專利名稱：新型dna編碼的d－酰化氨基酸水解酶以及將其用于生產(chǎn)d－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在工業(yè)有效的基質(zhì)濃度下具有高活性的，特別是一種可以使D-色氨酸由N-乙?；?DL-色氨酸經(jīng)立體選擇而高效獲得的新型D-?；被崴饷?，以及一種使用這種酶由N-?；被嶂苽銬-氨基酸的方法。本發(fā)明還涉及一種編碼D-?；被崴饷傅膲A基序列，一種含有這種序列的質(zhì)粒，以及由這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及一種使用這種轉(zhuǎn)化體制備D-?；被崴饷傅姆椒?。本發(fā)明還涉及一種通過將D-酰化氨基酸水解酶的轉(zhuǎn)化體、其培養(yǎng)基或者其加工物作用在N-乙酰基氨基酸上的反應(yīng)來制備一種相應(yīng)的光活性的D-氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
D-氨基酸是許多殺蟲劑、抗生素和醫(yī)藥的重要中間體。對(duì)于它們的合成已進(jìn)行了許多的研究。到目前為止，合成DL-氨基酸可以通過物理化學(xué)、化學(xué)或酶的方法實(shí)現(xiàn)，其中，酶方法被認(rèn)為是最方便和有效的。例如在一個(gè)已知的利用酶方法的例子中，使用D-?；被崴饷笇-乙酰基-DL-氨基酸直接水解得到相應(yīng)的D-氨基酸。
已知的D-?；被崴饷赴▽儆诩?xì)菌、放線菌和霉菌的微生物，例如，假單胞菌(日本專利公開(JP-B)60-31477)、鏈霉菌(JP-B53-36035)、產(chǎn)堿桿菌(JP-B 07-83711)、Rhodococcus，Pimelobacter(日本專利請(qǐng)公開(JP-A)06-227789)、節(jié)核細(xì)菌、棒狀桿菌、歐文氏菌、埃希氏桿菌、黃桿菌、Norcadia、精蛋白桿菌、黃(單胞)桿菌(日本專利申請(qǐng)公開(JP-A)11-113592)、Amycolatopsis(JP-A 11-98982)、Sebekia(JP-A 11-318442)、Hypomyces、鐮刀菌、Auricularia、Pythium、Menisporosis(JP-A 12-41684)。已經(jīng)有過用這些微生物得到的D-?；被崴饷缸饔迷贜-酰基氨基酸上反應(yīng)制備D-氨基酸的報(bào)道。
然而，這些D-酰化氨基酸水解酶的活性對(duì)于有效的基質(zhì)濃度來說卻是不夠的，因而就需要有一種工業(yè)上可應(yīng)用的D-?；被崴饷浮Ｌ貏e的是，在水解N-乙?；?D-色氨酸時(shí)，這些酶的活性對(duì)于有效的基質(zhì)濃度來說是不夠的。因此，它們都不能被稱為是滿足工業(yè)需要的酶。近來，Tokuyama(JP-A 13-275688)和Taylor(Chirotech Technology Limited，WO 00/23598)公開了一種作用于N-乙?；?D-色氨酸以制備D-色氨酸的D-?；被崴饷福揇-?；被崴饷阜謩e選自Hypomyces和產(chǎn)堿桿菌。這些D-?；被崴饷钢械娜魏我环N都只能使N-乙?；?D-色氨酸水解到10g/L，不能認(rèn)為是有效濃度下催化反應(yīng)的酶。
D-氨基酸是醫(yī)藥的重要原料，因此需要找到一種生產(chǎn)成本更低的方法來生產(chǎn)D-氨基酸。到目前，尚未發(fā)現(xiàn)一種能有效催化氨基酸的D-酰化氨基酸水解酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的在工業(yè)有效基質(zhì)濃度下顯示出有效高活性的D-?；被崴饷福褂迷撁改軌蛴行У赜蒒-乙?；?DL-氨基酸得到D-氨基酸，以及提供一種使用該酶由N-?；被嶂苽銬-氨基酸的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種D-?；被崴饷傅膲A基序列編碼，該D-?；被崴饷傅膲A基序列編碼是生產(chǎn)D-?；被崴饷敢约坝肈-?；被崴饷干a(chǎn)D-氨基酸的有用材料；一種含有堿基序列的質(zhì)粒；以及由這種質(zhì)粒宿主轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體。
在解決問題的同時(shí)，我們還對(duì)由眾多微生物得到的D-?；被崴饷傅男阅苓M(jìn)行了評(píng)價(jià)。在研究基質(zhì)濃度和反應(yīng)速率的關(guān)系時(shí)，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，在一種已知的D-?；被崴饷钢?，更高的基質(zhì)濃度更顯著地降低了它的反應(yīng)速率，即是說，抑制了酶的活性。這一現(xiàn)象當(dāng)基質(zhì)是N-乙?；?D-色氨酸時(shí)尤為顯著。我們猜想，在普通的D-?；被崴饷钢校@種現(xiàn)象可能會(huì)使得在有效的基質(zhì)濃度下，由N-乙?；?DL-色氨酸生產(chǎn)D-色氨酸的無效性。
因此，為了尋找一種新型的能夠在高的N-乙?；?D-色氨酸基質(zhì)濃度下仍顯示出高活性而其活性不受抑制的D-?；被崴饷?，我們測(cè)試了各種不同的微生物，最后，發(fā)現(xiàn)了能滿足上述要求的表現(xiàn)新型D-?；被崴饷富钚詫儆诩谆鶙U菌(Methylobacterium)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物。通過各種純化方法的結(jié)合使用，我們成功地測(cè)定了源自屬于甲基桿菌(Methylobacterium)的微生物的D-?；被崴饷傅陌被嵝蛄?，得到了序列表SEQ.ID.No.3中N-端基氨基酸殘基的氨基酸序列。我們還獲得了具有序列表SEQ.ID.No.1中序列的DNA，并由含有此序列的DNA碎片質(zhì)粒制得了轉(zhuǎn)化體，還制得了活性態(tài)的D-?；被崴饷福⒃谟行У幕|(zhì)濃度下高效地由N-乙?；被嶂频昧讼鄳?yīng)的D-氨基酸。由此完成了本發(fā)明。
基于上述的新觀察得到的本發(fā)明包括了以下方面
(1)一種能夠作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成相應(yīng)的D-氨基酸反應(yīng)的D-?；被崴饷?。
其中在水介質(zhì)中由N-乙?；?D-色氨酸經(jīng)催化反應(yīng)生成D-色氨酸時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
(2)根據(jù)(1)中所述的D-?；被崴饷福渲蠳-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
(3)根據(jù)(1)中所述的D-?；被崴饷甘怯蓪儆诩谆鶙U菌(Methylobacterium)或類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物得到的。
(4)根據(jù)(3)中所述的D-?；被崴饷福渲袑儆诩谆鶙U菌(Methylobacterium)的微生物是甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)，屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus。
(5)根據(jù)(4)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株。
(6)一種能夠作用于N-?；?D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反應(yīng)的D-?；被崴饷?，其包括
(A)序列表中SEQ.ID.No.2所示的氨基酸序列，或者
(B)在保持催化活性下，由插入、缺失或替換上述的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸殘基而得到的變異的氨基酸序列。
