺乳動物和植物細胞的基因。啟動子和增強子元件也已經(jīng)從病毒中分離，類似的控制元件，如啟動子，也在原核生物中發(fā)現(xiàn)。具體的啟動子和增強子的選擇取決于用來表達目的蛋白的細胞型。一些真核啟動子和增強子有寬宿主范圍，而其它的在有限的細胞型亞類中有功能(綜述參見Voss等人，Trends Biochem.Sci.，11287，1986；Maniatis等人，同上1987)。
如此處所用的術(shù)語“啟動子元件”、“啟動子”或“啟動子序列”是指位于DNA聚合物的蛋白質(zhì)編碼區(qū)5’端(即之前)的DNA序列。自然界已知的大多數(shù)啟動子的位置在轉(zhuǎn)錄區(qū)之前。啟動子作為一個開關(guān)，激活基因的表達。如果基因被激活，即說是被轉(zhuǎn)錄或參與轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄包括由基因合成mRNA。因此，啟動子作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，也提供基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的起始位點。
啟動子可以是組織特異的或是細胞特異的。術(shù)語“組織特異的”在用于啟動子時是指一種啟動子，它能夠在目的核苷酸序列在不同組織類型(例如葉)中相對不表達的的下，使同一目的核苷酸序列的選擇性表達定向于一種特定組織類型(例如種子)中。啟動子的組織特異性可以如下評價，例如一種報道基因與啟動子序列有效連接，產(chǎn)生報道構(gòu)建體，將該報道構(gòu)建體導(dǎo)入一種植物的基因組中，使得該報道構(gòu)建體整合到獲得的轉(zhuǎn)基因植物的每種組織中，檢測該報道基因在該轉(zhuǎn)基因植物的不同組織中的表達(例如檢測mRNA、蛋白質(zhì)或該報道基因編碼的蛋白質(zhì)的活性)。檢測到該報道基因在一種或多種組織中的表達水平高于該報道基因在其它組織中的表達水平，表明該啟動子對于檢測到表達水平較高的組織是特異的。術(shù)語“細胞型特異的”當(dāng)用于啟動子時是指一種啟動子，它能夠在目的核苷酸序列在同一組織內(nèi)不同細胞型中相對不表達的情況下，使同一目的核苷酸序列的選擇性表達定向于一種特定細胞型。術(shù)語“細胞型特異的”當(dāng)用于啟動子時也指能夠促進目的核苷酸序列在一種組織內(nèi)的一個區(qū)域中選擇性表達的一種啟動子。啟動子的細胞型特異性可以用本領(lǐng)域公知的方法評價，例如免疫組化染色。簡言之，將組織切片包埋于石蠟中，石蠟切片與第一抗體反應(yīng)，該抗體對于該啟動子控制表達的目的核苷酸序列編碼的多肽產(chǎn)物是特異的。使標(biāo)記的(例如過氧化物酶偶聯(lián)的)第一抗體特異的第二抗體結(jié)合切片的組織，用顯微鏡檢查特異性結(jié)合(例如使用親和素/生物素)。
啟動子可以是組成型或是調(diào)節(jié)型的。術(shù)語“組成型”當(dāng)用于啟動子時是指該啟動子在沒有刺激(例如熱休克、化學(xué)物質(zhì)、光線等)的情況下能夠引導(dǎo)有效連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。組成型啟動子一般能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因基本上在所有細胞和所有組織中表達。典型的組成型植物啟動子包括但不限于SD花椰菜花葉病毒(CaMV SD；參見，例如美國專利號5,352,605，在此引用作為參考)，甘露氨酸合酶，章魚氨酸合酶(ocs)，超啟動子(參見，例如WO95/14098)和ubi3(參見，例如Garbarino和Beiknap(1994)Plant Mol.Bioi.24119-127)啟動子。這些啟動子已經(jīng)成功地用于引導(dǎo)異源核酸序列在轉(zhuǎn)化的植物組織中表達。
相反，“調(diào)節(jié)型”啟動子能夠在刺激(例如熱休克、化學(xué)物質(zhì)、光線等)存在下引導(dǎo)有效連接的核酸序列的一定水平的轉(zhuǎn)錄，這不同于有效連接的核酸序列在沒有刺激的情況下的轉(zhuǎn)錄水平。
增強子和/或啟動子可以是“內(nèi)源的”或“外源的”或“異源的”?！皟?nèi)源的”增強子或啟動子與基因組中的一種特定基因自然連接?！巴庠吹摹被颉爱愒吹摹痹鰪娮踊騿幼油ㄟ^遺傳操作(即分子生物學(xué)技術(shù))與一種基因并列，使得該基因的轉(zhuǎn)錄由連接的增強子或啟動子指導(dǎo)。例如，與第一種基因有效組合的一種內(nèi)源啟動子能夠分離、提取，并與第二種基因有效組合，從而使得“異源啟動子”與第二種基因有效組合。預(yù)期有多種這樣的組合(例如，第一種和第二種基因能夠來自同一個種，或者來自不同的種)。
表達載體上“剪接信號”的存在常常導(dǎo)致重組轉(zhuǎn)錄物在真核宿主細胞中的較高水平的表達。剪接信號介導(dǎo)從一級RNA轉(zhuǎn)錄物上去除內(nèi)含子，由一個剪接供體和接受位點組成(Sambrook等人(1989)《分子克隆實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，pp.16.7-16.8)。常用的剪接供體和接受位點是來自SV40的16S RNA的剪接點。
重組DNA序列在真核細胞中的高效表達需要表達引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物有效終止和聚腺苷酸化的信號。轉(zhuǎn)錄終止信號通常在聚腺苷酸化信號下游發(fā)現(xiàn)，長度為幾百個核苷酸。如此處所用的術(shù)語“poly(A)位點”或“poly(A)序列”是指引導(dǎo)新生RNA轉(zhuǎn)錄物終止和聚腺苷酸化的DNA序列。重組轉(zhuǎn)錄物的有效聚腺苷酸化是希望的，因為缺乏poly(A)尾的轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定，且快速降解。表達載體使用的poly(A)信號可以是“異源的”或“內(nèi)源的”。內(nèi)源poly(A)信號在基因組中特定基因編碼區(qū)的3’端自然發(fā)現(xiàn)。異源poly(A)信號分離自一種基因，位于另一種基因的3’。常用的異源poly(A)信號是SV40 poly(A)信號。SV40 poly(A)信號包含于237bp的BamHI/BclI限制酶切片段上，引導(dǎo)終止和聚腺苷酸化(Sambrook，同上，16.6-16.7)。
術(shù)語“選擇性標(biāo)記”是指一種基因，它編碼一種酶，該酶具有使表達該選擇性標(biāo)記的細胞具有抗生素或藥物抗性或者使得能夠檢測的性狀(例如發(fā)光或熒光)表達的活性。選擇性標(biāo)記可以是“正”或“負”的。正選擇性標(biāo)記的例子包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因，它提供G418和卡那霉素抗性，和細菌潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hyg)，它提供抗生素潮霉素抗性。負選擇性標(biāo)記編碼一種酶活性，當(dāng)在適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其表達對細胞具有細胞毒性。例如，HSV-tk基因常常用作負選擇性標(biāo)記。在更昔洛韋或阿昔洛韋存在下，HSV-tk基因在培養(yǎng)的細胞中的表達具有細胞毒性，因此，細胞在含有更昔洛韋或阿昔洛韋的選擇性培養(yǎng)基中生長可選擇能夠表達功能HSV TK酶的細胞。
術(shù)語“載體”是指從一個細胞向另一個細胞轉(zhuǎn)移DNA片段的核酸分子。術(shù)語“載體(vehicle)”有時與“載體(vector)”互換使用。
術(shù)語“表達載體”或“表達盒”是指一種重組DNA分子，其含有希望的編碼序列，和有效連接的編碼序列在特定宿主生物中表達所需的適當(dāng)核酸序列。在原核生物中表達所必需的核酸序列通常包括啟動子、操縱基因(任選的)和核糖體結(jié)合位點，常常還有其它序列。已知真核細胞使用啟動子、增強子和終止及聚腺苷酸化信號。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指外源DNA向細胞內(nèi)的導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染可以用本領(lǐng)域公知的多種方法實現(xiàn)，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、多聚季胺(polybrene)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、玻璃珠、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、病毒感染、biolistics(例如顆粒轟擊)等。
術(shù)語“感染的”和“感染”在用于細菌時是指靶生物樣品(例如細胞、組織等)與該細菌在一定條件下共溫育，使得細菌所含的核酸序列導(dǎo)入靶生物樣品的一個或多個細胞中。
術(shù)語“農(nóng)桿菌”是指一種土壤攜帶的革蘭氏陰性桿狀植物致病菌，其導(dǎo)致冠癭病。術(shù)語“農(nóng)桿菌”包括但不限于下列菌株根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(一般在感染的植物中引起冠癭病)，和毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogens)(在感染的宿主植物中引起毛根病)。植物細胞感染農(nóng)桿菌通常導(dǎo)致感染的細胞產(chǎn)生冠癭氨基酸(例如胭脂氨酸、農(nóng)桿氨酸、章魚氨酸等)。因此，導(dǎo)致產(chǎn)生胭脂氨酸的農(nóng)桿菌株(例如LBA4301、C58、A208、GV3101株)被稱為“胭脂氨酸型”農(nóng)桿菌；導(dǎo)致產(chǎn)生章魚氨酸的農(nóng)桿菌株(例如LBA4404、Ach5、B6株)被稱為“章魚氨酸型”農(nóng)桿菌；導(dǎo)致產(chǎn)生農(nóng)桿氨酸的農(nóng)桿菌株(例如EHA105、EHA101、A281株)被稱為“農(nóng)桿氨酸型”農(nóng)桿菌。
術(shù)語“轟擊”和“biolistic轟擊”是指為了實現(xiàn)靶生物樣品中細胞細胞膜的創(chuàng)傷，和/或使顆粒進入靶生物樣品內(nèi)，向靶生物樣品(例如細胞、組織等)加速顆粒的方法。biolistic轟擊方法在本領(lǐng)域公知(例如美國專利號5,584,807，其內(nèi)容在此引用作為參考)，可以商品獲得(例如，氦氣驅(qū)動的微粒加速器(PDS-1000/He，BioRad)。
術(shù)語“顯微創(chuàng)傷”當(dāng)用于植物組織時是指向組織中引入顯微鏡下可見的創(chuàng)傷。例如，顯微創(chuàng)傷可以用此處所述的顆粒轟擊實現(xiàn)。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”當(dāng)用于植物或果實或種子時(即“轉(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)基因果實”或“轉(zhuǎn)基因種子”)，是指在其一種或多種細胞中至少含有一種異源基因的植物或果實或種子。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物材料”泛指在一種或多種細胞中至少含有一種異源基因的植物、植物結(jié)構(gòu)、植物組織、植物種子或植物細胞。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化子”或“轉(zhuǎn)化的細胞”包括轉(zhuǎn)化的初級細胞和來自這些細胞的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的數(shù)量。由于有意的或無意的突變，所有后代在DNA含量上可能不會完全相同。轉(zhuǎn)化子的定義中包括與在最初的轉(zhuǎn)化細胞中篩選的具有相同功能性的突變后代。
術(shù)語“野生型”當(dāng)用于基因時是指一種基因，其具有從天然存在的來源中分離的基因的特征。術(shù)語“野生型”當(dāng)用于基因產(chǎn)物時是指一種基因產(chǎn)物，其具有從天然存在的來源中分離的基因產(chǎn)物的特征。野生型基因是在群體中最常發(fā)現(xiàn)的基因，因而隨意命名為基因的“正?！被颉耙吧汀毙问?。相反，術(shù)語“修飾的”或“突變的”當(dāng)用于基因或基因產(chǎn)物時分別是指一種基因或基因產(chǎn)物，與野生型基因或基因產(chǎn)物相比，其顯示序列和/或功能性質(zhì)的修飾(即改變的特征)。應(yīng)當(dāng)指出，能夠分離天然存在的突變體；它們根據(jù)以下事實鑒定與野生型基因或基因產(chǎn)物相比，它們具有改變的特征。
術(shù)語“反義”是指一種脫氧核糖核苷酸序列，與DNA雙鏈體有義鏈的脫氧核糖核苷酸殘基序列相比，其脫氧核糖核苷酸殘基序列為相反的5’-3’方向。DNA雙鏈體的“有義鏈”是指DNA雙鏈體中的一條鏈，它被自然狀態(tài)的細胞轉(zhuǎn)錄為“有義mRNA”。因此“反義”序列是與DNA雙鏈體的非編碼鏈具有相同序列的序列。術(shù)語“反義RNA”是指一種RNA轉(zhuǎn)錄物，它與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或一部分互補，通過干擾初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的加工、轉(zhuǎn)運和/或翻譯阻斷靶基因的表達。反義RNA可以與具體的基因轉(zhuǎn)錄物的任一部分互補，即，5’非編碼序列、3’非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列。另外，如此處所用的，反義RNA可能含有提高反義RNA阻斷基因表達的效能的核酶序列區(qū)?！昂嗣浮笔侵敢环N催化性的RNA，包括序列特異的內(nèi)切核糖核酸酶?！胺戳x抑制”是指能夠阻止靶蛋白質(zhì)表達的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。
術(shù)語“siRNAs”是指短干擾RNAs。在有些實施方案中，siRNAs含有長約18-25個核苷酸的雙鏈體或雙鏈區(qū)；siRNAs在每條鏈的3’端通常含有約2個到約4個未配對的核苷酸。siRNA的雙鏈體或雙鏈區(qū)的至少一條鏈與靶RNA分子基本上同源或基本上互補。與靶RNA分子互補的鏈?zhǔn)恰胺戳x鏈”；與靶RNA分子同源的鏈?zhǔn)恰坝辛x鏈”，也與siRNA反義鏈互補。siRNAs也可含有其它序列；這些序列的非限制性例子包括連接雙鏈的兩條鏈的連接序列或環(huán)，以及可能存在于連接序列內(nèi)的莖和其它折疊結(jié)構(gòu)。siRNAs似乎作為在無脊椎動物和脊椎動物中引發(fā)RNA干擾以及在植物的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程中引發(fā)序列特異的RNA降解的關(guān)鍵中間物。
術(shù)語“靶RNA分子”是指一種RNA分子，siRNA的短雙鏈區(qū)的至少一條鏈與它同源或互補。一般而言，當(dāng)這種同源性或互補性約為100％時，siRNA能夠沉默或抑制靶RNA分子的表達。盡管可以認為加工的mRNA是siRNA的靶標(biāo)，但是本發(fā)明不限于任何具體的假說，這些假說不是實施本發(fā)明所必需的。因此，預(yù)期其它RNA分子也可能是siRNA的靶標(biāo)。這些靶標(biāo)包括未加工的mRNA、核糖體RNA和病毒RNA基因組。
術(shù)語“RNA干涉”或“RNAi”是指siRNAs引起的基因表達沉默或降低。它是動物和植物中序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程，由雙鏈區(qū)中與沉默的基因序列同源的siRNA啟動。該基因?qū)τ谠撋锒钥梢允莾?nèi)源或外源的，整合到染色體內(nèi)或存在于未整合到基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)染載體中。該基因的表達被完全或部分抑制。也可以認為RNAi抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全的或部分的。
術(shù)語“轉(zhuǎn)錄后基因沉默”或“PTGS”是指轉(zhuǎn)錄后植物中基因表達的沉默，似乎包括由基因重復(fù)片段合成的mRNA的特異降解。
術(shù)語“過量表達”是指轉(zhuǎn)基因生物中一種基因產(chǎn)物的產(chǎn)量超過了正常的或未轉(zhuǎn)化的生物的產(chǎn)量水平。術(shù)語“共抑制”是指與一種內(nèi)源基因基本同源的一種外源基因的表達，導(dǎo)致該外源基因和內(nèi)源基因的表達均受到抑制。術(shù)語“改變的水平”是指轉(zhuǎn)基因生物中基因產(chǎn)物的產(chǎn)量或比例不同于正常的或未轉(zhuǎn)化的生物。
術(shù)語“重組的”當(dāng)用于核酸分子時是指由通過分子生物學(xué)技術(shù)連接在一起的核酸片段組成的核酸分子。術(shù)語“重組的”當(dāng)用于蛋白質(zhì)或多肽時是指使用重組核酸分子表達的蛋白質(zhì)分子。
術(shù)語“Southern印跡分析”和“Southern印跡法”和“Southern”是指在瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠上對DNA的分析，其中DNA根據(jù)大小分離或破碎，隨后將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固體載體上，如硝酸纖維素或尼龍膜上。固定的DNA然后暴露于標(biāo)記探針，檢測與所用探針互補的DNA種。DNA在電泳之前可以用限制性內(nèi)切酶酶切。電泳后，在轉(zhuǎn)移到固體載體之前或過程中，DNA可以部分去嘌呤和變性。Southern印跡法是分子生物學(xué)家的一種標(biāo)準(zhǔn)方法(J.Sambrook等人(1989)《分子克隆實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Press，NY，pp9.31-9.58)。
如此處所用的術(shù)語“Northern印跡分析”和“Northern印跡法”和“Northern”是指通過RNA在瓊脂糖凝膠上電泳對RNA的分析，以根據(jù)大小分級分離RNA，隨后將RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固體載體上，如硝酸纖維素或尼龍膜上。固定的RNA然后用一種標(biāo)記探針雜交，檢測與所用探針互補的RNA種。Northern印跡法是分子生物學(xué)家的一種標(biāo)準(zhǔn)方法(J.Sambrook，等人(1989)同上，pp 7.39-7.52)。
術(shù)語“Western印跡分析”和“Western印跡法“和“Western”是指對固定于載體(如硝酸纖維素或膜)上的蛋白質(zhì)(或多肽)的分析。至少含有一種蛋白質(zhì)的混合物首先在丙烯酰胺凝膠上分離，然后將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固體載體上，如硝酸纖維素或尼龍膜上。固定的蛋白質(zhì)暴露于與至少一種目的抗原有反應(yīng)性的至少一種抗體。結(jié)合的抗體可以用多種方法檢測，包括使用放射性標(biāo)記的抗體。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”是指含有通過肽鍵連接的氨基酸的化合物，可以互換使用。
如此處使用的，當(dāng)“氨基酸序列”在此是指一種蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時，“氨基酸序列”等，如“多肽”或“蛋白質(zhì)”，不是將氨基酸序列限于與所述蛋白質(zhì)分子有關(guān)的完整的原始氨基酸序列；而且，“氨基酸序列”也能夠由編碼蛋白質(zhì)的核酸序列推斷而來。
術(shù)語“部分”當(dāng)用于蛋白質(zhì)時(“特定蛋白質(zhì)的一部分”)是指該蛋白質(zhì)的片段。片段的大小可以是4個氨基酸殘基到完整的氨基酸序列減一個氨基酸。
術(shù)語“同源性”當(dāng)用于氨基酸時是指相似性或同一性的程度?？梢允遣糠滞葱曰蛲耆葱?即同一性)?！靶蛄型恍浴笔侵竷煞N或多種蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性的一個量度，表示為相對于總對比長度的百分比。同一性的計算考慮在相應(yīng)的較大序列中相同和位于相同相對位置的氨基酸殘基。同一性的計算可以用計算機程序所含的算法進行。
術(shù)語“分離的”當(dāng)用于核酸時，如“分離的寡核苷酸”，是指一種核酸序列，它從通常在自然來源中與之結(jié)合的至少一種污染核酸序列中鑒定并分離。分離的核酸以不同于自然中的形式或狀態(tài)存在。相反，未分離的核酸，如DNA和RNA，發(fā)現(xiàn)是自然中存在的狀態(tài)。例如，發(fā)現(xiàn)一種具體DNA序列(例如基因)在宿主細胞染色體上靠近鄰近的基因；RNA序列，如編碼一種具體蛋白質(zhì)的具體mRNA序列，發(fā)現(xiàn)在細胞中是含有編碼多種蛋白質(zhì)的大量其它mRNA的混合物。然而，分離的編碼植物CPA-FAS的核酸包括，例如，在細胞中通常表達DES的核酸，其中核酸的染色體位置不同于自然細胞，或者其側(cè)翼為與自然形式不同的核酸序列。分離的核酸或寡核苷酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)利用分離的核酸或寡核苷酸表達蛋白質(zhì)時，寡核苷酸最少將含有有義鏈或編碼鏈(即可能是單鏈的寡核苷酸)，但是也可含有有義鏈和反義鏈兩者(即可以是雙鏈的寡核苷酸)。
術(shù)語“純化的”是指從自然環(huán)境中分離或分開的核酸或氨基酸序列分子?！胺蛛x的核苷酸序列”因此是純化的核酸序列。“基本純化的”分子至少60％不含、優(yōu)選地至少70％不含、更優(yōu)選地至少90％不含自然結(jié)合的其它成分。術(shù)語“純化的”或“純化”也指從樣品中除去污染物。污染蛋白質(zhì)的去除導(dǎo)致樣品中目的多肽的百分比提高。在另一個實施例中，重組多肽在植物、細菌、酵母或哺乳動物宿主細胞中表達，通過了除去宿主細胞蛋白質(zhì)純化該多肽；樣品中重組多肽的百分比因而提高。
術(shù)語“樣品”最廣義地使用。一層意思是指一種植物細胞或組織。另一層意思包括從任何來源獲得的標(biāo)本或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣品。生物樣品可以從植物或動物(包括人)中獲得，包括液體、固體、組織和氣體。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料，如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品。這些例子不能被視為限制適用于本發(fā)明的樣品類型。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供含有分離的植物CPA-FAS基因和多肽的組合物，具體而言，提供含有分離的蘋婆和棉花CPA-FAS基因和多肽的組合物。本發(fā)明也提供使用植物CPA-FAS基因、多肽和合酶產(chǎn)物的方法；這些方法包括但不限于環(huán)丙烷脂肪酸生產(chǎn)中的植物CPA-FAS基因和多肽。下面的描述提供了本發(fā)明實施方案的具體但非限制性的說明性實施例。
I.植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因和多肽細菌中CPA-FAs的合成途徑已經(jīng)很好地表征(Grogan和Cronan(1997)Microbiol Molecular Biol Rev 61(4)429-441)。第一種環(huán)丙烷合酶基因根據(jù)它與CPA-FA缺陷突變體互補的能力從大腸桿菌中克隆(Grogan和Cronan(1984)J Bacteriol 158(1)286-295)。清楚地證實，細菌CPA-FAs通過對雙鍵加成一個來自S-腺苷甲硫氨酸的亞甲基由單不飽和脂肪酸直接合成。然而，該酶的底物似乎是酯化為磷脂的單不飽和脂肪酸，最可能是磷脂酰乙醇胺(Grogan和Cronan(1997)Microbiol Molecular Biol Rev 61(4)429-441)。在鑒定細菌環(huán)丙烷合酶后，發(fā)現(xiàn)來自結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的三種基因具有向分枝菌酸上加上一個環(huán)丙烷環(huán)的能力(Yuan和Barry(1996)Proc Nat’l AcadSci USA 93(23)12828-12833；Yuan等人(1995)Proc Nat’l Acad SciUSA 92(14)6630-6634)。
