專利名稱：生產(chǎn)D－N－氨基甲?；粒被岬姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及用一種新型轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的方法，該轉(zhuǎn)化體具有編碼一種酶的基因，該酶能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸(以下將所述酶稱作乙內(nèi)酰脲酶)。
旋光D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸可被轉(zhuǎn)化成相應的D-α-氨基酸，而旋光D-α-氨基酸是重要的制藥用中間化合物。具體地講，工業(yè)用化合物包括用作生產(chǎn)半合成青霉素和半合成頭孢菌素的中間化合物的D-苯基甘氨酸和D-(P-羥苯基)甘氨酸。
為了生產(chǎn)D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸，已知采用能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的微生物酶促反應的方法，所述方法披露于JP-A 53-91189、JP-A 53-44690、JP-A 53-69884、JP-A53-133688等中。
此外，由嗜熱微生物獲得了一種與乙內(nèi)酰脲酶有關(guān)的基因(所述酶是一種能將5-取代的乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶)并將該基因插入中溫微生物中以產(chǎn)生具有乙內(nèi)酰脲酶活性的轉(zhuǎn)化型微生物。另外，在WO 94/00577中，乙內(nèi)酰脲酶基因片段是從屬于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的微生物中提取，并將其導入大腸桿菌(E.Coli)或農(nóng)桿菌屬的一種微生物中，以表達這種酶的活性。
上述利用微生物酶促反應的方法具有以下缺陷已知為所述酶的來源的微生物的酶產(chǎn)量不足，而且，培養(yǎng)基昂貴。
另外，就JP-A 62-87089中所披露的轉(zhuǎn)化型微生物而言，其酶促活性僅比具有乙內(nèi)酰脲酶活性的孢子形成嗜熱微生物高幾倍，而且酶的產(chǎn)量仍然不足。
此外，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有用上述轉(zhuǎn)化型微生物對5-取代乙內(nèi)酰脲進行不對稱裂解水解以便產(chǎn)生和積累相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的先例。
本發(fā)明就是為了解決上述問題，而且涉及創(chuàng)造一種具有極高的酶產(chǎn)量的微生物，還涉及用由此所獲得的酶源有效地生產(chǎn)D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。
JP-A 62-87089和WO 94/00577披露了通過重組DNA技術(shù)獲得乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)微生物的方法。不過，用于提供乙內(nèi)酰脲酶基因的來源微生物完全不同于在本發(fā)明中被用于獲得乙內(nèi)酰脲酶基因的微生物。另外，所述乙內(nèi)酰脲酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列明顯不同于本發(fā)明的有關(guān)序列本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的方法，該方法包括在一種含水介質(zhì)中使5-取代乙內(nèi)酰脲與乙內(nèi)酰脲酶反應，該乙內(nèi)酰脲酶是由一種轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)化體又是通過用含有源自芽胞桿菌KNK245(FERMBP-4863)、農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)或假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的乙內(nèi)酰脲酶編碼基因的一種DNA片段和一種載體DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化一種宿主微生物，如屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬、黃桿菌屬、芽胞桿菌屬、沙雷菌屬(Serratia)、農(nóng)桿菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物而獲得的。
迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見具有極高乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，如在本發(fā)明中所得到的轉(zhuǎn)化體，而且，通過利用該轉(zhuǎn)化體的酶的反應能夠極為有效和經(jīng)濟地生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
隨后，將結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明。


圖1是質(zhì)粒pAH1043的限制酶圖。
圖2是質(zhì)粒pTH102的限制酶圖。
圖3是質(zhì)粒pTH103的限制酶圖。
圖4是質(zhì)粒pTH104的限制酶圖。
圖5是質(zhì)粒pPHD301的限制酶圖。
圖6是質(zhì)粒pTHB301的限制酶圖。
可以從芽胞桿菌KNK245、農(nóng)桿菌KNK712或假單胞菌KNK003A獲得帶有用于本發(fā)明的基因的DNA片段。
農(nóng)桿菌KNK712和假單胞菌KNK003A已由本發(fā)明人保藏于NIBH(National Institute of Bioscience and Human Technology)，A-gency of Industrial Science&Technology，Ministry of internationalTrade&Industry，保藏編號分別為FERM BP-1900和FERM BP-3181，這些菌株詳細披露于Wo 92/10579中。芽胞桿菌KNK245是由本發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)的菌株，并于1994年11月2日提交NIBH保藏，保藏編號為FERM BP-4863。
芽胞桿菌KNK245的微生物學特征如下芽胞桿菌 KNK245形狀 棒狀，絲狀大小 0.5-0.8x3-10(μm)革蘭氏染色 +孢子+游動性 -生長溫度 37-60℃生長pH 5.0-8.9生長于5％NaCl中 -生長于7％NaCl中 -生長于0.02％疊氮化物中 -生長于0.001％溶菌酶中 -硝酸還原-淀粉水解+酪蛋白分解 +酪氨酸分解 -過氧化氫酶 -氧化酶 +吲哚產(chǎn)生-
由碳水化合物產(chǎn)生酸甘露糖 (+)木糖 -阿拉伯糖 +鼠李糖-萄萄糖+果糖 +棉子糖-蔗糖 +麥芽糖+乳糖 -為了從所述菌株中獲取乙內(nèi)酰脲酶基因，通常采用以下方法。
首先，從一種微生物細胞中提取基因組DNA，然后用合適的限制酶，如Sau3AI等對該DNA進行部分水解。將所得到的片段連接到載體DNA上，以得到具有各種基因組DNA片段的重組DNA分子作為基因文庫(見JP-A 58-126789和US 4,237,224)。
然后，從該基因文庫中選擇帶有所需基因的重組體。例如，可以通過檢測表達蛋白的酶促活性進行選擇，或通過分析蛋白的N-末端序列，合成相應的DNA探針并通過菌落雜交等檢測目的基因的存在。另外，可以采用DNA引物通過菌落雜交或聚合酶鏈式反應(PCR)方法獲得所需要的基因，所述DNA引物是合成的已知乙內(nèi)酰脲酶堿基序列的合適部分。一旦得到目的基因，即分析其核苷酸序列。另外，對一種乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)微生物和一種含有該酶基因的重組體進行培養(yǎng)。純化所得到的酶，并測定所得蛋白的分子量。同時，用一臺氣相蛋白測序儀或類似裝置測其N-末端部分的氨基酸序列。
接著，通過比較所述DNA核苷酸序列和N-末端氨基酸序列，確定編碼乙內(nèi)酰脲酶蛋白的核苷酸序列部分翻譯成蛋白的起始位點，而且，通過考慮其與該蛋白分子量的關(guān)系證實，該酶蛋白是由所述基因上從該起始位點至終止密碼子的部分編碼，從而證實了所述目的基因(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Chapter 4和13)。因此，從芽胞桿菌KNK245、農(nóng)桿菌KNK712和假單胞菌KNK003A中獲得了序列1、2和3的DNA片段。眾所周知，編碼由此獲得的酶的基因和/或帶有該基因的DNA片段與具有編碼相應于上述基因和/或DNA片段的氨基酸序列的另一種核苷酸序列的DNA片段相同，因為一個氨基酸通常相應于若干個堿基密碼子。