(7)根據(jù)(6)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中在水介質(zhì)中由N-乙?；?D-色氨酸經(jīng)催化反應(yīng)生成D-色氨酸時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
(8)根據(jù)(7)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中N-乙酰基-D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
(9)一種編碼了能夠作用于N-?；?D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反應(yīng)的D-?；被崴饷傅膲A基序列，其包括
(a)序列表中SEQ.ID.No.1所示的堿基序列，或者
(b)在保持由上述的堿基序列中編碼的D-?；被崴饷傅拇呋钚韵?，由插入、缺失或替換堿基序列SEQ.ID.No.1中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。
(10)根據(jù)(9)中所述的堿基序列，其中變異的堿基序列與SEQ.ID.No.1中的堿基序列在苛刻條件下進(jìn)行雜交。
(11)根據(jù)(9)中所述的堿基序列，其中在水介質(zhì)中由N-乙?；?D-色氨酸經(jīng)催化反應(yīng)生成D-色氨酸時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
(12)根據(jù)(11)中所述的堿基序列，其中N-乙?；?D-色氨酸濃度為l00g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
(13)一種含有(9)中所述堿基序列的質(zhì)粒。
(14)一種由(13)中所述質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體。
(15)一種制備D-酰化氨基酸水解酶的方法，其中包括將含有堿基序列的質(zhì)粒插入到(14)中所述的轉(zhuǎn)化體中，并對(duì)此轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)生成編碼的D-?；被崴饷傅牟襟E。
(16)一種制備具有光活性的氨基酸的方法，其中包括在水介質(zhì)中用D-酰化氨基酸水解酶作用于N-?；被岬玫较鄳?yīng)的D-氨基酸的步驟，其中，在水介質(zhì)中用D-?；被崴饷复呋蒒-乙?；?D-色氨酸生成D-色氨酸的反應(yīng)時(shí)，N-乙酰基-D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
(17)根據(jù)(16)中所述的方法，其中N-乙酰基-D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
(18)根據(jù)(16)中所述的方法，其中的?；被崴饷甘怯蓪儆诩谆鶙U菌(Methylobacterium)或類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物得到的。
(19)根據(jù)(18)中所述的方法，其中屬于甲基桿菌(Methylobacterium)的微生物是甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)，屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus。
(20)根據(jù)(19)中所述的方法，其中屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株。
(21)根據(jù)(16)中所述的方法，其中N-酰基氨基酸的濃度為大于等于50g/L。
(22)根據(jù)(21)中所述的方法，其中N-?；被岬臐舛葹榇笥诘扔?00g/L。
(23)一種制備具有光活性的氨基酸的方法，其中包括在水介質(zhì)中用D-?；被崴饷缸饔糜贜-酰基氨基酸得到相應(yīng)的D-氨基酸的步驟，其中D-?；被崴饷笧?6)中所述的D-酰化氨基酸水解酶。
(24)根據(jù)(23)中所述的方法，其中在水介質(zhì)中用D-?；被崴饷复呋蒒-乙酰基-D-色氨酸生成D-色氨酸的反應(yīng)時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
(25)根據(jù)(24)中所述的方法，其中N-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
(26)根據(jù)(23)中所述的方法，其中用于和N-?；被岱磻?yīng)的D-?；被崴饷甘菍?14)中所述的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)得到的培養(yǎng)基或者從培養(yǎng)基中分離得到的轉(zhuǎn)化體或者由其制得的材料。
(27)根據(jù)(23)中所述的方法，其中N-?；被嶙鳛榛|(zhì)的濃度為大于等于50g/L。
(28)根據(jù)(27)中所述的方法，其中N-酰基氨基酸作為基質(zhì)的濃度為大于等于100g/L。
本發(fā)明中的D-酰化氨基酸水解酶可用于在工業(yè)有效的濃度下以更高的反應(yīng)速率由N-?；被嶂苽湎鄳?yīng)的D-氨基酸。本發(fā)明還提供了在使用基因重組技術(shù)制備D-酰化氨基酸水解酶的一種有用的堿基序列，和一種含有此堿基序列的質(zhì)粒以及通過將含有此質(zhì)粒宿主轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體。


圖1為重組質(zhì)粒pUSDA3的物理譜圖。圖中，“ori”和“Ampr”分別代表了質(zhì)粒的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)抗氨比西林標(biāo)計(jì)；“SacI”、“HincII”、“PstI”和“XhoI”代表限制點(diǎn)；粗箭頭代表在D-?；被崴饷钢蠴RF的位置和方向。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中的D-酰化氨基酸水解酶是一種能夠作用于N-?；?D-氨基酸以催化制備相應(yīng)的D-氨基酸的反應(yīng)的酶。特別的是，即使是在較高的基質(zhì)濃度下，這種酶也只對(duì)N-乙?；?D-色氨酸表現(xiàn)出少量的抑制，同時(shí)自身顯示出較高的活性。對(duì)N-乙酰基-D-色氨酸的抑制可以通過下面的基質(zhì)濃度和反應(yīng)速率的關(guān)系來定義。
I.在水介質(zhì)中，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
II.N-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
一種本發(fā)明中的D-?；被崴饷妇哂猩鲜鯥中所述的性質(zhì)，優(yōu)選為具有上述I和II中所述的性質(zhì)。因此，本發(fā)明可以包括由任何一種微生物得到的D-?；被崴饷富蛘哂扇魏我环N通過基因重組改變的已知的D-?；被崴饷福灰鼈冎辽俦憩F(xiàn)出了上述的抑制性質(zhì)I的D-?；被崴饷富钚约纯?。
對(duì)于性質(zhì)I來說，更優(yōu)選的情況是N-乙酰基-D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的50％，特別是60％。對(duì)于性質(zhì)II來說，更優(yōu)選的情況是N-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的25％，特別是30％。