盡管知道植物中存在CPE-FAs至少已經(jīng)幾十年了，但是迄今為止這種具體種類的脂肪酸的生物合成只受到極少的關(guān)注。為了理解CPE-FAs的生物合成，Yano等人((1972)Lipids 735-45)用錦葵科的幾個種進行了體內(nèi)標(biāo)記實驗。作者推斷，CPE-FA合成途徑包括最初由油酸形成二氫蘋婆酸，隨后二氫蘋婆酸去飽和為蘋婆酸，他們假定亞甲基通過S-腺苷甲硫氨酸來源于甲硫氨酸(見圖1)。他們也表示，不可能對蘋婆酸的9，10-三鍵加成亞甲基直接產(chǎn)生蘋婆酸，因為從標(biāo)記實驗中未觀察到[1-14C]硬脂炔酸轉(zhuǎn)化為蘋婆酸。后來，基本上沒有對植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的進一步的研究。
已經(jīng)報告，在臭蘋婆種子中，總CPE-FA水平超過總脂肪酸的68％，也存在少量的二氫蘋婆酸(Badami和Patil(1981)Prog.Lipid Res.19119-153；Christie(1970)《脂類化學(xué)主題》(Topics in LipidChemistry)(Gunstone FD編著；Logos PressLondon)第一卷，1-49頁；Sebedio和Gradgirard(1989)Prog.Lipid Res.28303)。油含量約為其干重的55％，發(fā)育的蘋婆種子似乎是研究CPE-FAs生物合成的理想組織。而且，根據(jù)幾個假設(shè)，推斷蘋婆種子是植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶(CPA-FAS)的良好來源?？梢酝茢嗵O婆酸的生物合成通過一個兩步反應(yīng)發(fā)生，它們由兩種不同的酶催化，即環(huán)丙烷合酶和環(huán)丙烷去飽和酶；這一推斷是根據(jù)體內(nèi)標(biāo)記實驗(Yano等人(1972)Lipids 735-45)和對細菌中環(huán)丙烷合成的了解。也可以推斷，來自蘋婆的環(huán)丙烷合酶與細菌環(huán)丙烷合酶有一定程度的相似性。而且，因為蘋婆種子含有高水平的油，而且該油含有高水平的高CPE-FAs，可以推斷負責(zé)CPE-FAs合成的酶的轉(zhuǎn)錄水平在發(fā)育的種子組織中也適當(dāng)升高。
蘋婆種子含有CPA-FA和CPE-FA合成所需的高水平酶的第一手證據(jù)是根據(jù)發(fā)育的蘋婆種子勻漿的體內(nèi)標(biāo)記研究(參見實施例2)。當(dāng)這些勻漿的樣品與標(biāo)記的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)溫育且脂類產(chǎn)物皂化時，標(biāo)記的游離脂肪酸是皂化產(chǎn)物中的主要成分(大于90％)。當(dāng)用醚重氮甲烷衍化并通過C18反向TLC分離后進行分析時，一個放射性斑點與二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)被同時洗脫。因此，表明來自發(fā)育的臭蘋婆種子的無細胞提取物能夠向油酸酯上添加一個來自S-腺苷甲硫氨酸的標(biāo)記的亞甲基，產(chǎn)生二氫蘋婆酸酯。在植物提取物中的這一反應(yīng)以前未曾報告。其它實驗表明，合成CFA-FA的酶是一種膜結(jié)合的或是一種整合的膜蛋白，油酰磷脂酰膽堿是該酶的底物。因此，這些結(jié)果表明，合成CPA-FA的酶是具有類似于大腸桿菌CPA-FAS的某些特征的CPA-FAS。
根據(jù)這一證據(jù)，發(fā)展了鑒定植物CPA-FAS的策略。該策略開始于觀察植物組織中CPA-FAs或CPE-FAs的存在。下一步是組織勻漿的標(biāo)記研究，以證實組織中實際存在合成CPA-FAs和/或CPE-FAs的能力。下一步是利用由優(yōu)選地相對高水平地合成環(huán)丙烷脂肪酸的組織(對于蘋婆而言是發(fā)育的種子)制備的cDNA文庫，獲得大量種子特異的EST。對于蘋婆，分析發(fā)育的種子的脂肪酸譜，確定CPE-FAs以最高速度積累時的發(fā)育階段；然后用此發(fā)育階段獲得的種子制備cDNA文庫。對最早一組克隆的第一個小亞組(約10％)測序，由此獲得平均閱讀長度約為500bp的更小亞組(約7％)。BLAST搜索這一更小亞組，發(fā)現(xiàn)并選擇豐富的序列(對于蘋婆cDNA文庫，代表約30％的克隆)，然后從剩余的克隆中扣除。然后對扣除后的克隆測序，選擇平均閱讀長度為500bp的第二亞組。它們也進行BLAST搜索，產(chǎn)生更小的一組EST，它們顯示與細菌環(huán)丙烷合酶有一定程度的相似性。然后編譯這些EST序列，鑒定至少一種推斷的植物CPA-FAS。
然后，由重疊的克隆編譯至少一種編碼推斷的植物CPA-FAS的完整cDNA克隆，用來證實編碼的序列是一種植物CPA-FAS。證實的方法是該克隆在體外或體內(nèi)系統(tǒng)中表達，使得CPA-FAs只在克隆表達后產(chǎn)生，或者只在克隆表達后產(chǎn)生含量提高的CPA-FAs。優(yōu)選地，該系統(tǒng)是體內(nèi)系統(tǒng)，該克隆轉(zhuǎn)染一種宿主生物并在其中表達。更優(yōu)選地，該系統(tǒng)通常不產(chǎn)生CPA-FAs，如當(dāng)宿主生物是酵母株時。再更優(yōu)選地，該系統(tǒng)具有合適的底物，如油酸，能夠耐受異常脂肪酸的存在，如當(dāng)宿主生物是培養(yǎng)的煙草細胞時。
該策略用于發(fā)育蘋婆種子，如實施例所述，并且鑒定來自同一基因的23種EST，發(fā)現(xiàn)它們與細菌環(huán)丙烷合酶有一定的相似性；這些EST沿基因的分布如圖3所示。該基因的相對轉(zhuǎn)錄物豐度為0.36％，這與蘋婆種子中68％的CPE-FA含量一致。一種全長克隆由含有SEQID NO1的EST裝配而成(如圖4所示)。預(yù)測的蛋白質(zhì)長度為864個氨基酸(SEQ 1D NO2，如圖5所示)。因此，該蛋白質(zhì)比大腸桿菌CPA-FAS大約長470個氨基酸。蘋婆CPA-FAS與大腸桿菌序列在重疊區(qū)(即羧基端)有49％相似或32％相同。因此蘋婆CPA-FAS在氨基端還含有約470個氨基酸。
植物CPA-FAS在酵母和煙草懸浮細胞中的表達導(dǎo)致在這兩個系統(tǒng)中合成二氫蘋婆酸，特別是在煙草細胞中，其中CPA-FA的含量高達總脂肪酸的6.3％。[1-14C]油酸和L-[甲基-14C]甲硫氨酸產(chǎn)生的放射性有效摻入轉(zhuǎn)基因煙草細胞中的二氫蘋婆酸內(nèi)(見實施例3)。這些標(biāo)記結(jié)果表明，二氫蘋婆酸的生物合成是向油酸雙鍵上加成一個亞甲基。該亞甲基來源于甲硫氨酸，最可能的是S-腺苷甲硫氨酸?？傊?，這些數(shù)據(jù)清楚地證實，鑒定的蘋婆基因編碼一種起環(huán)丙烷合酶作用的蛋白質(zhì)。
盡管了解機制對于實施本發(fā)明不是必需的，本發(fā)明也并非限于任何具體機制，下列關(guān)于CPA-FAS及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和提出的及假定的功能的討論可進一步了解新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)。到目前為止，來自大腸桿菌的一種環(huán)丙烷合酶(Wang等人(1992)Biochem 31(45)11020-11028)和來自分枝桿菌的三種(cmal、cma2和mma2)密切相關(guān)的酶(George等人(1995)J Biol Chem 270(45)27292-27298；Yuan和Barry(1995)Proc Nat′l Acad Sci USA 92(14)6630-6634)已經(jīng)在功能上證實催化亞甲基從S-腺苷-L-甲硫氨酸向某些脂肪酸的雙鍵的轉(zhuǎn)移。此處報告的蘋婆CPA-FAS是從植物中分離的這一類的第一種酶。分枝桿菌的另一組基因(mma1、mma3和mma4)也與大腸桿菌CFA合酶高度同源。但是這些酶將雙鍵轉(zhuǎn)化為幾種結(jié)構(gòu)之一(Yuan等人(1997)J.Biol.Chem.27210041-10049)，即α-甲基-分支的反式-烯烴-CH(CH3)CHCH-(mmas-1)或α-羥基-甲基(mmas-4)-CH(OH)CH(CH3)-。通過向羥基氧原子而不是向不飽和碳原子上加成另一個亞甲基，α-羥甲基結(jié)構(gòu)能夠被轉(zhuǎn)化為α-甲氧基甲基——CH(OCH3)CH(CH3)-。此外，10-甲基硬脂酸或結(jié)核硬脂酸是分枝桿菌的一種眾所周知的脂肪酸，是由10-亞甲基硬脂酸中間物產(chǎn)生的。Grogan和Cronan(1997，Microbiol.Mol.Biol.Rev.61429-441)描述了這些反應(yīng)的機制相似性。這在化學(xué)水平上易于理解，因為添加來自S-腺苷甲硫氨酸的甲基形成的中間物碳正離子能夠容易地再排列，使得活性部位構(gòu)型的微小改變能夠?qū)е庐a(chǎn)物的不同結(jié)構(gòu)。
蘋婆CPA-FAS與其它CPA-FAS和有關(guān)甲氧基分枝菌酸合酶的氨基酸序列的對比在圖10(A)中顯示。所有細菌氨基酸序列都大約是蘋婆環(huán)丙烷合酶大小的一半，與蘋婆基因的羧基端有顯著的相似性。提出的S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合基序(氨基酸殘基171-179，使用大腸桿菌編號，蘋婆酶中的氨基酸殘基627-635)和在催化上重要的半胱氨酸354(蘋婆酶中的氨基酸殘基822)在所有蛋白質(zhì)中絕對保守。圖10(B)顯示這些酶之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。蘋婆和大腸桿菌酶彼此之間比來自分枝桿菌的酶更加密切相關(guān)，可能反映這兩種酶都作用于酯化為磷脂的單不飽和脂肪酸這一事實(Ohlrogge等人(1976)Biochim.Biophys.Acta 431257-267)。然而，高度相關(guān)的一組微生物基因編碼添加亞甲基的一系列不同脂肪酸合酶的事實提示，植物CPA-FAS基因能夠被修飾，產(chǎn)生相同的產(chǎn)物多樣性，從而提高其效用。
蘋婆CPA-FAS多肽的氨基端部分(氨基酸1-438)是蘋婆環(huán)丙烷合酶特有的，因為沒有其它已知的環(huán)丙烷合酶具有這一部分。與任何已知的蛋白質(zhì)也沒有顯著的相似性。然而，蘋婆環(huán)丙烷合酶的N端一半與擬南芥基因At3g23500有顯著的同源性，低于與At3g23520的同源性。這些推斷的基因編碼暫時被鑒定為色氨酸2-單加氧酶的產(chǎn)物。色氨酸2-單加氧酶屬于含黃素的氧化酶類別。色氨酸2-單加氧酶(IaaM)基因產(chǎn)物本身產(chǎn)生吲哚乙酰胺，它們通過水解能夠轉(zhuǎn)化為生長素吲哚乙酸。大多數(shù)含黃素的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)的N端都有一個高度保守的基序，與FAD的ADP部分的結(jié)合有關(guān)(Eggink等人，1990；Eberhardt等人，1996；Haigler等人，1996)。提出的基序(G-X-G-X-X-G-X-X-X-A)之前為3或4個疏水殘基(Russel，M和Model，P(1988)J.Biol.Chem.2639015-9019)。保守的FAD結(jié)合基序存在于蘋婆環(huán)丙烷合酶的前15個氨基酸中(MGVAVIGGGIQGLVSAYVLAKAGVNVVVYE)。由于認為環(huán)丙烷環(huán)的形成機制由通過添加來自S-腺苷甲硫氨酸的甲基形成的所述中間物(-CHCH3-CH+-)通過碳正離子機制進行，因此氧化還原系統(tǒng)(如含F(xiàn)AD的蛋白質(zhì))不可能參與加成亞甲基的催化反應(yīng)。因此，蘋婆CPA-FAS的氨基端部分不可能參與環(huán)丙烷環(huán)的形成。CPA-FA合酶多肽在其氨基端似乎含有一種融合的氧化還原蛋白(大約氨基酸1-438)，它或許是一種氧化酶。預(yù)期該氧化還原蛋白域在二氫蘋婆酸去飽和為蘋婆酸或者更可能地在伴隨蘋婆酸形成的-氧化中起作用。
可以認為，二氫蘋婆酸通過去飽和轉(zhuǎn)化為蘋婆酸(圖1)。在使用發(fā)育的蘋婆種子組織的標(biāo)記研究中，添加的[14C]硬脂酸，油酸的9，10-乙炔類似物，不被轉(zhuǎn)化為[14C]蘋婆酸。另一方面，二氫蘋婆酸顯然被去飽和為蘋婆酸，但是轉(zhuǎn)化率較慢。但是，綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持提出的蘋婆酸通過二氫蘋婆酸去飽和合成的途徑。然而，與種子和其它植物組織中蘋婆酸生物合成有關(guān)的一個異常特征是基本上-氧化。錦葵酸通常是主要的CPE-FA。盡管其它非碳環(huán)脂肪酸顯示少量的-氧化產(chǎn)物，但是CPE-FA的鏈通常極大比例的縮短。這種廣泛的-氧化似乎是CPE-FA生物合成所特有的。然而，在用蘋婆CPA-FAS編碼序列轉(zhuǎn)化的煙草細胞系中，在篩選的所有獨立轉(zhuǎn)基因煙草細胞系中沒有發(fā)現(xiàn)17碳或18碳CPA-FAs。17碳CPA-FAs的缺乏被認為是由于16∶1底物的缺乏。18碳CPA-FAs的缺乏表明蘋婆CPA-FAS不誘導(dǎo)-氧化，盡管存在明顯的氧化還原融合蛋白，預(yù)期該蛋白將參與-氧化。然而，預(yù)期-氧化的底物是不飽和CPE-FA，而不是飽和CPA-FA。這得到了以下發(fā)現(xiàn)的支持在荔枝中，已知種子只有CPA-FAs積累而不含CPE-FA，沒有二氫蘋婆酸的-氧化產(chǎn)物，盡管可見痕量17碳和15碳 氧化產(chǎn)物(Gaydou等人(1993)J.Agric.FoodChem.41886-890)。
因此，預(yù)期蘋婆CPA-FAS含有一種具有兩種催化活性的天然融合產(chǎn)物一種催化環(huán)丙烷脂肪酸的合成(羧基端，大約位于氨基酸439-864)，另一種催化具有環(huán)碳功能基、最可能的是不飽和環(huán)碳環(huán)或環(huán)丙烯環(huán)的脂肪酸的-氧化縮短(氨基端，大約位于氨基酸1-438)。已知融合蛋白，特別是與脂類合成有關(guān)的融合蛋白的例子(例如，報告在珊瑚中自然存在一種具有兩種酶活性的多肽，其中融合蛋白含有脂加氧酶和氧化丙二烯合酶)(Koljak等人(1997)Science 2771994-1996；Boutand和Brash(1999)J.Biol.Chem.27433764-33770)。
蘋婆CPA-FAS是第一個被證實的植物CPA-FAS，盡管最近報告了據(jù)說編碼環(huán)丙烷合成酶(或CFA合酶)的植物核酸序列的推斷鑒定(WO99/43827)。該申請描述了據(jù)稱至少編碼幾種環(huán)丙烷合成酶的一部分的核酸片段；分離這些片段，使用BLAST算法比較隨機植物cDNA序列與含有核苷酸和蛋白質(zhì)序列的公開數(shù)據(jù)庫，進行鑒定。根據(jù)與來自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)或來自大腸桿菌的環(huán)丙烷合成酶的相似性，發(fā)現(xiàn)編碼的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果是一組5個核苷酸序列，其中之一是來自玉米的重疊群(由三個克隆裝配而成)，另外三個是來自菜豆屬(Phaseolus)、水稻和大豆的克隆，最后一個是來自小麥的重疊群(由兩個克隆裝配而成)；只有前兩個序列似乎編碼約386個氨基酸的“完整”蛋白質(zhì)。第一個“完整”蛋白質(zhì)被描述為含有氨基酸1-28的信號序列(盡管如何鑒定該信號序列還沒有描述)和氨基酸29-386的成熟蛋白質(zhì)。大腸桿菌CFA合酶氨基酸序列也被描述為與兩種“完整”蛋白質(zhì)分別19.95％和19.2％相似。除了顯示與細菌酶有氨基酸序列同源性(從核酸序列預(yù)測)，該申請不提供證實這些序列實際上編碼植物CPA-FAS的任何證據(jù)。
然而，似乎WO99/43827描述了實際上不編碼植物CFA合酶的核酸序列。這是根據(jù)幾條推論。首先，預(yù)測的蘋婆CFA合酶的氨基酸序列長864個氨基酸，或者長度是WO 99/43827所述的“完整”蛋白質(zhì)的兩倍以上。蘋婆酶的氨基酸序列與大腸桿菌序列在重疊區(qū)的同源性程度似乎高于WO 99/43827所述的“完整”序列。本發(fā)明者在實施例3中提供證據(jù)表明，蘋婆核酸序列轉(zhuǎn)化酵母和植物細胞導(dǎo)致在通常不含這些脂肪酸的組織中產(chǎn)生CPA-FAs；這與WO 99/43827不同，后者根本不提供關(guān)于這些序列的表達能導(dǎo)致CPA-FAs出現(xiàn)的任何證據(jù)。預(yù)測從中分離蘋婆核酸序列的來源是該酶的豐富來源，這是根據(jù)蘋婆種子油中存在高達60％的CPE-FAs，并且根據(jù)CPE-FAs來源于CPA-FAs的假設(shè)。這不同于WO 99/43827中制備cDNA文庫的來源，它們是玉米、菜豆屬、水稻、大豆和小麥，已知不含CPA-FAs。最后，有許多依賴S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移酶，它們具有類似的DNA和蛋白質(zhì)序列(如Wang等人(1992)Biochemistry 3111020-11028所述)。因此僅僅序列相似性不足以證明蛋白質(zhì)的功能和身份。
然而，能夠利用蘋婆CPA-FAS氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其它植物CPA-FAS，如下文進一步描述；在一個實施方案中，用下文所述的和實施例5詳述的方法發(fā)現(xiàn)棉花CPA-FAS的編碼序列。
A.植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因本發(fā)明提供含有分離的編碼植物CPA-FAS的核酸序列的組合物。在有些實施方案中，該序列編碼一種錦葵科CPA-FAS；在其它實施方案中，該序列編碼一種蘋婆CPA-FAS；在其它實施方案中，該序列編碼棉花CPA-FAS。在有些實施方案中，該序列含有圖4所示的序列(SEQ ID NO1)；在其它實施方案中，該序列編碼圖5所示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在其它實施方案中，該序列至少含有圖14和15所示序列之一(SEQ ID NOs3、4、5、6)；在其它實施方案中，該序列至少編碼圖16所示氨基酸序列之一(SEQ ID NOs7、8、9、10)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸序列編碼的CPA-FAS是功能性的，或者具有CPA-FAS活性。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有分離的核酸序列的組合物，該序列編碼保留CPA-FAS某些功能特征的植物CPA-FAS的一部分。這些功能特征的例子包括作為免疫原產(chǎn)生識別CPA-FAS的抗體的能力(參見，例如實施例4)；在具體實施方案中，該核酸序列編碼圖13所示的氨基酸序列(SEQ ID NO11)。其它例子包括編碼植物CPA-FAS的氨基端或羧基端的核酸序列，假定它們具有分離的和不同的酶促能力；在這些實施方案中，該核酸序列編碼植物CPA-FAS的氨基端(在蘋婆中約為氨基酸1-438)或植物CPA-FAS的羧基端(在蘋婆中約為氨基酸439-864)；在具體實施方案中，這些蛋白質(zhì)片段保留與天然或完整CPA-FAS蛋白結(jié)合的酶活性。在其它具體實施方案中，該核酸片段編碼SEQ ID NOs7、8、9或10。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有分離的編碼植物CPA-FAS的核酸序列的組合物，其中編碼的CPA-FAS至少含有SEQ ID NOs2、7、8、9或10中的一個片段，其中編碼的CPA-FAS與抗蘋婆CPA-FAS抗體有交叉反應(yīng)性，與蘋婆CPA-FAS大小大致相同(長約864個氨基酸)。實施例4描述了一種典型的抗CPA-FAS抗體。蘋婆CPA-FAS的大小范圍是約800-900個氨基酸。一個氨基酸序列片段含有該氨基酸序列內(nèi)任何位置存在的至少10個、更優(yōu)選地20個、再優(yōu)選地30個、最優(yōu)選地40個或更多氨基酸殘基。此外，一個片段含有該氨基酸序列內(nèi)任何位置存在的至少20個、更優(yōu)選地約30個、更優(yōu)選地約40個、最優(yōu)選地約50個或更多氨基酸殘基，其中該片段還含有至少一個氨基酸缺失或添加或置換，任一片段內(nèi)氨基酸添加、缺失或置換的總數(shù)高達該片段內(nèi)氨基酸總數(shù)的約10％。如果存在一個以上的氨基酸缺失、添加或置換，它們可能是相鄰的或不相鄰的。優(yōu)選地，氨基酸置換是保守的。
B.植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶多肽本發(fā)明提供含有純化的植物CPA-FAS多肽的組合物，以及含有變體(包括其同源物、突變體或片段或融合蛋白)的組合物。在有些實施方案中，該多肽含有一種錦葵科CPA-FAS；在其它實施方案中，該多肽含有一種蘋婆CPA-FAS；在其它實施方案中，該多肽含有一種棉花CPA-FAS。在一個實施方案中，該多肽由圖4所示的序列(SEQ IDNO1)編碼；在其它實施方案中，該多肽含有圖5所示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在其它實施方案中，該多肽由至少含有圖14和15所示序列之一(SEQ ID NOs3、4、6)的序列編碼；在其它實施方案中，該多肽至少含有圖16所示氨基酸序列之一(SEQ ID NOs7和8)。
該多肽催化對不飽和脂肪酸的不飽和中心加成一個亞甲基，包括對?；碾p鍵加成亞甲基。因此，本發(fā)明的植物CPA-FAS是一種能夠合成含有環(huán)丙烷環(huán)的脂肪酸的多肽。
因此，植物CPA-FAS催化下列反應(yīng)
其中X優(yōu)選地是甘油脂，最可能的是磷脂，如磷脂酰膽堿。該酶最可能原位作用于脂肪酸，如酯化為脂質(zhì)的油酸或棕櫚油酸，并使用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體。而且，該酶在不同條件下可以利用不同底物，活性程度不同，并且也可以產(chǎn)生其它底物。因此，其它底物可以接受亞甲基，產(chǎn)生的脂肪酰基可能含有一個不飽和碳環(huán)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，該多肽是一種由天然基因在細胞中表達獲得的純化產(chǎn)物，而在其它實施方案中，可能是化學(xué)合成方法的一種產(chǎn)物，在其它實施方案中，可能使用原核或真核宿主通過重組技術(shù)產(chǎn)生(例如由培養(yǎng)的細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞產(chǎn)生)。在有些實施方案中，根據(jù)重組生產(chǎn)方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可能被糖基化或者可能不被糖基化。在其它實施方案中，本發(fā)明的多肽也可含有一個起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的測定植物CPA-FAS的活性可以用多種方法測定。一方面，活性測定方法包括在轉(zhuǎn)基因生物中表達編碼該合酶的核酸序列，然后分析總脂肪酸的組成。因此，活性在測定為一種轉(zhuǎn)基因生物中內(nèi)源環(huán)丙烷脂肪酸的存在或含量的提高，該生物含有一種外源核酸序列，該序列含有SEQ ID NO1或編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；這些轉(zhuǎn)基因生物如別處所述獲得。轉(zhuǎn)基因生物中環(huán)丙烷脂肪酸的含量與非轉(zhuǎn)基因生物中的含量相比較。一般分析從轉(zhuǎn)基因生物樣品提取的脂質(zhì)中的脂肪酸；樣品在甲醇/氯仿(2∶1，v/v)中勻漿，如Bligh和Dyer(1959)所述提取脂質(zhì)。
另一方面，測定從一種生物(可能是或者可能不是轉(zhuǎn)基因的)中獲得的組織樣品中的酶活性。例如，在植物中，組織樣品包括但不限于葉樣品(如葉盤)、莖和根樣品，發(fā)育的和成熟的種子胚或胚乳組織。組織樣品一般與脂肪酸合成的前體(如14C-乙酸)或與脂肪酸底物(如14C-脂肪酸的銨鹽，它們能被吸收并摻入組織脂質(zhì)中)一起溫育，或者與標(biāo)記的底物(如14C-甲硫氨酸)一起溫育。必要時，在溫育過程中包括脂類合成的其它輔因子；這些輔因子包括但不限于ATP、CoA、MgCl2和SAM。此外，組織樣品也可與標(biāo)記的SAM溫育。溫育通常在室溫下在緩沖溶液(如pH7.2的0.1M磷酸鉀)中進行適當(dāng)?shù)囊欢螘r間。然后用緩沖液洗滌樣品，組織樣品在甲醇/氯仿(2∶1，v/v)中勻漿，如Bligh和Dyer(1959)所述提取脂質(zhì)。
另一方面，測定從一種生物獲得的亞細胞級分的酶活性，該生物可能是或者可能不是轉(zhuǎn)基因的(轉(zhuǎn)基因生物如別處所述)，其中組織被破壞產(chǎn)生無細胞級分。例如，在植物中，亞細胞級分可以從上述任何一類組織中獲得，包括整個細胞和微粒體膜、質(zhì)體和質(zhì)體膜級分。這些級分的制備在本領(lǐng)域公知。亞細胞級分然后與脂肪酸(如14C-脂肪酸的銨鹽，它們能被吸收并摻入組織脂質(zhì)中)溫育。此外，亞細胞級分也與標(biāo)記的SAM溫育。需要時，在溫育過程中包括脂類合成的其它輔因子；這些輔因子包括但不限于ATP、CoA、MgCl2、溶血磷脂，如lysoPC，和SAM。也可添加可增強脂類合成的其它試劑；這些試劑包括磷脂脂質(zhì)體(例如，含有磷脂酰膽堿)和脂轉(zhuǎn)移蛋白。溫育樣品，如上所述提取脂質(zhì)。
