專利名稱：基因靶向方法和載體的制作方法
本申請(qǐng)聲明，在35U.S.C.§119(e)條款下，對(duì)2001年12月4日歸檔的美國系列號(hào)第60/338,768擁有優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此合并為參考文獻(xiàn)。
發(fā)明的背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及為了修飾遺傳位點(diǎn)而進(jìn)行的細(xì)胞操作，更特殊的是涉及基因靶向載體和在細(xì)胞中產(chǎn)生遺傳修飾的方法。
背景資料外源遺傳物質(zhì)被穩(wěn)定地導(dǎo)入真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的基因組中，這已經(jīng)在很多情況下為了各種目的而成功實(shí)現(xiàn)了，如為了表達(dá)外源基因或破壞內(nèi)源性位點(diǎn)。主要是通過隨機(jī)的基因組插入或位點(diǎn)特異性同源重組而實(shí)現(xiàn)。隨機(jī)整合涉及將線性化的DNA片段插入宿主細(xì)胞的基因組中，插入的位置大部分地是非位點(diǎn)特異的。這些插入趨向于以多聚體(multimer)或多聯(lián)體(concatemer)存在，大多數(shù)往往不引起特異位點(diǎn)的破壞或失活。也存在內(nèi)源性位點(diǎn)被隨機(jī)插入事件破壞的可能性，從而經(jīng)常使分析外源基因?qū)?xì)胞或來自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生物體的作用變得很困難。另外，可以觀察到外源啟動(dòng)子活性的有效范圍有賴于整合的區(qū)域。
經(jīng)位點(diǎn)特異性同源重組將DNA插入宿主基因組中，可使外源DNA分子的單拷貝整合作用靶向宿主基因組的特異區(qū)域。同源重組涉及明顯相似的核苷酸序列通過特異重組酶的作用而交換。早期的實(shí)驗(yàn)試圖用外源DNA以位點(diǎn)特異的方式操控細(xì)胞內(nèi)源性基因組DNA序列，集中于酵母作為模型系統(tǒng)。重組作用以酵母基因組和經(jīng)leu2.sup位點(diǎn)轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入的外源質(zhì)粒為示范(Hinnen等人(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929)。最近使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的同源重組能力使細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA中產(chǎn)生了特異突變的DNA序列。獲得功能和喪失功能的等位基因都已經(jīng)在干細(xì)胞和這些細(xì)胞產(chǎn)生的動(dòng)物中產(chǎn)生(見下文)。另外，應(yīng)用陽性-陰性選擇載體和方法促進(jìn)了含突變DNA序列的細(xì)胞和動(dòng)物的產(chǎn)生和研究(Capecchi等人，(1997)美國專利第5,631,153號(hào))。
已經(jīng)從胚胎干細(xì)胞培育成許多動(dòng)物，這些干細(xì)胞含有經(jīng)位點(diǎn)特異同源作用而突變的特異位點(diǎn)。這些動(dòng)物包括來源于嵌合體的小鼠，是通過向胚泡中注射經(jīng)特異位點(diǎn)同源重組作用靶向的胚胎干細(xì)胞而產(chǎn)生的。一些實(shí)例包括p53和paraxis位點(diǎn)(Donehower等人，(1992)，Nature，356,215；Burgess等人，(1996)，Nature，384，570)。豬也已經(jīng)從包括豬的同源重組修飾胚胎干細(xì)胞中培育出來(Butler等人，(2002)，Nature，415，103)。
至今，已經(jīng)設(shè)計(jì)了主要的兩型載體可以靶向基因組的特異區(qū)域，以便用外源DNA序列取代內(nèi)源序列。這些載體已經(jīng)證明足以在許多不同的細(xì)胞類型中產(chǎn)生多種靶向的等位基因。插入型載體含有側(cè)向于編碼選擇性標(biāo)記物的內(nèi)部核苷酸序列的兩個(gè)同源區(qū)域。載體在一個(gè)同源區(qū)域內(nèi)被線性化。一個(gè)遺傳交叉事件和同源重組引起基因組序列的部分復(fù)制。染色體內(nèi)重組經(jīng)常引起內(nèi)源復(fù)制序列被去除。這種類型靶向載體的缺點(diǎn)是缺少陰性選擇標(biāo)記物，后者可通過去除含有主鏈或載體序列的細(xì)胞而有效地富集正確的靶向作用。另外，在同源區(qū)域內(nèi)的線性化減少了可進(jìn)行同源重組的DNA序列的數(shù)量，因此減少了鏈交換的機(jī)率(Thomas等人，(1986)，Cell，44，49)。最終，染色體內(nèi)重組必須發(fā)生在規(guī)定的區(qū)域內(nèi)，否則可發(fā)生位點(diǎn)野生型結(jié)構(gòu)的再生。
置換型載體含有兩個(gè)同源區(qū)域，通常側(cè)向于陽性選擇性標(biāo)記物，如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因。陰性選擇性標(biāo)記物通常位于外側(cè)并與其中一個(gè)同源區(qū)域相鄰，以便通過去除含有陰性選擇性序列盒的細(xì)胞而在總?cè)郝渲懈患_靶向的細(xì)胞。置換型載體導(dǎo)入細(xì)胞后，同時(shí)或逐步進(jìn)行陽性和陰性的選擇得到了分離的細(xì)胞，由于使用陰性選擇性標(biāo)記物，接受位點(diǎn)特異性同源重組的分離細(xì)胞具有大約8至12倍富集的機(jī)率。在可能是第一個(gè)成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因靶向?qū)嶒?yàn)中，Capecchi等人顯示通過使用置換型載體靶向小鼠HPRT和int-2位點(diǎn)(美國專利第5,631,153號(hào))。從此大量位點(diǎn)被成功的靶向，一些通過插入型載體，大多數(shù)通過置換型載體。這些載體中的許多包括陰性選擇性標(biāo)記物，位于同源區(qū)域之一或兩者的外側(cè)，這往往導(dǎo)致靶向的等位基因的鑒定效率增加。
關(guān)于這種方法和置換型載體的應(yīng)用和陽性-陰性選擇仍然存在許多缺點(diǎn)。使用許多陰性選擇性序列盒如HSV胸苷激酶需要添加抗生素或選擇劑如更昔洛韋，它們可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)膽?yīng)激，以及引起不必要或不成熟的分化作用。另外，選擇富集陰性選擇性標(biāo)記物的細(xì)胞要花費(fèi)相當(dāng)多的時(shí)間，以回收由于缺乏選擇性標(biāo)記物而對(duì)藥物具有抵抗性的細(xì)胞。同樣，典型地通過這種方法獲得的富集因子最多為大約8至12倍。同樣，陽性-陰性選擇載體的建立常常在戰(zhàn)略上是困難的和費(fèi)時(shí)間的。因此需要可以將外源性核酸分子位點(diǎn)特異性地插入細(xì)胞基因組中的靶向載體。本發(fā)明滿足了這種需求，并提供了其他的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明簡述提供了通過載體DNA與靶DNA的同源重組作用在真核細(xì)胞中修飾基因組DNA序列的方法(

圖1)。該方法首先需要轉(zhuǎn)化能夠與載體進(jìn)行同源重組的細(xì)胞，該載體在此是指FPIC基因靶向載體，含有與在細(xì)胞基因組中存在的序列實(shí)質(zhì)上相似的序列。盡管載體可以基本上以隨機(jī)的方式整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，對(duì)基因組的特異區(qū)域沒有優(yōu)先選擇，但一定比例的細(xì)胞中還是含有通過位點(diǎn)特異性同源重組作用被整合進(jìn)基因組的基因靶向載體。隨后選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以分離和鑒定已成功接受了位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞。根據(jù)檢測(cè)存在特異的轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的能力進(jìn)行選擇，該序列呈現(xiàn)基因靶向載體中存在的序列。
本發(fā)明的FPIC載體包括與宿主細(xì)胞基因組中存在的序列實(shí)質(zhì)上同源的第一條DNA序列，以及與宿主細(xì)胞基因組中第一條序列的下游或上游的其他序列實(shí)質(zhì)上同源的第三條DNA序列。載體進(jìn)一步在第一條和第三條DNA序列之間含有第二條DNA序列，它與宿主基因組中存在的序列很少或沒有同源性，并使之能夠鑒定基因組中被整合進(jìn)載體序列的細(xì)胞。載體也含有第四條DNA序列，可以位于第一條或第二條序列的5’或3’端，與宿主基因組中存在的序列很少或沒有同源性，并賦予單獨(dú)的獨(dú)特方式來鑒定含有被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的序列的細(xì)胞。第二條和第四條序列的聯(lián)合應(yīng)用可以鑒定已經(jīng)接受了載體與內(nèi)源序列同源重組的細(xì)胞。相應(yīng)地，本發(fā)明也提供了用這種載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，特別是已經(jīng)被這種載體介導(dǎo)了同源重組的細(xì)胞，以及由這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的生物體，其中同源重組賦予了特殊的遺傳改變。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點(diǎn)特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。這種方法可以通過，例如，以下步驟來實(shí)施，a)采用設(shè)計(jì)用來進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼所述細(xì)胞中的陽性選擇特征，與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列沒有同源性，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA序列代表所述細(xì)胞中的特異轉(zhuǎn)錄序列，不編碼功能性蛋白產(chǎn)物并與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細(xì)胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第一條DNA序列，編碼陽性選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第三條DNA序列，被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能性蛋白產(chǎn)物的第四條DNA序列；b)繁殖細(xì)胞以選擇或富集已經(jīng)成功地用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過存在所述第二個(gè)DNA序列的陽性可選擇標(biāo)記物基因產(chǎn)物和缺少所述第四條DNA序列轉(zhuǎn)錄的無功能序列而選擇，和c)從含有所述表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列不編碼功能蛋白的第四條序列的細(xì)胞中分離含有所述編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列的細(xì)胞。這種方法可進(jìn)一步包括對(duì)所述細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行定性的步驟，該細(xì)胞攜帶編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列，但不攜帶第四條DNA序列，該序列編碼轉(zhuǎn)錄序列但不編碼位點(diǎn)特異同源重組事件的功能性蛋白產(chǎn)物，該事件可進(jìn)行細(xì)胞靶DNA的修飾。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點(diǎn)特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。這種方法可以通過例如以下步驟來實(shí)施，a)采用設(shè)計(jì)用來進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA編碼陰性可選擇標(biāo)記物，與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細(xì)胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第一條DNA序列，編碼轉(zhuǎn)錄的序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第三條DNA序列，編碼陰性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列；b)繁殖細(xì)胞以選擇或富集已經(jīng)成功地用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過存在所述的第二條DNA序列而選擇，和c)從含有所述編碼陰性可選擇標(biāo)記物的第四條序列的細(xì)胞中分離含有所述編碼轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列的細(xì)胞。這種方法可進(jìn)一步包括對(duì)所述細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行定性的步驟，所述細(xì)胞攜帶表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，但不攜帶位點(diǎn)特異同源重組事件中的第四條DNA序列，該事件可進(jìn)行細(xì)胞靶DNA的修飾。