本發(fā)明中基質(zhì)濃度和反應(yīng)速率的關(guān)系可以確定如下。例如，向200μL含有10、50、100或者200g/L基質(zhì)(N-乙?；?D-色氨酸)的100mM的磷酸鹽緩沖液中加入200μL具有足夠反應(yīng)活性的酶溶液，將混合液在30℃下反應(yīng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。反應(yīng)生成的D-色氨酸的量可以用如HPLC方法確定，并可用于比較得出每一個(gè)基質(zhì)濃度下的酶活性(反應(yīng)速率)。對(duì)于本發(fā)明中用于確定反應(yīng)速率的水介質(zhì)沒有限制，只要它能夠使酶反應(yīng)得以進(jìn)行即可，例如，水及緩沖液，這些緩沖液是向水中加入一種或多種適當(dāng)選自磷酸、Tris、檸檬酸、乙酸、硼酸、氨基乙酸、HEPES、MOPS、MES、CAPS、CHES、PIPES和其他的酸成分而得到。反應(yīng)溫度可以選自包含了最佳溫度的選擇范圍。例如，特別優(yōu)選的溫度范圍是使反應(yīng)保持在30-60℃。反應(yīng)的pH范圍也應(yīng)該能使D-酰化氨基酸水解酶保持其活性，特別是當(dāng)pH為6-11時(shí)，包括了最佳pH值。酶可以是微生物培養(yǎng)基自身，也可以是利用離心過濾通過分離和收集得到的微生物，或者是其提取物，由微生物制得的粗產(chǎn)品或純化產(chǎn)品。在本發(fā)明中，以能夠正確確定反應(yīng)速率來選擇反應(yīng)速率的條件如酶的用量和反應(yīng)時(shí)間；這些條件如，在確定反應(yīng)速率的過程中，反應(yīng)達(dá)到飽和前的時(shí)間段，優(yōu)選的是當(dāng)N-乙?；?D-色氨酸作為基質(zhì)濃度為5g/L時(shí)，產(chǎn)生的D-色氨酸的累積濃度約為0.2g/L-1g/L時(shí)。
本發(fā)明中的D-?；被崴饷傅奈锢硇再|(zhì)如下
最佳pHpH8-10(最優(yōu)選為pH9)；
最佳溫度60℃；
熱穩(wěn)定性在40℃下加熱20小時(shí)后，有80％保持活性。
本發(fā)明中的D-?；被崴饷妇哂行蛄斜碇蠸EQ.ID.No.2的氨基酸序列，或者在保持D-?；被崴饷富钚韵?，將SEQ.ID.No.2的氨基酸序列進(jìn)行替換、缺失、變形或插入其中的一個(gè)或兩個(gè)，優(yōu)選為幾個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
編碼本發(fā)明中的D-酰化氨基酸水解酶的多聚核苷酸包含序列表中SEQ.ID.No.1的堿基序列。堿基序列SEQ.ID.No.1編碼了SEQ.ID.No.2的蛋白質(zhì)，盡管編碼SEQ.ID.No.2的氨基酸序列的堿基序列不僅僅局限于堿基序列SEQ.ID.No.1，但是任何堿基序列基于不同的密碼子。另外，還可以通過適當(dāng)引入替換、缺失、改變、插入和/或增加來提供一個(gè)多聚核苷酸的同源物。本發(fā)明中多聚核苷酸的同源物可以通過對(duì)堿基序列SEQ.ID.No.1的一個(gè)或多個(gè)堿基在保持酶活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺失或增加來制得。這種同源物的一個(gè)例子是一種具有能夠在苛刻條件下和具有與SEQ.ID.No.1互補(bǔ)序列的多聚核苷酸進(jìn)行雜交的堿基序列的多聚核苷酸。
在苛刻條件下進(jìn)行的雜交可根據(jù)“分子克隆”中描述的方式進(jìn)行Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物學(xué)中的通用協(xié)議(Current Protocols in Molecular Biology)；Wiley Interscience。一種可以由商業(yè)上可用的體系是GeneImage體系(Amersham)。具體來說，雜交可以按照如下步驟進(jìn)行，根據(jù)上述協(xié)議中的產(chǎn)物協(xié)議，將一個(gè)載有被轉(zhuǎn)錄的待測(cè)DNA或RNA分子的膜與一個(gè)標(biāo)記探針在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交。雜交緩沖液的組成為0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀釋抑制劑(dilution blocking agent)以及2-7×SSC。稀釋抑制劑可以例如由將5倍濃度的100×Denhardt’s溶液、2％(重量/體積)的牛血清蛋白、2％(重量/體積)的FicllTM400和2％(重量/體積)的聚乙烯吡咯烷酮稀釋到1/20制得。20×SSC為3M的氯化鈉和0.3M的檸檬酸組成的溶液。優(yōu)選使用的SSC為3-6×SSC，更優(yōu)選為4-5×SSC。雜交溫度為40-80℃，更優(yōu)選為50-70℃，進(jìn)一步優(yōu)選為55-65℃。在培養(yǎng)幾小時(shí)或過夜后，用清洗緩沖液清洗膜。清洗溫度優(yōu)選為室溫，更優(yōu)選為雜交溫度。清洗緩沖液的組成為6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更優(yōu)選為4×SSC+0.1wt％SDS溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為1×SSC+0.1wt％SDS溶液，最優(yōu)選為0.1×SSC+0.1wt％SDS溶液。當(dāng)用這種清洗緩沖液清洗完膜后，就可以通過在DNA或RNA分子內(nèi)被雜交的探針上的標(biāo)記來識(shí)別DNA或RNA分子。
本發(fā)明中的新型D-?；被崴饷赴藦募谆鶙U菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophi1icum)MT 10894菌株和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株中得到的酶。其中，甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894菌株是從日本的Mobara城，Ciba中的土壤中分離得到的。表1給出了它的菌學(xué)特征。
表1
通過將以上的菌學(xué)特征與Bergey’s Manual of SystematicBacteriology Vol.1(1984)William & Wilkins，Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology Ninth Edition(1994)Williams & Wilkins，G.I.Barrow and R.K.A.Feltham ed.，Cowan & Steel’s Manual forthe Identification of Medical Bacteria 3rd. ed，Cambridge univ.press，(1993)等書中描述的類別相比較，從而確定出該菌株屬于甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)。菌株MT 10984于2000年3月8日在日本經(jīng)濟(jì)工業(yè)部下的國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaragi，Japan)保藏，保藏編號(hào)為FERMP-17771，然后在2002年1月21日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏后，保藏編號(hào)變?yōu)镕ERM BP-7856。
編碼本發(fā)明的新型D-?；被崴饷傅腄NA可以通過如下步驟分離。從微生物中純化一種基因組DNA。用一種限制內(nèi)切酶進(jìn)行消化后得到的DNA通過超離心或電泳沿其長(zhǎng)度分段。收集碎片DNA，將之插入質(zhì)粒以得到質(zhì)粒庫。從庫中選出一個(gè)表達(dá)D-?；被崴饷傅目寺?，給出一個(gè)含有編碼D-?；被崴饷富虻腄NA的質(zhì)粒?？赏ㄟ^分析該質(zhì)粒的堿基序列確定出編碼目標(biāo)D-酰化氨基酸水解酶基因的DNA堿基序列，并從該DNA堿基序列推斷出編碼D-?；被崴饷傅陌被嵝蛄?。