另一方面，測定體外核酸表達系統(tǒng)的酶活性，其中加入含有SEQID NO1或編碼含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的核酸序列，并表達編碼的酶。這些表達系統(tǒng)在本領(lǐng)域周知，例如網(wǎng)織紅細胞裂解物或麥胚。因為該酶可能是一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，甘油脂的存在能夠使其穩(wěn)定，所以在混合物中包含微團或膜結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)合成期間或之后可以向混合物中摻入該酶。而且，因為該酶可能原位作用于酯化為脂質(zhì)的脂肪酸，這些微團結(jié)構(gòu)優(yōu)選地從具有有關(guān)脂類合成能力的來源獲得，如來自植物組織的微粒體，其中該植物不含內(nèi)源環(huán)丙烷脂肪酸合酶，但是具有向甘油脂內(nèi)摻入標(biāo)記的脂肪酸底物的能力。直接和定量測定需要向微團或膜結(jié)構(gòu)內(nèi)摻入標(biāo)記的脂質(zhì)，并保證脂肪酸底物的摻入不是限定性的。然后如上對于亞細胞級分所述分析新表達的酶。
提取的植物CPA-FAS的脂質(zhì)產(chǎn)物用本領(lǐng)域公知的方法分析。例如，脂肪酸甲酯由一等份提取的脂質(zhì)級分制備，方法包括在N2下蒸發(fā)該等份中的溶劑，將脂質(zhì)重懸浮于等體積的1％甲醇鈉的甲醇溶液(w/w)和庚烷溶液中。用酸性條件破壞脂肪酸中的環(huán)丙烷和環(huán)丙烯基，含有這些酸的脂質(zhì)樣品最好與堿性試劑酯交換；游離脂肪酸能夠用重氮甲烷安全地甲基化(Christie(1982)《脂質(zhì)分析》(Lipid Analysis)，第二版，55頁)。然后將脂肪酸甲酯抽提到己烷中，分離，對于放射性樣品，通過TLC、GC或GC/MS測定每個不同級分中的放射性(參見，如實施例1所述)。
植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的純化在本發(fā)明的某些實施方案中，提供從生物中純化的植物CPA-FAS多肽；這些生物可以是轉(zhuǎn)基因生物，含有異源植物CPA-FAS基因。本發(fā)明提供一種純化的植物CPA-FAS多肽，及其變體、同源物、突變體或融合蛋白，如別處所述。
本發(fā)明也提供從一種生物中回收和純化植物CPA-FAS的方法；這些生物包括單細胞和多細胞生物。一般而言，首先破壞細胞，在隨后的酶純化前分級分離；破壞和分級分離方法眾所周知。純化方法也是眾所周知的，包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和凝集素層析。
可以預(yù)期，根據(jù)大腸桿菌環(huán)丙烷脂肪酸合酶(CFA合酶)推斷，植物CPA-FAS是不穩(wěn)定的(Grogan，DW和Cronan，JW Jr.(1997)Microbiol Molec Biol Reviews 61(4)429-441)。大腸桿菌酶極其不穩(wěn)定，因此當(dāng)通過超速離心除去大腸桿菌粗提物的內(nèi)源脂質(zhì)時，在30℃溫育30分鐘后只有最初CFA合酶活性的不到1％得以保留，其不穩(wěn)定性嚴(yán)重阻礙了該酶的純化和深入研究。應(yīng)當(dāng)指出，該酶與膜片段和磷脂囊泡可逆地結(jié)合，這種結(jié)合是參考文獻發(fā)表時確定的穩(wěn)定CFA合酶的普遍有效的唯一方法。因此，預(yù)期在一個實施方案中，本發(fā)明的植物CPA-FAS如對于細菌CFA合酶所述純化(Grogan，DW和Cronan，JW Jr.(1997)Microbiol Molec Biol Reviews 61(4)429-441)。該方案包括細胞的破壞(例如通過弗氏壓碎器或勻漿)，高速離心除去細胞碎片(如150,000g約2h)，從獲得的上清液中沉淀蛋白質(zhì)，例如加入硫酸銨至約40％飽和，離心收集沉淀的蛋白質(zhì)(例如10,000g約15min)，從重懸浮的蛋白質(zhì)沉淀中除去殘余的硫酸銨(例如通過凝膠過濾)，酶的脂質(zhì)體浮選(flotation)，以及隨后通過蔗糖梯度離心純化脂層。
本發(fā)明還提供含有與一種標(biāo)記序列框內(nèi)融合的本發(fā)明的編碼序列(例如SEQ ID NO1)的核酸序列，該標(biāo)記序列允許本發(fā)明的多肽的表達或表達和純化。標(biāo)記序列的一個非限制性例子是六組氨酸尾，它可由一種載體提供，例如pQE-30載體，它向植物CPA-FAS的N端添加一個六組氨酸尾，在細菌宿主中導(dǎo)致多肽表達，更優(yōu)選的是載體PT-23B，它向植物CPA-FAS的C端添加一個六組氨酸尾，在細菌宿主中導(dǎo)致更容易地純化與該標(biāo)記融合的多肽，或者例如，當(dāng)使用哺乳動物宿主時，標(biāo)記序列可以是血凝素(HA)標(biāo)簽。HA標(biāo)簽對應(yīng)于來自流感血凝素蛋白的一個表位(Wilson等人(1984)Cell，37767)。
植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的化學(xué)合成在本發(fā)明的一個備選實施方案中，使用本領(lǐng)域公知的化學(xué)方法，全部或部分地合成植物CPA-FAS的編碼序列(參見，例如Caruthers等人(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.，7215-233；Crea和Horn(1980)Nucl.Acids Res.，92331；Matteucci和Caruthers(1980)Tetrahedron Lett.，21719；Chow和Kempe(1981)Nucl.Acids Res.，92807-2817)。在本發(fā)明的其它實施方案中，利用化學(xué)方法合成完整的植物CPA-FAS氨基酸序列或其部分，產(chǎn)生蛋白質(zhì)本身。例如，利用固相技術(shù)合成肽，從樹脂上切下，通過高效液相層析純化(參見，例如Creighton(1983)《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子原理》(Proteins Structures AndMolecular Principles)，W H Freeman and Co，New York N.Y.)。在本發(fā)明的其它實施方案中，合成肽的組成通過氨基酸分析或測序證實(參見，例如Creighton，同上)。
直接肽合成能夠用不同固相技術(shù)進行(Roberge等人(1995)Science，269202-204)，例如使用ABI 431A肽合成儀，根據(jù)廠商提供的說明書，可以完成自動合成。另外，植物CPA-FAS的氨基酸序列或其任何部分在直接合成過程中可以改變，和/或利用化學(xué)方法與其它序列組合，產(chǎn)生一種變異的多肽。
植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶抗體的產(chǎn)生在本發(fā)明的一些實施方案中，產(chǎn)生抗體，用于植物CPA-FAS蛋白的檢測和表征?？贵w可以用不同免疫原制備。在一個實施方案中，免疫原是一種蘋婆CPA-FAS肽(例如，如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其片段)，產(chǎn)生可識別蘋婆CPA-FAS的抗體。這些抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段和Fab表達文庫。
可以利用本領(lǐng)域公知的多種方法生產(chǎn)抗植物CPA-FAS的多克隆抗體。為了生產(chǎn)抗體，能夠通過注射對應(yīng)于植物CPA-FAS表位的肽，免疫不同的宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個優(yōu)選實施方案中，肽與一種免疫原性載體(例如白喉類毒素、牛血清白蛋白(BSA)或匙孔戚血藍蛋白(KLH))偶聯(lián)?？梢杂枚喾N佐劑增強免疫應(yīng)答，這取決于宿主種，包括但不限于弗氏(完全和不完全)、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔戚血藍蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人用佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。
為了制備抗植物CPA-FAS的單克隆抗體，預(yù)期本發(fā)明可以使用由培養(yǎng)的連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)(參見，例如Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。包括但不限于最早由Kohler和Milstein(Kohler和Milstein(1975)Nature，256495-497)發(fā)展的雜交瘤技術(shù)，以及trioma技術(shù)，人B細胞雜交瘤技術(shù)(參見，例如Kozbor等人(1983)Immunol.Tod.，472)，以及產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人(1985)《單克隆抗體與癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
另外，可以預(yù)期，描述的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)可以用于生產(chǎn)植物CPA-FAS特異的單鏈抗體。本發(fā)明的另一個實施方案使用描述的構(gòu)建Fab表達文庫的技術(shù)(Huse等人(1989)Science，2461275-1281)，以允許快速且容易地鑒定具有希望的植物CPA-FAS特異性的單克隆Fab片段。
可以預(yù)期，適于生產(chǎn)抗體片段的任何技術(shù)都可以用來生產(chǎn)含有抗體分子的獨特型(抗原結(jié)合區(qū))的抗體片段。例如，這些片段包括但不限于通過胃蛋白酶消化抗體分子能夠產(chǎn)生的F(ab′)2片段；通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵能夠產(chǎn)生的Fab′片段；和用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子能夠產(chǎn)生的Fab片段。
在抗體的生產(chǎn)中，預(yù)期希望的抗體的篩選通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)完成(例如放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散測定、原位免疫測定(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)、Western印跡法、沉淀反應(yīng)、凝集測定(例如凝膠凝集測定、血細胞凝集測定等、補體結(jié)合測定、免疫熒光測定、蛋白A測定和免疫電泳測定等。
在一個實施方案中，通過檢測第一抗體上的標(biāo)記物檢測抗體的結(jié)合。在另一個實施方案中，通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結(jié)合檢測第一抗體。在另一個實施方案中，第二抗體被標(biāo)記。通過免疫測定檢測結(jié)合的多種方法在本領(lǐng)域公知，在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本領(lǐng)域公知，免疫原性肽應(yīng)當(dāng)不含許多免疫方案中使用的載體分子。例如，如果該肽與KLH偶聯(lián)，在篩選測定中它可以與BSA偶聯(lián)或者直接使用。
在本發(fā)明的某些實施方案中，在本領(lǐng)域公知的與植物CPA-FAS表達有關(guān)的方法(例如Western印跡分析)中使用上述抗體，測定它在適當(dāng)生物樣品中的水平等。能夠利用這些抗體檢測植物生物樣品中的植物CPA-FAS。生物樣品可以是組織提取物，或為了鏡檢而固定的樣品。
然后利用適當(dāng)?shù)牟呗?例如ELISA或放射免疫測定)和形式(例如微孔、dipstick(如國際專利公開文本W(wǎng)O 93/03367所述)等直接檢測生物樣品中植物CPA-FAS的存在。此外，樣品中的蛋白質(zhì)也能夠在存在或不存在十二烷基硫酸鈉(SDS)的條件下大小分離(例如通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE))，植物CPA-FAS的存在通過免疫印跡法(Western印跡法)檢測。使用針對對應(yīng)于蛋白質(zhì)表位的肽的抗體的免疫印跡技術(shù)通常更加有效，因此特別適于本發(fā)明。
II.鑒定植物CPA-FAS基因和有關(guān)植物基因的方法本發(fā)明的一些實施方案涉及分離編碼植物CPA-FAS的核酸序列的方法，這是根據(jù)植物組織、優(yōu)選地種子組織中存在CPA-FAs和/或CPE-FAs即表明存在CPA-FAS的假說。這些方法包括，首先由產(chǎn)生相對高水平的CPA-FAs或CPE-FAs的組織制備cDNA文庫。這些方法然后包括從文庫中扣除高豐度的序列，對其余的文庫克隆測序，比較編碼的氨基酸序列與大腸桿菌CPA-FAS或蘋婆CPA-FAS的氨基酸序列，選擇推斷的CPA-FAS候選ESTs。這些方法然后包括，裝配編碼推斷的完整植物CPA-FAS的克隆，表征這樣發(fā)現(xiàn)的這些序列的表達產(chǎn)物。
此外，這些方法也包括，首先檢查植物表達序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫，以發(fā)現(xiàn)新的可能的CPA-FAS編碼序列。優(yōu)選地，EST數(shù)據(jù)庫的植物來源包括植物組織、如種子組織中的CPA-FAs和/或CPE-FAs。在有些實施方案中，植物EST數(shù)據(jù)庫的檢查包括用蘋婆CPA-FAS的氨基酸序列(例如SEQ ID NO2)blast搜索該數(shù)據(jù)庫，以發(fā)現(xiàn)編碼與蘋婆CPA-FAS蛋白同源的氨基酸序列的EST。在其它一些實施方案中，這些方法包括，然后裝配成編碼推斷的完整植物CPA-FAS的克隆，表征這樣發(fā)現(xiàn)的這些序列的表達產(chǎn)物。在其它實施方案中，這些方法然后包括，對可能的候選序列測序，表征這樣發(fā)現(xiàn)的這些序列的表達產(chǎn)物。
使用這些方法導(dǎo)致蘋婆CPA-FAS的發(fā)現(xiàn)，如說明性實施例所述。分離的新編碼序列被證實編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶，如說明性實施例所述。可以預(yù)期，這些方法也能夠用來從已知含有CPA-FAs和CPE-FAs的植物中發(fā)現(xiàn)其它CPA-FAS。典型植物包括來自錦葵科、梧桐科、木棉科、Tilaceae、含羞草科和無患子科的植物。具體而言，預(yù)期通過這些方法可鑒定并分離來自棉花的CPA-FAS。因此，使用這些方法導(dǎo)致棉花CPA-FAS編碼序列的發(fā)現(xiàn)，如說明性實施例所述。棉花組織證實含有環(huán)丙烷和環(huán)丙烯脂肪酸(CPA-FAs和CPE-FAs)，其中有些組織(如根和莖)含有相對高水平的這些脂肪酸(分別可達約30％、約35％)。而且，棉花組織證實含有可與抗蘋婆CPA-FAS抗體交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)的大小與蘋婆CPA-FAS大致相同，該蛋白質(zhì)的組織分布通常與組織中的CPA-FAs和CPE-FAs的含量相符。
編碼蘋婆CPA-FAS的核苷酸序列和蘋婆CPA-FAS的推斷的氨基酸序列在圖4中顯示(分別為SEQ ID NOs 1和2)。通過本領(lǐng)域公知的方法利用蘋婆CPA-FAS編碼序列定位和分離蘋婆CPA-FAS基因；因此，通過本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)的植物CPA-FAS編碼序列也能夠用來通過相同的方法定位和分離其它植物基因。為了分離該基因，利用32P-放射性標(biāo)記的CPA-FAS編碼序列(或cDNA)通過DNA-DNA雜交篩查由蘋婆基因組DNA構(gòu)建的基因組或cDNA文庫。檢測為雜交陽性的分離的單克隆預(yù)計含有部分或全部CPA-FAS基因，并且測序。這些陽性克隆的蘋婆基因組DNA的序列用來證實該基因是一種植物CPA-FAS。如果一個具體克隆只編碼基因的一部分，則分離并測序檢測為與CPA-FAS編碼序列(或cDNA)雜交陽性的其它克隆。利用CPA-FAS基因全長序列與cDNA的比較確定內(nèi)含子的位置(如果它們存在的話)。
也能夠利用蘋婆CPA-FAS鑒定和分離有關(guān)的植物基因。一個例子是，可以認為CPE-FA通過CPA-FA的去飽和而合成。盡管用CPA-FAS轉(zhuǎn)化的蘋婆煙草細胞系產(chǎn)生CPA-FA(二氫蘋婆酸)，但是它們似乎不產(chǎn)生CPE-FA(蘋婆酸)。因此，似乎鑒定的蘋婆CPA-FAS不會使CPA-FA去飽和為CPE-FA，而另一種蘋婆多肽負責(zé)去飽和CPA-FA。負責(zé)該活性的核酸序列根據(jù)上述關(guān)于鑒定CPA-FAS編碼序列的方法鑒定并分離，不同之處在于使用去飽和酶氨基酸序列作為同源性比較的基礎(chǔ)。預(yù)期該去飽和酶與一種FAD2或P450酶同源。然后如實施例所述，用候選序列共轉(zhuǎn)化已經(jīng)用蘋婆CPA-FAS轉(zhuǎn)化的煙草細胞系，如實施例所述分析脂肪酸產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因細胞系中CPE-FA的存在證實候選序列是一種CPA-FA去飽和酶。
III.其它植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因本發(fā)明提供分離的編碼植物CPA-FAS的核酸序列。例如，本發(fā)明的一些實施方案提供分離的多核苷酸序列，這些序列在低到高嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NOs1、3和/或6雜交，只要能夠雜交的多核苷酸序列編碼保留植物CPA-FAS的希望的生物活性的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，雜交條件以核酸結(jié)合復(fù)合物的解鏈溫度(Tm)為基礎(chǔ)，并具有如上所述定義的“嚴(yán)格性”(參見，例如Wahl等人(1987)Meth.Enzymol.，152399-407，在此引用作為參考)。
在其它實施方案中，提供了一種分離的編碼植物CPA-FAS的核酸序列，它與蘋婆CPA-FAS同源；在有些實施方案中，該序列從錦葵科、梧桐科、木棉科、Tilaceae、含羞草科和無患子科的植物中獲得。在具體實施方案中，這些序列從棉花中獲得；這些序列至少含有SEQID NOs3、4、6之一。
在本發(fā)明的其它實施方案中，提供植物CPA-FAS的等位基因。在優(yōu)選實施方案中，等位基因是由于突變(即核酸序列的改變)產(chǎn)生的，通常產(chǎn)生改變的mRNA或結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不改變的多肽。任何特定基因可能沒有、有一個或多個等位基因形式。產(chǎn)生等位基因的常見突變通常是由于核酸的缺失、添加或置換。所有這些改變類型均可在特定序列中以一倍或幾倍的速度單獨發(fā)生，或者與其它類型組合發(fā)生。
在本發(fā)明的其它實施方案中，通過本領(lǐng)域公知的多種方法，使用核苷酸序列(例如SEQ ID NO1)延伸編碼植物CPA-FAS的多核苷酸序列，以檢測上游序列，如啟動子和調(diào)節(jié)元件。例如，預(yù)期本發(fā)明可使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。這是一種直接法，它使用通用引物獲得(retrieve)與已知基因座相鄰的未知序列(Gobinda等人(1993)PCRMethods Applic.，2318-322)。首先，在接頭序列的引物和已知區(qū)域特異的引物存在下擴增基因組DNA。擴增的序列然后進行第二輪PCR，其中使用相同的接頭引物和在第一種引物內(nèi)部的另一種特異引物。每一輪PCR的產(chǎn)物都用適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶轉(zhuǎn)錄，并用反轉(zhuǎn)錄酶測序。
在另一個實施方案中，使用基于已知區(qū)域的趨異(divergent)引物，利用反向PCR擴增或延伸序列(Triglia等人(1988)Nucleic Acids Res.，168186)。引物可以用Oligo 4.0(National Biosciences Inc，PlymouthMinn.)或另一種適當(dāng)?shù)某绦蛟O(shè)計為例如長22-30個核苷酸，GC含量為50％或更高，在約68-72℃時與靶序列退火。該方法使用幾種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生位于基因已知區(qū)域內(nèi)的適當(dāng)片段。該片段然后通過分子內(nèi)連接環(huán)化，并用作PCR模板。在本發(fā)明的另一個實施方案中使用捕獲PCR(Lagerstrom等人(1991)PCR Methods Applic.，1111-119)。這是PCR擴增與人和酵母人工染色體(YAC)DNA內(nèi)已知序列相鄰的DNA片段的一種方法。捕獲PCR也需要多次限制性內(nèi)切酶消化和連接，以在PCR前將構(gòu)建的雙鏈序列置于DNA分子的未知部分內(nèi)。在其它實施方案中使用步移PCR。步移PCR是一種定向基因步移的方法，可以獲得未知序列(Parker等人(1991)Nucleic Acids Res.，193055-60)。PROMOTERFINDER試劑盒(Clontech)利用PCR、巢式引物和具體文庫在基因組DNA中“步移”。該方法不需要篩查文庫，可用于發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子/外顯子連接。在本發(fā)明的其它實施方案中，加尾(add TAIL)PCR作為獲得側(cè)翼基因組區(qū)(包括調(diào)節(jié)區(qū))的一種優(yōu)選方法(Lui和Whittier，(1995)；Lui等人(1995))。
用于篩選全長cDNA的優(yōu)選文庫包括經(jīng)過大小選擇以包含較大cDNA的文庫。隨機引物文庫也是優(yōu)選的，因為它們含有更多的包含5’和上游基因區(qū)的序列。如果oligo d(T)文庫不產(chǎn)生全長cDNA，隨機引物文庫是特別有用的?；蚪M文庫可用于獲得內(nèi)含子及延長5′序列。
IV.變異的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶在有些實施方案中，本發(fā)明提供公開的編碼植物CPA-FAS的核酸序列的分離的變體，和由其編碼的多肽；這些變體包括植物CPA-FAS的突變體、片段、融合蛋白或功能相當(dāng)物。因此，為了因多種原因改變植物CPA-FAS編碼序列，構(gòu)建本發(fā)明的核苷酸序列，包括但不限于改變基因產(chǎn)物的克隆、加工和/或表達的改變(這些改變包括插入新的限制酶切位點，改變糖基化模式，改變密碼子偏好性(preference)，以及改變酶活性(這些改變包括但不限于底物親和力不同，底物偏好和利用不同，抑制劑親和力或有效性不同，反應(yīng)動力學(xué)不同，亞細胞定位不同，蛋白質(zhì)加工和/或穩(wěn)定性不同)。例如，引入可改變底物特異性的突變，使得優(yōu)選的底物改變。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供分離的編碼植物CPA-FAS的核酸序列，其中編碼的合酶與含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)競爭結(jié)合不飽和脂肪酸底物。
植物環(huán)丙烷合酶的突變體本發(fā)明的一些實施方案提供植物CPA-FAS的突變形式(即突變蛋白)。在優(yōu)選實施方案中，變體由于突變(即核酸序列的改變)產(chǎn)生，通常產(chǎn)生改變的mRNA或結(jié)構(gòu)或功能可能改變或者可能不變的多肽。任何特定基因都可能沒有、有一個或多個突變形式。產(chǎn)生變體的常見突變通常是由于核酸的缺失、添加或置換。所有這些改變類型都可在特定序列中以一倍或幾倍的速度單獨發(fā)生，或者與其它類型組合發(fā)生。