可用于本發(fā)明的載體包括質(zhì)粒、噬菌體或其衍生物，它們源于微生物，并能夠在屬于埃希氏菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、芽胞桿菌屬、沙雷菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬的細菌細胞中自主生長。
例如，可以采用披露于“Guidelines on Recombinant DNA Experi-ments，-Commentation，Q and A-”(The life Science Section of theResearch Development Office in the Science and Technology Agency，Ed.，revised Sept.16，1987)的第25至27頁和第36至38頁上的宿主-載體系統(tǒng)。另外，可將重組DNA用于提高待生產(chǎn)的酶的量的目的，該重組DNA具有一個與一種載體的適當位置連接的翻譯起始位點，對該載體作過修飾，使其具有強結(jié)構(gòu)啟動子。用一種限制酶對該片段的兩端進行切割，以形成與合適載體的重組體。通過直接轉(zhuǎn)化屬于埃希氏菌、假單胞菌、黃桿菌、芽胞桿菌、沙雷桿菌、農(nóng)桿菌、棒狀桿菌或短桿菌屬的微生物可以產(chǎn)生乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)重組微生物。
無須直接轉(zhuǎn)化上述屬的微生物也可獲得乙內(nèi)酰脲酶生產(chǎn)重組微生物；即，一旦用其它微生物，如大腸桿菌將目的基因克隆到宿主載體系統(tǒng)中，此后便產(chǎn)生了具有合適載體的重組DNA。
以下文獻所披露的內(nèi)容可廣泛用于生產(chǎn)重組體授予S.N.Cohen等的美國專利US4,237,244說明書；Idenshi-SousaJikken-hou(Experimental Method of Gene Manipulation)”[Ed.，Yasuyuki TAKAGI，Kohdan-sha Scientific(1980)]；Method in En-zymology，68，Recombinant DNA[Ed.，Ray Mv，Academic Press(1979)]，JP-A58126789說明書等。
克隆目的基因，并除去其不必要的DNA。可以用其翻譯起始位點與一個載體上的合適位置連接的重組DNA轉(zhuǎn)化上述宿主細胞，以便提高待生產(chǎn)的酶產(chǎn)量，對所述載體作過修飾，使其具有強結(jié)構(gòu)啟動子。
在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，以表達導入的重組DNA。當來自基因DNA或載體DNA的一個性狀被賦予重組DNA之后，可根據(jù)具體性狀將一種合適的成分加入培養(yǎng)基中。
為了將由此所得的轉(zhuǎn)化體作為酶的生產(chǎn)源，可以用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)化體。如果必要，還可以進行一種處理，以便誘導酶的產(chǎn)生，如添加乙內(nèi)酰脲化合物、尿嘧啶、異丙基-1-硫基-β-D-半乳糖苷(IPTG)等，并提高溫度。通常，用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基可以是含有碳源、氮源和無機離子的培養(yǎng)基。在很多場合，通過進一步添加有機微量養(yǎng)分，如維生素、氨基酸等可以獲得理想的結(jié)果。通常，可將諸如葡萄糖和蔗糖之類的碳水化合物、諸如乙酸之類的有機酸、和醇等用作碳源。作為氮源，可以采用氨氣、氨水、銨鹽等。作為無機離子，可以采用磷酸根離子、鎂離子、鉀離子、鐵離子、錳離子、鉆離子、鎳離子、銅離子、鋁離子、鉬離子等。
如果在需氧條件下培養(yǎng)1～10天，同時，分別將pH和溫度調(diào)整至4-8和25-60℃的合適范圍，可以獲得理想結(jié)果。
由轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的酶促活性可以如下形式表現(xiàn)，如轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液、其微生物細胞、自該微生物細胞中提取的酶、固定化微生物細胞等。