通過如上分離得到的編碼本發(fā)明中D-?；被崴饷傅腄NA可被插入到一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中，例如，當(dāng)宿主為大腸桿菌時(shí)，典型的表達(dá)質(zhì)粒為pUC18、pKK223-3、pBR322、Bluescript II SK(+)和pSC101，這樣，可以得到表達(dá)D-酰化氨基酸水解酶的質(zhì)粒。對(duì)于宿主的選者不僅僅局限于大腸桿菌等，任何微生物只要滿足重組載體可以穩(wěn)定地和自動(dòng)地生長(zhǎng)并且一些外源DNA可以被表達(dá)即可作為轉(zhuǎn)化宿主。
在本發(fā)明中，一種由質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體可以基于已知信息生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明中的D-?；被崴饷浮Ｈ魏我环N人工的或天然的含有適量的碳源、氮源、無機(jī)和其他營(yíng)養(yǎng)物的介質(zhì)均可使用?？墒褂猛ǔ５呐囵B(yǎng)方法如搖瓶培養(yǎng)、充氣旋轉(zhuǎn)器培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和流加培養(yǎng)在含有上述培養(yǎng)成分的液體介質(zhì)中進(jìn)行。對(duì)于培養(yǎng)條件的選擇沒有特別的限制，可以根據(jù)培養(yǎng)類型和方法等因素的不同而進(jìn)行適當(dāng)選擇，只要使宿主菌株能夠產(chǎn)生D-?；被崴饷讣纯?。
用于制備本發(fā)明的D-氨基酸的方法中的D-?；被崴饷缚梢允巧鲜霎a(chǎn)生D-?；被崴饷傅募?xì)菌的培養(yǎng)物，也可以是通過將培養(yǎng)基進(jìn)行離心后分離和收集得到的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或者用其加工的細(xì)菌制品。這里使用的“加工的細(xì)菌制品”是指由轉(zhuǎn)化體得到的提取物或粗產(chǎn)品、通過對(duì)提取物或粗產(chǎn)品中的D-酰化氨基酸水解酶活性碎片進(jìn)行分離和/或純化得到的分離產(chǎn)品，或者通過固定轉(zhuǎn)化體或提取物或者轉(zhuǎn)化體的粗產(chǎn)品或分離產(chǎn)品而得到的固定產(chǎn)品。宿主生物體中產(chǎn)生的活性成分可能會(huì)對(duì)培養(yǎng)基介質(zhì)本身、離心分離培養(yǎng)基介質(zhì)并收集得到的轉(zhuǎn)化體和/或由轉(zhuǎn)化體的加工的細(xì)菌制品的目的反應(yīng)的反應(yīng)性或選擇性造成不良的影響。在這種情況下，可以用有機(jī)溶劑或在反應(yīng)前或反應(yīng)中加熱處理培養(yǎng)基介質(zhì)本身、離心分離培養(yǎng)基介質(zhì)并收集得到的轉(zhuǎn)化體或者轉(zhuǎn)化體的加工的細(xì)菌制品，以改善其反應(yīng)性和/或選擇性。有機(jī)溶劑可以適當(dāng)?shù)剡x用一種或多種醇類，如甲醇和乙醇；可與水混合的有機(jī)溶劑如丙酮、THF、DMF、DMI和DMSO；芳香有機(jī)溶劑如甲苯和苯；酯如乙酸乙酯和丁酸乙酯；烴如己烷和庚烷；鹵化烴如二氯甲烷和氯仿；醚如二乙醚。有機(jī)溶劑用量范圍根據(jù)D-酰化氨基酸水解酶活性的穩(wěn)定性存在范圍而定。加熱溫度可以為40℃-70℃，考慮到D-?；被崴饷傅姆€(wěn)定性，優(yōu)選為45℃-55℃。加熱的時(shí)間范圍根據(jù)D-?；被崴饷富钚缘姆€(wěn)定性存在范圍而定；30-100分鐘足夠。
在用本發(fā)明中的D-酰化氨基酸水解酶處理N-?；?D-氨基酸時(shí)，選擇對(duì)反應(yīng)性如D-酰化氨基酸水解酶的活性和穩(wěn)定性有利的條件有利于反應(yīng)的進(jìn)行。
反應(yīng)中使用的介質(zhì)可以是水或含有不同緩沖液的水介質(zhì)。其中的緩沖液可以是向水中加入一種或多種適當(dāng)選自磷酸、Tris、檸檬酸、乙酸、硼酸、氨基乙酸、HEPES、MOPS、MES、CAPS、CHES、PIPES和其他的酸成分而得到。
為了進(jìn)一步提高反應(yīng)效率或產(chǎn)品產(chǎn)率，還可以加入各種添加劑。一些D-?；被崴饷笇?duì)金屬離子如Zn2+和Co2+具有活性，因此，可向反應(yīng)中加入這些二價(jià)金屬離子。與此相反，如果金屬離子抑制酶時(shí)，可加入螯合劑如EDTA。
本發(fā)明中制備D-氨基酸的原料(N-?；被?包括N-酰基-D-氨基酸，其存在形式可以是DL-氨基酸、富集了D-異構(gòu)體或純D-異構(gòu)體的光活性的氨基酸。
原料的濃度沒有限制，通常為約1g/L-300g/L。特別是考慮到反應(yīng)性和經(jīng)濟(jì)性時(shí)，濃度優(yōu)選為大于等于50g/L，更優(yōu)選為大于等于100g/L并且優(yōu)選為小于等于200g/L。反應(yīng)溫度優(yōu)選保持在D-?；被崴饷缚梢员磉_(dá)其活性的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選為30-60℃。反應(yīng)pH也優(yōu)選保持在D-?；被崴饷缚梢员磉_(dá)其活性的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選為pH6-11。
本發(fā)明中的新型D-酰化氨基酸水解酶可以提供由多種N-?；被岬腄-異構(gòu)體得到的相應(yīng)的D-氨基酸。因此，本發(fā)明中的D-?；被崴饷缚梢栽诠I(yè)上方便地用于由N-酰基-DL-氨基酸制備旋光性氨基酸?？蓱?yīng)用的N-酰基-DL-氨基酸可選的化合物范圍很廣，沒有限制。典型的優(yōu)選N-?；?DL-氨基酸的例子包括N-酰基-DL-甲硫氨酸、N-?；?DL-亮氨酸、N-酰基-DL-色氨酸、N-?；?DL-5-羥基色氨酸、N-酰基-DL-苯基丙氨酸、N-?；?DL-苯基甘氨酸、N-?；?DL-高苯基丙氨酸(N-acyl-DL-homophenylalanine)、N-酰基-DL-二高苯基丙氨酸(N-acyl-DL-bishomophenylalanine)、N-?；?DL-對(duì)-硝基苯基丙氨酸、N-?；?DL-對(duì)-氟苯基丙氨酸、N-?；?DL-對(duì)-氯苯基丙氨酸、N-?；?DL-對(duì)-溴苯基丙氨酸、N-?；?DL-對(duì)-甲氧基苯基丙氨酸、N-?；?DL-酪氨酸、N-?；?DL-對(duì)-腈基苯基丙氨酸、N-?；?DL-2-吡啶基丙氨酸、N-酰基-DL-3-吡啶基丙氨酸、N-?；?DL-4-吡啶基丙氨酸、N-酰基-DL-鄰-芐基絲氨酸、N-?；?DL-S-苯基半胱氨酸、N-酰基-DL-1-萘基丙氨酸和N-?；?DL-2-萘基丙氨酸。更優(yōu)選的N-?；?DL-氨基酸是N-乙?；?DL-氨基酸。特別是對(duì)于N-乙酰基-D-苯基丙氨酸或N-乙?；?D-色氨酸來說，基質(zhì)專一性特別高。
實(shí)施例
下面將用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更為詳細(xì)的描述，但并非對(duì)發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行限制。
通過高效液相色譜分析反應(yīng)中產(chǎn)生的D-氨基酸和剩余的N-?；被醽碓u(píng)價(jià)反應(yīng)性和光學(xué)純度。(色譜柱CROWNPAK CR(-)；DaicelChemical Industries，Ltd.；柱溫40℃；流動(dòng)相HClO4水溶液，pH1.5和0-15％甲醇(V/V)；流速0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm)