預(yù)期能夠修飾具有活性(例如植物CPA-FAS活性)的肽的結(jié)構(gòu)，目的在于提高合成活性，或者改變植物CPA-FAS對特定脂肪酸底物的親和力。這些修飾的肽被認為是具有如此處定義的植物CPA-FAS活性的肽的功能相當(dāng)物。能夠產(chǎn)生一種修飾的肽，其中編碼該多肽的核苷酸序列已經(jīng)改變，如置換、缺失或添加。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，這種改變提高了合成活性，或者改變了植物CPA-FAS對特定脂肪酸底物親和力。在特別優(yōu)選的實施方案中，這些修飾不會顯著降低修飾的酶的合成活性。換句話說，能夠評價構(gòu)建體“X”，以確定它是否是如功能上而不是結(jié)構(gòu)上定義的本發(fā)明的修飾或變異植物CPA-FAS種類的一員。在優(yōu)選實施方案中，變異植物CPA-FAS的活性用實施例3所述的方法評價。因此，在有些實施方案中，本發(fā)明提供編碼植物CPA-FAS的核酸，它與SEQ ID NO1的編碼區(qū)互補。在其它實施方案中，本發(fā)明提供編碼植物CPA-FAS的核酸，它與SEQ IDNO1編碼的蛋白質(zhì)競爭結(jié)合脂肪酸底物。
在一個實施方案中，進行位點特異性誘變來修飾植物CPA-FAS的催化活性，從對雙鍵的亞甲基加成到位點10的亞甲基加成，如已知tubercuolic acid的合成所發(fā)生的。修飾的酶將產(chǎn)生含有側(cè)(pendant)乙烯基的脂肪酸，它是工業(yè)衍生的一個有價值的平臺。而且，脂肪酸產(chǎn)物的氫化將定量轉(zhuǎn)化為甲基分支的飽和物。
如上所述，植物CPA-FAS的突變形式也被視為與此處詳述的肽和DNA分子相當(dāng)。例如，分別用異亮氨酸或纈氨酸替換亮氨酸，用谷氨酸替換天冬氨酸，用絲氨酸替換蘇氨酸，或者用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸類似地替換氨基酸(即保守突變)，預(yù)期對產(chǎn)生的分子的生物活性沒有重要影響。因此，本發(fā)明的一些實施方案提供此處公開的含有保守置換的植物CPA-FAS的變體。保守置換在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生。遺傳編碼的氨基酸可分為4個家族(1)酸性(天冬氨酸，谷氨酸)；(2)堿性(賴氨酸，精氨酸，組氨酸)；(3)非極性(丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)；和(4)不帶電荷的極性(甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時一起被分類為芳族氨基酸。以類似的方式，氨基酸的所有成分(repertoire)能夠被分組為(1)酸性(天冬氨酸，谷氨酸)；(2)堿性(賴氨酸，精氨酸，組氨酸)；(3)脂肪族(甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸)，絲氨酸和蘇氨酸任選地被單獨分類為脂肪族羥基；(4)芳族(苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺，谷氨酰胺)；和(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如，Stryer編著(1981)《生物化學(xué)》(Biochemistry)，17-21頁，第二版，WH Freeman and Co.)。通過評價變異肽以類似于野生型蛋白質(zhì)的方式起作用的能力，能夠容易地確定肽氨基酸序列的改變是否產(chǎn)生功能同源物。含有一個以上置換的肽能夠用相同的方法檢測。
更少見的是，一種變體包含“非保守”改變(例如，用色氨酸置換甘氨酸)。類似的較小變異也可包括氨基酸缺失或插入或這兩者。確定哪一種氨基酸殘基能夠被置換、插入或刪除而不消除生物活性的指導(dǎo)能夠用計算機程序發(fā)現(xiàn)(例如LASERGENE軟件，DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)。
植物CPA-FAS的突變體能夠用本領(lǐng)域公知的任何合適的方法產(chǎn)生，包括但不限于定點誘變、隨機“點”誘變和結(jié)構(gòu)域交換(domain-swap)誘變，其中蘋婆CPA-FAS cDNA的部分與其它植物或細菌CPA-FAS編碼cDNA的類似部分“交換”(Back和Chappell(1996)PNAS936841-6845)。
變體的產(chǎn)生可以使用如定向進化等方法或產(chǎn)生變體組合文庫的其它技術(shù)。因此，本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生植物CPA-FAS蛋白的幾組組合突變體以及截短突變體的方法，尤其可用于鑒定具有CPA-FAS生物活性(例如CPA-FAs的合成)的可能的變體序列(即同源物)。另外，通過篩查這些組合文庫，例如產(chǎn)生同時具有新型底物特異性或其它生物活性的新的植物CPA-FAS同源物；下面描述了底物特異性的例子。
可以預(yù)期，植物CPA-FAS核酸(例如SEQ ID NO1及其片段和變體)能夠用作定向進化的起始核酸。這些技術(shù)能夠用來發(fā)展具有希望的特性(如提高的合成活性或改變的對特定脂肪酸底物的親和力)的植物CPA-FAS變體。
在有些實施方案中，通過隨機誘變進行人工進化(例如使用易錯PCR向特定編碼序列內(nèi)引入隨機突變)。該方法需要微調(diào)突變頻率。一般說來，有益的突變極少，而有害的突變常見。這是因為有害突變和有益突變的組合通常產(chǎn)生一種無活性的酶。靶基因的堿基置換的理想數(shù)量是1.5-5(Moore和Arnold(1996)Nat.Biotech.，14，458-67；Leung等人(1989)Technique，111-15；Eckert和Kunkel(1991)PCRMethods Appl.，117-24；Caldwell和Joyce(1992)PCR Methods Appl.，228-33；Zhao和Arnold(1997)Nuc.Acids.Res.，251307-08)。誘變后根據(jù)希望的活性篩選獲得的克隆(例如，如下所述根據(jù)CPA-FAS活性篩選)。為了研制具有希望的特性的酶，連續(xù)幾輪誘變和篩選通常是必需的。應(yīng)當(dāng)指出，只有有用的突變才進行下一輪誘變。
在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸用于基因改組或有性PCR方法(例如Smith(1994)Nature，370324-25；美國專利號5,837,458；5,830,721；5,811,238；5,733,731)?；蚋慕M包括隨機破碎幾個突變DNA，隨后PCR重裝配為全長分子。不同基因改組方法的例子包括但不限于DNase處理后裝配，交錯延伸法(STEP)和隨機引發(fā)體外重組。在DNase介導(dǎo)的方法中，從一組陽性突變體中分離的DNA片段用DNaseI酶切為隨機片段，不加引物進行多輪PCR。隨機片段的長度接近PCR循環(huán)繼續(xù)進行時未酶切的片段，使得不同克隆中存在的突變在獲得的一些序列中混合并積累。多個循環(huán)的篩選和改組使幾種酶的功能增強(Stemmer(1994)Nature，370398-91；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，10747-10751；Crameri等人(1996)Nat.Biotech.，14315-319；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944504-09；和Crameri等人(1997)Nat.Biotech.，15436-38)。定向進化產(chǎn)生的變體能夠用下面所述的方法(參見實施例3)根據(jù)CPA-FAS活性篩選。
同源物本發(fā)明的其它實施方案提供分離的編碼植物CPA-FAS同源物的核酸序列，和它們編碼的多肽。植物CPA-FAS的一些同源物的細胞內(nèi)半衰期顯著不同于相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)。例如，改變的蛋白質(zhì)對蛋白質(zhì)分解降解或?qū)е轮参顲PA-FAS破壞或滅活植物CPA-FAS的其它細胞方法更加穩(wěn)定或者更不穩(wěn)定。能夠利用這些同源物和編碼它們的基因，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的半衰期，改變植物CPA-FAS的活性。例如，短的半衰期能夠產(chǎn)生更短暫的植物CPA-FAS生物效應(yīng)。其它同源物具有類似于野生型植物CPA-FAS或者在一個或多個方面不同于野生型植物CPA-FAS的特征。
由cDNA推斷的蘋婆CPA-FAS的氨基酸序列與cDNA推斷的其它已知細菌CPA-FAS或CPA-FAS-樣蛋白質(zhì)的氨基酸序列相比較，如圖10所示。提出的S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合基序(氨基酸殘基171-179，使用大腸桿菌編號，蘋婆酶中的氨基酸殘基627-635)和催化上重要的半胱氨酸(氨基酸殘基354，使用大腸桿菌編號，蘋婆酶中的氨基酸殘基822)在所有蛋白質(zhì)中都保守。因此，在有些實施方案中，本發(fā)明提供一種植物CPA-FAS，其至少含有氨基酸基序V-L-D-I-G-C-G-W-G(S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合基序，對應(yīng)于蘋婆酶中的氨基酸殘基627-635)或與之對應(yīng)的核酸序列。在本發(fā)明的其它實施方案中，設(shè)想通過比較基序篩選可能編碼植物CPA-FAS同源物的核酸序列。在有些實施方案中，能夠分析推斷的氨基酸序列中氨基酸基序V-L-D-I-G-C-G-W-G(S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合基序，對應(yīng)于蘋婆酶中的氨基酸殘基627-635)的存在。
在本發(fā)明的組合誘變方法的一些實施方案中，排比一群植物CPA-FAS同源物的氨基酸序列，優(yōu)選地使最高同源性成為可能。變體群體可包括，例如來自一個或多個種的植物CPA-FAS同源物，或者來自同一個種但是由于突變而不同的植物CPA-FAS同源物。選擇在排比的序列的每個位點處出現(xiàn)的氨基酸，產(chǎn)生一組簡并的組合序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，組合植物CPA-FAS文庫通過編碼多肽庫的基因的簡并文庫產(chǎn)生，它們均至少包含候選植物CPA-FAS-蛋白序列的一部分。例如，合成寡核苷酸的混合物酶促連接到基因序列內(nèi)，使得這組簡并的候選植物CPA-FAS序列可表達為單個多肽，或者表達為含有該組植物CPA-FAS序列的一組較大的融合蛋白(例如噬菌體文庫)。
有許多方法，通過它們能夠由簡并寡核苷酸序列產(chǎn)生可能的植物CPA-FAS同源物的文庫。在一些實施方案中，簡并基因序列的化學(xué)合成用自動DNA合成儀進行，合成的基因連接到適當(dāng)?shù)幕蛑羞M行表達。一組簡并基因的目的在于在一種混合物中提供編碼希望的一組可能的植物CPA-FAS序列的所有序列。簡并寡核苷酸的合成在本領(lǐng)域眾所周知(參見，例如Narang(1983)Tetrahedron Lett.，393-9；Itakura等人(1981)“重組DNA”，Walton(編著)，《第三屆克利夫蘭大分子論壇論文集》(Proceedings of the 3rd Cleveland Symposium onMacromolecules)，Elsevier，Amsterdam，pp 273-289；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.，53323；Itakura等人(1984)Science1981056；Ike等人(1983)Nucl.Acid Res.，11477)。這些技術(shù)已經(jīng)用于其它蛋白質(zhì)的定向進化(參見，例如Scott等人(1980)Science，249386-390；Roberts等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，892429-2433；Devlin等人(1990)Science，249404-406；Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876378-6382；以及美國專利號5,223,409、5,198,346和5,096,815)。
植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的截短突變體另外，本發(fā)明還提供分離的編碼植物CPA-FAS片段(例如截短突變體)的核酸序列，和這些核酸序列編碼的多肽。在優(yōu)選實施方案中，植物CPA-FAS片段具有生物活性。如上所述，蘋婆CPA-FAS預(yù)期是具有不同催化活性的兩個多肽片段的自然融合體；這兩個片段催化CPA-FA的形成(羧基端，或約氨基酸397或約20氨基酸到末端的片段)或-氧化或類似的反應(yīng)(氨基端，或從開始到約氨基酸397約20氨基酸的片段)。因此，預(yù)期蘋婆CPA-FAS能夠通過眾所周知的方法截短為羧基端片段和氨基端片段(盡管每種截短片段可能彼此有大量氨基酸重疊)。預(yù)計兩個結(jié)構(gòu)域之間的截短位點位于氨基酸393-401區(qū)內(nèi)。進一步預(yù)計這些不同的片段將具有賦予的催化活性。
在本發(fā)明的一些實施方案中，當(dāng)希望表達植物CPA-FAS蛋白的一部分時，向含有欲表達的序列的寡核苷酸片段中添加一個起始密碼子(ATG)可能是必要的。本領(lǐng)域周知，N端位點的甲硫氨酸能夠用甲硫氨酸氨肽酶(MAP)酶切下來。MAP已經(jīng)從大腸桿菌(Ben-Bassat等人(1987)J.Bacterioi.，169751-757)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)中克隆，其體外活性已經(jīng)在重組蛋白上證實(Miller等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，842718-1722)。因此，希望時，通過在產(chǎn)生MAP的宿主(例如大腸桿菌或CM89或釀酒酵母)中表達這些重組多肽能夠在體內(nèi)實現(xiàn)N端甲硫氨酸的去除，或者通過使用純化的MAP在體外實現(xiàn)。
含有植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的融合蛋白本發(fā)明也提供編碼摻有全部或部分植物CPA-FAS的融合蛋白的核酸序列，和這些核酸序列編碼的多肽。在一些實施方案中，該融合蛋白含有一個植物CPA-FAS功能域，以及一個融合配偶體。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，多肽的編碼序列(例如植物CPA-FAS功能域)作為融合基因的一部分摻入，包含編碼不同多肽的核苷酸序列。在一個實施方案中，一種融合產(chǎn)物多肽將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為CPA-FA(具有合成CPA-FA能力的一種融合配偶體)。在另一個實施方案中，一種融合產(chǎn)物多肽將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為偶碳數(shù)量的CPA-FA(具有合成CPA-FA能力的一種融合配偶體，和能夠從CPA-FA上除去一個碳的第二種融合配偶體)。在另一個實施方案中，一種融合產(chǎn)物多肽將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為CPE-FA(具有合成CPA-FA能力的一種融合配偶體，和具有去飽和CPA-FA能力的第二種融合配偶體)。在另一個實施方案中，一種融合產(chǎn)物多肽將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為偶碳數(shù)量的CPE-FA(具有合成CPA-FA能力的融合配偶體，具有去飽和CPA-FA能力的第二種融合配偶體，和能夠從CPA-FA上除去一個碳的第三種配偶體)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，嵌合構(gòu)建體編碼含有植物CPA-FAS的一部分和另一種基因的一部分的融合蛋白。在有些實施方案中，該融合蛋白具有類似于野生型植物CPA-FAS的生物活性(例如至少具有植物CPA-FAS的一種希望的生物活性)。在其它實施方案中，該融合蛋白具有改變的生物活性。
在本發(fā)明的其它實施方案中，嵌合構(gòu)建體編碼含有植物CPA-FAS基因或其部分和引導(dǎo)蛋白質(zhì)到靶亞細胞位置的前導(dǎo)序列或其它信號序列的融合蛋白。這些序列在本領(lǐng)域公知，引導(dǎo)蛋白質(zhì)到如葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡形成體、高爾基網(wǎng)絡(luò)和質(zhì)膜等的位置。
除了利用融合蛋白改變生物活性外，廣泛地認為，融合蛋白也能夠利于蛋白質(zhì)的表達和/或純化，如本發(fā)明的植物CPA-FAS蛋白。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，植物CPA-FAS作為一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生(即GST融合蛋白)。預(yù)期這些GST融合蛋白使得能夠容易地純化植物CPA-FAS，如通過利用谷胱甘肽衍化的基質(zhì)(參見，例如Ausabel等人(編著)(1991)《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，NY)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，一種融合基因編碼一種純化前導(dǎo)序列，如位于植物CPA-FAS希望部分的N端的poly-(His)/腸激酶酶切位點序列，該序列允許利用Ni2+金屬樹脂通過親和層析純化表達的植物CPA-FAS融合蛋白。在本發(fā)明的另一個實施方案中，隨后通過腸激酶處理除去純化前導(dǎo)序列(參見，例如Hochuli等人(1987)J.Chromatogr.，411177；Janknecht等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888972)。在本發(fā)明的其它實施方案中，編碼添加到N(氨基)或C(羧基)端的純化序列的融合基因允許親和純化；一個例子是向植物CPA-FAS的羧基端添加一個六組氨酸標(biāo)簽，它最適于親和純化。
制備融合基因的技術(shù)眾所周知。編碼不同多肽序列的不同核酸片段的連接基本上按照常規(guī)技術(shù)進行，使用平端或交錯端進行連接，限制酶消化提供適當(dāng)?shù)哪┒?，必要時補平粘端，堿性磷酸酶處理以避免不希望的連接，以及酶促連接。在本發(fā)明的另一個實施方案中，融合基因能夠用常規(guī)技術(shù)合成，包括自動DNA合成儀。此外，在本發(fā)明的其它實施方案中，基因片段的PCR擴增用錨定引物進行，在兩個連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補的突出端，它們隨后能夠退火，產(chǎn)生嵌合基因序列(參見，例如《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，同上)。
篩選基因產(chǎn)物有大量技術(shù)在本領(lǐng)域公知，用來篩選通過點突變制備的組合文庫的基因產(chǎn)物，篩查cDNA文庫中具有某種性質(zhì)的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)通常適于快速篩查通過植物CPA-FAS同源物的組合誘變產(chǎn)生的基因文庫。最廣泛使用的篩查大基因文庫的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆到復(fù)制型表達載體中，用獲得的載體文庫轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募毎?，在一定條件下表達組合基因，其中檢測希望的活性有利于相對容易地分離編碼檢測其產(chǎn)物的基因的載體。以下描述的每種說明性測定法在必要時均進行高通量分析，以篩選通過組合誘變技術(shù)產(chǎn)生的大量簡并序列。
因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，候選植物CPA-FAS基因產(chǎn)物在細胞或病毒顆粒表面展示，具體細胞或病毒顆粒合成CPA-FAs的能力利用實施例中描述的技術(shù)測定。在本發(fā)明的其它實施方案中，將基因文庫克隆到細菌細胞表面膜蛋白的基因中，通過淘選檢測產(chǎn)生的融合蛋白(WO88/06630；Fuchs等人(1991)BioTechnol.，91370-1371；Goward等人(1992)TIBS 18136-140)。在本發(fā)明的其它實施方案中，能夠利用熒光標(biāo)記的可與植物CPA-FAS結(jié)合的分子對可能具有功能的植物CPA-FAS同源物進行評分。目視檢查細胞，在熒光顯微鏡下分離，或者在細胞形態(tài)學(xué)允許時，利用熒光激活的細胞分選儀分離。
在本發(fā)明的一個備選實施方案中，基因文庫在病毒顆粒表面表達為一種融合蛋白。例如，外源肽序列在絲狀噬菌體系統(tǒng)中的傳染性噬菌體表面表達，從而具有兩個明顯的好處。第一，由于這些噬菌體能夠以極高濃度加到親和基質(zhì)上，所以一次能夠篩選大量噬菌體。第二，由于每種傳染性噬菌體在其表面展示組合基因產(chǎn)物，如果從親和基質(zhì)上低產(chǎn)量地回收一種特定噬菌體，該噬菌體能夠通過另一輪感染擴增。幾乎相同的一組大腸桿菌絲狀噬菌體M13、fd和fl最常在噬菌體展示文庫中使用，因為噬菌體gIII或gVIII外殼蛋白都能用來產(chǎn)生融合蛋白，而不破壞病毒顆粒的最后包裝(參見，例如WO 90/02909；WO92/09690；Marks等人(1992)J.Biol.Chem.，26716007-16010；Griffths等人(1993)EMBO J.，12725-734；Clackson等人(1991)Nature，352624-628；和Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，894457-4461)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，修飾重組噬菌體抗體系統(tǒng)(例如RPAS，Pharmacia目錄號27-9400-01)，用于植物CPA-FAS組合文庫的表達和篩查。RPAS試劑盒的pCANTAB 5噬菌粒含有編碼噬菌體gIII外殼蛋白的基因。在本發(fā)明的一些實施方案中，將植物CPA-FAS組合基因文庫克隆到噬菌粒中與gIII信號序列相鄰，使其表達為gIII融合蛋白。在本發(fā)明的其它實施方案中，在連接后用噬菌粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1細胞。在本發(fā)明的其它實施方案中，隨后用M13KO7輔助噬菌體感染轉(zhuǎn)化的細胞，拯救噬菌粒及其候選植物CPA-FAS基因插入片段。產(chǎn)生的重組噬菌體含有編碼特定候選植物CPA-FAS蛋白的噬菌粒DNA，展示一個或多個拷貝的相應(yīng)融合外殼蛋白。在本發(fā)明的某些實施方案中，通過淘選選擇或富集例如能夠代謝過氧化氫的噬菌體展示的候選蛋白質(zhì)。然后分離結(jié)合的噬菌體，如果重組噬菌體至少表達一個拷貝的野生型gIII外殼蛋白，它們將保留感染大腸桿菌的能力。因此，連續(xù)幾輪大腸桿菌再感染和淘選將大大富集植物CPA-FAS同源物，然后能夠根據(jù)其它生物活性篩選，以區(qū)分激動劑和拮抗劑。
根據(jù)本公開內(nèi)容，除了以保守與非保守殘基為基礎(chǔ)的上述合理誘變之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白通常適用的其它誘變形式。例如，植物CPA-FAS同源物的產(chǎn)生及篩選能夠利用丙氨酸掃描誘變等(Ruf等人(1994)Biochem.，331565-1572；Wang等人(1994)J.Biol.Chem.，2693095-3099；Balint(1993)Gene 137109-118；Grodberg等人(1993)Eur.J.Biochem.，218597-601；Nagashima等人(1993)J.Biol.Chem.，2682888-2892；Lowman等人(1991)Biochem.，3010832-10838；和Cunningham等人(1989)Science，2441081-1085)；通過接頭掃描誘變(Gustin等人(1993)Viroi.，193653-660；Brown等人(1992)Mol.Cell.Biol.，122644-2652；McKnight等人Science，232316)；或者通過飽和誘變(Meyers等人(1986)Science，232613)。