作為微生物細胞，可以采用任何培養(yǎng)液，在結(jié)束培養(yǎng)液的培養(yǎng)之后，從培養(yǎng)液中分離微生物細胞，洗滌微生物細胞，然后即可使用。作為處理過的微生物細胞，可以采用凍干的微生物細胞、丙酮干燥的微生物細胞、與甲苯或洗滌劑接觸的微生物細胞、溶菌酶處理過的微生物細胞、超聲處理過的微生物細胞、機械研磨的微生物細胞等。另外，可以使用獲自上述處理過的微生物細胞、固定化微生物細胞、不可溶化處理的微生物細胞的具有乙內(nèi)酰脲酶活性的酶提取物，固定在用于固定化的支持物(如陰離子交換樹脂)上的酶蛋白。固定化的方法可以參考JP-A63-185382等的說明書。
作為固定化用的支持物，適用的有酚醛陰離子交換樹脂，如Duolite A568或DS17186(Rohm&Haas Co.注冊商標)；以及含有各種胺、銨鹽、或二羥乙基胺類官能團類的各種陰離子交換樹脂，例如聚苯乙烯樹脂，如Amberlite IRA935、IRA945、IRA901(Rohm&haas Co.注冊商標)、Lewatit OC1037(Bayer A.G.注冊商標)和Diaion EX-05(Mitsubishi Chemical Industries，Ltd.注冊商標)。其它支持物，如DEAE-纖維素也可以采用。
另外，為了獲得更強、更穩(wěn)定的酶吸收，通常采用交聯(lián)劑，交聯(lián)劑的優(yōu)選例子為戊二醛。所使用的酶不僅可以是純化酶，而且可以是具有不同純化度的酶，如部分純化的酶、解離的微生物細胞的懸浮液和無細胞提取液。固定化酶的制備可以按常規(guī)方法進行，例如，將酶吸附在一種支持物上，隨后進行交聯(lián)處理。
對用作本發(fā)明酶促反應的底物的5-取代乙內(nèi)酰脲無特殊限制，可以是通常用于此類反應的任何化合物。其例子包括由以下通式(1)所代表的化合物
式(1)化合物的取代基的選擇范圍很寬。為了提供工業(yè)用制品，如藥物的中間化合物，優(yōu)選的R為苯基、由羥基取代的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻吩基。對于由羥基取代的苯基來說，羥基數(shù)可以為一個或幾個，而且可以位于鄰-、間-和對-位中的任一位置上，其典型例子為對羥苯基。烷基是1-4個碳原子的基團，相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸是D-N-氨基甲?；?丙氨酸、D-N-氮基甲?；i氨酸、D-N-氨基甲?；涟彼?、D-N-氨基甲?；惲涟彼岬取Ｋ鋈〈榛鶠橛昧u基、烷基硫基、羧基、氨基、苯基、羥基取代的苯基、酰胺基等取代的1-4個碳原子的烷基，其相應的D-N-氨基甲?；被釣镈-N-氨基甲酰基-絲氨酸、D-N-氨基甲酰基蘇氨酸、D-N-氨基甲酰基蛋氨酸、D-N-氨基甲?；腚装彼?、D-N-氨基甲?；於０?、D-N-氨基甲?；劝滨０?、D-N-氨基甲?；野彼?、D-N-氨基甲?；?色氨酸、D-N-氨基甲?；於彼?、D-N-氨基甲?；劝彼?、D-N-氨基甲?；M氨酸、D-N-氨基甲?；嚢彼?、D-N-氨基甲?；彼帷-N-氨基甲?；习彼岬?。芳烷基是具有7-8個碳原子的基團，例如芐基或苯乙基，相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸為D-N-氨基甲?；?苯丙氨酸等。
作為含水介質(zhì)，可以使用含有水、緩沖液或有機溶劑，如乙醇的介質(zhì)。另外，必要時還可向該含水介質(zhì)中加入微生物生長所需的營養(yǎng)物、抗氧化劑、洗滌劑、輔酶、羥胺、金屬等。
當在水溶性介質(zhì)中培養(yǎng)上述微生物的微生物細胞時，讓該微生物細胞接觸一種特定的5-取代乙內(nèi)酰脲的情況下，采用一種不僅含有5-取代乙內(nèi)酰脲，而且含有微生物生長所需的營養(yǎng)物，如碳源、氮源和無機離子源的含水介質(zhì)。如果再向其中加入諸如維生素和氨基酸之類的有機微量營養(yǎng)物，在多數(shù)情況下會取得理想效果。作為碳源，通常采用諸如葡萄糖、蔗糖之類的碳水化合物，諸如乙酸之類的有機酸；醇等。作為氮源，可以采用氨氣、氨水、銨鹽等。作為無機離子，可以采用磷酸根離子、鎂離子、鉀離子、鐵離子、錳離子、鉆離子、鎳離子、銅離子、鋁離子、鉬離子等。
培養(yǎng)是在有氧條件下進行，同時，分別將pH和溫度調(diào)至4-8和25～60℃的適當范圍內(nèi)。如果培養(yǎng)進行1～10天，能高效地將5-取代的乙內(nèi)酰脲僅轉(zhuǎn)化為D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