實(shí)施例1甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)的培養(yǎng)
在具有下述組成的液體介質(zhì)中，在肉湯瓊脂皿中培養(yǎng)細(xì)菌，介質(zhì)在30℃下振蕩培養(yǎng)40小時(shí)制備表現(xiàn)D-酰化氨基酸水解酶活性的細(xì)菌。
培養(yǎng)介質(zhì)組成
N-乙酰基-DL-亮氨酸5g/L
葡萄糖10g/L
胨10g/L
磷酸二氫鉀1g/L
一代磷酸氫鉀(potassium hydrogenphosphate monobasic)1g/L
七水合硫酸鎂0.1g/L
酵母提取物0.5g/L
pH7.0(用KOH標(biāo)定)
實(shí)施例2類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus(ATCC35863)的培養(yǎng)
在具有下述組成的液體介質(zhì)中，在肉湯瓊脂皿中培養(yǎng)細(xì)菌，介質(zhì)在30℃下振蕩培養(yǎng)100小時(shí)制備表現(xiàn)D-酰化氨基酸水解酶活性的細(xì)菌。
培養(yǎng)介質(zhì)組成
N-乙酰基-DL-亮氨酸5g/L
改進(jìn)的察氏-Dox液體介質(zhì)(Oxoid)5g/L
酵母提取物2g/L
維他命測(cè)試?yán)业鞍装被?vitamin assay casamino acid)10g/L
pH7.2(用KOH標(biāo)定)
實(shí)施例3由甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus(ATCC 35863)得到的D-?；被崴饷傅幕|(zhì)濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系
粗酶溶液
用實(shí)施例1和2中得到的甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus(ATCC 35863)制備細(xì)菌細(xì)胞懸浮液(0.1g/0.1M的磷酸緩沖溶液(pH7.8)1mL)。用超聲均質(zhì)器將每一懸浮液進(jìn)行均質(zhì)，再用冷凍離心分離機(jī)使細(xì)胞碎片沉淀。收集上清液即為粗酶溶液。
基質(zhì)溶液
將N-乙?；?D-色氨酸溶于0.1M的磷酸鹽緩沖液中(pH7.8)，配成濃度為200g/L的基質(zhì)溶液。
測(cè)定
用0.1M的磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋基質(zhì)溶液，制備200μL的5，25，50和100g/L的基質(zhì)溶液。向其中加入200μL的粗酶溶液后，混合物在30℃下反應(yīng)1小時(shí)。然后，加入0.4mL1M的磷酸鹽緩沖液結(jié)束反應(yīng)。再加入0.4mL 1N
的氫氧化鈉溶解沉淀的未反應(yīng)的乙酰基化合物。離心除去細(xì)菌碎片后，用HPLC確定反應(yīng)液中生成的D-色氨酸。表2中假設(shè)基質(zhì)濃度為5g/L時(shí)反應(yīng)速率為100時(shí)，給出了用不同菌株得到的D-?；被崴饷缸饔糜跐舛确謩e為25、50和100g/L的基質(zhì)時(shí)，D-色氨酸的相對(duì)生成速率。
表2
對(duì)比例1在已知菌株中基質(zhì)濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系
我們研究過已知的帶有D-?；被崴饷傅募?xì)菌株產(chǎn)堿桿菌屬denitrificans subsp.xylosodans MI4(FERM P-9413)和鏈霉菌tuirus(IFO 13418)中基質(zhì)濃度與反應(yīng)速率之間的關(guān)系。這些菌株的制備方法將在下面介紹。如例1所述的方法制備Alcaligenes denitrificans subsp.xylosodans MI4(FERM P-9413)。將鏈霉菌tuirus(IFO 13418)在含有下列組分的液體介質(zhì)中于30℃下培養(yǎng)48小時(shí)以制得鏈霉菌tuirus(IFO13418)。
培養(yǎng)基介質(zhì)組成
D-纈氨酸4g/L
葡萄糖10g/L
胨10g/L
磷酸二氫鉀1g/L
一代磷酸氫鉀(potassium hydrogenphosphate monobasic)1g/L
七水合硫酸鎂0.5g/L
酵母提取物10g/L
氯化鈷1mg/mL
pH7.0(用KOH標(biāo)定)
粗酶溶液和基質(zhì)溶液的制備以及酶活性的測(cè)定如實(shí)施例3所述進(jìn)行。表3中假設(shè)基質(zhì)濃度為5g/L時(shí)反應(yīng)速率為100時(shí)，給出了用不同菌株得到的D-?；被崴饷缸饔糜跐舛确謩e為25、50和100g/L的基質(zhì)時(shí)，D-色氨酸的相對(duì)生成速率。
表3
實(shí)施例4由甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM P-17771)得到的D-?；被崴饷傅腘-端基氨基酸序列
如實(shí)施例1所述培養(yǎng)并收集甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)。將細(xì)菌細(xì)胞懸浮于0.1M的含1mM DTT(dithiothreitol)的磷酸鹽緩沖液中(pH7.8)。懸浮的細(xì)菌細(xì)胞通過超聲均質(zhì)機(jī)進(jìn)行勻質(zhì)。再用冷凍離心分離機(jī)將細(xì)胞碎片除去，得到粗酶溶液。向粗酶溶液中加入硫酸銨。然后，將30-60％的沉淀組分進(jìn)行脫鹽，并通過一個(gè)DEAEToypearl柱收集流過的組分。再將收集的組分經(jīng)過采用苯基Toypearl和Q-瓊脂糖凝膠的色譜進(jìn)行分離，得到表現(xiàn)D-?；被崴饷富钚缘慕M分。組分再經(jīng)過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，在56kDa處觀察到譜帶。對(duì)56kDa處的蛋白質(zhì)的N-端基氨基酸進(jìn)行排序，結(jié)果確認(rèn)為如SEQ.ID.No.3.中的Thr-Asp-Ser-Thr-Arg-。
實(shí)施例5甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894(FERM P-17771)的基因組DNA庫的制備
如實(shí)施例1所述將甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)培養(yǎng)2天。然后對(duì)細(xì)菌細(xì)胞離心收集并用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)洗。再按照“Kiso Seikagaku Jikken Hou 2，Extraction，Separation and Purification，Koichi Anami et al.，MaruzenPublication”中所述的DNA分離方法從細(xì)菌細(xì)胞中制備基因組DNA。得到的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶Sac I進(jìn)行完全消化，并用超離心沿DNA長(zhǎng)度分段，收集3kb或更長(zhǎng)的DNA。用5’-端基已被限制性內(nèi)切酶Sac I消化后已經(jīng)被脫去磷酸的載體pUC18對(duì)DNA進(jìn)行綁扎，以制備質(zhì)粒庫。用質(zhì)粒庫對(duì)大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化體放入含有50μg/mL氨比西林的LB(Luria-Bertani)瓊脂糖介質(zhì)中靜置培養(yǎng)以生成菌落。