IV.克隆的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的表達在本發(fā)明的其它實施方案中，可以利用對應(yīng)于如上所述的植物CPA-FAS基因、同源物和突變體的核酸序列產(chǎn)生引導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物在適當(dāng)宿主細胞中表達的重組DNA分子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，產(chǎn)生含有非天然存在的密碼子的植物CPA-FAS編碼核苷酸序列可能是有利的。因此，在一些優(yōu)選實施方案中，能夠選擇特定原核或真核宿主優(yōu)選的密碼子(Murray等人(1989)Nucl.Acids Res.，17)，例如提高植物CPA-FAS的表達率，或產(chǎn)生具有希望的特性(例如比天然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物半衰期更長)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。
A.用于產(chǎn)生植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的載體本發(fā)明的核酸序列可以用來通過重組技術(shù)產(chǎn)生多肽。因此，例如，為了表達一種多肽，可以在多種表達載體的任何一種中包含該核酸序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，載體包括但不限于染色體、非染色體和合成DNA序列(例如SV40衍生物，細菌質(zhì)粒，噬菌體DNA；桿狀病毒，酵母質(zhì)粒，質(zhì)粒和噬菌體DNA組合產(chǎn)生的載體，和病毒DNA，如痘苗、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病)。預(yù)期可以使用任何載體，只要它在宿主中可復(fù)制且存活。
具體而言，本發(fā)明的某些實施方案提供含有一種或多種如上所述核酸序列(例如SEQ ID NO1)的重組構(gòu)建體。在本發(fā)明的某些實施方案中，該構(gòu)建體含有一種載體，如質(zhì)?；虿《据d體，其中以正向或反向插入了本發(fā)明的核酸序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，使用多種方法之一將適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄胁迦胼d體中。通常利用本領(lǐng)域公知的方法將核酸序列插入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶位點中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道大量合適的載體，它們可以商品獲得。這些載體包括但不限于下列載體1)細菌——pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pDlO、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；2)真核——pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、PXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。也可以使用其它任何質(zhì)?；蜉d體，只要它們在宿主中可復(fù)制且存活。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，植物表達載體含有一個復(fù)制起點、一個適當(dāng)?shù)膯幼雍驮鰪娮右约叭魏伪匾暮颂求w結(jié)合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。在其它實施方案中，可以利用SV40剪接產(chǎn)生的DNA序列和聚腺苷酸化位點提供需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
在本發(fā)明的某些實施方案中，一種表達載體內(nèi)的本發(fā)明的核酸序列與引導(dǎo)mRNA合成的適當(dāng)表達控制序列(啟動子)有效連接。在本發(fā)明中有用的啟動子包括但不限于LTR或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體lambda PL和PR，T3和T7啟動子，和巨細胞病毒(CMV)直接早期，單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶，和小鼠金屬硫蛋白-I啟動子，和已知控制原核或真核細胞或其病毒中基因表達的其它啟動子。在本發(fā)明的其它實施方案中，重組表達載體包括復(fù)制起點和允許宿主細胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(例如用于真核細胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，通過向載體內(nèi)插入一個增強子序列提高高等真核生物轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明的多肽的DNA。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10-300bp，作用于啟動子提高其轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中有用的增強子包括但不限于復(fù)制起點bp 100-270遠側(cè)的SV40增強子，巨細胞病毒早期啟動子增強子，復(fù)制起點遠側(cè)的多瘤增強子，和腺病毒增強子。
在其它實施方案中，表達載體也含有一個用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點和一個轉(zhuǎn)錄終止子。在本發(fā)明的其它實施方案中，該載體也可包含適于擴增表達的序列。
B.用于生產(chǎn)植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的宿主細胞在另一個實施方案中，本發(fā)明提供含有上述任何構(gòu)建體的宿主細胞。在本發(fā)明的某些實施方案中，宿主細胞是高等真核細胞(例如植物細胞)。在本發(fā)明的其它實施方案中，宿主細胞是低等真核細胞(例如酵母細胞)。在本發(fā)明的其它實施方案中，宿主細胞是原核細胞(例如細菌細胞)。宿主細胞的具體例子包括但不限于大腸桿菌(Escherichiacoli)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的多個種，以及釀酒酵母(Saccharonaycees cerivisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyceespombe)，果蠅(Drosophila)S2細胞，夜蛾(Spodoptera)Sf9細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，猴腎成纖維細胞COS-7系(Gluzman(1981)Cell23175)，293T，C127，3T3，HeLa和BHK細胞系，NT-1(煙草細胞培養(yǎng)系)，根細胞和在rhizosecretion中培養(yǎng)的根(Gleba等人(1999)Proc Natl Acad Sci USA 965973-5977)。其它例子包括小孢子衍生的油籽油菜(oilseed rape)培養(yǎng)物(Weselake RJ和Taylor DC(1999)Prog.Lipid Res.38401)，和花粉和小孢子培養(yǎng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化。其它例子在實施例中描述。
宿主細胞中的構(gòu)建體能夠以常規(guī)方法使用，產(chǎn)生由上述本發(fā)明的任何重組序列編碼的基因產(chǎn)物。在有些實施方案中，向宿主細胞內(nèi)導(dǎo)入構(gòu)建體能夠通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔實現(xiàn)(參見，例如Davis等人(1986)《基礎(chǔ)分子生物學(xué)方法》(BasicMethods in Molecular Biology))。此外，在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的多肽也能夠用常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生。
蛋白質(zhì)能夠在適當(dāng)啟動子的控制下在真核細胞、酵母、細菌或其它細胞中表達。也能夠利用無細胞翻譯系統(tǒng)，使用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA，產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)。Sambrook等人(1989)《分子克隆實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.描述了適用于原核和真核宿主的克隆和表達載體。
在本發(fā)明的某些實施方案中，在合適的宿主株轉(zhuǎn)化且宿主株生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群螅眠m當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)選擇的啟動子(例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))，細胞再培養(yǎng)一段時間。在本發(fā)明的其它實施方案中，細胞一般通過離心收獲，用物理或化學(xué)方法破壞，保留獲得的粗提物進一步純化。在本發(fā)明的其它實施方案中，在蛋白質(zhì)表達中使用的微生物細胞能夠用任何常規(guī)方法破壞，包括凍融循環(huán)、超聲處理、機械破壞或使用細胞裂解劑。
VI.大量環(huán)丙烷脂肪酸的產(chǎn)生在本發(fā)明的一個方面，提供了生產(chǎn)大量CPA-FAs的方法。在一些實施方案中，CPA-FAs在生物體內(nèi)產(chǎn)生，該生物用編碼顯示植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性的多肽的異源基因轉(zhuǎn)化，并且在足以實現(xiàn)CPA-FAs產(chǎn)生的條件下生長。在其它實施方案中，CPA-FAs在體外產(chǎn)生，來自編碼植物CPA-FAS的核酸序列，或來自顯示植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性的多肽。
A.在轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)在本發(fā)明的某些實施方案中，CPA-FAs在體內(nèi)產(chǎn)生，方法是提供用編碼植物CPA-FAS活性的異源基因轉(zhuǎn)化的生物，并且在足以實現(xiàn)CPA-FAs產(chǎn)生的條件下生長該轉(zhuǎn)基因生物。在本發(fā)明的其它實施方案中，CPA-FAs在體內(nèi)產(chǎn)生，方法是用編碼植物CPA-FAS的異源基因轉(zhuǎn)化一種生物，并在足以實現(xiàn)CPA-FAs產(chǎn)生的條件下生長該轉(zhuǎn)基因生物。實施例中提供了轉(zhuǎn)基因生物的說明性例子。
用編碼植物CPA-FAS的異源基因轉(zhuǎn)化的生物優(yōu)選地包括以某種方式自然合成并貯存脂肪酸的生物，和商業(yè)上可以生長并且適于收獲大量脂肪酸產(chǎn)物的生物。這些生物包括但不限于細菌、含油酵母和藻類和植物。細菌的例子包括能夠在商業(yè)規(guī)模發(fā)酵罐中生長的大腸桿菌和有關(guān)細菌。植物的例子優(yōu)選地包括產(chǎn)油植物，如大豆、油菜籽和蕓苔、向日葵、棉花、玉米、可可、紅花、油椰、椰子、亞麻、蓖麻和花生。許多商品栽培種都能夠用異源基因轉(zhuǎn)化。如果不可能，則能轉(zhuǎn)化非商品植物栽培種，并且通過本領(lǐng)域公知的培育技術(shù)將表達植物CPA-FAS的性狀轉(zhuǎn)移給商品栽培種。
編碼植物CPA-FAS的異源基因，包括植物CPA-FAS的突變體或變體，包括如上所述的本發(fā)明的所有合適的序列。優(yōu)選地，異源基因存在于一種表達載體中，使得用載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)致多肽的表達；合適的載體如上文及下文所述。
轉(zhuǎn)基因生物在足以實現(xiàn)CPA-FAs產(chǎn)生的條件下生長。在本發(fā)明的某些實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物提供植物CPA-FAS的外源底物(如在發(fā)酵罐中)。這些底物包括不飽和脂肪酸；雙鍵數(shù)量為1個到1個以上，這些不飽和脂肪酸的鏈長是可變的，但是優(yōu)選地長度為約14-22碳。脂肪酸底物也可含有其它功能基團，包括但不限于乙炔鍵、偶聯(lián)的乙炔鍵和乙烯鍵、丙二烯基、呋喃環(huán)和環(huán)氧基和酮基；在一種脂肪酸中能夠發(fā)現(xiàn)這些功能基團中的兩種或兩種以上。底物是游離脂肪酸或其鹽。底物可以是本領(lǐng)域公知的多種形式；這些形式包括通過超聲處理制備的水懸液、用去污劑和其它表面活性劑制備的水懸液、底物溶解于溶劑中和干燥的底物粉末?？梢韵蛏锘蛟诎l(fā)酵罐中培養(yǎng)的細胞或組織中加入這些形式。
在本發(fā)明的其它實施方案中，一種轉(zhuǎn)基因生物包含與誘導(dǎo)型啟動子有效連接的編碼植物CPA-FAS的異源基因，在一種誘導(dǎo)劑存在下生長，或者在生長后暴露于一種誘導(dǎo)劑。在本發(fā)明的其它實施方案中，一種轉(zhuǎn)基因生物含有一種異源基因，該基因編碼與組織特異的或發(fā)育特異的啟動子有效連接的植物CPA-FAS，該生物生長到組織發(fā)育的時間點或發(fā)育特異的啟動子被激活的發(fā)育階段。這些啟動子包括種子特異性啟動子。
在備選實施方案中，構(gòu)建如上所述的轉(zhuǎn)基因生物，產(chǎn)生更大量的不飽和底物。在一個實施方案中，用編碼一種去飽和脂肪酸的蛋白質(zhì)的異源基因共轉(zhuǎn)化一種轉(zhuǎn)基因生物，使得脂肪酸去飽和酶表達。更優(yōu)選地，植物CPA-FAS和異源脂肪酸去飽和酶靶向同一細胞內(nèi)位置；最優(yōu)選地，該位置用來合成油，如植物中的微粒體。這些共轉(zhuǎn)化子然后在足以實現(xiàn)CPA-FAS產(chǎn)生的條件下生長。在本發(fā)明的某些實施方案中，共轉(zhuǎn)化子提供脂肪酸去飽和酶的外源底物；這些底物包括飽和的和不飽和脂肪酸。這些不飽和脂肪酸的鏈長是可變的，但是優(yōu)選地長度為約14-22碳。脂肪酸底物也可含有其它功能基團，包括但不限于乙炔鍵、偶聯(lián)的乙炔鍵和乙烯鍵、丙二烯基、環(huán)氧基和酮基；在一種脂肪酸中能夠發(fā)現(xiàn)這些功能基團中的兩種或兩種以上。底物是游離脂肪酸，或者是摻入較大分子內(nèi)的脂肪酸，如甘油脂類。最優(yōu)選地，脂肪酸底物被酯化成一種磷脂。底物可以如上所述提供、添加或應(yīng)用。
在其它實施方案中，異源基因在誘導(dǎo)型、組織特異的或發(fā)育特異的啟動子控制之下，生物如上所述生長，使得編碼具有脂肪酸去飽和酶和植物CPA-FAS活性的多肽的異源基因表達。
在本發(fā)明的其它實施方案中，如上所述，用編碼含有脂肪酸去飽和酶和植物CPA-FAS的融合蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化一種生物，使得這兩種酶活性都表達。這些轉(zhuǎn)基因生物如上所述生長。
在本發(fā)明的其它實施方案中，宿主生物是產(chǎn)生大量底物的生物。例如，預(yù)期油酸鹽是蘋婆CPA-FA的一種優(yōu)選底物；因此，一種特別合適的宿主是產(chǎn)生高比例油酸的宿主。這些宿主包括培育的產(chǎn)生高油酸油的植物系，如向日葵或玉米；這些系由個別的植物產(chǎn)生，其中選擇自然低水平的FAD2，以及進行誘變隨后根據(jù)降低的FAD2活性選擇的植物，和經(jīng)歷敲除技術(shù)的植物，其中通過反義或共抑制沉默F(xiàn)AD2。在其它系中，通過上述任何方法，短鏈脂肪酸的合成也減少，導(dǎo)致油酸表達提高。也可以組合任何這些修飾，產(chǎn)生具有更高油酸含量的植物系。
在本發(fā)明的其它實施方案中，產(chǎn)生大量CPA-FAs的方法還包括收集產(chǎn)生的CPA-FAs。這些方法在本領(lǐng)域公知，包括收獲轉(zhuǎn)基因生物及提取CPA-FAs(參見，例如Christie，W.W(1982)《脂類分析》(LipidAnalysis)，第二版(Pergamon Press，Oxford)；和Kates，M(1986)《脂學(xué)技術(shù)》(Techniques of Lipidoiogy)(Elsevier，Amsterdam))。提取方法優(yōu)選地包括溶劑抽提，一般包括在溶劑抽提之前如通過剁碎(chopping)、切碎、研磨和/或超聲處理破壞細胞。在一個實施方案中，按照Bligh和Dyer(1959)(Can J Biochem Physiol 37911-917)的方法從組織中提取脂類；酯化為甘油脂類的脂肪酸在酸或堿性條件下能夠水解，并通過溶劑抽提收集。在本發(fā)明的其它實施方案中，例如通過薄層液相層析、氣-液相層析或高壓液相層析進一步純化CPA-FAs。
1.轉(zhuǎn)基因植物、種子和植物部分按照本領(lǐng)域公知的方法，植物用編碼植物CPA-FAS的異源基因轉(zhuǎn)化，或者用編碼植物CPA-FAS的第一種異源基因和編碼脂肪酸去飽和酶的第二種異源基因共轉(zhuǎn)化，或者用一種融合基因轉(zhuǎn)化，該融合基因編碼一種表達植物CPA-FAS和脂肪酸去飽和酶活性的融合多肽?？梢灶A(yù)期，該異源基因用來提高該異源基因編碼的酶活性水平。
a.植物本發(fā)明的方法不限于任何具體植物。實際上，設(shè)想使用多種植物，包括但不限于西紅柿、馬鈴薯、煙草、胡椒、水稻、玉米、大麥、小麥、蕓苔、擬南芥、向日葵、大豆、白楊和松樹。優(yōu)選的植物包括產(chǎn)油種，它們是在特定器官(主要是種子)中產(chǎn)生并貯存三?；视偷闹参锓N。這些種包括但不限于大豆(Glycine max)、油菜籽和蕓苔(包括蕓苔(Brassica napus)和野油菜(B.campestris))，向日葵(Helianthusannus)，棉花(陸地棉(Gossypiurn hirsutum))、玉米(玉蜀黍(Zea mays))，可可(Theobroma cacao)，紅花(Carthamus tinctorius)，油椰(Elaeisguineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亞麻(linum usitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和落花生(Arachis hypogaea)。該組也包括在發(fā)展適當(dāng)表達載體中有用的非農(nóng)業(yè)種，如煙草、快循環(huán)蕓苔屬的種，和擬南芥，和可以作為獨特脂肪酸來源的野生種。優(yōu)選的植物系包括如上所述的高單不飽和化合物的、特別是高油酸的植物。特別優(yōu)選的植物系是具有高油酸背景的油籽作物系。高油酸背景能夠如下產(chǎn)生使用通過培育和/或誘變產(chǎn)生的現(xiàn)有的植物系(例如高油酸向日葵系和高油酸油菜籽系)，或者使用遺傳工程系，如通過fad2共抑制產(chǎn)生的高油酸大豆，或使用OLE1基因降低飽和度。
b.載體本發(fā)明的方法預(yù)期使用如上所述編碼植物CPA-FAS的異源基因。本發(fā)明的方法還涉及使用編碼一種脂肪酸去飽和酶的第二種異源基因；這些多肽已知(參見，例如，Polashock JJ，Chin C-K，Martin CE(1992)Plant Physiol.100894-901，描述了酵母delta-9脂肪酸去飽和酶在煙草中的表達。酵母delta-9脂肪酸去飽和酶是OLE1基因，它能夠提高植物組織中16:1和18:1的水平)。編碼脂肪酸去飽和酶突變體和變體的異源基因如上關(guān)于植物CPA-FAS所述制備。編碼融合CPA-FAS/脂肪酸去飽和酶的異源基因如上所述制備。
準(zhǔn)備在植物中表達的異源基因首先在含有一個啟動子的表達盒中裝配?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法構(gòu)建含有異源基因和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。這些技術(shù)在本領(lǐng)域廣泛描述(參見，例如Sambrook.等人(1989)《分子克隆實驗室手冊》，Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.，和Ausubel，F(xiàn).M.等人(1989)《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，John Wiley & Sons，New York，N.Y)。
這些載體通常含有編碼植物CPA-FAS的本發(fā)明的核酸序列(如上所述)，該序列與在植物中表達所需的啟動子和其它調(diào)節(jié)序列(例如增強子、聚腺苷酸化信號等)有效連接。
啟動子包括但不限于組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S；來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶(“LAP”，Chao等人(1999)Plant Physiol 120979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；一種西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動子(美國專利5,187,267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(美國專利5,057,422)；種子特異性啟動子，如種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的啟動子(Beachy等人(1985)EMBO J.43047-3053))。此處引用的所有參考文獻均全文引用。
該表達盒還可含有mRNA表達所需的任何序列。這些序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄終止子，增強子，如內(nèi)含子，病毒序列，和旨在將基因產(chǎn)物靶向特定細胞器和細胞區(qū)室的序列。
多種轉(zhuǎn)錄終止子可以在使用本發(fā)明的啟動子的序列表達中使用。轉(zhuǎn)錄終止子引起超出轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄終止及其正確的聚腺苷酸化。合適的轉(zhuǎn)錄終止子和已知在植物中起作用的終止子包括但不限于CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如Odell等人(1985)Nature 313810；Rosenberg等人(1987)Gene，56125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.，262141；Proudfoot(1991)Cell，64671；Sanfacon等人Genes Dev.，5141；Mogen等人(1990)Plant Cell，21261；Munroe等人(1990)Gene，91151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.177891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.，159627)。
另外，在一些實施方案中，用于表達目的基因的構(gòu)建體包含一種或多種序列，發(fā)現(xiàn)這些序列可以提高轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達。這些序列能夠與目的核酸序列聯(lián)合使用，以提高植物中的表達。已經(jīng)顯示有多種內(nèi)含子序列可以提高尤其在單子葉植物中的表達。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)玉米Adh1基因的內(nèi)含子在導(dǎo)入玉米細胞中后可顯著提高野生型基因在其同源啟動子下的表達(Calais等人(1987)Genes Develop.11183)。內(nèi)含子序列常規(guī)摻入植物轉(zhuǎn)化載體內(nèi)，一般在非翻譯前導(dǎo)序列內(nèi)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，用于表達目的核酸序列的構(gòu)建體也包含調(diào)節(jié)子，如核定位信號(Calderone等人(1984)Cell 39499；Lassoer等人(1991)Plant Molecular Biology 17229)、植物翻譯共有序列(Joshi(1987)Nucleic Acids Research 156643)、內(nèi)含子(Luehrsen和Walbot(1991)Mol.Gen.Genet.22581)等，它們與編碼植物CPA-FAS的核酸序列有效連接。