也在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點(diǎn)特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。這種方法可以通過例如以下步驟來實(shí)施，a)采用設(shè)計(jì)用來進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA序列表現(xiàn)為所述細(xì)胞中的一條特異轉(zhuǎn)錄序列，它不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細(xì)胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第一條DNA序列，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第三條DNA序列，被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第四條DNA序列；b)繁殖細(xì)胞以選擇或富集已經(jīng)成功的被所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過存在表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列而選擇，并以缺少所述第四條DNA序列的不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列而選擇，和c)從含有所述表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列的第四條序列的細(xì)胞中分離含有所述表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列的細(xì)胞。這種方法可進(jìn)一步包括對(duì)所述細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行定性的步驟，所述細(xì)胞攜帶表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列，但不攜帶編碼轉(zhuǎn)錄序列但不編碼位點(diǎn)特異同源重組事件中功能蛋白產(chǎn)物的第四條DNA序列，該事件可進(jìn)行細(xì)胞靶DNA的修飾。
仍然在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了鑒定已經(jīng)接受使用FPIC基因靶向載體的位點(diǎn)特異性同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。這種方法可以通過例如以下步驟來實(shí)施，a)采用設(shè)計(jì)用來進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組的FPIC基因靶向載體來轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述的載體包含，第一條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源；第二條DNA序列編碼轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，不編碼功能蛋白產(chǎn)物并與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組；第三條DNA序列與宿主基因組中存在的內(nèi)源性基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并與第一條DNA序列不同；以及第四條DNA編碼陽性可選擇標(biāo)記物，與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的載體能夠在細(xì)胞中通過具有內(nèi)源性靶序列的第一條DNA序列和具有內(nèi)源性靶DNA序列的第三條DNA序列之間的鏈交換進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組；其中所述的FPIC基因靶向載體中的DNA序列的組成形式是，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第一條DNA序列，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄序列但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的第二條DNA序列，與靶DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第三條DNA序列，編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列；b)繁殖細(xì)胞以選擇或富集已經(jīng)成功地用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過存在表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列而選擇，并以缺少由所述第四條DNA序列轉(zhuǎn)錄的陽性可選擇蛋白產(chǎn)物而選擇，和c)從含有所述編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列的細(xì)胞中分離含有所述表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列的細(xì)胞。這種方法可進(jìn)一步包括對(duì)所述細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行定性，所述細(xì)胞攜帶表現(xiàn)為不編碼功能蛋白產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄序列的第二條DNA序列，但不攜帶編碼位點(diǎn)特異同源重組事件中的陽性可選擇標(biāo)記物的第四條DNA序列，該事件可進(jìn)行細(xì)胞靶DNA的修飾。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供為修飾內(nèi)源性核苷酸序列而靶向真核細(xì)胞基因組特異區(qū)域的位點(diǎn)特異同源重組方法，和組合物，包括以這種位點(diǎn)特異同源重組為特征的細(xì)胞和含有這種細(xì)胞的非人生物體。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供選擇和檢測(cè)接受位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供應(yīng)用所述方法的載體。也是本發(fā)明的另一個(gè)目的，即提供核酸和肽核酸((peptide nucleic acid)(PNA))分子信標(biāo)探針以鑒定細(xì)胞中是否存在特異的非同源基因靶向序列。仍然是本發(fā)明的進(jìn)一步目的，即提供已經(jīng)通過所述的位點(diǎn)特異同源重組方法修飾的細(xì)胞。也是本發(fā)明的另一個(gè)目的，即提供已經(jīng)通過所述的位點(diǎn)特異同源重組和檢測(cè)方法修飾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及分離的FPIC基因靶向載體，用于在能夠接受同源重組的細(xì)胞中進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組。這種FPIC基因靶向載體包括，第一條DNA序列與靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)源性基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源，能夠在靶細(xì)胞中進(jìn)行同源重組；第二條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源性基因組序列非同源，不能在靶細(xì)胞的基因組中進(jìn)行同源重組，第二條DNA序列進(jìn)一步包括能夠鑒定含有所述核苷酸序列的細(xì)胞的核苷酸序列；第三條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，能在靶細(xì)胞中接受同源重組；和任選地，第四條DNA序列與靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)源基因組序列非同源，不能在細(xì)胞中接受同源重組，當(dāng)存在第四條DNA序列時(shí)，進(jìn)一步包括能夠從不含有所述核苷酸序列的細(xì)胞中鑒定和分離含有所述DNA序列的細(xì)胞的核苷酸序列。優(yōu)選地，F(xiàn)PIC基因靶向載體中的DNA序列組成部分以5’至3’方向連接如下與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第一條DNA序列，第二條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第三條DNA序列，和第四條DNA序列。這樣的載體以能夠進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性靶基因組DNA序列的修飾為特征。
如此，本發(fā)明也涉及獲取轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，該細(xì)胞已使用這種FPIC基因靶向載體進(jìn)行位點(diǎn)特異同源重組。這種方法可通過，例如，以下的步驟實(shí)施在適合載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的條件下，將細(xì)胞與在此公開的FPIC基因靶向載體接觸；在選擇存在表現(xiàn)所述第二條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列和缺少表現(xiàn)第四條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列的條件下，增殖與載體接觸的細(xì)胞，因此選擇或富集用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和從含有所述第四條DNA的細(xì)胞中分離含有所述第二條DNA序列的細(xì)胞，從而獲得已經(jīng)使用FPIC基因靶向載體接受位點(diǎn)特異同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
附圖簡述圖1是對(duì)在使用FPIC基因靶向載體的位點(diǎn)定向誘變中涉及的過程進(jìn)行說明的流程解。
圖2是經(jīng)同源重組進(jìn)行的FPIC基因靶向的分子事件的圖解。
圖3是幾種類型的FPIC基因靶向載體的圖解。
圖4是在ptch2位點(diǎn)進(jìn)行FPIC基因靶向的圖解。
圖5是在paraxis位點(diǎn)進(jìn)行FPIC基因靶向的圖解。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于基因靶向載體的進(jìn)展，該載體用于通過位點(diǎn)特異性同源重組將修飾作用導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA序列中。相應(yīng)地，提供了基因靶向載體，以及采用這種載體基因修飾細(xì)胞的方法。也提供了使用本發(fā)明的基因靶向載體被基因修飾的細(xì)胞，以及由這些細(xì)胞發(fā)育而成的轉(zhuǎn)基因非人生物體，例如采用本發(fā)明的靶向載體在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列中以位點(diǎn)特異的方式進(jìn)行基因修飾的胚胎干細(xì)胞(ES)，以及由這些修飾的(ES)細(xì)胞發(fā)育而成的非人生物體。