另一方面，當讓上述微生物的培養(yǎng)液原樣與培養(yǎng)的微生物細胞、處理過的微生物細胞、酶提取物、固定化微生物細胞、不可溶化的微生物細胞或固定的酶蛋白在含有溶解的或懸浮的5-取代乙內(nèi)酰脲的含水介質(zhì)中反應時，可將反應混合物靜置一段時間或攪拌，同時維持10-80℃的適當溫度和pH4-9.5的適當pH值。因此，如果將反應進行5-100小時，由乙內(nèi)酰脲酶進行底物的D-特異性水解反應，而且底物發(fā)生化學外消旋，所有D-，DL-或L-5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸，從而在所述含水介質(zhì)中積累大量的氨基酸。另外，可以隨著反應的進行，以單獨部分加入5-取代乙內(nèi)酰脲。
可以分離所產(chǎn)生的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸，并通過常規(guī)分離方法提純。
通過采用按上述方法獲得的分離并純化的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸或由乙內(nèi)酰脲酶反應所獲得的反應混合物可很容易地獲得D-α-氨基酸，通過化學作用或具有脫甲氨酰酶活性的酶促作用將D-N-氨基甲?；?α-氨基酸轉(zhuǎn)化成相應的D-α-氨基酸。
下面的實施例將對本發(fā)明作進一步的詳細說明。例1從土壤中分離具有乙內(nèi)酰脲酶活性的微生物將0.5g土壤樣品懸浮于2ml生理鹽水中之后，靜置該懸浮液，然后將1滴上清液涂在一種分離瓊脂板培養(yǎng)基(1.0％肉膏，1.0％胨，1.0％酵母提取物，0.3％氯化鈉，2.0％瓊脂；pH7.5)上。將其在50℃下培養(yǎng)2天，并將所得菌落轉(zhuǎn)移到添加了0.1％尿嘧啶和20ppm氯化錳的同一分離平板培養(yǎng)基上，并在50℃下再培養(yǎng)1天。將所獲得的微生物細胞懸浮于100μl反應底物溶液[DL-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲30mM，亞硫酸鈉0.1％，碳酸緩沖液50mM]中，并讓其在50℃下反應2小時。然后，將反應混合物點滴在TLC板上，用展開溶劑丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶1)展開，接著用在濃鹽酸中配制的10％對二甲氨基苯甲醛溶液顯色，檢測黃色斑點，以便選擇能產(chǎn)生N-氨基甲酰基-對羥苯基甘氨酸的微生物菌株。這樣，從2740個菌落中分離得到具有高乙內(nèi)酰脲酶活性的芽胞桿菌KNK245(FERM BP-4863)。例2得自芽胞桿菌KNK245的乙內(nèi)酰脲酶的N-末端氨基酸測序?qū)⒁徽h(huán)的芽胞桿菌KNK245接種到盛于500ml體積的Sak-aguchi燒瓶中的100ml接種培養(yǎng)基(1.0％肉膏、1.0％胨、0.5％酵母提取物；pH7.5)里，并在55℃下培養(yǎng)19小時。然后將2％的該培養(yǎng)物接種到盛于2L Sakaguchi燒瓶中的500ml主培養(yǎng)基(1.0％肉膏，1.0％胨，0.5％尿嘧啶，20ppm氯化錳四水合物；pH7.5)里，并在55℃下培養(yǎng)19小時。通過離心從由此獲得的9升培養(yǎng)液中收集微生物細胞。將其懸浮于含有20mM硫酸錳的0.2M Tris-HCl(pH8.0)中，超聲波破碎并離心，以獲得無細胞提取物。然后，通過硫酸銨沉淀分級分離、DEAE-Sepharose和苯基-Sepharose將該提取物純化32倍。此外，用硫酸銨獲得乙內(nèi)酰脲酶結(jié)晶。將該結(jié)晶溶于水中，并用A470A Model Gas Phase Protein Sequencer(由AppliedBiosystems生產(chǎn))進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該乙內(nèi)酰脲酶的N-末端的氨基酸序列為1 5 10Met-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Asn-Gly-Thr-Ile-Val-Thr-例3獲得帶有源于農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)的編碼乙內(nèi)酰脲酶基因的質(zhì)粒通過以下方法進行的研究業(yè)已發(fā)現(xiàn)，乙內(nèi)酰脲酶基因位于克隆于質(zhì)粒pADH101中的DNA片段上，該質(zhì)粒披露于WO 92/10579中。用常規(guī)方法由pAHD101轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，接種到含有100mg/l氨芐青霉素的50ml的L-液(10g/l胨，5g/l酵母提取物、5g/l氯化鈉；pH7.0)里，并在37℃培養(yǎng)16小時。然后，收集50ml培養(yǎng)液，除去上清液，將微生物細胞懸浮于50ml底物溶液(0.5％5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲，0.05％Triton x-100，0.05 M磷酸緩沖液；pH8.7)里，在37℃下，在氮氣流中反應3小時。將反應混合物點滴到TIC板上，展開，并用在氫氯酸中配制的對二甲氨基苯甲醛顯色，以便檢測與真實樣品相符合的D-N-氨基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸斑點。關(guān)于前者，我們證實pAHD101轉(zhuǎn)化體能表達編碼乙內(nèi)酰脲酶的基因。