在制備含有編碼植物CPA-FAS的核酸序列的構(gòu)建體時，能夠操作不同的DNA片段，以便以希望的方向(例如有義或反義)、必要時在希望的閱讀框中提供DNA序列。例如，能夠使用連接體(adapter)或接頭連接DNA片段，或者能夠利用其它操作提供合適的限制酶切位點，除去多余的DNA，除去限制酶切位點等。為此，優(yōu)選地使用體外誘變、引物修復(fù)、限制酶切、退火、切除、連接等，其中包括插入、缺失或置換(例如轉(zhuǎn)換和顛換)。
有大量轉(zhuǎn)化載體可用于植物轉(zhuǎn)化。所用載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的靶種。對于某些靶種，優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇性標(biāo)記。在轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇性標(biāo)記包括提供卡那霉素及有關(guān)抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra(1982)Gene 19259；Bevan等人(1983)Nature 304184)，提供除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人(1990)Nucl Acids Res.181062；Spencer等人(1990)Theor.Appl.Genet.79625)，提供抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochlinger和Diggeimann(1984)Mol.Cell.Biol.42929)，和提供氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人(1983)EMBO J.，21099)。
在一些優(yōu)選實施方案中，改造載體使其適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法(參見，例如美國專利號5,981,839；6,051,757；5,981,840；5,824,877；和4,940,838；均在此引用作為參考)。重組Ti和Ri質(zhì)粒的構(gòu)建通常按照一般用于多種細菌載體如pBR322的方法。另外可以使用有時在天然質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的、有時由外源序列構(gòu)建的輔助遺傳元件?？砂ǖ幌抻诳股乜剐越Y(jié)構(gòu)基因，如選擇基因。
現(xiàn)在有兩個系統(tǒng)正在使用重組Ti和Ri質(zhì)粒載體系統(tǒng)。第一個系統(tǒng)被稱為“共整合”系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，含有目的基因的穿梭載體通過基因重組插入非致癌Ti質(zhì)粒中，該質(zhì)粒含有植物轉(zhuǎn)化所需的順式作用和反式作用元件，如pMLJl穿梭載體和非致癌Ti質(zhì)粒pGV3850。第二個系統(tǒng)被稱為“二元”系統(tǒng)，其中使用兩種質(zhì)粒；目的基因插入含有植物轉(zhuǎn)化所需順式作用元件的穿梭載體內(nèi)。其它輔助功能由非致癌Ti質(zhì)粒順式提供，如pBIN19穿梭載體和非致癌Ti質(zhì)粒PAL4404。這些載體中的一些可以商品獲得。
在本發(fā)明的其它實施方案中，目的核酸序列被靶向植物基因組上的特定基因座。目的核酸序列向植物細胞基因組內(nèi)的定向整合例如可以使用農(nóng)桿菌衍生序列通過同源重組實現(xiàn)。植物細胞通常與一種農(nóng)桿菌菌株溫育，該菌株含有一種靶向載體，其中與靶基因座內(nèi)的DNA序列同源的序列側(cè)翼為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)序列，如前所述(美國專利號5,501,967)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，同源重組可以利用靶向載體實現(xiàn)，該載體內(nèi)含有與靶向的植物基因的任一部分同源的序列，無論它是屬于基因的調(diào)節(jié)元件，還是基因的編碼區(qū)。同源重組可以在植物基因的任一區(qū)域?qū)崿F(xiàn)，只要靶向位點側(cè)翼區(qū)域的核酸序列已知。
在其它實施方案中，利用本發(fā)明的核酸構(gòu)建來源于植物(+)RNA病毒的載體(例如雀麥花葉病毒、煙草花葉病毒、紫花苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、西紅柿花葉病毒及其組合和雜種)。通常，插入的本發(fā)明的植物CPA-FAS多核苷酸能夠從這些載體表達為融合蛋白(例如外殼蛋白融合蛋白)或者從其自身的亞基因組啟動子或其它啟動子表達。這些病毒的構(gòu)建及使用方法在美國專利號5,846,795；5,500,360；5,173,410；5,965,794；5,977,438；和5,866,785中描述，均在此引用作為參考。
在本發(fā)明的某些實施方案中，目的核酸序列直接導(dǎo)入一種植物中。一種可用于直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的載體與通過除草劑Basta(或磷絲菌素)選擇聯(lián)合使用，是質(zhì)粒pCIB246的一種修飾形式，其含有一個CaMV 35S啟動子，與大腸桿菌GUS基因和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子有效融合(WO 93/07278)。
c.轉(zhuǎn)化技術(shù)一旦編碼植物CPA-FAS的核酸序列與一種合適的啟動子有效連接，并插入適用于具體轉(zhuǎn)化技術(shù)的載體中(例如上述載體之一)，即可利用本領(lǐng)域公知的多種方法將上述重組DNA導(dǎo)入植物細胞內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，方法的選擇取決于為轉(zhuǎn)化而靶向的植物類型。在有些實施方案中，載體保持在附加體上。在其它實施方案中，載體整合到基因組內(nèi)。
在一些實施方案中，利用質(zhì)體基因組內(nèi)的直接轉(zhuǎn)化將載體導(dǎo)入植物細胞中(參見，例如美國專利號5,451,513；5,545,817；5,545,818；PCT申請WO 95/16783)。葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括向合適的靶組織中導(dǎo)入位于選擇性標(biāo)記側(cè)翼的克隆的質(zhì)體DNA區(qū)以及編碼目的RNA序列的核酸(例如利用biolistics或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，使用氯化鈣或PEG)。1-1.5kb側(cè)翼區(qū)，被稱為靶向序列，有利于與質(zhì)體基因組同源重組，從而允許質(zhì)體基因組(plastome)特定區(qū)域的置換或修飾。最初，使用提供大觀霉素和/或鏈霉素抗性的葉綠體16S rRNA和rps12基因的點突變作為轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(Svab等人(1990)PNAS，878526；Staub和Maliga，(1992)Plant Cell，439)。這些標(biāo)記之間克隆位點的存在允許產(chǎn)生一種導(dǎo)入外源DNA分子的質(zhì)體靶向載體(Staub和Maliga(1993)EMBO J.，12601)。將隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替換為一種顯性選擇性標(biāo)記，編碼大觀霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷轉(zhuǎn)移酶的細菌aadA基因，轉(zhuǎn)化頻率大大提高(Svab和Maliga(1993)PNAS，90913)。可用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的其它選擇性標(biāo)記在本領(lǐng)域公知，包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。獲得質(zhì)體基因組同質(zhì)的植物，其中含有被本發(fā)明的啟動子隔開的兩個核酸序列，能夠優(yōu)先高表達DNA分子編碼的RNA。
在其它實施方案中，使用機械轉(zhuǎn)移重組DNA的微量移液器，將用于實施本發(fā)明的載體直接顯微注射到植物細胞內(nèi)(Crossway(1985)Mol.Gen.Genet，202179)。在其它實施方案中，將載體轉(zhuǎn)移到植物細胞內(nèi)的方法包括使用聚乙二醇(Krens等人(1982)Nature，29672；Crossway等人(1986)BioTechniques，4320)；原生質(zhì)體與其它實體(小細胞、細胞、溶酶體或其它可融合的脂表面體)融合(Fraley等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，791859)；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(EP 0 292 435)；直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.，32717；Hayashimoto等人(1990)Plant Physiol.93857)。
在其它實施方案中，也可以通過電穿孔將載體導(dǎo)入植物細胞中(Fromm等人(1985)Pro.Natl Acad.Sci.USA 825824；Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835602)。利用這種技術(shù)，在含有該基因構(gòu)建體的質(zhì)粒存在下電穿孔植物原生質(zhì)體。高場強的電脈沖可逆地透化生物膜，允許質(zhì)粒的導(dǎo)入。電穿孔的植物原生質(zhì)體改變了細胞壁，分裂，并形成植物愈傷組織。
在其它實施方案中，利用裝置(例如，可獲自Agracetus，Inc.，Madison，Wis.and Dupont，Inc.，Wilmington，Del)通過ballistic粒子加速導(dǎo)入載體(參見，例如美國專利號4,945,050；和McCabe等人(1988)Biotechnology 6923)。參見Weissinger等人(1988)Annual Rev.Genet.22421；Sanford等人(1987)Particulate Science andTechnology，527(洋蔥)；Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878526(煙草葉綠體)；Christou等人(1988)Plant Physiol.，87671(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6923(大豆)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854305(玉米)；Klein等人(1988)Bio/Technology，6559(玉米)；Klein等人(1988)Plant Physiol.，914404(玉米)；Fromm等人(1990)Bio/Technology，8833；和Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell，2603(玉米)；Koziel等人(1993)Biotechnology，11194(玉米)；Hill等人(1995)Euphytica，85119和Koziel等人(1996)Annals of the New York Academy ofSciences 792164；Shimamoto等人(1989)Nature 338274(水稻)；Christou等人(1991)Biotechnology，9957(水稻)；Datta等人(1990)Bio/Technology 8736(水稻)；歐洲專利申請EP 0 332 581(鴨茅和其它Pooideae科)；Vasil等人(1993)Biotechnology，111553(小麥)；Weeks等人(1993)Plant Physiol.，1021077(小麥)；Wan等人(1994)PlantPhysiol.10437(大麥)；Jahne等人(1994)Theor.Appl.Genet.89525(大麥)；Knudsen和Muller(1991)Planta，185330(大麥)；Umbeck等人(1987)Bio/Technology 5263(棉花)；Casas等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011212(高粱)；Somers等人(1992)Bio/Technology101589(燕麥)；Torbert等人(1995)Plant Cell Reports，14635(燕麥)；Weeks等人(1993)Plant Physiol.，1021077(小麥)；Chang等人，WO 94/13822(小麥)；和Nehra等人(1994)The Plant Journal，5285(小麥)。
除了直接轉(zhuǎn)化之外，在一些實施方案中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移含有編碼本發(fā)明的植物CPA-FAS的核酸序列的載體(Hinchee等人(1988)Biotechnology，6915；Ishida等人(1996)NatureBiotechnology 14745)。農(nóng)桿菌屬是革蘭氏陰性Rhizomaceae科的一個代表性屬。它的種引起植物腫瘤，如冠癭病和毛根病。在腫瘤特有的去分化組織中，被稱為冠癭氨基酸的氨基酸衍生物產(chǎn)生并分解代謝。引起冠癭氨基酸表達的細菌基因是嵌合表達盒的控制元件的一個方便的來源。利用根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，能夠?qū)愒椿蛐蛄?例如與本發(fā)明的啟動子有效連接的核酸序列)導(dǎo)入合適的植物細胞內(nèi)。在根瘤農(nóng)桿菌感染后，Ti質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到植物細胞中，并且穩(wěn)定整合于植物基因組內(nèi)(Schell(1987)Science，2371176)。易被農(nóng)桿菌感染的種可以在體外轉(zhuǎn)化。此外，植物也可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化，如利用農(nóng)桿菌侵入成年植物轉(zhuǎn)化整個植物，如“花浸(floral dip)”法(Bechtold N，Ellis J，Pelletier G(1993)Cr.Acad.Sci.Ill-Vie 3161194-1199)。
d.再生在篩選能夠表達編碼植物CPA-FAS的異源基因的轉(zhuǎn)化植物材料后，再生為整個植物。Evans等人(1983)《植物細胞培養(yǎng)手冊》(Handbook of Plant Cell Cultures)，第一卷(MacMillan Publishing Co.NewYork)；和VasilI.R.(編著)，《植物細胞培養(yǎng)和體細胞遺傳學(xué)》(CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants)，Acad.Press，Orlando，第一卷(1984)和第三卷(1986)描述了由培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生為植物。眾所周知，許多植物能夠由培養(yǎng)的細胞或組織再生，包括但不限于甘蔗、甜菜、棉花、水果和其它樹木、莢果和蔬菜和單子葉植物(例如上述植物)的所有主要種。再生方法隨植物的種而不同，但是通常首先提供含有異源基因拷貝的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的懸液。形成愈傷組織，可從愈傷組織中發(fā)芽，隨后生根。
此外，胚的形成能夠由原生質(zhì)體懸液誘發(fā)。這些胚萌芽并形成成熟的植物。培養(yǎng)基通常含有不同的氨基酸和激素，如生長素和細胞分裂素。芽和根通常同時發(fā)育。有效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)史。再生的可重復(fù)性取決于這些變量的控制。
e.轉(zhuǎn)基因系的產(chǎn)生通過組織培養(yǎng)繁殖由轉(zhuǎn)基因植物建立轉(zhuǎn)基因系。通過傳統(tǒng)植物培育技術(shù)，可以使編碼本發(fā)明的外源植物CPA-FAS(包括突變體和變體)的核酸序列的存在轉(zhuǎn)移到有關(guān)的變種中。
然后用這些轉(zhuǎn)基因系評價油的產(chǎn)生和其它農(nóng)學(xué)性狀。
B.體外系統(tǒng)在本發(fā)明的其它實施方案中，CPA-FAs由編碼植物CPA-FAS的核酸序列或顯示植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性的多肽在體外產(chǎn)生。
1.使用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的核酸序列在本發(fā)明的一些實施方案中，產(chǎn)生大量CPA-FAs的方法包括在足以導(dǎo)致產(chǎn)生CPA-FAs的條件下向體外表達系統(tǒng)中加入分離的編碼植物CPA-FAS的核酸序列。分離的編碼植物環(huán)丙烷的核酸序列是如上所述的任何合適的本發(fā)明的序列，優(yōu)選地在一種表達載體內(nèi)提供，以致向一種體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中加入該載體導(dǎo)致該多肽的表達。該系統(tǒng)還包括植物CPA-FAS的底物，如上所述。此外，該系統(tǒng)還包括產(chǎn)生植物CPA-FAS的底物的手段。這些手段包括但不限于提供至少一種顯示脂肪酸去飽和酶活性的蛋白質(zhì)，和脂肪酸去飽和酶的底物，如上所述。
在本發(fā)明的其它實施方案中，產(chǎn)生大量CPA-FAs的方法還包括收集產(chǎn)生的CPA-FAs。這些方法在本領(lǐng)域公知。在本發(fā)明的其它實施方案中，CPA-FAs進一步純化，例如利用薄層層析、氣-液相層析或高壓液相層析純化。
2.使用植物環(huán)丙烷合酶多肽在本發(fā)明的一些實施方案中，產(chǎn)生大量CPA-FAs的方法包括在足以導(dǎo)致CPA-FAs合成的條件下溫育植物CPA-FAS；這種溫育通常在含有植物CPA-FAS的混合物中進行。
如上所述的植物CPA-FAS如下獲得如上所述，從編碼植物CPA-FAS的異源基因轉(zhuǎn)化的生物中純化自然存在的植物CPA-FAS或重組植物CPA-FAS。自然存在的植物CPA-FAS的來源預(yù)計包括但不限于植物，如錦葵科、梧桐科、木棉科、Tilaceae、含羞草科和無患子科。重組植物CPA-FAS的來源是如上所述用編碼植物CPA-FAS的異源基因轉(zhuǎn)化的植物、細菌或其它轉(zhuǎn)基因生物。重組植物CPA-FAS可能包括改善純化的方法，例如如上所述向蛋白質(zhì)C端添加一個六組氨酸尾。此外，植物CPA-FAS也可化學(xué)合成。
溫育混合物還包含如上所述的植物CPA-FAS的底物。此外，該混合物還包括產(chǎn)生植物CPA-FAS的底物的手段。這些手段包括但不限于提供至少一種顯示脂肪酸去飽和酶活性的蛋白質(zhì)，和脂肪酸去飽和酶的合適底物，如上所述。其它底物包括但不限于磷脂合成的底物，如溶血磷脂和磷脂?；D(zhuǎn)移酶，以及含有脂轉(zhuǎn)移蛋白的磷脂脂質(zhì)體；特別優(yōu)選的磷脂是磷脂酰膽堿。
在本發(fā)明的其它實施方案中，產(chǎn)生大量CPA-FAs的方法還包括收集產(chǎn)生的CPA-FAs；這些方法如上所述。
VII.通常不存在的環(huán)丙烷脂肪酸的產(chǎn)生在本發(fā)明的另一個方面，提供在通常不含或含有極低水平的CPA-FAs的生物和/或組織中產(chǎn)生CPA-FAs的方法。在此方面，在如下生物中產(chǎn)生CPA-FAs，該生物用編碼顯示植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性的多肽的異源基因轉(zhuǎn)化，并且在足以實現(xiàn)CPA-FAs產(chǎn)生的條件下生長。在有些實施方案中，該方法包括在特定組織或器官(如植物根)中產(chǎn)生CPA-FAs。在其它實施方案中，該方法包括在特定發(fā)育階段產(chǎn)生CPA-FAs。在其它實施方案中，該方法包括在特定發(fā)育階段在特定組織或器官中產(chǎn)生CPA-FAs。
在此方面，預(yù)計CPA-FAs起生理作用。例如，預(yù)計CPA-FAs使植物的根具有真菌抗性。因此，在通常不含CPA-FAs或含有極低水平的CPA-FAs的植物根中表達CPA-FAS使真菌抗性提高。
在本發(fā)明的一些實施方案中，這些方法包括提供一種轉(zhuǎn)基因生物，該生物包含與一個誘導(dǎo)型啟動子有效連接的編碼植物CPA-FAS的異源基因，以及在一種誘導(dǎo)劑存在下生長該轉(zhuǎn)基因生物，或者在該生物生長后暴露于一種誘導(dǎo)劑，從而表達CPA-FAS，導(dǎo)致CPA-FAs的產(chǎn)生。在本發(fā)明的其它實施方案中，這些方法包括提供一種轉(zhuǎn)基因生物，該生物含有與一個組織特異性或發(fā)育特異性啟動子有效連接的編碼植物CPA-FAS的異源基因，使該轉(zhuǎn)基因生物生長到組織發(fā)育的時間點或發(fā)育特異性啟動子被激活時的發(fā)育階段，從而表達CPA-FAS，導(dǎo)致CPA-FAs的產(chǎn)生。代表性啟動子包括但不限于種子特異性啟動子。
編碼植物CPA-FAS，包括植物CPA-FAS的突變體或變體的異源基因，包括如上所述的本發(fā)明的任何合適的序列。優(yōu)選地，該異源基因在表達載體內(nèi)提供，使得用載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)致多肽的表達；合適的載體如上文及下文所述。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物，特別是轉(zhuǎn)基因植物的方法如上所述。
VIII.植物中植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性的操作如上所述，CPE-FAs被認為是食用油中的一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，而含有CPE-FAs的許多種子脂類被人類(特別是在熱帶地區(qū))以及動物大量消費(例如棉籽粉是一種典型的動物飼料產(chǎn)品，是為了獲得油加工棉籽的副產(chǎn)品)。由于這些健康方面的擔(dān)心，含有CPE-FAs的植物油在消費前必須高溫處理或氫化。這些處理增加了油加工的成本，也導(dǎo)致了由于氫化產(chǎn)生的一定百分比的反式脂肪酸；這些反式脂肪酸的存在也是不希望的。因此，本發(fā)明提供從種子油中去除CPE-FAs的方法，以及產(chǎn)生CPE-FAs水平降低的油的植物，和CPE-FAs水平降低的油，它們沒有為了降低CPE-FAs水平進行高溫處理或氫化，含有低水平的反式脂肪酸。本發(fā)明的這些方面在顯著降低油加工成本，減少不希望的氫化脂肪酸的含量，以及提高未加工的種子和加工的食用種子粉的種子油的價值方面，具有極大的用途。本發(fā)明的某些實施方案提供通過環(huán)丙烷合酶基因沉默技術(shù)降低植物種子油中CPE-FAs含量的方法。其它實施方案提供通過環(huán)丙烷合酶基因沉默技術(shù)降低棉籽油中CPE-FAs含量的方法。
進一步預(yù)期，編碼本發(fā)明的植物CPA-FAS的核酸可以用來提高或降低(與野生型細胞中的水平相比)轉(zhuǎn)染細胞中植物CPA-FASmRNA和/或蛋白質(zhì)的水平。這些轉(zhuǎn)基因細胞具有極大用途，包括但不限于關(guān)于植物CPA-FAS過量表達的作用以及關(guān)于植物CPA-FAS表達不足或缺乏的作用的進一步研究。
因此，在有些實施方案中，通過上述方法在植物中表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物、植物組織或植物細胞中植物CPA-FAS過量表達。