術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列”在此定義為正常存在于細(xì)胞基因組中的核苷酸序列。如在此公開的，細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列能夠接受使用本發(fā)明基因靶向載體的序列進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組，因此，可以用作所公開的FPIC基因靶向載體的修飾靶標(biāo)。包括在此定義中的序列可代表細(xì)胞基因組中存在的特異基因的任何編碼或非編碼區(qū)。編碼如結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白、激素、受體、酶類、轉(zhuǎn)錄因子等蛋白產(chǎn)物的基因也包括在此定義中。這些序列也代表調(diào)控元件等同體如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或阻遏物元件。細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA序列的組成形式一般類似于FPIC基因靶向載體中存在的特異序列。即，它含有與FPIC基因靶向載體中存在的序列實(shí)質(zhì)上同源的序列，使得位點(diǎn)特異性同源重組能夠進(jìn)行。
術(shù)語“位點(diǎn)特異性同源重組”是指在核苷酸組成上實(shí)質(zhì)上相似的DNA序列之間發(fā)生的鏈交換遺傳交叉事件。這種遺傳交叉事件可發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列所包含的序列之間。另外，可能有超過一個(gè)位點(diǎn)特異性同源重組事件發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組序列中存在的序列之間，可引起置換事件，包含在FPIC基因靶向載體中的DNA序列替代了存在于細(xì)胞內(nèi)源基因組序列中的特異序列。同樣，單個(gè)位點(diǎn)特異性同源重組事件可發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組序列中存在的DNA序列之間，可引起插入事件，其中大部分或整個(gè)FPIC基因靶向載體被插入細(xì)胞內(nèi)源基因組序列中的特異位點(diǎn)。
術(shù)語“第一條DNA序列”是指存在于FPIC基因靶向載體中DNA序列，它們與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上是同源的。正是這些序列，在它們被導(dǎo)入含有相似序列、能夠接受所述重組作用的細(xì)胞中時(shí)，預(yù)測(cè)可接受位點(diǎn)特異性同源重組。
術(shù)語“第二條DNA序列”是指可根據(jù)特別的特性被檢測(cè)其存在的序列，由于缺少啟動(dòng)子和在陽性可選擇標(biāo)記物的上游存在的調(diào)控元件，它們可以，但不是必須的，獨(dú)立于細(xì)胞靶向序列而表達(dá)。第二條DNA序列定位在第一條和第三條DNA序列之間，后兩者與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上是同源的。第二條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此使用這條序列接受位點(diǎn)特異性同源重組。
術(shù)語“第三條DNA序列”是指在FPIC基因靶向載體中存在的DNA序列，它們與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上是同源的，然而與第一條DNA序列的序列是不同的，但可能是鄰近的，或適當(dāng)接近的。正是這些序列，在它們被導(dǎo)入含有相似序列，能夠接受所述的重組作用的細(xì)胞的過程中，預(yù)測(cè)可接受位點(diǎn)特異性同源重組。
術(shù)語“第四條DNA序列”是指可根據(jù)特別的特性被檢測(cè)其存在的特異序列，它們定位在第一條和第三條DNA序列的外部。第四條DNA序列含有自己的啟動(dòng)子和調(diào)控元件，因此其表達(dá)是獨(dú)立于細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA序列中存在的調(diào)控元件。第四條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此不能使用這條序列進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組。
在一個(gè)置換型FPIC基因靶向載體中，第一條，第二條，第三條和第四條DNA序列可如此組織，即第二條DNA序列位于第一條和第三條DNA序列之間，第四條DNA序列位于第一條或第三條DNA序列的5’或3’端。圖2圖示了用來進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組的一個(gè)FPIC基因靶向載體的組成形式。
第四條DNA序列可定位在包含在FPIC基因靶向載體中的第一條和第三條序列的上游或下游。上游一般是指載體中第一條和第三條序列的5’，下游一般是指其3’，所述載體含有第一條和第三條DNA序列，在方向上類似于細(xì)胞內(nèi)源基因組序列。應(yīng)該闡明的是5’和3’分別是指第一條和第三條DNA序列。這種組成形式代表一個(gè)置換型載體。第二條DNA序列可能根據(jù)第一條和第三條DNA序列而被反轉(zhuǎn)，仍保留可表達(dá)性，因此可檢測(cè)它的存在。另外，與細(xì)胞靶DNA中的相似序列比較可能FPIC基因靶向載體中第一條和第三條序列的部分可根據(jù)互相的位置而被反轉(zhuǎn)。插入型載體一般在位點(diǎn)特異性同源重組作用下將大部分載體序列插入細(xì)胞基因組中。
其他的選擇特征可由第五條DNA序列來表現(xiàn)，它位于第四條DNA序列相反的位置上。術(shù)語“相反”是指在第一條或第三條DNA序列外部的位置，位于這些序列的另一端，即與編碼陽性標(biāo)記物相關(guān)的第四條DNA序列的5’或3’端。
在一個(gè)插入型FPIC基因靶向載體中，第一條，第二條和第三條序列可被如此組織起來，即第三條序列可根據(jù)第一條序列在載體的線性化過程從5’反轉(zhuǎn)至3’端。所述的反轉(zhuǎn)方向可使載體在位點(diǎn)特異性同源重組過程中在位點(diǎn)特異的位置上的插入，該重組作用發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列之間。在大多數(shù)情況下，整個(gè)載體將被插入，實(shí)質(zhì)上同源的DNA序列的部分被復(fù)制。第四條DNA的編碼序列可以，但不是必須的包含在FPIC基因靶向載體中。
FPIC基因靶向載體的長度可根據(jù)所選擇的陽性可選擇標(biāo)記物，被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白產(chǎn)物的核苷酸序列，能夠驅(qū)動(dòng)第二條DNA序列編碼的陽性可選擇標(biāo)記物表達(dá)的啟動(dòng)子存在與否，適當(dāng)?shù)耐粗亟M所需的第一條和第三條DNA序列的長度，基本載體的長度和在細(xì)菌中質(zhì)粒載體的選擇作用如氨芐青霉素抗性和質(zhì)粒主鏈復(fù)制起始點(diǎn)的大小等而變化。但基于已知質(zhì)粒和陽性可選擇標(biāo)記物的大小，合理的估計(jì)整個(gè)載體將在長度上至少為幾千堿基對(duì)。
術(shù)語“分子信標(biāo)”在此的定義是指鑒定存在細(xì)胞內(nèi)的特異核苷酸序列的探針。分子信標(biāo)可由僅核酸如DNA或RNA組成，或可由肽核酸(PNA)結(jié)合物組成。分子信標(biāo)與特異核苷酸序列的結(jié)合可允許在體外或體內(nèi)鑒定這些序列的存在。
術(shù)語“功能性”在此的定義，就陽性可選擇標(biāo)記物而言，是賦予標(biāo)記物下面所述的能力，可檢測(cè)和分離含有編碼陽性可檢測(cè)標(biāo)記物的DNA的細(xì)胞，可從不含有陽性可選擇標(biāo)記物的或含有被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白的序列的細(xì)胞中鑒別出這些細(xì)胞。許多選擇試劑可因檢測(cè)存在于細(xì)胞中的陽性可選擇標(biāo)記物。這些試劑包括，但不限于，例如G418，次黃嘌呤，博來霉素，潮霉素，嘌呤霉素，殺稻瘟素，列于表I。另外，鑒定標(biāo)記物存在不需要添加試劑的陽性可選擇標(biāo)記物被認(rèn)為是功能性的，如果它們可從含有不同的可選擇標(biāo)記物或不含有可選擇標(biāo)記物的細(xì)胞中分離含有所述可選擇標(biāo)記物的細(xì)胞。一些實(shí)例包括，但不限于，熒光蛋白GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED和HcRED，也列于表I。
表I.在FPIC基因靶向載體中應(yīng)用的陽性可選擇標(biāo)記物
FPIC基因靶向載體包括兩個(gè)同源區(qū)，第一條和第三條DNA序列，它們與宿主基因組的區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上是同源的。典型地，載體含有的第一條和第三條DNA序列的同源性長度為大約50個(gè)堿基對(duì)和50,000個(gè)堿基對(duì)之間。也包括第二條和第四條DNA序列，它們編碼陽性可選擇標(biāo)記物，陰性可選擇標(biāo)記物，或被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白的序列，可鑒定FPIC靶向載體整體和其部分在宿主基因組中的存在與否。第二條DNA序列可編碼陽性可選擇標(biāo)記物，如，但不限于，例如藍(lán)綠熒光蛋白(cyan fluorescent protein)(CFP)，它定位在兩個(gè)同源區(qū)之間，因此可被包含在位點(diǎn)特異性同源重組應(yīng)該發(fā)生的宿主基因組整合體中。理想地，如果第四條DNA序列被轉(zhuǎn)錄但不編碼功能蛋白，第二條DNA序列將編碼陽性可選擇標(biāo)記物。如果第二條DNA序列編碼陽性可選擇標(biāo)記物，第四條DNA序列表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，它定位在同源區(qū)之外，因此將不會(huì)在同源重組作用下被加入宿主基因組中?？蛇x擇地，如果第二條DNA序列表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，第四條DNA序列則編碼陽性的可選擇標(biāo)記物。另外，可能第二條DNA序列表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，第四條DNA序列表現(xiàn)為陰性可選擇標(biāo)記物。另外，也可能第二條和第四條DNA序列均表現(xiàn)為不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列。選擇過程涉及在顯微鏡下或通過熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)細(xì)胞分選儀分選細(xì)胞，這將可以同時(shí)和單獨(dú)的從含有第四條DNA序列的細(xì)胞中分離出含有第二條DNA序列的細(xì)胞。這些細(xì)胞的鑒定涉及采用熒光或其他方法檢測(cè)陽性可選擇標(biāo)記物，通過應(yīng)用分子信標(biāo)技術(shù)檢測(cè)不編碼功能蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，分子信標(biāo)技術(shù)可鑒定細(xì)胞中特異的已轉(zhuǎn)錄序列。然后細(xì)胞可在組織培養(yǎng)中增殖，確定正確位點(diǎn)特異同源重組的基因靶向事件的基因型。應(yīng)用陽性可選擇標(biāo)記物與可適用于分子信標(biāo)技術(shù)的已轉(zhuǎn)錄序列的組合可鑒定已接受位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞，對(duì)已有的基因靶向方法學(xué)是一個(gè)實(shí)質(zhì)上的改良。
在本發(fā)明中描述的方法中使用的FPIC基因靶向載體可被如此組織，即第二條DNA序列可操作的定位在兩個(gè)同源區(qū)之間，第四條DNA序列可操作的定位在兩個(gè)同源區(qū)的外部和外側(cè)。可能第二條DNA序列可采用這種方式來定位以破壞或置換外顯子或基因組內(nèi)源區(qū)的編碼序列，在此位置上可發(fā)生位點(diǎn)特異性同源重組，因此可使內(nèi)源位點(diǎn)失活并因此喪失功能。
在一個(gè)方面，第二條DNA序列可被定位，以便置換或插入不表現(xiàn)為外顯子或編碼序列的基因組區(qū)域，如內(nèi)含子，外顯子的不翻譯區(qū)域或調(diào)控元件區(qū)域如啟動(dòng)子。在這種情況下，細(xì)胞可因在該位點(diǎn)上接受位點(diǎn)特異性同源重組，并不會(huì)滅活該特異位點(diǎn)而被選擇。
在另一個(gè)方面，第二條DNA序列也可包含該序列獨(dú)特的調(diào)控元件，其定位方式為在選擇進(jìn)行位點(diǎn)特異重組的基因組區(qū)域中可導(dǎo)入新的調(diào)控元件。本發(fā)明包括了為了實(shí)施位點(diǎn)特異同源重組的所述FPIC基因靶向載體和隨后對(duì)接受所述重組的細(xì)胞的鑒定。