實(shí)施例6從質(zhì)粒庫中對(duì)D-?；被崴饷高M(jìn)行活性篩選
在實(shí)施例5中形成的每一個(gè)菌落到在LB介質(zhì)(1％bactor胰島素，0.5％bacto酵母提取物，1％氯化鈉，pH 7.0)中于37℃下進(jìn)行液相搖瓶培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)化體經(jīng)離心沉淀，再用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.8)洗一次。離心收集細(xì)菌細(xì)胞。對(duì)得到的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行均質(zhì)得到粗酶溶液。選擇表現(xiàn)D-?；被崴饷富钚缘霓D(zhuǎn)化體，通過它作用于基質(zhì)N-乙?；?D-色氨酸產(chǎn)生D-色氨酸。測(cè)定步驟如下所述。
粗酶溶液
將得到的細(xì)菌細(xì)胞懸浮于0.1M的磷酸緩沖溶液(pH7.8)中，配成濃度為0.1mg/mL的懸浮液。用超聲均質(zhì)器將細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行均質(zhì)，再用冷凍離心分離機(jī)使細(xì)胞碎片沉淀。收集上清液即為粗酶溶液。
基質(zhì)溶液
將N-乙?；?D-色氨酸溶于0.1M的磷酸鹽緩沖液中(pH7.8)，配成濃度為10g/L的基質(zhì)溶液。
測(cè)定
向200μL的基質(zhì)溶液中加入200μL的粗酶溶液，混合物在30℃下反應(yīng)1小時(shí)。然后，加入0.4mL1M的磷酸鹽緩沖液結(jié)束反應(yīng)。離心除去碎片后，用HPLC確定反應(yīng)液中生成的D-色氨酸。
實(shí)施例7編碼D-?；被崴饷傅腄NA序列的測(cè)定
從實(shí)施例6中得到的表現(xiàn)D-?；被崴饷富钚缘霓D(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒。其物理譜圖表示在圖1中。其進(jìn)一步排序，利用BigDye TermiatorCycle Sequencing kit(PE Applied Biosystem)，通過基因分析儀310(PE應(yīng)用生物系統(tǒng))(PE Applied Biosystem)對(duì)它進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果得到編碼D-?；被崴饷富虻腄NA的堿基序列(SEQ.ID.No.1)。SEQ.ID.No.2為D-?；被崴饷笁A基序列的氨基酸翻譯后的序列。它的N-端基氨基酸序列與實(shí)施例2中的N-端基氨基酸的測(cè)序結(jié)果是一致的。由氨基酸序列估計(jì)的D-?；被崴饷傅姆肿恿考s為53kDa。
實(shí)施例8含有由甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM P-17771)得到的D-?；被崴饷富虻腄NA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體作用于基質(zhì)N-乙酰基-DL-色氨酸時(shí)反應(yīng)的評(píng)價(jià)
實(shí)施例7中由圖1中所示的質(zhì)粒得到的大腸桿菌在含氨比西林(50μg/mL)的LB介質(zhì)中于37℃下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)過夜。然后，離心收集細(xì)菌細(xì)胞并用0.1M的磷酸緩沖溶液(pH7.8)洗。再將細(xì)菌細(xì)胞懸浮于0.1M的磷酸緩沖溶液(pH7.8)中。
N-乙?；?DL-色氨酸溶液的制備
將N-乙?；?DL-色氨酸溶解于0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)，配成濃度為200g/L的基質(zhì)溶液。
測(cè)定
將上述的于40℃下預(yù)熱的細(xì)菌細(xì)胞懸浮液(2.5mL)和基質(zhì)溶液(2.5mL)混合并在40℃下反應(yīng)(反應(yīng)基質(zhì)濃度為100g/L)。反應(yīng)20小時(shí)后，從反應(yīng)液中取100μL，并加入相同量的1N的NaOH結(jié)束反應(yīng)。然后用HPLC流動(dòng)相將取出樣品稀釋到1/200，并離心沉淀細(xì)菌細(xì)胞。上清液用HPLC分析以測(cè)定由基質(zhì)N-乙?；?DL-色氨酸產(chǎn)生的D-和L-色氨酸的濃度。結(jié)果見表4。
表4
*(產(chǎn)生的D-色氨酸[mM])÷(產(chǎn)生的D-色氨酸[mM]+產(chǎn)生的L-色氨酸[mM]+剩余的N-乙酰基-DL-色氨酸[mM])
實(shí)施例9含有由甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)得到的D-?；被崴饷富虻腄NA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體對(duì)基質(zhì)的專一性
對(duì)實(shí)施例7中用圖1所示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌對(duì)N-乙酰基-DL-氨基酸的基質(zhì)專一性進(jìn)行了比較。此例中，在基質(zhì)N-乙?；?DL-氨基酸的濃度為5g/L時(shí)，在40℃下反應(yīng)16小時(shí)。假設(shè)基質(zhì)為N-乙?；?DL-色氨酸時(shí)D-?；被崴饷傅幕钚詾?00時(shí)，同時(shí)測(cè)定多種N-乙酰基-DL-氨基酸的的相對(duì)活性與產(chǎn)物光學(xué)純度以及反應(yīng)產(chǎn)率。結(jié)果見表5。
表5
*(產(chǎn)生的D-氨基酸[mM])÷(產(chǎn)生的D-氨基酸[mM]+產(chǎn)生的L-氨基酸[mM]+剩余的N-乙?；?DL-氨基酸[mM])
工業(yè)應(yīng)用
本發(fā)明提供了一種新型的由如甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)得到的D-?；被崴饷负途幋a它的DNA。本發(fā)明的D-?；被崴饷甘且环N工業(yè)上有用的酶，它可以使由N-?；被嵘上鄳?yīng)的D-氨基酸的反應(yīng)以更高的效率進(jìn)行。序列表圖1
序列表<110>Mitsui Chemicals Inc.<120>編碼新型D-?；被崴饷傅腄NA及其制備方法<130>MTC02P014<160>3<210>1<211>1464<212>DNA<213>甲基桿菌嗜中溫菌屬<400>1atgaccgaca gcacccgtaa gcacgacctg atcatccgcg gcggcaccgt catcgacggc 60cgccggacgc cccgcttccg cgccgatgtg gcggtgcgcg acggccgact gagcgccatc 120ggcgatctgg cggaccatcg ggccgcccag gagatcgatg ccacgggacg catcgtggcg 180ccgggcttca tcgactcgca cacgcacgat gaccaggcgg tgctgtcgca gccgcagatc 240ccgttcaagg tgtcgcaggg cgtcacgacg gtgatcgccg gcaattgcgg catcagcgcg 300gcgccgctgc ggcgggacat ggacctgccc atgcccctca acctgatcga cgtgcccgcc 360gaggagcgct tcacccgctt cgccgactac ctggatgcgc tgcgtgcccg cccctcgtcg 420gtcaacgtgg ccgcgatggt cggccactcc accctgcgcg ccgtcaccat gccggcgctg 