在本發(fā)明的其它實施方案中，植物CPA-FAS多核苷酸用來降低(與野生型植物、植物組織或植物細胞相比)轉(zhuǎn)基因植物、植物組織或植物細胞中植物CPA-FAS蛋白或mRNA的水平。一種減少植物CPA-FAS表達的方法利用反義轉(zhuǎn)錄物的表達。反義RNA用來以組織特異的方式抑制植物靶基因(例如，van der Krol等人(1988)Biotechniques 6958-976)。反義抑制顯示使用整個cDNA序列以及部分cDNA序列(例如，Sheehy等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA858805-8809；Cannon等人(1990)Plant Mol.Biol.1539-47)。也有證據(jù)表明，含有1.87kb cDNA的少至41個堿基對的3′非編碼序列片段和5′編碼序列片段，在反義抑制中可能起重要作用(Ch′ng等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610006-10010)。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的編碼植物CPA-FAS的核酸(例如SEQ ID NO1及其片段和變體)定向于載體中并且表達，產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄物。為了實現(xiàn)這一點，克隆來自希望的基因的核酸片段，并與一個啟動子有效連接，使得RNA的反義鏈轉(zhuǎn)錄。然后用表達盒轉(zhuǎn)化植物，產(chǎn)生RNA的反義鏈。將要導(dǎo)入的核酸片段與將要抑制的內(nèi)源基因的至少一部分通?；鞠嗤?。然而，該序列不是必須完全相同才能抑制表達。能夠設(shè)計本發(fā)明的載體，使得抑制作用施加于顯示與靶基因有同源性或基本同源性的一個基因家族內(nèi)的其它蛋白質(zhì)。
此外，對于反義抑制，導(dǎo)入的序列相對于初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA也不必是全長的。通常能夠用較高的同源性補償較短序列的使用。此外，導(dǎo)入的序列不必含有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，非編碼片段的同源性可能同樣有效。通常應(yīng)當(dāng)使用約30或40個核苷酸的或大約全長核苷酸的序列，但是至少約100個核苷酸的序列是優(yōu)選的，至少約200個核苷酸的序列是更優(yōu)選的，至少約500個核苷酸的序列是特別優(yōu)選的。
催化RNA分子或核酶也能夠用來抑制靶基因的表達。能夠設(shè)計與實際上所有靶RNA均特異配對，并且在特定位點切割磷酸二酯主鏈，從而在功能上滅活靶RNA的核酶。在進行這種切割后，核酶本身不改變，因而能夠再環(huán)化并切割其它分子，使其成為一種真正的酶。反義RNA內(nèi)含有核酶序列使得它們具有RNA切割活性，從而提高了構(gòu)建體的活性。
已經(jīng)鑒定了大量類別的核酶。一類核酶來源于大量能夠自切割并在植物中復(fù)制的小環(huán)形RNA。這些RNA單獨復(fù)制(類病毒RNA)或與輔助病毒一起復(fù)制(衛(wèi)星RNA)。例子包括來自鱷梨白斑病類病毒的RNA，和來自煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿短暫條紋病毒、絨樣煙草斑點病毒、茄斑點病毒和地三葉斑點病毒的衛(wèi)星RNA。Haseloff等人(1988)Nature 334585-591描述了靶RNA特異的核酶的設(shè)計和用途。也描述了靶向脂類生物合成基因的mRNA的核酶，導(dǎo)致靶酶底物可遺傳地增加(Merlo AO等人(1998)Plant Cell 101603-1621)。
減少CPA-FAS表達的另一種方法是利用共抑制或基因沉默現(xiàn)象(參見，例如美國專利號6,063,947，在此引用作為參考)。共抑制現(xiàn)象也已用來以組織特異的方式抑制植物靶基因。已知使用全長cDNA序列以及部分cDNA序列(1770bp cDNA的730bp)共抑制內(nèi)源基因(例如，Napoli等人(1990)Plant Cell 2279-289；van der Krol等人(1990)Plant Cell 2291-299；Smith等人(1990)Mol.Gen.Genetics224477-481)。因此，在有些實施方案中，編碼本發(fā)明的植物CPA-FAS的核酸序列(例如包含SEQ ID NOs1，及其片段和變體)在另一個植物種中表達，以實現(xiàn)同源基因的共抑制。
在希望表達受到抑制時，導(dǎo)入的序列通常有一些轉(zhuǎn)錄。當(dāng)導(dǎo)入的序列本身不含編碼序列，而只含有與內(nèi)源基因初級轉(zhuǎn)錄物中存在的序列同源的內(nèi)含子或非翻譯序列時，可能發(fā)生這種作用。導(dǎo)入的序列與將要抑制的內(nèi)源序列通常基本相同。這種最小同一性一般高于約65％，但是更高的同一性可能更有效地抑制內(nèi)源序列。超過約80％的大大提高的同一性是優(yōu)選的，而大約95％到絕對同一性是最優(yōu)選的。至于反義調(diào)節(jié)，這種作用應(yīng)當(dāng)施加于顯示同源性或基本同源性的類似基因家族內(nèi)的其它蛋白質(zhì)。
為了共抑制，導(dǎo)入表達盒內(nèi)的序列，需要低于絕對同一性，相對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA，也不必是全長的。為了避免同時產(chǎn)生過量表達的某些植物，這可能是優(yōu)選的。短于全長序列的更高同一性補償較長的同一性較低的序列。此外，導(dǎo)入的序列也不需要含有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，非編碼片段的同一性同樣有效。反義調(diào)節(jié)通常使用上述大小范圍的序列。
一種有效的負調(diào)節(jié)基因的方法是使用發(fā)夾RNA構(gòu)建體。為有效、高通量基因沉默設(shè)計這種構(gòu)建體的指南已經(jīng)描述(Wesley SV等人(2001)Plant J.27581-590)。減少基因(內(nèi)源或外源的)表達的另一種方法是通過siRNA。siRNA能夠應(yīng)用于植物并被植物細胞吸收；此外，siRNA也能夠由一種表達盒在體內(nèi)表達。
實驗提供下列實施例是為了證明并進一步說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，不能視為限制其范圍。
在下列實驗公開內(nèi)容中使用下列縮寫N(正常)；M(體積摩爾)；mM(毫體積摩爾)；μM(微體積摩爾)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；pmol(皮摩爾)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；am(納米)；℃(攝氏度)；PCR(聚合酶鏈反應(yīng))；RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶-PCR)；TAIL-PCR(熱不對稱交錯-PCR)；EST，表達序列標(biāo)簽；BLAST；FAME，脂肪酸甲酯；GC/MS，氣相色譜/質(zhì)譜；TLC，薄層層析；SC介質(zhì)；NT介質(zhì)；MES；2，4-D；CPA-FA，環(huán)丙烷脂肪酸；CPE-FA，環(huán)丙烯脂肪酸；DHSA，二氫蘋婆酸；SCPA-FAS，蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶；MSU，密歇根州立大學(xué)。
實施例1實驗方法材料發(fā)育種子從1998年7月20日到10月15日在邁阿密Montgomery植物學(xué)中心(Florida USA 33156-4242)采集發(fā)育的臭蘋婆種子。在收到新鮮的種子后，除去種子的外殼，立即用新鮮的子葉和胚進行標(biāo)記實驗，或者凍存于-80℃，隨后進行RNA提取和脂類分析。
煙草懸浮細胞煙草懸浮細胞(煙草亮黃2栽培種)保存于含有Murashige和Skoog堿鹽(Gibco，Grand island，NY)、3％蔗糖、2.5mM MES/KOH pH5.7、1mg/ml硫胺素、1mg/ml肌醇和1μM 2，4-D的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物每周用來自7天培養(yǎng)物的5％(v/v)接種物傳代培養(yǎng)，在200ml搖瓶中28℃振搖。
化學(xué)物質(zhì)放射性同位素，L-[甲基-14C]甲硫氨酸(55mCi/mmol)，[1-14C]乙酸(55mCi/mmol)和[1-14C]油酸(50mCi/mmol)購自AmericanRadiolabeled Chemicals，Inc.。
脂類分析為了測定蘋婆種子發(fā)育過程中的脂肪酸積累，在脂類抽提前向200mg種子組織(鮮重)中加入2mg三酰基甘油(13:0-1.89mg)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。在每個發(fā)育階段，按照Bligh和Dyer(1959)Can J BiochemPhysiol 37，911-917)的方法抽提脂類。脂肪酸甲酯(FAMES)如下制備將一等份脂類提取物轉(zhuǎn)移到一個新試管中，在氮氣下干燥該提取物。向每個試管中加入2.5ml 1％甲醇鈉甲醇溶液和2.5ml庚烷，混合物在室溫下渦旋2-3分鐘。向每個試管中加入2.5ml水，短暫渦旋混合物。如下抽提FAMES用2.5ml己烷洗滌混合物三次，然后用3.0ml水洗滌合并的有機相兩次，并在氮氣下干燥。然后使用配備自動加樣器和HP MSD 5972質(zhì)量分析儀的Hewlett Packard 5890氣相色譜儀，通過GC-MS分析FAMES(重復(fù)四次，以電子碰撞模式操作)。FAMEs的分離在長30m直徑0.25mm的DB 23柱上進行。
對酵母和煙草懸浮細胞的脂類抽提、脂肪酸甲酯的制備和GC/MS分析按照與以上對于蘋婆種子所述相同的方法進行，不同之處在于不加內(nèi)部脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)。為了精確地測定轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細胞中二氫蘋婆酸(DHSA)的身份，通過銀化TLC分離飽和及不飽和脂肪酸甲酯(Morris等人(1967)J Chromatography 3169-76)。銀化板(15％硝酸銀)在甲苯中在-20℃下順序顯色至高度為8、13、19cm。通過噴射0.2％(w/v)2′，7′-二氯熒光素甲醇溶液定位板上的脂肪酸甲酯。將銀化板頂部的飽和脂肪酸甲酯帶刮到試管中，用6ml己烷∶乙醚(2∶1，v/v)洗脫回收，通過GC/MS分析。
環(huán)丙烷脂肪酸合成的測定在含有0.1ml無細胞勻漿、0.02-0.05mM油酰-CoA和0.02mM[14C-甲基]S-腺苷甲硫氨酸底物的總體積為0.2ml的反應(yīng)混合物中，測定組織勻漿中的環(huán)丙烷脂肪酸合酶。油酰-CoA的存在使活性比不存在時提高約兩倍，但是更高濃度的油酰-CoA是抑制性的。粗提物中S-腺苷甲硫氨酸的Km為0.02mM。該測定混合物在30℃下溫育1小時。加入0.5ml KOH水溶液和1.0ml乙醇終止試驗，靜置過夜，使脂質(zhì)完全皂化。酸化后，將標(biāo)記的游離脂肪酸抽提到己烷中，然后用水洗滌己烷相，蒸發(fā)干燥。測定一等份有機相的放射性。其余的產(chǎn)物通過TLC分析。一部分脂肪酸產(chǎn)物也可以用醚重氮甲烷衍化。
放射性標(biāo)記發(fā)育的蘋婆種子和轉(zhuǎn)基因煙草細胞用8月25日采集的發(fā)育的種子進行標(biāo)記實驗。將一個子葉切成8片，在室溫和恒定振搖下在0.5ml標(biāo)記緩沖液(50mM磷酸緩沖液pH7.0，含5μCi放射性同位素)中溫育。在30、60、120分鐘時通過直接脂質(zhì)抽提終止標(biāo)記。來自這些樣品的脂肪酸甲酯用C18反相TLC在乙腈∶甲醇∶水(75∶25∶0.5，v/v)溶劑系統(tǒng)中分離。放射性用快速成像儀顯示。
將獨立的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移回液體培養(yǎng)基中，細胞如上所述傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)3天后，向培養(yǎng)基中加入5μCi L-[甲基-14C]甲硫氨酸或[1-14C]油酸，細胞再溫育24小時。然后短暫離心收集細胞，隨后進行脂質(zhì)抽提和脂肪酸甲酯的制備。通過銀化TLC使飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸分離，各種飽和脂肪酸通過C18反相TLC彼此分離，回收放射性斑點進行GC/MS分析。
文庫構(gòu)建與測序?qū)碜?月5日、8月25日、9月10日和9月30日采集的種子的等量發(fā)育種子合并在一起。在這段時間內(nèi)，顯示油沉積線性升高(參見實施例2)。將10克合并的發(fā)育種子在液氮中研磨成細粉。如Schultz等人(1994)所述提取RNA。分離的總RNA的質(zhì)量通過1％甲醛瓊脂糖凝膠分離分析。按照Stratagene(11011 North Torrey Pines Road，LaJolla，CA 92037)的方法，由發(fā)育的蘋婆種子的分離的總RNA制備cDNA文庫。將cDNA定向克隆到Uni-ZAP的EcoRI和XhoI位點處。根據(jù)Stratagene提供的方案進行大量酶切。挑取總共21,120個克隆，在220塊96孔板上培養(yǎng)。220塊板中的28個在MSU測序設(shè)施內(nèi)直接測序。其余192塊板(18432個克隆)用Genome System點樣到濾紙上進行文庫扣除。根據(jù)未扣除文庫前1500個序列獲得的信息，選擇三個最豐富的序列從文庫中扣除到濾紙上。重新放置(re-rack)并測序總共70塊96孔板。
用于煙草和酵母表達的構(gòu)建體根據(jù)與細菌環(huán)丙烷合酶的序列同源性鑒定一種推斷的蘋婆環(huán)丙烷合酶(SCPA-FAS)基因。推斷的(SCPA-FAS)的整個cDNA長2977bp，由兩個重疊的克隆R50-D5(1-1732bp)和C15-C3(933-2977bp)編譯。這兩個克隆都從兩條鏈測序。為了將完整的推斷SCPA-FAS放置在一起，用引物JO886(TCCTCTAGACTCGAGCCCGGGATGGGAGTGGCTGTGATCGGTGGTGGGATC)和JO883(GTTGTAAGACGTCGTGTAACTCGGTC ATACAATTCG)從克隆R50-D5中擴增編碼氨基酸1-335的序列，用引物JO884(CAATGTGCTGCAGAATGTTGGGAAAACAAGTCAGCC)和JO885(GGGAGATCTCGAGCCTATTTACTTTTGATAAAGTTAATAGGC)從克隆C15-C3中擴增編碼氨基酸336-864且含有終止密碼子的序列。為便于克隆，在氨基酸335賴氨酸的密碼子的第三個位點處進行無效突變，將賴氨酸密碼子由CTA變?yōu)镃TG，使得能夠產(chǎn)生PstI位點。將上游片段插入pBluescript KS的XhoI和PstI位點處，下游片段插入PstI和XbaI處。獲得的構(gòu)建體被命名為pBluescript KS-SCPAS；該構(gòu)建體從兩條鏈重新測序，發(fā)現(xiàn)沒有錯誤。完整的SCPA-FAS從pBluescript KS的SmaI和XbaI位點處釋放，插入二元載體pE1776的SmaI和XbaI位點之間。pE1776攜帶組成型啟動子“超級啟動子”和一個ags終止子。獲得的構(gòu)建體被命名為pE1776-SCPAS，轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌LBA4404株內(nèi)，以進行煙草懸浮細胞轉(zhuǎn)化。
對于酵母構(gòu)建體，為了產(chǎn)生EcoRI位點上游，使用引物JO968(GCCCTCGAGAATTCTAAAATGTCTGTGGCTGTGATCGGTGGTGGGATCCAAGGGCTGG)和JO883R(GTTGTAAGACGTCGTGTAACTCGGTCATACAATTCG)從克隆R50-D5中擴增氨基酸1-335。PCR片段用XhoI和PstI消化，用來替換構(gòu)建體pBluescriptKS-SCPAS中的相應(yīng)部分。用EcoRI和XbaI釋放SCPA-FAS，插入酵母載體pYES2/CT(Invitrogen)中。獲得的構(gòu)建體被命名為pYES2/CT-SCPAS。
SCPA-FAS在酵母和煙草懸浮細胞中的表達使用S.c.EasyCompTM轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen目錄號K5050-01)，用構(gòu)建體pYES2/CT-SCPAS轉(zhuǎn)化酵母株InvSc1。為了表達SCPA-FAS，含有pYES2/CT-SCPAS的酵母菌落接種50ml含有2％半乳糖和200mg/L油酸的SC培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在28℃和150轉(zhuǎn)/分振搖下培養(yǎng)。生長48小時后，短暫離心收集酵母細胞；從沉淀中提取酵母脂質(zhì)，由提取的脂質(zhì)制備脂肪酸甲酯，通過GC/MS分析。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化如Rempel和Nelson(1991)所述進行。農(nóng)桿菌培養(yǎng)物生長過夜，向3天煙草懸浮細胞的4ml樣品中加入100μl含有適當(dāng)構(gòu)建體的培養(yǎng)液。細胞然后在28℃下培養(yǎng)3天，通過短暫離心沉淀，用含有100μg/ml卡那霉素和500μg/ml羧芐青霉素的NT培養(yǎng)基洗滌三次。洗滌的細胞擴散到選擇平板上(添加0.7％ phytagar、100mg/L卡那霉素和500mg/ml羧芐青霉素的NT培養(yǎng)基)。3-4周后，將獨立的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到新平板上。一旦收集到足夠的組織，即提取脂質(zhì)，并通過GC/MS分析脂肪酸組成。
實施例2來自發(fā)育的臭蘋婆種子的環(huán)丙烷合酶的鑒定環(huán)丙烷脂肪酸合酶的測定從發(fā)育的臭蘋婆種子中收獲并在-70℃下凍存的冷凍胚乳組織在液氮中研磨為細粉。一份重量的粉末在兩倍體積的緩沖液中融化，該緩沖液含有0.1M Na tricine，pH7.0、1％ w/v脫脂BSA、1％ w/vPVP-40、15％ v/v甘油和1mM β-巰基乙醇。漿液短暫勻漿，通過微孔布(miracloth)過濾。濾液貯存于冰上。剩余的糊在兩倍體積的上述緩沖液中重新勻漿，再次過濾，濾液與第一次的濾液合并。合并的濾液被稱為“無細胞勻漿”，能夠進行酶測定或者隨后進行分級分離。使用Tricine緩沖液(對比tris或磷酸緩沖液)、使用pH7.0(對比pH6.4或7.8)和添加BSA和PVP-40(對比不添加)均使無細胞勻漿中恢復(fù)的活性提高約2倍。
環(huán)丙烷脂肪酸合酶的活性如上所述測定。當(dāng)不加衍化即進行分析時，標(biāo)記的游離脂肪酸是皂化產(chǎn)物中的主要成分(＞90％)。當(dāng)用醚重氮甲烷衍化后分析時，標(biāo)記的脂肪酸甲酯是主要產(chǎn)物(＞90％)。當(dāng)通過C18反相TLC分析標(biāo)記的脂肪酸甲酯時，一個放射性斑點與二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)同時洗脫下來。因此皂化后在己烷中回收的放射性是[14C-甲基]二氫蘋婆酸中總標(biāo)記物的一個良好量度。
測定最大環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性的數(shù)量級為0.5-1nmole/min/g種子組織鮮重。該活性易被多種去污劑((CHAPS，Triton-X100，辛基葡糖苷，去氧膽酸鈉，氯化十六烷基吡啶和溶血磷脂膽堿)抑制。在分級分離研究中，在10,000×g離心5分鐘后，大多數(shù)活性保留在上清液加脂肪層級分中。隨后以100,000×g離心1小時產(chǎn)生微粒體沉淀，其中含有在無細胞勻漿中發(fā)現(xiàn)的總環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性的72％，但是僅僅占總蛋白質(zhì)的1.5％，使比活性提高48倍。離心過程中去污劑的作用和活性行為與作為膜結(jié)合或整合膜蛋白的環(huán)丙烷脂肪酸合酶一致。當(dāng)通過脂質(zhì)抽提終止與無細胞勻漿的反應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)標(biāo)記的二氫蘋婆酸在磷脂酰膽堿級分中。這提示油酰磷脂酰膽堿是該酶的一種底物。
因此，最初對環(huán)丙烷脂肪酸合酶的測定和對活性的表征表明，發(fā)育的臭蘋婆種子能夠合成CPA-FA。而且，該酶似乎是一種膜結(jié)合或整合膜蛋白，底物似乎是油酰磷脂酰膽堿。
種子發(fā)育過程中的脂質(zhì)沉積從1998年7月20日到10月15日，在100天內(nèi)的7個時間點，在邁阿密Montgomery植物學(xué)中心采集發(fā)育的臭蘋婆種子。每個莢含有10-20個種子。在7月份，這些莢呈暗綠色，種子呈白色；當(dāng)種子發(fā)育后，莢的顏色逐漸變紅，而種子變成褐色。7月20日第一次采集的子葉仍然含有很多水份，10月28日最后一次采集的種子幾乎完全干燥。除了最后一次采集(種子十分干燥)之外，所有采集的種子的脂肪酸都如上所述分析。
發(fā)育的種子的脂肪酸積累情況如圖2所示。結(jié)果表明，從8月5日到10月14日，總脂肪酸和CPE-FAs以線性速度積累。在同一時間內(nèi)，CPE-FAs的百分比從總脂肪酸的40％上升到60％。90天時的脂肪酸組成與報告的成熟種子的數(shù)據(jù)非常類似(Bohannon和Kleiman(1978)Lipids 13(4)270-273)。
這些結(jié)果也提示，如果最初的假說是正確的，CPE-FAs來源于CPA-FAs，則發(fā)育的臭蘋婆種子具有高環(huán)丙烷脂肪酸合酶活性，應(yīng)當(dāng)是編碼該酶的mRNA的良好來源。
編碼環(huán)丙烷合酶的cDNA的鑒定和分離為了使cDNA文庫中環(huán)丙烷合酶和去飽和酶的含量最大，應(yīng)當(dāng)使用處于CPE-FAs以最高速度積累階段的發(fā)育的臭蘋婆種子制備cDNA文庫。如圖2所示，從8月5日到10月14日CPE-FAs基本以線性速度積累。因此，將8月5日、8月25日、9月10日、9月30日和10月14日采集的等量的發(fā)育種子合并在一起，進行RNA提取。
將RNA運至Stratagene進行cDNA文庫構(gòu)建。主要的噬斑為2.6×107pfu，平均插入片段大小為1.7kb。如上所述進行大量酶切后，挑取總共21,120個克隆，在220塊96孔板中生長。28塊板在密西根州立大學(xué)測序設(shè)施直接測序。獲得約1500個平均閱讀長度為500bp的序列。在NCBI對這1500個未扣除的序列進行Blast搜索(翻譯BLAST搜索核苷酸查詢-蛋白質(zhì)db[blastx])，鑒定出豆球蛋白A、豆球蛋白B和一種非特異的脂轉(zhuǎn)移蛋白是3種最豐富的序列；選擇這些序列進行隨后的文庫扣除。其余192塊(18,432個克隆)板用GenomeSystem點樣到濾紙上，進行文庫扣除。選擇的三個序列代表濾紙上約30％的克隆。總共70個96孔板(除去或扣除陽性克隆)重新放置；對所有這70塊板測序。獲得約3800個500bp的序列。也對這些序列進行Blast搜索。
根據(jù)blast結(jié)果，23個EST顯示與細菌環(huán)丙烷合酶有一定水平的相似性。編譯這些EST序列后，非常清楚地顯示所有23個EST均來自同一基因。圖3顯示了EST沿該基因的分布。裝配一個全長克隆，圖4顯示了該基因的核酸序列。預(yù)測的推斷環(huán)丙烷合酶長864個氨基酸，如圖5所示。細菌環(huán)丙烷合酶長382個氨基酸，不到蘋婆環(huán)丙烷合酶大小的一半。蘋婆酶與大腸桿菌酶的對比顯示，蘋婆序列與大腸桿菌序列在重疊區(qū)(羧基端)上有49％相似(188/376)且32％相同(122/376)(參見圖6)。蘋婆酶在氨基端還有約470個氨基酸。
實施例3來自蘋婆的環(huán)丙烷脂肪酸合酶的表征在酵母中對推斷的SCPA-FAS的功能分析酵母細胞具有幾個特征，使其成為一種特別有用的檢測生物，用于評價從發(fā)育的蘋婆種子分離的推斷的SCPA-FAS基因?qū)嶋H上是否編碼SCPA-FAS。這些特征包括以下事實酵母是真核生物，其脂肪酸組成非常簡單，僅由16:0、16:1、18:0和18:1組成。因此，如果在用編碼SCPA-FAS的基因轉(zhuǎn)染的酵母中能夠檢測到二氫蘋婆酸，則可證實SCPA-FAS作為一種環(huán)丙烷合酶起作用。
使用酵母表達載體pYES2/CT，如上所述將SCPA-FAS編碼序列置于半乳糖誘導(dǎo)型啟動子控制下。同樣如上所述，用該表達載體轉(zhuǎn)染酵母并培養(yǎng)。根據(jù)油酸(18:1)9)最可能是該酶的前體這一假設(shè)，向培養(yǎng)基中加入油酸至終濃度為200mg/L。分析15個含有pYES2/CT-SCPAS的酵母菌落和5個含有pYES2/CT-LacZ的對照菌落的脂肪酸，結(jié)果在圖6中顯示。