現(xiàn)在所描述的本發(fā)明也包括了根據(jù)FPIC基因靶向載體已接受位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞和在此所述的鑒定方法。另外，現(xiàn)在所描述的本發(fā)明包括來自這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物和在此所描述的方法，所述的這些細(xì)胞使用FPIC基因靶向載體已接受了位點(diǎn)特異同源重組。
也包括來自這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物和在此所描述的方法，所述的這些細(xì)胞使用FPIC基因靶向載體已接受了位點(diǎn)特異性同源重組。以往已經(jīng)證實(shí)了植物通過陽性-陰性選擇可接受位點(diǎn)特異性同源重組以及基因靶向，因此可接受FPIC基因靶向載體和在此所描述的方法(Siebert等人，(2002)，Plant Cell，14，1121；Hanin等人，(2001)，Plant J.，28，671；Xiaohui等人，(2001)，Gene，272，249)。
在本發(fā)明中所描述的方法中，大多數(shù)被整合進(jìn)宿主細(xì)胞中的載體可以基本上隨機(jī)的方式進(jìn)行，不需優(yōu)選基因組的特異區(qū)域。但合理的建議是一定比例的第一條DNA載體通過位點(diǎn)特異性同源重組作用整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中。隨后的細(xì)胞選擇可分離和鑒定成功接受位點(diǎn)特異性同源重組作用的細(xì)胞。選擇作用是基于FPIC基因靶向載體的組成形式和組成成分。FPIC基因靶向載體包括兩個(gè)同源區(qū)，第一條和第三條DNA序列，它們與宿主基因組區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上是同源的。也包括第二條DNA序列和可選擇的第四條DNA序列，它們可鑒定FPIC基因靶向載體整體和其部分在宿主基因組中存在與否。第二條DNA序列定位在兩個(gè)同源區(qū)之間，因此可被包含在位點(diǎn)特異性同源重組應(yīng)該發(fā)生的宿主基因組整體中。選擇過程涉及顯微鏡下或通過FACS細(xì)胞分選儀來進(jìn)行細(xì)胞分選，這樣可同時(shí)和單獨(dú)的從含有第四條DNA序列的細(xì)胞中分離含有第二條DNA序列的細(xì)胞。然后細(xì)胞在組織培養(yǎng)中增殖，并確定正確位點(diǎn)特異同源重組的基因靶向事件的基因型。
現(xiàn)在所描述的本發(fā)明的FPIC基因靶向載體方法可如此組織起來，即第二條DNA序列被可操作性的定位在兩個(gè)同源區(qū)之間。可能第二條DNA序列可以此模式被定位以破環(huán)或置換基因組內(nèi)源區(qū)域的外顯子或編碼序列，其位置可發(fā)生位點(diǎn)特異性同源重組，可使內(nèi)源位點(diǎn)失活并喪失功能。
第二條DNA序列可被定位，即它可置換或插入不表現(xiàn)為外顯子或編碼序列的基因組區(qū)域中，如內(nèi)含子，外顯子的不翻譯區(qū)域或調(diào)控元件區(qū)域如啟動(dòng)子。在這種情況下，細(xì)胞可因在該位點(diǎn)上接受位點(diǎn)特異性同源重組，并不會(huì)滅活該特異位點(diǎn)而被選擇。
在第三種情況下，可能第二條DNA序列也包含該序列獨(dú)特的調(diào)控元件，其定位方式為在選擇進(jìn)行位點(diǎn)特異重組的基因組區(qū)域中可導(dǎo)入新的調(diào)控元件。
第二條和第四條DNA序列的序列組成一般與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此不能接受位點(diǎn)特異性同源重組。因此所有的位點(diǎn)特異同源重組是編碼與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的區(qū)域的第一條和第三條DNA序列的結(jié)果，因此能夠接受鏈交換的遺傳交叉過程。另外，第二條和第四條DNA序列可根據(jù)相互的位置和根據(jù)細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列以方向獨(dú)立的方式被定位。但第二條DNA序列的這種定位，需要不依賴細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA調(diào)控元件的這些序列的轉(zhuǎn)錄。
許多優(yōu)選的陽性可選擇標(biāo)記物可用于FPIC基因靶向載體中(見表I)。這些序列可選擇含有陽性可選擇標(biāo)記物的細(xì)胞，以便將所述細(xì)胞區(qū)分于那些不含有陽性可選擇標(biāo)記物的細(xì)胞。用作第二條DNA序列的最廣泛使用的陽性可選擇標(biāo)記物可能編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因產(chǎn)物。其他適合第二條DNA序列的陽性可選擇標(biāo)記物包括，但不限于，編碼殺稻瘟素抗性，嘌呤霉素抗性，博來霉素抗性和潮霉素抗性的序列。這些陽性可選擇標(biāo)記物的幾種也可適用于使用FPIC基因靶向載體在植物中進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組。
術(shù)語“陰性可選擇標(biāo)記物”包括任何特異的基因，DNA序列，蛋白，肽或氨基酸序列，當(dāng)導(dǎo)入細(xì)胞中或接近細(xì)胞時(shí)，可具有通過細(xì)胞殺傷的作用將細(xì)胞從一個(gè)總的群體中消除的能力。術(shù)語“陰性選擇作用”是指通過實(shí)現(xiàn)可殺死所述細(xì)胞的方法學(xué)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇的作用。為了，許多陰性可選擇標(biāo)記物可用來增強(qiáng)或補(bǔ)充鑒定已接受位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞的可能性。這些標(biāo)記物包括，但不限于，胸苷激酶，白喉毒素A鏈，次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hprt)和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(gpt)，見表II。
表II.用于共轉(zhuǎn)化方法中的陰性可選擇標(biāo)記物
“突變中DNA序列”在此是指任何改變了細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列的序列。這樣的改變可導(dǎo)致細(xì)胞DNA序列功能容量的失活。這樣的改變也可增強(qiáng)細(xì)胞序列DNA的功能容量或?qū)?xì)胞DNA序列的功能容量無影響。
“突變的DNA序列”在此是指任何可在使用FPIC基因靶向載體的過程中接受改變的細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列。一般預(yù)測(cè)突變的DNA序列將在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列之間的位點(diǎn)特異重組作用下而產(chǎn)生?！巴蛔兊陌屑?xì)胞”是能夠接受位點(diǎn)特異性同源重組的細(xì)胞，它含有通過使用如在此所公開的存在于FPIC基因靶向載體中的突變DNA序列在細(xì)胞基因組內(nèi)建立的突變DNA序列。
術(shù)語“實(shí)質(zhì)上非同源的DNA”或“實(shí)質(zhì)上不同源的DNA”是指不含有與靶DNA序列相似并足以發(fā)生位點(diǎn)特異同源重組過程的核苷酸序列的DNA序列。不相似序列的這種不能接受與靶DNA序列的位點(diǎn)特異同源重組的能力的原因是兩條序列之間堿基對(duì)組成的不匹配。
在細(xì)胞基因組中建立突變的DNA序列具有許多應(yīng)用上的益處。例如X-連鎖基因可用來分析組織培養(yǎng)中的功能關(guān)系，如果由FPIC基因靶向載體靶向的特定細(xì)胞類型是雄性來源的話。另外，采用FPIC基因靶向載體對(duì)胚胎干細(xì)胞的操作可建立研究人類疾病的動(dòng)物模型。例如p53位點(diǎn)，已經(jīng)成功的采用陽性-陰性選擇技術(shù)在鼠胚胎干細(xì)胞中被滅活，這些細(xì)胞已被用于建立這個(gè)位點(diǎn)編碼的蛋白產(chǎn)物缺陷的小鼠(Donehower等人，(1992)，Nature，356，215)。這些小鼠在發(fā)育上是正常的，但易于發(fā)生特發(fā)性腫瘤。FPIC基因靶向載體和技術(shù)可在胚胎干細(xì)胞和由所述細(xì)胞建立的動(dòng)物中產(chǎn)生相似的基因修飾。FPIC基因靶向載體和技術(shù)的其他應(yīng)用包括產(chǎn)生獲取功能的等位基因，可研究許多細(xì)胞和生理現(xiàn)象。許多原癌基因已經(jīng)被當(dāng)作獲取功能的等位基因來分析，包括c-myc，細(xì)胞周期蛋白D1和ErbB-2(綜述見Hutchinson等人，(2000)，Oncogene，19，130)。使用FPIC基因靶向載體和在此所描述的方法可有效地進(jìn)行胚胎干細(xì)胞和來自這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的喪失和獲取功能的研究。
FPIC基因靶向載體和方法可用于建立和鑒定已接受載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組靶序列之間位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞。載體實(shí)質(zhì)上可富集鑒定接受所述過程的細(xì)胞?！皩?shí)質(zhì)上富集”是指明顯增加鑒定接受載體和細(xì)胞DNA序列之間位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞可能性的能力?？赡苄缘拿黠@增加是當(dāng)與非特異插入或整合事件相比，至少兩倍的同源重組事件，優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少100倍，甚至更優(yōu)選10,000倍。使用FPIC基因靶向載體獲得的實(shí)質(zhì)上富集的細(xì)胞群包括大約1％，更優(yōu)選10％，甚至更優(yōu)選99％的分離細(xì)胞接受了在FPIC基因靶向載體序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組靶序列之間的位點(diǎn)特異同源重組。
FPIC基因靶向載體可能被設(shè)計(jì)成可在內(nèi)源調(diào)控元件的控制下驅(qū)動(dòng)第二條DNA序列的轉(zhuǎn)錄為FPIC基因靶向載體靶向的特異基因。在這種情況下，載體被構(gòu)建，這樣第二條DNA序列足以缺少驅(qū)動(dòng)這些序列轉(zhuǎn)錄的上游元件。在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組靶序列之間的同源重組提供了隨后要驅(qū)動(dòng)第二條DNA序列轉(zhuǎn)錄的靶基因的特異調(diào)控元件。如果不發(fā)生位點(diǎn)特異性同源重組，第二條DNA序列大多數(shù)經(jīng)常不被轉(zhuǎn)錄，因此對(duì)足以驅(qū)動(dòng)這些序列的轉(zhuǎn)錄提供了內(nèi)源性的細(xì)胞調(diào)控元件。這樣一個(gè)載體組成形式的實(shí)例是將第二條DNA序列定位在第一條DNA序列和第三條DNA序列之間，其中第一條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA是實(shí)質(zhì)上同源的，并含有一個(gè)啟動(dòng)子和部分5’未翻譯區(qū)，第三條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA實(shí)質(zhì)上是同源的，并含有內(nèi)含子和下游外顯子的一部分。FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組靶序列之間的位點(diǎn)特異同源重組可在內(nèi)源調(diào)控元件的控制下對(duì)第二條DNA序列進(jìn)行定位。
就靶向修飾的基因功能而言，對(duì)于第二條DNA序列的定位可有許多種情況，可產(chǎn)生許多表現(xiàn)型。例如，可能不需要破壞內(nèi)源位點(diǎn)就可能在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組靶序列之間實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異同源重組。這可以通過將第二條DNA序列定位在一個(gè)內(nèi)含子或非編碼區(qū)內(nèi)而實(shí)現(xiàn)，這樣將所述的第二條DNA序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組中不會(huì)破壞調(diào)控，外顯或編碼序列。這樣一個(gè)載體的組成形式的實(shí)例是將第二條DNA序列定位在第一條DNA序列和第三條DNA序列之間，其中第一條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA實(shí)質(zhì)上是同源的，并含有一個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子的一部分，第三條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA實(shí)質(zhì)上是同源的，并含有一個(gè)內(nèi)含子的一部分和一個(gè)下游的外顯子。在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組靶序列之間的位點(diǎn)特異同源重組可在內(nèi)含子中定位陽性可選擇標(biāo)記物，因此不會(huì)破壞重要的外顯編碼序列。一個(gè)要求是第二條DNA序列必須由存在于FPIC基因靶向載體中的調(diào)控元件控制。