480gaccgcgagg ccaacagcga ggaaatcgca cgcatgcgcg cgctggtgca ggaggcgatg 540gacgcgggcg ccatcggcgt ctccaccggc accttctatc cacccgcggt gaaggccacc 600acggaggaga tcatcgaagt ctgccggccc ctcactgccg cggggggcct gtacgtcacc 660cacatgcggg acgagtccga ccaggtgatg acctcgctgg aagagacctt ccgcatcggc 720cgcgcgctgg acgtgccggt ggtcgtctcc caccacaaag tgcagaacac gcccaacttc 780ggcaagtcgc aggtcacgct gcccttcatc cgcgaagcca tgcaacgcca gcgcagtgtg 840cctcgactgc tatccctaca cggcgggctc gaccatgatc cgcgcggacc ggggcatgct 900cgaaggccgc gtgctgatcg ccgagagcct gccgcatccg gaatgcgcag gccgcgacct 960ggacgacatc gcccgcgact ggggcgtgac cgggtggagg ccgcccgccg gctgcagccc 1020ggcagcgcca tctacttcct gatggacgag ggcgatgtgc agcgcatcct ggccttcgac 1080gacacgatga tcggctcgga cggcatcccg gtcggcagca agccgcatcc gcggctctgg 1140ggcaccttcc cgcgcgtgct gggccattac agccgcgacg tcggcctgtt ccccctggag 1200accgccgtct ggaagatgac cggactcacg gcccgcaact tcggcctgca cggccggggc 1260acgctggagg ccggccaggc cgccgacatc gtggtcttcg atgccggcac cgtgcgcgac 1320gcggccgact atgccgagcc cacgcgtccc gcggaaggca tcgatgcggt gatcgtcaat 1380ggcgccatca cctggcaagg cggccagcac acgggcgcac gccagggtca ggtcatccgc 1440cgccaggcgg ccccatccca ctga1464<210>2<211>487<212>PRT<213>甲基桿菌嗜中溫菌屬<400>2Met Thr Asp Ser Thr Arg Lys His Asp Leu Ile Ile Arg Gly Gly Thr 1 5 10 15Val Ile Asp Gly Arg Arg Thr Pro Arg Phe Arg Ala Asp Val Ala Val
20 25 30Arg Asp Gly Arg Leu Ser Ala Ile Gly Asp Leu Ala Asp His Arg Ala
35 40 45Ala Gln Glu Ile Asp Ala Thr Gly Arg Ile Val Ala Pro Gly Phe Ile
50 55 60Asp Ser His Thr His Asp Asp Gln Ala Val Leu Ser Gln Pro Gln Ile 65 70 75 80Pro Phe Lys Val Ser Gln Gly Val Thr Thr Val Ile Ala Gly Asn Cys
85 90 95Gly Ile Ser Ala Ala Pro Leu Arg Arg Asp Met Asp Leu Pro Met Pro
100 105 110Leu Asn Leu Ile Asp Val Pro Ala Glu Glu Arg Phe Thr Arg Phe Ala
115 120 125Asp Tyr Leu Asp Ala Leu Arg Ala Arg Pro Ser Ser Val Asn Val Ala
130 135 140Ala Met Val Gly His Ser Thr Leu Arg Ala Val Thr Met Pro Ala Leu145 150 155 160Asp Arg Glu Ala Asn Ser Glu Glu Ile Ala Arg Met Arg Ala Leu Val
165 170 175Gln Glu Ala Met Asp Ala Gly Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Thr Phe
180 185 190Tyr Pro Pro Ala Val Lys Ala Thr Thr Glu Glu Ile Ile Glu Val Cys
195 200 205Arg Pro Leu Thr Ala Ala Gly Gly Leu Tyr Val Thr His Met Arg Asp
210 215 220Glu Ser Asp Gln Val Met Thr Ser Leu Glu Glu Thr Phe Arg Ile Gly225 230 235 240Arg Ala Leu Asp Val Pro Val Val Val Ser His His Lys Val Gln Asn
245 250 255Thr Pro Asn Phe Gly Lys Ser Gln Val Thr Leu Pro Phe Ile Arg Glu
260 265 270Ala Met Gln Arg Gln Arg Ser Val Pro Arg Leu Leu Ser Leu His Gly
275 280 285Gly Leu Asp His Asp Pro Arg Gly Pro Gly His Ala Arg Arg Pro Arg
290 295 300Ala Asp Arg Arg Glu Pro Ala Ala Ser Gly Met Arg Arg Pro Arg Pro305 310 315 320Gly Arg His Arg Pro Arg Leu Gly Arg Asp Arg Val Glu Ala Ala Arg
325 330 335Arg Leu Gln Pro Gly Ser Ala Ile Tyr Phe Leu Met Asp Glu Gly Asp
340 345 350Val Gln Arg Ile Leu Ala Phe Asp Asp Thr Met Ile Gly Ser Asp Gly
355 360 365Ile Pro Val Gly Ser Lys Pro His Pro Arg Leu Trp Gly Thr Phe Pro
370 375 380Arg Val Leu Gly His Tyr Ser Arg Asp Val Gly Leu Phe Pro Leu Glu385 390 395 400Thr Ala Val Trp Lys Met Thr Gly Leu Thr Ala Arg Asn Phe Gly Leu
405 410 415His Gly Arg Gly Thr Leu Glu Ala Gly Gln Ala Ala Asp Ile Val Val
420 425 430Phe Asp Ala Gly Thr Val Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Pro Thr
權(quán)利要求
1.一種能夠作用于N-?；?D-氨基酸而催化生成相應(yīng)的D-氨基酸反應(yīng)的D-?；被崴饷福性谒橘|(zhì)中由N-乙?；?D-色氨酸經(jīng)催化反應(yīng)生成D-色氨酸時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中N-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的D-?；被崴饷甘怯蓪儆诩谆鶙U菌(Methylobacterium)或類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的D-?；被崴饷?，其中屬于甲基桿菌(Methylobacterium)的微生物是甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)，屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的D-?；被崴饷?，其中屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株。