如圖6(A)所示，油酸高效地摻入酵母脂質(zhì)中。飼養(yǎng)實驗中使用的油酸污染一定的亞麻酸(18:2)也是明顯的，因為GC譜在32.78分鐘時出現(xiàn)亞麻酸。如圖6(B)所示，用SCPA-FAS基因轉(zhuǎn)染的所有15個細胞集落中均有保留時間為34.44分鐘的一個獨特的小峰，但是在所有對照樣品中都沒有。根據(jù)以下兩條證據(jù)，該峰被確定為二氫蘋婆酸脂肪酸甲酯。第一，該峰的保留時間與二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)相同。第二，該峰的質(zhì)譜與二氫蘋婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)相同，如圖6(C)所示。因此，來自蘋婆的推斷的SCPA-FAS酶作為環(huán)丙烷合酶起作用。
推斷的SCPA-FAS煙草懸浮細胞的功能分析盡管SCPA-FAS的功能在酵母系統(tǒng)中得到證實，但是評價其在植物組織中的功能是重要的。煙草懸浮細胞(亮黃2)有幾個特征，尤其可作為一種檢測植物系統(tǒng)，用于評價從發(fā)育的蘋婆種子中分離的SCPA-FAS基因在轉(zhuǎn)基因植物細胞中的功能。該細胞系是充分表征的細胞系，非常容易轉(zhuǎn)化。懸浮細胞不含任何CPA-FAs，在轉(zhuǎn)化后的40天內(nèi)可為脂質(zhì)分析提供足夠的組織。甚至更為重要的是，已經(jīng)充分證實煙草愈傷組織更耐受異常脂肪酸。
在組成型啟動子的控制下，編碼SCPA-FAS的核酸轉(zhuǎn)化煙草懸浮細胞；同時，也用一種空載體轉(zhuǎn)化煙草細胞作為對照。轉(zhuǎn)化后，將獨立的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到新平板上，以20天的間隔傳代培養(yǎng)。從含有pE1776-SCAPS的15個轉(zhuǎn)化子和含有空載體pE1776的12個對照轉(zhuǎn)化子中提取脂質(zhì)。提取脂質(zhì)，如上所述從這些樣品中制備脂肪酸甲酯。用銀化TLC將飽和FAMEs與其它FAMEs分離；然后通過GC/MS分析飽和FAMEs，以及DHSA甲酯標(biāo)準(zhǔn)。這些結(jié)果在圖7中顯示。用空載體pE1776轉(zhuǎn)化的對照煙草愈傷組織中的主要飽和脂肪酸是16:0、18:0和一些20:0，如圖7(A)所示。在用推斷的蘋婆環(huán)丙烷合酶(SCPA-FAS)轉(zhuǎn)化的待測煙草愈傷組織中，存在與對照樣品中相同的脂肪酸，有保留時間為35.69分鐘的另一個凸峰，如圖7(B)所示。通過與二氫蘋婆酸標(biāo)準(zhǔn)對比，它與另一個峰有相同的保留時間——35.69分鐘，如圖7(C)所示，從而確定該凸峰為二氫蘋婆酸。為了證實它的身份，該凸峰用質(zhì)譜法進一步分析；結(jié)果在圖8中顯示。對照二氫蘋婆酸的質(zhì)譜的特征在于310的分子離子，以及其它獨特離子，如278(M-32)和236(M-74)，如圖8(B)所示。保留時間為35.69分鐘的另一個峰的質(zhì)譜，如圖8(D)所示，與二氫蘋婆酸標(biāo)準(zhǔn)幾乎相同。因此，根據(jù)保留時間和質(zhì)譜對比，在用編碼蘋婆CPA-FAS的核酸轉(zhuǎn)化的煙草愈傷組織中發(fā)現(xiàn)的另一種脂肪酸被確定為二氫蘋婆酸。分析了用編碼蘋婆CPA-FAS的核酸轉(zhuǎn)化的15個獨立轉(zhuǎn)化子的脂肪酸組成，這些轉(zhuǎn)化子中的二氫蘋婆酸含量為3％-6％，如圖9所示。二氫蘋婆酸的平均含量約為4％。
環(huán)丙烷環(huán)形成的闡明Yano等人((1972)Lipids 735-45)根據(jù)放射性同位素標(biāo)記實驗提出的蘋婆酸合成途徑是，首先由油酸形成二氫蘋婆酸，隨后二氫蘋婆酸去飽和為蘋婆酸。Yano等人進一步提出，該環(huán)的亞甲基來源于甲硫氨酸的甲基。使用發(fā)育的蘋婆種子進行的預(yù)標(biāo)記研究證實了這一提議。當(dāng)發(fā)育的種子用14C-甲硫氨酸標(biāo)記時，大多數(shù)放射性首先在DHSA中發(fā)現(xiàn)，少量存在于蘋婆酸中；通過較長時間的溫育，蘋婆酸中積累更多的放射性。
使用以編碼SCPA-FAS的核酸(SCPAS-2和SPAS-11，用pE1776-SCPAS轉(zhuǎn)化的兩個獨立轉(zhuǎn)基因系)或一種空載體轉(zhuǎn)化的煙草懸浮細胞進行其它標(biāo)記實驗。懸浮細胞與[1-14C]油酸或L-[甲基-14C]甲硫氨酸溫育24小時。然后用銀化TLC從標(biāo)記的細胞中分離FAMEs，用快速成像儀顯示放射性的分布。當(dāng)與[1-14C]油酸溫育時，攜帶編碼SCPA-FAS的核酸的待測轉(zhuǎn)化子在僅含飽和脂肪酸的最上一條帶中產(chǎn)生總放射性的約3.5％，而攜帶空載體pE1776的對照轉(zhuǎn)化子不產(chǎn)生與飽和脂肪酸結(jié)合的放射性。這些結(jié)果證實，SCPA-FAS的存在導(dǎo)致油酸(18:1)轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸，最可能的是二氫蘋婆酸。而且，吸收的大多數(shù)[1-14C]油酸進一步去飽和為亞油酸(18:2)。當(dāng)細胞與L-[甲基-14C]甲硫氨酸一起溫育時，僅在編碼SCPA-FAS的核酸轉(zhuǎn)化的細胞的飽和脂肪酸帶中發(fā)現(xiàn)放射性，而對照細胞中未發(fā)現(xiàn)。根據(jù)以前對待測和對照轉(zhuǎn)化子的飽和脂肪酸的分析，這兩者之間的不同僅在于只在含有編碼SCPA-FAS的核酸的轉(zhuǎn)化子中發(fā)現(xiàn)DHSA。因此，與飽和脂肪酸結(jié)合的放射性最可能是DHSA。
為了證實放射性脂肪酸實際上是DHSA，由pE1776-SCPAS-2獲得的飽和FAME在與[1-14C]油酸或L-[甲基-14C]甲硫氨酸溫育后從銀化板上洗脫下來，通過C18反相TLC分離各種飽和FAMEs。來自[1-14C]油酸或L-[甲基-14C]甲硫氨酸的標(biāo)記放射性FAMEs與DHSA標(biāo)準(zhǔn)位于相同的位置。然后從C18板上洗脫放射性斑點，通過GC/MS分析。根據(jù)保留時間和質(zhì)譜，鑒定放射性FAMEs為DHSA。
綜合起來，這些結(jié)果證實，SCPA-FAS通過將來自S-腺苷甲硫氨酸的亞甲基轉(zhuǎn)移給油酸合成二氫蘋婆酸。
實施例4抗蘋婆環(huán)丙烷合酶抗體的制備針對在細菌表達系統(tǒng)中表達的蘋婆環(huán)丙烷脂肪酸合酶(CPA-FAS)制備抗體。為了抗體生產(chǎn)，選擇該蛋白質(zhì)的保守羧基端區(qū)(約390個氨基酸)，PCR擴增，并在大腸桿菌中表達，其含有一個HIS尾。蘋婆與細菌CPA-FAS之間的排比在圖11中顯示；蘋婆CPA-FAS從大約氨基酸470到氨基酸864的部分用來制備抗體。
使用的載體是pET28a(+)(Novagen，Inc.，601 Science Drive，Madison，WI 53711)，其中插入位點是EcoRI和SacI。
用來擴增部分蘋婆環(huán)丙烷合酶的PCR引物如下JO873CCGGAATTCTGTTCTCTTAAAACAGCTCTGAAAGTGCJO885CCCTCTAGAGCTCGGATAAATGAAAACTATTTCAATTATCCG引物在蘋婆環(huán)丙烷合酶中的位置如圖12所示。PCR反應(yīng)在下列條件下進行模板[R15-C3]5.0μl緩沖液[10×]10.0μldNTP[10mM] 2.0μlJO873[4.1pM/μl]9.0μlJO885[7.3pM/μl]5.0ul水 68.5μl
PWO 0.5μl94℃ 5min94℃ 30s55℃ 30s72℃ 30s30個循環(huán)72℃ 7min三種不同的樣品進行PCR，被稱為EA-I、EA-II和EA-III。反應(yīng)后，PCR片段用Qiagen PCR純化試劑盒純化。PCR片段和載體然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI消化。通過使用T4 DNA連接酶在4℃下連接過夜，將PCR片段插入載體內(nèi)，插入片段∶載體比例為4∶1。獲得的構(gòu)建體被命名為pET28a-EA-I、pET28a-EA-II和pET28a-EA-III，轉(zhuǎn)化DH5α。篩選菌落，鑒定正確的構(gòu)建體；由pET28a-EA-II-4和pET28a-EA-III-5制備自旋劑(spin-preps)。為了蛋白質(zhì)表達，用這兩種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21。表達的蛋白質(zhì)如圖13所示，突出的氨基酸序列的部分來源于該載體，其中含有一個六組氨酸尾便于純化。
然后如下誘導(dǎo)部分蘋婆CPA-FAS的表達用含有pET28a-EA-II-4或pET28a-EA-III-5的BL21接種2ml含50μg/ml卡那霉素的LB，在振搖下37℃培養(yǎng)過夜。次日早晨，用1.5ml過夜培養(yǎng)物接種500ml含50μg/ml卡那霉素的LB；細胞生長2.5小時。然后加入IPTG至終濃度為0.5mM。細胞再生長5小時，以5,000g離心10分鐘收集。收集的細胞貯存于-20℃，或者直接用于蛋白質(zhì)提取。
如下從收集的細胞中提取蛋白質(zhì)來自500ml培養(yǎng)物的細胞重懸浮于60ml細胞裂解緩沖液中(20mM Tris-HCl，pH7.4；0.2mM NaCl；10mM β-巰基乙醇；1mM芐脒；1％(v/v)Triton X-100；和1mMPMSF)。在50瓦下利用三次20秒的脈沖，在冰上通過超聲處理破壞細胞，懸液以10,000g離心20分鐘?？扇苄约壏质巧锨逡?，不可溶級分含有包涵體。
如下從不可溶級分中純化包涵體將不可溶級分重懸浮于8ml緩沖液中(50mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA；25％(w/v)蔗糖；和25mg溶菌酶)。然后加入MgCl2、MnCl2和DNase I至終濃度分別為10mM、1mM和10μg/ml?；旌衔镌谑覝叵聹赜?0分鐘，加入20ml下列緩沖液(0.2M NaCl；1％脫氧膽酸；1.6％(v/v)TritonX-100；20mM Tris-HCl，pH7.5；和2mM EDTA)?；旌衔镆?000×g離心10分鐘，將沉淀重懸浮于0.5％triton X-100/1 mM EDTA中，再次離心。重復(fù)這一過程，直到獲得壓緊的沉淀。
包涵體然后進行10％ SDS PAGE，切下部分蘋婆CPA-FAS的優(yōu)勢帶，貯存于-20℃。將冷凍的凝膠片送到Cocalico Biologicals，Inc.(Reamstown，PA)，在兔中制備抗體。
實施例5來自棉花的環(huán)丙烷脂肪酸合酶的鑒定和表征編碼棉花CPA-FAS的序列的鑒定利用蘋婆CPA-FAS的氨基酸序列blast搜索NCBI EST數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)有三個ESTs來自于棉花。所有這三個均來自同一文庫(從7-10天后收獲的棉鈴中分離的纖維)，在Clemson大學(xué)遺傳學(xué)研究所測序。這些EST如下命名和描述，在圖14中顯示。
EST1gi|13351381|gb|BG441729.1|BG441729GA_Ea0014H01f7-10dpa纖維文庫樹棉cDNA克隆GA_Ea0014H01f.
EST2gi|21094588|gb|BQ406901.1|BQ406901GA_Ed0100C02f樹棉7-10dpa纖維文庫樹棉cDNA克隆GA_Ed0100C02f.
EST3互補gi|18099677|gb|BM358931.1|BM358931GA_Ea0014H01r樹棉7-10dpa纖維文庫樹棉cDNA克隆GA_Ea0014H01r.
根據(jù)重疊群分析，確定EST2和EST3是重疊的ESTs，命名為EST2-3，如圖15所示。兩個重疊群——EST1和EST2-3以及EST2和EST3的預(yù)測的氨基酸序列在圖16中顯示。兩個重疊群——EST2和EST2_3的預(yù)測的氨基酸序列與蘋婆CPA-FAS的序列的排比在圖17中顯示。
EST序列中測序錯誤的普遍存在常常需要對EST編碼的預(yù)測的氨基酸序列進行另外的分析。在有些情況下，這是由于測序錯誤導(dǎo)致移碼的情況，導(dǎo)致不連續(xù)的氨基酸序列；換句話說，EST中編碼序列的直接翻譯可能不產(chǎn)生全長多肽片段。因此，預(yù)測的氨基酸序列能夠與一種已知序列排比，以便能夠發(fā)現(xiàn)錯誤；更正這些錯誤，重新構(gòu)建連續(xù)的氨基酸序列。對三個棉花EST的分析顯示，EST3含有幾個明顯的測序錯誤。通過比較編碼序列與蘋婆CPA-FAS氨基酸序列的類似區(qū)，發(fā)現(xiàn)兩個明顯的閱讀框，閱讀框+2和閱讀框+3，如下閱讀框+2 閱讀框+3 組合這兩個閱讀框，產(chǎn)生下列氨基酸序列；該序列(SEQ ID NO9)包含上述閱讀框+2和+3的突出部分，如圖16所示。
組合的閱讀框 棉花CPA-FAS的表征使用抗蘋婆CPA-FAS抗體的Western印跡分析如實施例4所述制備的抗蘋婆CPA-FAS抗體用來染色通過下列方法從棉花和蘋婆蛋白質(zhì)提取物中獲得的蛋白質(zhì)提取物。蘋婆如前所述栽培，提取胚組織。棉花植物(陸地棉)在生長室中在14小時光線、10小時黑暗循環(huán)下生長。發(fā)芽2周后從這些植物上采集根、莖、葉組織。開花約10天后，從溫室中在自然光線和溫度條件下生長的棉花植物上采集胚組織。Western印跡和脂肪酸分析使用相同類型的組織。
從棉花胚、葉、莖、根和蘋婆胚中獲得組織樣品。通過在2ml冰冷的緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.2M NaCl，10mM β-巰基乙醇)中勻漿0.5gm組織，獲得蛋白質(zhì)提取物。測定勻漿中的蛋白質(zhì)濃度，然后將150μg棉花組織蛋白質(zhì)和20μg來自蘋婆胚的蛋白質(zhì)加到8％ SDS聚丙烯酰胺凝膠上。電泳后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進行Western印跡分析，其中使用抗蘋婆CPA-FAS抗體。
Western印跡分析的結(jié)果在圖18中顯示，其中棉花組織提取物中的蛋白質(zhì)與蘋婆抗體結(jié)合；根據(jù)這種抗體結(jié)合，和棉花組織中EST序列的存在，該蛋白質(zhì)被鑒定為一種棉花CPA-FAS。結(jié)果證實，抗蘋婆CPA-FAS抗體與棉花CPA-FAS極好地交叉反應(yīng)，表明這兩種蛋白質(zhì)非常類似。而且，棉花CPA-FAS的大小與它在蘋婆中的對應(yīng)物幾乎相同。在棉花中，CPA-FAS在幼小的胚、莖、根組織中高表達，但是在葉組織中不表達。這些發(fā)現(xiàn)與這些組織中碳環(huán)脂肪酸的產(chǎn)生通常一致，如下所述。
脂肪酸分析分析來自棉花胚、葉、莖、根組織的脂肪酸，結(jié)果如下所示。
總環(huán)丙烯脂肪酸，包括18:1c+19:1c根 34％莖 27.5％葉 0.00％胚 0.3％總環(huán)丙烷脂肪酸，包括19:0c
根 0.88％莖 0.48％葉 0.00％胚 0.23％表1.棉花組織的脂肪酸分析脂肪酸 根 莖 葉 胚16:0 25.922.121.028.416:1 0 0 0 0.518:1c 25.118.30 0.318:0 0.5 0.5 2.9 1.618:1 2.9 7.0 14.712.218:2 21.527.539.556.719:1c 8.9 9.2 0 019:0c 0.9 0.5 0 0.218:3 14.315.021.92 0.1這些結(jié)果證實，在棉花根和莖組織中，環(huán)丙烷和環(huán)丙烯脂肪酸分別包含總脂肪酸的約30％和約35％。但是在更成熟的胚組織中，這些脂肪酸僅含有總脂肪酸的約2％，葉組織中不含。在根和莖組織的這些脂肪酸中，錦葵酸是最豐富的，在根和莖組織中分別占總脂肪酸的約25％和約20％。
因此，通過如上所述的Western印跡分析證實，在棉花組織中，不同組織中CPA-FAS的豐度與環(huán)脂肪酸的百分比通常一致。應(yīng)當(dāng)指出，在發(fā)現(xiàn)環(huán)脂肪酸的植物中，環(huán)丙烷和環(huán)丙烯脂肪酸在種子發(fā)育的極早期合成，它們最初能夠代表相對高比例的總脂肪酸；然而，隨著種子成熟，這些脂肪酸的合成減少，以致成熟種子組織中這些脂肪酸的比例降到相當(dāng)?shù)偷乃健?br> 在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)的多種修飾和變化。盡管已經(jīng)通過具體優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不只限于這些具體實施方案。實際上，材料學(xué)、化學(xué)和分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所知的用來實施本發(fā)明的方式的不同修改都屬于下列權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其含有編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的分離的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述植物來自錦葵目。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述植物是一種蘋婆屬植物或棉花植物。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述蘋婆屬植物是臭蘋婆植物，或者所述棉花植物是樹棉植物。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO1，或者至少SEQ ID NOs3-6之一，或者在高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1或至少SEQ ID NOs3-6之一雜交的核酸序列。
6.一種組合物，其含有權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列，該序列與一個異源啟動子有效連接。
7.一種組合物，其含有一種載體，該載體包含權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列。
8.一種組合物，其含有一種純化的多肽，該多肽由權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列編碼。
9.一種組合物，其含有純化的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述植物來自錦葵目。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述植物是一種蘋婆屬植物或棉花植物。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述蘋婆屬植物是臭蘋婆，或者所述棉花植物是樹棉植物。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中純化的環(huán)丙烷脂肪酸合酶含有氨基酸序列SEQ ID NO2，或者含有至少氨基酸序列SEQ ID NOs7-10之一，或者含有SEQ ID NO11。
14.一種組合物，其含有一種分離的核酸序列，該序列編碼權(quán)利要求9、10、11、12或13中任一項的環(huán)丙烷脂肪酸合酶。
15.用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的異源基因轉(zhuǎn)化的一種生物，其中該基因含有權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列，或編碼權(quán)利要求9、10、11、12或13中任一項的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的核酸序列。
16.用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的異源基因轉(zhuǎn)化的一種植物，其中該基因含有權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列，或編碼權(quán)利要求9、10、11、12或13中任一項的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的核酸序列。
17.用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的異源基因轉(zhuǎn)化的一種植物細胞，其中該基因含有權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列，或編碼權(quán)利要求9、10、11、12或13中任一項的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的核酸序列。
18.用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的異源基因轉(zhuǎn)化的一種植物種子，其中該基因含有權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列，或編碼權(quán)利要求9、10、11、12或13中任一項的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的核酸序列。
19.來自權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物的油。
20.用編碼植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的異源基因轉(zhuǎn)化的一種細菌，其中該基因含有權(quán)利要求1、2、3、4或5中任一項的核酸序列，或編碼權(quán)利要求9、10、11、12或13中任一項的植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的核酸序列。
21.來自權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)基因細菌的油。
22.一種組合物，其含有一種分離的核酸序列，該序列編碼含有與植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶氨基端同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
23.一種組合物，其含有一種純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有與植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶氨基端同源的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述氨基端含有植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的約前420個到約470個氨基酸。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述氨基端含有SEQ ID NO2的氨基端的大約前420-470個氨基酸，或者含有氨基酸SEQ ID NO7。
26.一種在植物中表達植物環(huán)丙烷脂肪酸合酶的方法，包括a)提供i)一種載體，其含有編碼植物CPA-FAS或其部分的核酸序列，和ii)植物組織；以及b)在允許合酶表達的條件下，用該載體轉(zhuǎn)染該植物組織。
27.一種減少植物中CPA-FAS表達的方法，包括a)提供i)一種載體，其含有編碼一種反義序列的核酸序列，該反義序列對應(yīng)于編碼植物CPA-FAS或其部分的核酸序列，和ii)植物組織；以及b)在允許反義序列表達且CPA-FAS表達減少的條件下，用該載體轉(zhuǎn)染該植物組織。
28.一種減少植物中CPA-FAS表達的方法，包括a)提供i)編碼一種siRNA的載體，該siRNA靶向于編碼植物CPA-FAS或其部分的核酸序列，和ii)植物組織；以及b)在允許siRNA表達且CPA-FAS表達減少的條件下，用該載體轉(zhuǎn)染該植物組織。
全文摘要
本發(fā)明提供環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因和蛋白質(zhì)，及其使用方法。本發(fā)明包括該合酶的天然和重組野生型形式，以及突變體和變體形式，其中一些具有相對于野生型合酶發(fā)生改變的特征。本發(fā)明也提供使用環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因和蛋白質(zhì)的方法，包括在轉(zhuǎn)基因生物中的表達，以及在植物油，特別是在種子油中，環(huán)丙烷脂肪酸的產(chǎn)生。
文檔編號C12N15/82GK1617880SQ02827741
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者X·鮑, J·B·歐赫羅格, M·R·泊拉德 申請人:密執(zhí)安州立大學(xué)