將突變的DNA序列導(dǎo)入能夠接受位點(diǎn)特異同源重組的靶細(xì)胞基因組中，并不限制于建立喪失功能或獲得功能的等位基因。例如，可能為了驅(qū)動(dòng)由位點(diǎn)特異同源重組靶向的特異細(xì)胞內(nèi)源位點(diǎn)的表達(dá)，將外源調(diào)控序列導(dǎo)入細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物中新的組織-和/或細(xì)胞類型特異的區(qū)域，所述的動(dòng)物或植物是從由FPIC基因靶向載體靶向的細(xì)胞建立的。為此目的使用的FPIC基因靶向載體和方法學(xué)可指導(dǎo)或控制任何基因?qū)嵸|(zhì)上空間和時(shí)間上的表達(dá)模式，這些基因能夠接受位點(diǎn)特異性同源重組。在此所述為此目的所述技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例是導(dǎo)入來自原癌基因c-myc編碼序列的上游Pit-1位點(diǎn)的啟動(dòng)子和調(diào)控元件。這種情況可使c-myc在發(fā)育中和成體垂體的促生長激素細(xì)胞，垂體催乳素細(xì)胞(lactotrope)和促甲狀腺素細(xì)胞中異位表達(dá)，并提供了一種垂體腫瘤發(fā)生的模型(Rhodes等人，(1996)，Mol.Cell Endocrinol.，124，163；Baxter等人，(2001)，75，9790)。表III列舉了許多已定性的調(diào)控序列，它們可通過FPIC基因靶向方法被用來驅(qū)動(dòng)內(nèi)源位點(diǎn)的表達(dá)。
表III.調(diào)控元件的實(shí)例.
可以理解的是，可以接受位點(diǎn)特異同源重組的任何類型細(xì)胞可被FPIC基因靶向載體和方法處理以對(duì)細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列進(jìn)行突變。能夠接受位點(diǎn)特異同源重組的細(xì)胞可來自許多生物體和物種，包括但不限于，人，鼠，綿羊，豬，牛，猿，犬和貓。一般，任何能夠接受位點(diǎn)特異同源重組的真核細(xì)胞可成功地被FPIC基因靶向載體和方法靶向，在細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA中中產(chǎn)生突變的DNA序列。
當(dāng)建立含有需要通過使用FPIC基因靶向載體和方法或共轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生的修飾作用的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物時(shí)，優(yōu)選的細(xì)胞類型是胚胎干細(xì)胞。這些細(xì)胞一般來自植入之前的胚胎內(nèi)細(xì)胞群，并在組織培養(yǎng)中增殖進(jìn)行基因操作。在通過使用FPIC基因靶向載體和方法突變細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列的過程中，細(xì)胞經(jīng)微注射技術(shù)被導(dǎo)入胚泡中，所述的胚泡被植入至假孕的雌性宿主中(Hogan等人，(編者)(1994)，鼠胚的操作，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。司選擇地，桑椹胚聚集方法可用于建立含有基因修飾干細(xì)胞的胚胎(Kong等人，(2000)，Lab Anim.，29，25)。在出生后階段仍然存活的胚胎經(jīng)常表現(xiàn)嵌合的細(xì)胞成分，其中一定比例的細(xì)胞來自胚泡來源，一定比例的細(xì)胞來自那些通過FPIC基因靶向載體和技術(shù)突變的起源。嵌合的動(dòng)物隨后被繁殖成為對(duì)FPIC基因靶向載體和技術(shù)突變的等位基因來說是雜合性和純合性的。
在此所述的FPIC基因靶向技術(shù)被用于糾正人體中的特異基因缺陷。例如，可能通過FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列之間的位點(diǎn)特異同源重組在人干細(xì)胞中產(chǎn)生突變的DNA序列，隨后將這些細(xì)胞移植到病人體內(nèi)，以糾正特異的基因疾患或補(bǔ)充特異基因產(chǎn)物?；驕缁畹钠渌麧撛趹?yīng)用是細(xì)胞表面上蛋白受體的破壞。例如其中已經(jīng)采用適當(dāng)?shù)腇PIC基因靶向載體破壞了假定病毒受體表達(dá)的細(xì)胞系或生物體進(jìn)行病毒檢測(cè)，以證實(shí)受體實(shí)際上參與了病毒的感染。進(jìn)一步，適當(dāng)?shù)腇PIC基因靶向載體被用于產(chǎn)生特異基因缺陷的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。例如，許多基因缺陷已經(jīng)通過特異基因不能表達(dá)功能基因產(chǎn)物而被定性，如α和β地中海貧血，血友病，高歇病(Gaucher’s disease)和影響α1-抗胰蛋白酶，ADA，PNP，苯丙酮尿癥，家族性高膽固醇血癥和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤產(chǎn)生的缺陷。含有一個(gè)或多個(gè)與這些疾病狀態(tài)或編碼特異基因缺陷的修飾作用有關(guān)的等位基因被破壞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作治療的模型。對(duì)于出生時(shí)成活的這些動(dòng)物，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。但當(dāng)基因缺陷影響生存時(shí)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的適當(dāng)后代(如F0，F(xiàn)1)可用于研究基因治療的體內(nèi)技術(shù)。
FPIC基因靶向載體被設(shè)計(jì)特別用來在細(xì)胞的內(nèi)源基因組DNA中突變DNA序列，所述細(xì)胞能夠接受位點(diǎn)特異性同源重組。FPIC基因靶向載體的成分包括至少一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的DNA區(qū)，一個(gè)使人能夠從不含有這些序列的細(xì)胞中鑒別含有這些序列的細(xì)胞的DNA序列，至少一個(gè)其他的DNA序列，它可使人從不含有這些序列的細(xì)胞中鑒別和分離出含有這些序列的細(xì)胞。(圖3)另外，優(yōu)選的是，F(xiàn)PIC基因靶向載體在被導(dǎo)入細(xì)胞中突變細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列之前被線性化，因?yàn)榫€性化載體可較環(huán)狀載體表現(xiàn)明顯更高的靶向頻率(Thomas等人，(1986)，Cell，44，49)。但是，可能不需要線性化就可使用FPIC基因靶向載體達(dá)到這些目的。
為了靶向不同的等位基因，不同的調(diào)控元件可以，但不是必須的，用于轉(zhuǎn)錄第二條和第四條DNA序列，特別是第二條DNA序列，它可被定位在置換載體中實(shí)質(zhì)上同源的兩個(gè)區(qū)域之間。通過操縱第二條和第四條DNA序列的轉(zhuǎn)錄水平，可成功地進(jìn)行靶向，其中這些序列由于異染色質(zhì)的組成或鄰近的調(diào)控元件對(duì)這些水平是很敏感的，所述的水平可影響陽性標(biāo)記物的表達(dá)或可影響位點(diǎn)特異性同源重組的過程。表IV列出了可用于現(xiàn)在所描述的本發(fā)明中的更普遍的調(diào)控區(qū)域。
表IV.用來驅(qū)動(dòng)可選擇標(biāo)記物表達(dá)的調(diào)控區(qū)R
成功進(jìn)行位點(diǎn)特異同源重組所需要的FPIC基因靶向載體的長度是重要的參數(shù)，經(jīng)常依賴于建立突變DNA序列所要靶向的特異基因。載體的長度也依賴于幾種因素。代表第二條和第四條DNA序列的DNA序列的選擇將影響總的載體長度，因?yàn)樾蛄薪M成是根據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄的或表達(dá)的DNA序列，陽性或陰性可選擇標(biāo)記物而變化的。另外，在置換型載體中，第一條和第三條DNA序列的長度是重要的參數(shù)，為了進(jìn)行成功的基因靶向必須被正確確定，兩條序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA序列實(shí)質(zhì)上是同源的。一般來說，一個(gè)同源區(qū)可小至25bp(Ayares等人，(1986)，Genetics，83，5199)，盡管推薦使用明顯更大的區(qū)域。直至一個(gè)特定的長度，在FPIC基因靶向載體同源性數(shù)量的增加可增加靶向的效率(Zhang等人，(1994)，Mol.Cell Biol.，14，2404)。在大多數(shù)情況下，整個(gè)載體的長度最小為1kb，通常最大不超過500kb，盡管載體長度也可依賴于用來構(gòu)建載體的技術(shù)。例如，可能用粘粒，細(xì)菌人工染色體(BAC)，或酵母人工染色體(YAC)構(gòu)建FPIC基因靶向載體，作為兩個(gè)實(shí)質(zhì)上的同源區(qū)的供給者，因此產(chǎn)生了一個(gè)明顯很大的載體(Ananvoranich等人，(1997)，BioTechniques，23，812；Cocchia等人.，(2000)，Nucleic Acids Res.，28，E81)。載體的長度也包括質(zhì)粒主鏈序列，如編碼復(fù)制起始點(diǎn)的序列，以及細(xì)菌藥物抗性產(chǎn)物如氨芐青霉素，如果它們?cè)谟幂d體轉(zhuǎn)化細(xì)胞前沒有被移除的話。
與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的，并接受位點(diǎn)特異同源重組以在細(xì)胞靶標(biāo)中建立突變DNA序列的FPIC基因靶向載體DNA序列優(yōu)選與細(xì)胞的對(duì)應(yīng)部分具有明顯高的同源性。在位點(diǎn)特異性同源重組的遺傳交叉和鏈交換過程中，高同源性可進(jìn)行有效的堿基配對(duì)。在FPIC基因靶向和細(xì)胞DNA序列之間的堿基配對(duì)不匹配都可影響重組反應(yīng)。例如，優(yōu)選在FPIC基因靶向置換載體中的第一條和第三條DNA序列與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列是100％同源的，次優(yōu)選的是80％的同源，更次優(yōu)選的是50％的同源。第二條和第四條DNA序列一般對(duì)細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列是非同源的，因此含有這些序列就不能接受位點(diǎn)特異性同源重組。
在特定的情況下，在發(fā)生在FPIC基因靶向載體和細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA序列之間的位點(diǎn)特異同源重組過程中，去除已經(jīng)摻入至細(xì)胞基因組中的DNA序列是有益的。這是由于這些序列的表達(dá)可潛在的負(fù)面影響細(xì)胞或生物體的活力和生存?？蛇x擇地，導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中的調(diào)控元件反過來可影響與這些元件并排的內(nèi)源位點(diǎn)的表達(dá)。從宿主基因組中去除序列可能通過許多方法。Cre-Lox技術(shù)可成功地用于經(jīng)FPIC基因靶向載體和技術(shù)去除已導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA中的特異序列(Cre-Lox的綜述見Ryding等人，(2001)，J.Endocrinol.，171，1)。例如，編碼陽性可選擇標(biāo)記物的序列和相應(yīng)的調(diào)控元件在細(xì)胞轉(zhuǎn)化前可側(cè)向位于FPIC基因靶向載體的Lox P重組位點(diǎn)。將這些序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中后，Cre重組酶的暫時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)將可以去除一個(gè)Lox P位點(diǎn)和所有定位在Lox P位點(diǎn)之間的所有序列。存在許多去除序列的Cre-Lox技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例。Kaartinen等人已經(jīng)證明經(jīng)腺病毒感染16細(xì)胞期桑椹胚通過暫時(shí)表達(dá)Cre可去除側(cè)向1ox P位點(diǎn)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因盒(Kaartinen等人，(2001)，Genesis，31，126)。Xu等人通過在Ella啟動(dòng)子控制下與表達(dá)Cre小鼠的雜交以及對(duì)含有Cre表達(dá)質(zhì)粒的基因盒的細(xì)胞進(jìn)行前核注射，可成功地去除側(cè)向于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因盒的lox P(Xu等人(2001)，Genesis，30，1)。因此，如果FPIC基因靶向載體被配置以置換或糾正缺陷的細(xì)胞外顯序列，如為了進(jìn)行人體基因治療，轉(zhuǎn)錄的序列和相應(yīng)的第二條DNA序列的調(diào)控元件可在完成FPIC基因靶向載體和宿主DNA之間的位點(diǎn)特異同源重組后被去除。