6.一種能夠作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反應(yīng)的D-?；被崴饷?，其包括
(A)列表中SEQ.ID.No.2所示的氨基酸序列，或者
(B)在保持催化活性下，插入、缺失或替換上述的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸殘基而得到的變異的氨基酸。
7.據(jù)權(quán)利要求6中所述的D-?；被崴饷?，其中在水介質(zhì)中由N-乙?；?D-色氨酸經(jīng)催化反應(yīng)生成D-色氨酸時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的D-?；被崴饷?，其中N-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
9.一種編碼了能夠作用于N-?；?D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反應(yīng)的D-?；被崴饷傅膲A基序列，其包括
(a)序列表中SEQ.ID.No.1所示的堿基序列，或者
(b)在保持由上述的堿基序列中編碼的D-酰化氨基酸水解酶的催化活性下，由插入、缺失或替換上述的堿基序列SEQ.ID.No.1中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的堿基序列，其中變異的堿基序列與SEQ.ID.No.1中的堿基序列在苛刻條件下進(jìn)行雜交。
11.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的堿基序列，其中在水介質(zhì)中由N-乙?；?D-色氨酸經(jīng)催化反應(yīng)生成D-色氨酸時(shí)，N-乙酰基-D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
12.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的堿基序列，其中N-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
13.一種含有權(quán)利要求9中所述堿基序列的質(zhì)粒。
14.一種由權(quán)利要求13中所述質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體。
15.一種制備D-?；被崴饷傅姆椒?，其中包括將含有堿基序列的質(zhì)粒插入到權(quán)利要求14中所述的轉(zhuǎn)化體中，并對(duì)此轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)生成編碼的D-?；被崴饷傅牟襟E。
16.一種制備具有光活性的氨基酸的方法，其中包括在水介質(zhì)中用D-酰化氨基酸水解酶作用于N-?；被岬玫较鄳?yīng)的D-氨基酸的步驟，其中，在水介質(zhì)中用D-酰化氨基酸水解酶催化由N-乙?；?D-色氨酸生成D-色氨酸的反應(yīng)時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的方法，其中N-乙?；?D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
18.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的方法，其中的?；被崴饷甘怯蓪儆诩谆鶙U菌(Methylobacterium)或類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物得到的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的方法，其中屬于甲基桿菌(Methylobacterium)的微生物是甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacterium mesophilicum)，屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus。
20.根據(jù)權(quán)利要求19中所述的方法，其中屬于類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus的微生物是類諾卡氏菌屬(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株。
21.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的方法，其中N-酰基氨基酸的濃度為大于等于50g/L。
22.根據(jù)權(quán)利要求21中所述的方法，其中N-酰基氨基酸的濃度為大于等于100g/L。
23.一種制備具有光活性的氨基酸的方法，其中包括在水介質(zhì)中用D-?；被崴饷缸饔糜贜-?；被岬玫较鄳?yīng)的D-氨基酸的步驟，其中D-?；被崴饷笧闄?quán)利要求6中所述的D-?；被崴饷?。
24.根據(jù)權(quán)利要求23中所述的方法，其中在水介質(zhì)中用D-?；被崴饷复呋蒒-乙酰基-D-色氨酸生成D-色氨酸的反應(yīng)時(shí)，N-乙?；?D-色氨酸濃度為50g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的40％。
25.根據(jù)權(quán)利要求24中所述的方法，其中N-乙酰基-D-色氨酸濃度為100g/L時(shí)的反應(yīng)速率至少是其濃度為5g/L時(shí)的20％。
26.根據(jù)權(quán)利要求23中所述的方法，其中用于和N-酰基氨基酸反應(yīng)的D-?；被崴饷甘菍?quán)利要求14中所述的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)得到的培養(yǎng)基或者從培養(yǎng)基中分離得到的轉(zhuǎn)化體或者由其制得的材料。
27.根據(jù)權(quán)利要求23中所述的方法，其中N-?；被嶙鳛榛|(zhì)的濃度為大于等于50g/L。
28.根據(jù)權(quán)利要求27中所述的方法，其中N-酰基氨基酸作為基質(zhì)的濃度為大于等于100g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的D－?；被崴饷?，它是對(duì)由甲基桿菌嗜中溫菌屬(Methylobacteriummesophilicum)MT10894等得到的新型D－?；被崴饷傅木幋aDNA進(jìn)行克隆得到的，它對(duì)在工業(yè)有效基質(zhì)濃度下有效進(jìn)行由N－?；璂L－氨基酸制備D－氨基酸的反應(yīng)具有足夠高的活性；本發(fā)明還提供了一種編碼D－?；被崴饷傅腄NA，以及使用含有這種DNA的轉(zhuǎn)化體來由相應(yīng)的N－酰基氨基酸制備D－氨基酸的一種方法。
文檔編號(hào)C12P13/04GK1457362SQ0280026
公開日2003年11月19日 申請(qǐng)日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月1日
發(fā)明者長(zhǎng)部雅己, 高橋克幸, 八卷俊文, 有井輝夫, 及川利洋 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社