將通過用SacI和SalI裂解質(zhì)粒pAHD101縮短插入的片段而獲得的2.1kbp片段連接到用SacI和SalI裂解的pUC18片段上，以獲得質(zhì)粒pAH1043(見圖1)。
另外，用DNA測序試劑盒(由APPlied Biosystems生產(chǎn))對乙內(nèi)酰脲酶基因進行核苷酸測序。結(jié)果示于序列1中。
用質(zhì)粒pAH1043轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，以便獲得大腸桿菌HB101 pAH1043(FERM BP-4865)轉(zhuǎn)化體。例4制備芽胞桿菌KNK245基因組DNA與載體DNA的重組DNA將芽胞桿菌KNK245(FERMBP-4863)放在2升培養(yǎng)液(10g/l肉膏、10g/l胨、5g/l酵母提取物；pH7.5)中，在45℃下培養(yǎng)24小時，收集微生物細胞。從按照Marmur方法獲得的微生物細胞中提取基因組DNA。將10單位BamHI加入1μg基因組DNA中，并讓其在37℃下反應16小時。
另一方面，用BamHI對質(zhì)粒pUC19進行徹底裂解，并用T4DNA連接酶將其連接到上述所得到的基因組DNA片段上，以便得到各種重組質(zhì)粒的混合物。例5獲得源于芽胞桿菌KNK245的乙內(nèi)酰脲酶基因根據(jù)源于例3的農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)和披露于JP-A62-87089中的Iu1220菌株的乙內(nèi)酰脲酶基因的核苷酸序列，合成兩種引物，引物1和引物2(見表1)，各種引物具有上述核苷酸序列互補鏈的序列，并且從1155bp間斷核苷酸序列起取向相反。用兩種引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)，引物是以在例4中制備的源于芽胞桿菌KNK245的基因組DNA為模板合成的，以獲得約1.2kbp的片段。用DNA測序試劑盒(由APPlied Biosystems生產(chǎn))對所述片段進行核苷酸測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它對已知的乙內(nèi)酰脲酶基因有很高的互補度，而且發(fā)現(xiàn)所獲得的PCR片段是乙內(nèi)酰脲酶基因的一部分。然后，合成兩個引物，引物3和引物4(表1)，其具有相應于該片段互補鏈的反向取向的序列。
另外，合成具有例4的重組DNA上的載體部分序列的引物5(表1)，通過采用上文合成的引物和后一種引物，并以例4的重組DNA為模板進行PCR，以獲得分別含有乙內(nèi)酰脲酶基因的前半部分和后半部分的兩類DNA片段。對所得到的DNA片段進行核苷酸測序。根據(jù)由例2中乙內(nèi)酰脲酶蛋白的N-末端氨基酸序列預計的核苷酸序列，確定翻譯密碼子。與上述確定的核苷酸序列一起確定編碼乙內(nèi)酰脲酶的基因的整個核苷酸序列。
結(jié)果示于序列2中。
然后，根據(jù)由此獲得的核苷酸序列，合成具有乙內(nèi)酰脲酶基因起始密碼子和NdeI限制位點的序列的引物6(表1)和具有乙內(nèi)酰脲酶基因上的PstI限制位點的序列的引物7(表1)，并以例4的基因組DNA為模板進行PCR，以獲得1.2kb的片段1。然后合成在上述PstI限制位點上具有反向序列的引物8(表1)和具有相應于終止密碼子的下游的序列和HindIII限制位點的引物9(表1)，并以例4的基因組DNA為模板進行PCR，以便獲得0.25kb的片段2。用NdeI和PstI對片段1進行限制性酶切，用PstI和HindIII對片段2進行限制性酶切，并用NdeI和HindIII對pUCNT進行限制性酶切，pUCNT是披露于WO94/03613中的pUC19的改進載體質(zhì)粒。用T4DNA連接酶將上述限制片段連接在一起，以便獲得含有乙內(nèi)酰脲酶基因的質(zhì)粒pTH102(見圖2)。
Table l引物1
引物2