在此公開的FPIC基因靶向載體和方法可用于在植物中突變DNA序列。實(shí)際上，存在有植物譜系中的幾個(gè)同源重組的實(shí)例(Siebert等人，(2002)，Plant Cell，14，1121，綜述見Schaefer，(2002)，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol Biol.，53，477)。另外，所述的同源重組已經(jīng)使用陽性-陰性選擇技術(shù)被用來靶向幾種植物位點(diǎn)，包括乙醇脫氫酶和原卟啉原氧化酶(PPO)位點(diǎn)(Xiaohui等人，(2001)，Gene，272，249；Hanin等人，(2001)，Plant J.，28，671)。假定有許多抗性標(biāo)記物，它們可用來實(shí)施FPIC基因靶向方法，以經(jīng)位點(diǎn)特異性同源重組產(chǎn)生突變的DNA序列。這些標(biāo)記物包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，以及任何除草劑或殺蟲劑抗性位點(diǎn)，其中這些位點(diǎn)在導(dǎo)入植物細(xì)胞的過程中可容受陽性可選擇的特征。在使用FPIC基因靶向載體和方法建立的植物中的突變通過導(dǎo)入外源調(diào)控元件，可在內(nèi)源位點(diǎn)表達(dá)水平上包括喪失功能，獲得功能或修飾。喪失功能或獲得功能的突變可通過去除特異的內(nèi)源DNA序列或改變序列而產(chǎn)生，所述的序列改變可改變特異植物基因編碼的氨基酸組成。另外，“敲入”(knock-in)實(shí)驗(yàn)可在植物中實(shí)施，通過使用FPIC基因靶向載體和方法將外源基因或編碼區(qū)導(dǎo)入到一個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)中。
FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，可通過許多方法實(shí)現(xiàn)，包括以前在將外源DNA插入原生質(zhì)體中時(shí)所建立的方法(Hain等人，(1985)，Mol.Gen.Genet.，199，161；Negrutiu等人，(1987)，Plant Mol.Biol.，8，363；Paszkowski等人，(1984)，EMBO J.，3，2717)。微注射也可成功地將FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Dela Pena等人，(1987)，Nature，325，274；Crossway等人(1986)，Mol.Gen.Genet.，202，179)。另外，可能經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Deshayes等人，(1985)，EMBO J.，4，2731)。在成功地將FPIC基因靶向載體導(dǎo)入植物細(xì)胞的過程中，位點(diǎn)特異性同源重組可根據(jù)FPIC基因靶向載體的構(gòu)建和組成形式突變細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列。
在本發(fā)明中所述的細(xì)胞分離策略包括通過使用FACStar PlusTM細(xì)胞分選儀來進(jìn)行細(xì)胞分選，以及人工分離技術(shù)，但本發(fā)明不限于這種儀器或其他分離技術(shù)(圖1)。其他的細(xì)胞分選儀器也可用來有效的分離表達(dá)特異DNA序列或反之其他獨(dú)特DNA序列的表達(dá)的細(xì)胞。這些包括但不限于FACS Vantage SE I，和FACS Vantage SE 11或能夠基于本發(fā)明中所描述的方法進(jìn)行分選細(xì)胞的任何儀器。
在某些情況下，在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)特異核苷酸序列存在與否的策略設(shè)計(jì)使用分子信標(biāo)。分子信標(biāo)(molecular beacon)是可在體外和/或體內(nèi)與特異核苷酸序列結(jié)合的核酸或肽核酸結(jié)合物。分子信標(biāo)與靶核苷酸序列的結(jié)合經(jīng)?？梢鹛禺惒ㄩL光的發(fā)射，這依賴于分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)(Tyagi等人，(1996)，Nature Biotechnol.，14，303；Tyagi等人，(1998)，Nature Biotechnol.，16，49；Vet等人，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，6394；Kostrikis等人，(1998)，Science，279，1228)。分子信標(biāo)典型地包括一條對(duì)兩個(gè)互補(bǔ)的臂序列中內(nèi)含的靶核苷酸特異的寡核苷酸序列。其他類型的分子信標(biāo)包括經(jīng)常為了添加的穩(wěn)定性與蛋白或氨基酸序列結(jié)合的序列。熒光基團(tuán)如EDANS與5’磷酸基團(tuán)結(jié)合，淬滅劑如DABCYL與3’羥基基團(tuán)結(jié)合。不同的熒光基團(tuán)和DABCYL對(duì)其的淬滅效率的實(shí)例列在表V。在分子信標(biāo)序列與靶序列結(jié)合的過程中，淬滅劑和熒光基團(tuán)是分離的，因此可使熒光具有特異的波長。熒光可有效的在體外或體內(nèi)鑒定特異靶核苷酸序列的存在與否?？梢允褂门c分子信標(biāo)探針結(jié)合的染料如與SybGreenTM標(biāo)記物結(jié)合的染料。
表V.分子信標(biāo)中DABCYL對(duì)不同熒光基團(tuán)的淬滅作用
分子信標(biāo)技術(shù)可用于在活細(xì)胞中鑒定特異的核苷酸序列。電穿孔，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)和磷酸鈣沉淀法已經(jīng)成功地用于將分子信標(biāo)導(dǎo)入活細(xì)胞內(nèi)(Matsuo，(1998)，Biochim.Biophys.Acta，1379，178；Sazani等人，(2001)，Nucleic Acids Res.，29，3965；Doyle等人，(2001)，40，53；Dirks等人，(2001)，Histochem.Cell BioL，115，3)。FPIC基因靶向策略可以使用所有這些方法或其中之一，成功地將分子信標(biāo)探針導(dǎo)入細(xì)胞中以鑒定在這些細(xì)胞中存在的特異核苷酸序列。
FPIC基因靶向載體用于FPIC基因靶向法，用來篩選含有第二條DNA序列的轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞。這樣的篩選步驟實(shí)質(zhì)上可富集那些已發(fā)生同源重組的轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞。如在此所使用的，“實(shí)質(zhì)上的富集作用”是指相比于同源轉(zhuǎn)化體與非同源轉(zhuǎn)化體中的比例，至少富集兩倍的轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞，優(yōu)選10倍的富集，更優(yōu)選的1000倍的富集，最優(yōu)選的10,000倍富集，也就是轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的比例。在一些情況下，同源重組與隨機(jī)整合相比的頻率是大約1000中出現(xiàn)1次，在某些情況下，低于10,000個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中出現(xiàn)1次。通過FPIC基因靶向載體和本發(fā)明的方法獲得的實(shí)質(zhì)上的富集作用經(jīng)常可產(chǎn)生一些細(xì)胞群，其中大約1％，更優(yōu)選大約20％，最優(yōu)選大約95％的收獲細(xì)胞群含有轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞，其中在轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞中FPIC基因靶向載體已經(jīng)被同源整合。這種實(shí)質(zhì)上富集的轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞群然后被用于隨后的基因操作，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。
下面理論上的實(shí)施例作為實(shí)施例而被展示，并不能解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的一種限制。
實(shí)施例1采用FPIC基因靶向載體在胚胎干細(xì)胞中滅活ptch2位點(diǎn)1.ptch2靶向載體的構(gòu)建ptch2是一個(gè)跨膜功能區(qū)受體，據(jù)推測(cè)在胚胎發(fā)育和出生后的過程中參與刺猬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控(Motoyama等人，(1998)，Nat.Genet.，18，104；Carpenter等人，PNAS，95，13630，每一篇在此都合并作為參考文獻(xiàn))。ptch2靶向載體可從λ噬菌體小鼠基因組DNA文庫中，采用噬菌體克隆而構(gòu)建，所述的噬菌體含有橫跨外顯子5至11的基因組序列，這個(gè)區(qū)域包含ptch2受體的跨膜區(qū)2至8(圖4)。簡言之，理論上1.7kb的同源區(qū)3’區(qū)域，在此是指第一條DNA序列，可從ptch2噬菌體克隆中分離的基因組DNA通過PCR擴(kuò)增，并側(cè)向于Kpn1和Not1位點(diǎn)。該片段可被亞克隆進(jìn)pPOLYLINKER質(zhì)粒，該質(zhì)粒此后稱為pPolylinkerl.7。理論上同源區(qū)的5’區(qū)域含有外顯子5，6以及外顯子7的大多數(shù)5’區(qū)域，在此稱為第三條DNA序列，可用限制性酶BamHl和Ncol從基因組克隆中去除，用Klenow片段DNA聚合酶填平，并將平端亞克隆進(jìn)pPolylinkerl.7的Hpa1位點(diǎn)，以產(chǎn)生這里稱為pPolylinkerl.7upper的質(zhì)粒。編碼抗生素抗性標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的DNA片段，在磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子的控制下，在此是指第二條DNA序列，隨后被插入同源區(qū)5’和3’區(qū)域之間，以取代跨膜功能區(qū)2、3和4的編碼區(qū)，從而使受體滅活，并產(chǎn)生被稱為P2的質(zhì)粒。在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下，編碼轉(zhuǎn)錄的但無功能序列的DNA片段，在此是指第四條DNA序列，可被亞克隆進(jìn)同源區(qū)5’區(qū)域上游，因此產(chǎn)生在此稱為P2TV的載體。
2.用ptch2靶向載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞存在于靶向載體的3’末端和同源區(qū)3’端下游的Not1位點(diǎn)可用來在胚胎干細(xì)胞(ES)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化前進(jìn)行線性化。100μg P2TVG載體被線性化，苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀，并在胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化前重懸在無菌蒸餾水中，濃度為1μg/μl。干細(xì)胞在明膠包被的10cm培養(yǎng)板，于M15培養(yǎng)基中在37℃，5％CO2增殖至大約50％融合，所述的培養(yǎng)基在Dulbecco′s最小限制性培養(yǎng)基(DMEM)中含有15％FCS，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸鈉，10-4Mβ-巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，50μg/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，1000U/ml LIF。細(xì)胞在無血清DMEM中沖洗，并以每個(gè)10cm培養(yǎng)板的胚胎干細(xì)胞，用8μg線性化載體采用LipofectamineTM試劑通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(Invitrogen Corp.；Carlsbad CA)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24至48小時(shí)，細(xì)胞或者被收獲在FACStar PlusTM細(xì)胞分選儀中分離，或是如下所述進(jìn)行抗生素選擇。細(xì)胞的收獲包括在無菌蒸餾磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中沖洗兩次，然后用1ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA，在每個(gè)10cm培養(yǎng)板中胰蛋白酶消化15分鐘。去除剩余的胰蛋白酶，細(xì)胞重新懸浮在細(xì)胞分選緩沖液中，緩沖液PBS中含有1mM EDTA，25mM HEPES，pH7.0和1％透析的FCS，細(xì)胞密度為10×106細(xì)胞/毫升。在分選之前細(xì)胞在5％CO2中保持在冰上。
3.導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)分子信標(biāo)a)用P2TVG轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞置于200μg/ml遺傳霉素(geneticin)(G418)中進(jìn)行選擇，篩選已經(jīng)被穩(wěn)定地?fù)饺腙栃钥蛇x擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞。細(xì)胞被選擇12天，陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，磷酸鈣，自由攝取或電穿孔步驟被用于實(shí)現(xiàn)分子信標(biāo)探針的導(dǎo)入，該探針在第四條DNA序列中包含的結(jié)構(gòu)性啟動(dòng)子的控制下可特異性地與轉(zhuǎn)錄的無功能序列雜交。分子信標(biāo)探針與這些轉(zhuǎn)錄的無功能序列的雜交可發(fā)出特異波長的熒光發(fā)射光，它是用來檢測(cè)的特異分子信標(biāo)的獨(dú)特特性。
b)可選擇地，分子信標(biāo)探針可在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)被導(dǎo)入細(xì)胞中，隨后收獲胚胎干細(xì)胞用FACS細(xì)胞分選儀進(jìn)行分離。
4.分離ptch2靶向和非靶向的胚胎干細(xì)胞如上所述收獲胚胎干細(xì)胞，并在FACS細(xì)胞分選儀中進(jìn)行大容量分選，分離由于與含有分子信標(biāo)探針的第四條DNA序列轉(zhuǎn)錄物特異雜交而發(fā)出熒光的細(xì)胞。不包括熒光細(xì)胞的已分選細(xì)胞群和未分選細(xì)胞被鋪板，隨后分離DNA并測(cè)定基因型。這些細(xì)胞的增殖在200μg/ml遺傳霉素(G418)的選擇條件下進(jìn)行，篩選已經(jīng)穩(wěn)定地?fù)饺肓岁栃钥蛇x擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞。
5.通過位點(diǎn)特異性同源重組對(duì)ptch2突變進(jìn)行基因型確認(rèn)基因組DNA可從分選的胚胎干細(xì)胞群和/或未分選的陰性對(duì)照細(xì)胞中通過下面的方法分離。細(xì)胞在10cm培養(yǎng)板中生長至大約80％融合，在培養(yǎng)板中直接加入1ml含有100mM氯化鈉，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA和0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)的裂解緩沖液。細(xì)胞在室溫下孵育15分鐘，轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管中，并在55℃輕輕振搖孵育過夜。裂解物用等容積的1∶1苯酚/氯仿提取兩次，用氯仿提取一次。用等容積的異丙醇沉淀基因組DNA。在15000xg離心后，基因組DNA沉淀物重懸浮在300μl無菌蒸餾水中。
每個(gè)樣品中的基因組DNA可以通過PCR進(jìn)行基因定型，采用對(duì)PGK啟動(dòng)子序列特異的寡核苷酸引物和對(duì)正在同源區(qū)3’端下游的序列特異的寡核苷酸引物(圖4)。20pmole每種寡核苷酸與100ng基因組DNA在終濃度為200μM的每種dNTP，2.5mM MgCl2，IX PCR緩沖液和1U Taq DNA聚合酶(Invitrogen Corp.)存在下混合在一起。通過使用下列的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增94.0℃ 2分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的96℃30秒，58℃ 30秒和72℃ 2.5分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物和1kb的梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)品一起在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠用溴化乙錠染色以進(jìn)行PCR產(chǎn)物的紫外線檢測(cè)。檢測(cè)到1.7kb PCR產(chǎn)物表明通過實(shí)施FPIC基因靶向技術(shù)獲得了正確的基因靶向。
實(shí)施例2采用FPIC基因靶向載體滅活胚胎干細(xì)胞中的paraxis位點(diǎn)1.paraxis靶向載體的構(gòu)建paraxis是一個(gè)堿性的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，涉及控制哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的體節(jié)形成(Burgess等人，(1995)，168，296；Burgess等人，(1996)，Nature，384，570；Barnes等人，(1997)，Devel.Biol.，189，95，每一篇在此合并為參考文獻(xiàn))。陽性-陰性選擇paraxis靶向載體的構(gòu)建以前已經(jīng)有所描述(Burgess等人，見前，1996)。這個(gè)載體可被修飾，成功地和有效地實(shí)施FPIC靶向技術(shù)。
paraxis基因組組成形式包括被一個(gè)5kb內(nèi)含子分隔的兩個(gè)外顯子(圖5)。第一個(gè)外顯子含有起始蛋氨酸密碼子和可進(jìn)行DNA結(jié)合和二聚化的堿性螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(bHLH)功能區(qū)。第一個(gè)外顯子可選擇被刪除以去除通過bHLH功能區(qū)而包含起始蛋氨酸的序列，因此可滅活paraxis蛋白產(chǎn)物。3.0kb的同源區(qū)5’區(qū)域，在此是指第一條DNA序列，可用于paraxis位點(diǎn)5’末端的同源重組。2.0kb的同源區(qū)3’區(qū)域，在此是指第三條DNA序列，可用于paraxis位點(diǎn)3’末端的同源重組。在PGK啟動(dòng)子控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，在此是指第二條DNA序列，用于取代外顯子1的大部分，以及內(nèi)含子1的5’區(qū)域(圖5)。FPIC基因靶向載體的第四條DNA序列表現(xiàn)為CMV啟動(dòng)子，它可驅(qū)動(dòng)與分子信標(biāo)探針特異雜交的無功能序列的轉(zhuǎn)錄。含有這些序列的載體在所述的順序中是指PTV-1。
2.用paraxis靶向載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞生長至大約50％融合，用4μg線性化的PTV-1轉(zhuǎn)染。如上所述根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(Invitrogen Corp.)經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法完成轉(zhuǎn)染。
3.導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)分子信標(biāo)a)用PTV-1轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞置于200μg/ml遺傳霉素(G418)的選擇條件下，篩選已穩(wěn)定摻入陽性可選擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞。細(xì)胞被選擇12天，陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，磷酸鈣沉淀，電穿孔或自由攝取的步驟被用于實(shí)現(xiàn)分子信標(biāo)探針的導(dǎo)入，該探針在第四條DNA序列中包含的結(jié)構(gòu)性活性啟動(dòng)子的控制下可特異性地與轉(zhuǎn)錄的無功能序列雜交。分子信標(biāo)探針與這些轉(zhuǎn)錄的無功能序列的雜交可發(fā)出特異波長的熒光發(fā)射光，它是用來檢測(cè)的特異分子信標(biāo)的獨(dú)特特性。
b)可選擇地，分子信標(biāo)探針在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，然后收獲胚胎干細(xì)胞經(jīng)FACS細(xì)胞分選儀進(jìn)行分離。
4.從未靶向的胚胎干細(xì)胞中分離靶向的paraxis收獲細(xì)胞，如上所述進(jìn)行或不進(jìn)行抗生素選擇，并在FACS細(xì)胞分選儀中進(jìn)行大容量分選，從不發(fā)生熒光的細(xì)胞中分離發(fā)熒光者。分選的無熒光細(xì)胞群被以10×106細(xì)胞/10cm培養(yǎng)板的密度鋪板，然后增殖至80％融合以分離DNA和基因定型。這些細(xì)胞的增殖在200μg/ml遺傳霉素(G418)的選擇條件下進(jìn)行，篩選已經(jīng)穩(wěn)定地?fù)饺肓岁栃钥蛇x擇標(biāo)記物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞。
5.通過位點(diǎn)特異性同源重組對(duì)paraxis突變進(jìn)行基因型確認(rèn)基因組DNA從分選的胚胎干細(xì)胞群或未分選的陰性對(duì)照細(xì)胞如上所述被分離。這些樣品中的基因組DNA，隨后通過PCR使用寡核苷酸引物進(jìn)行基因定型，所述的引物對(duì)neo編碼序列3’端的牛生長激素多腺苷酸化信號(hào)和正在同源區(qū)3’端下游的序列特異的寡核苷酸是特異的(圖5)。反應(yīng)體積和條件如上所述，除此之外，引物退火溫度為55℃。反應(yīng)產(chǎn)物與1kb梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)品一起在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠用溴化乙錠染色以進(jìn)行PCR產(chǎn)物的紫外線檢測(cè)。使用來自樣品細(xì)胞群的DNA檢測(cè)到的被分選可使細(xì)胞發(fā)熒光的1.5kb PCR產(chǎn)物顯示有位點(diǎn)特異性同源重組和成功的基因靶向作用。
盡管本發(fā)明就以上的實(shí)例進(jìn)行了描述，但可以理解的是各種修飾和變化包含在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。相應(yīng)地，本發(fā)明僅通過下面的權(quán)利要求被限制。
權(quán)利要求
1.一種獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，該細(xì)胞已經(jīng)使用FPIC基因靶向載體進(jìn)行了位點(diǎn)特異性同源重組，該方法包括a)在適合載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的條件下，將細(xì)胞與設(shè)計(jì)用來進(jìn)行位點(diǎn)特異同源重組的FPIC基因靶向載體接觸，其中所述的載體包括第一條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并能夠在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，第二條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上不同源，不能在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，所述的第二條DNA序列進(jìn)一步含有核苷酸序列，能夠用于鑒定含所述核苷酸序列的細(xì)胞，第三條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并能夠在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，第四條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上不同源，不能在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，所述的第四條DNA序列進(jìn)一步含有核苷酸序列，能夠從不含有所述核苷酸序列的細(xì)胞中鑒定和分離出含有所述核苷酸序列的細(xì)胞；b)在選擇存在代表所述第二條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列和缺少代表第四條DNA序列的轉(zhuǎn)錄序列的條件下增殖細(xì)胞，從而選擇或富集用所述FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和c)從含有所述第四條DNA的細(xì)胞中分離含有所述第二條DNA序列的細(xì)胞，從而獲得已經(jīng)使用FPIC基因靶向載體接受位點(diǎn)特異同源重組的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括對(duì)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行定性，該細(xì)胞攜帶有編碼陽性可選擇標(biāo)記物的第二條DNA序列，但不攜帶編碼轉(zhuǎn)錄的選擇特征的第四條DNA序列，該特征是可修飾細(xì)胞靶DNA的位點(diǎn)特異同源重組事件所具有的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向載體包含陽性可選擇標(biāo)記物，可以通過在抗生素的存在下孵育所述細(xì)胞，或通過熒光發(fā)射光檢測(cè)到。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向載體包含陰性可選擇標(biāo)記物，可以通過在抗生素的存在下孵育所述細(xì)胞檢測(cè)到。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向載體包含陰性可選擇標(biāo)記物，可以不采用抗生素或藥物而檢測(cè)到。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞是能夠同源重組的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞是多細(xì)胞生物體的細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞是植物細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞已經(jīng)接受了多次位點(diǎn)特異性同源重組，以多次修飾內(nèi)源細(xì)胞基因組。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞被用于產(chǎn)生多細(xì)胞的生物體。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
12.一種用于在可接受同源重組的細(xì)胞中進(jìn)行位點(diǎn)特異同源重組的分離的細(xì)胞內(nèi)熒光探針(FPIC)基因靶向載體，該載體包括第一條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并能夠在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，第二條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上不同源，不能在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，所述的第二條DNA序列進(jìn)一步含有核苷酸序列，能夠用于鑒定含所述核苷酸序列的細(xì)胞，第三條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上同源，并能夠在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，第四條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列實(shí)質(zhì)上不同源，不能在所述細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，所述的第四條DNA序列進(jìn)一步含有核苷酸序列，能夠從不含有所述核苷酸序列的細(xì)胞中鑒定和分離出含有所述核苷酸序列的細(xì)胞，所述的FPIC基因靶向載體按5’至3’的方向，包含與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第一條DNA序列，第二條DNA序列，與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的第三條DNA序列，和第四條DNA序列；和其中所述的載體能進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源靶基因組DNA序列的修飾。
13.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA包含外顯子和內(nèi)含子。
14.權(quán)利要求13的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體含有所述外顯子和內(nèi)含子的全部或部分，它們與細(xì)胞靶基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上是同源的。
15.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體含有全部或部分的調(diào)控元件，它們與細(xì)胞靶基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上是同源的。
16.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體含有與細(xì)胞靶基因組DNA序列實(shí)質(zhì)上同源的序列改變，所述的改變包括刪除、取代、添加、點(diǎn)突變或其組合。
17.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第二條DNA序列編碼所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的無功能選擇特征，并與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列不同源，因此不能進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組。
18.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第四條DNA序列編碼所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的無功能選擇特征，與細(xì)胞內(nèi)源基因組序列不同源，因此不能進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組。
19.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第四條DNA序列包含編碼熒光蛋白的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19的FPIC基因靶向載體，其中所述的熒光蛋白是GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED，或HcRED。
21.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第二條DNA序列包含編碼抗生素抗性標(biāo)記物的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求21的FPIC基因靶向載體，其中所述的抗生素抗性標(biāo)記物是新霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟素、博來霉素、梅衣靈或潮霉素。
23.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第二條DNA序列包含編碼熒光蛋白的核苷酸序列。
24.權(quán)利要求23的FPIC基因靶向載體，其中所述的熒光蛋白是GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED，或HcRED。
25.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第四條DNA序列包含編碼陰性選擇劑的核苷酸序列。
26.權(quán)利要求25的FPIC基因靶向載體，其中所述的陰性選擇試劑是胸苷激酶或白喉毒素A鏈。
27.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的載體進(jìn)一步包含第五條DNA序列，它與細(xì)胞內(nèi)源基因組DNA序列不同源，并位于所述第一條和第三條DNA序列的外側(cè)和5’端。
28.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中每一條所述的第四條和第五條DNA序列均編碼可選擇的轉(zhuǎn)錄序列，它可從不含編碼所述可選擇轉(zhuǎn)錄序列的DNA的細(xì)胞中分離含有編碼所述可選擇轉(zhuǎn)錄序列的DNA的細(xì)胞。
29.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體，其中所述的第一條DNA序列和所述的第三條DNA序列的實(shí)質(zhì)上同源的序列，每一條大約為50個(gè)堿基對(duì)至50,000個(gè)堿基對(duì)。
30.權(quán)利要求12的FPIC基因靶向載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的細(xì)胞，其中所述的載體引起至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA序列的修飾。
32.權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述的載體將至少一個(gè)外源調(diào)控元件導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)源基因組靶DNA序列中。
33.權(quán)利要求30的細(xì)胞，是胚胎干細(xì)胞。
34.一種轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，是從權(quán)利要求31所述的細(xì)胞產(chǎn)生的。
35.一種富集細(xì)胞群，包括權(quán)利要求1所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)受了位點(diǎn)特異性同源重組。
35.一種非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從權(quán)利要求35的細(xì)胞產(chǎn)生。
37.一種轉(zhuǎn)基因植物，從權(quán)利要求35的細(xì)胞產(chǎn)生。
全文摘要
提供了在真核細(xì)胞內(nèi)特異地改變特定遺傳位點(diǎn)的方法和載體。一種方法是使用細(xì)胞內(nèi)熒光探針(FPIC)基因靶向DNA載體來建立和鑒定細(xì)胞，其中的載體序列已經(jīng)通過位點(diǎn)特異性同源重組作用被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中。該方法也使用鑒定細(xì)胞的體內(nèi)可檢測(cè)標(biāo)記物的編碼序列，該細(xì)胞含有經(jīng)位點(diǎn)特異性同源重組作用或非同源重組作用或插入作用而被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中的外源載體序列。另外，提供了采用FPIC載體修飾的細(xì)胞和由該細(xì)胞產(chǎn)生的生物體。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1500141SQ02807496
公開日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月4日
發(fā)明者R·M·小伯吉斯, H·H·治, R M 小伯吉斯, 治 申請(qǐng)人:基因組生物科學(xué)有限公司