引物35-TAACATCCTTTTGCATCAACCACTTC-3引物45-AAAAAAGGAAGAATCACGTTAAA-3引物55-GTTTTCCCAGTCACGAC-3引物65-TACGAGCATATGAAAAAGATCATTAAGAACGGAAC-3引物75-GTGTGTTTCTGCAGAAATTACCCGTTC-3引物85-TAATTTCTGCAGAAACACACCATAT-3引物95-GCTGAAAGCTTCGAAATAAGCCATTTTCGAGCAG-3引物105-TAATTTCTGCAGAAACACACCACATGGCCGTCG-3引物115-CGAGCAAGCTTCTACTAAATGGTTAATTTCTCAT-3引物125-GGAAGCTTTCATTAAATGGTTAATTTCTCATCTTGTT-3引物135-TACGAGGGATCCTATAAATTCCAACAAGTGCTATA-3例6制備用于表達芽胞桿菌KNK245乙內(nèi)酰脲酶基因的重組DNA按照與獲得例5的片段2相同的方法進行PCR，以便得到0.25kb的片段3，所不同的是，不采用用于產(chǎn)生片段2的、具有Pst I限制位點的引物，而是采用合成的引物10(表1)代替具有終止密碼子序列的引物，其中，靠近PstI限制位點的NdeI限制位點上的一個核苷酸被取代，以阻止NdeI的裂解作用，并采用合成的引物11(表1)，基中，在終止密碼子下游的核苷酸數(shù)目進一步減少。然后，按照獲得例5中pTH102相同的方法由片段1和3和pUCNT(見圖3)獲得質(zhì)粒pTH103。
此外，以與獲得pTH103相同的方法獲得pTH104，所不同的是，不采用具有終止密碼子下游序列的引物11，而采用引物12(表1)。
由pTH104轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HB101被命名為大腸桿菌HB101pTH104。該菌株已于1994年11月2日保藏于NIBH，保藏編號為FERM BP-4864。例7獲得含有源于假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的乙內(nèi)酰脲酶編碼基因的質(zhì)粒按照例3所述方法發(fā)現(xiàn)，乙內(nèi)酰脲酶基因位于WO92/10579中所披露的質(zhì)粒pPHD301上。
用pPHD301轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，以獲得大腸桿菌HB101pPHD301(FERM BP-4866)。pPHD301的限制酶圖如圖5所示。
按照與例3相同的方法對乙內(nèi)酰脲酶基因進行核苷酸測序。結(jié)果如序列3所示。例8用所獲得的轉(zhuǎn)化體將5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成D-N-氮基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸。
將在例6中得到的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌HB101pTH104接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和400ppm氯化錳四水合物的50ml 2YT培養(yǎng)液(16g/l多胨(polypeptone)，10g/l酵母提取物，5g/l氯化鈉；pH 7.0)里，并在37℃培養(yǎng)24小時。以50ml上述培養(yǎng)液中收集微生物細胞，并懸浮于0.05M的碳酸緩沖液(pH8.7)中，定容至50ml。以0.05％的終濃度加入Triton x-100。向該溶液中添加1.5g 5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲，在40℃溫度下，在氮氣流中反應3小時，同時攪拌，用6N NaOH將pH調(diào)至8.7。反應結(jié)束后，對反應混合物進行離心，取上清液，用在濃氫氯酸配制的10％對二甲氨基芐醛溶液顯色，對其中的D-N-氨基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸進行比色測定。結(jié)果，以97.5％的轉(zhuǎn)化率獲得了D-N-氨基甲酰基-(對羥苯基)甘氨酸。
用氫氯酸將反應混合物的pH調(diào)至5。離心以后，濃縮上清液，用濃氫氯酸調(diào)至pH2，并于4℃下保存。濾除沉淀的結(jié)晶，并從水-乙醇中再結(jié)晶，以獲得970mg D-N-氨基甲?；?(對羥苯基)甘氨酸，m.p.176-177℃，[α]D20＝-177.0°(C＝0.5，5％乙醇)。例9制備固定化乙內(nèi)酰脲酶從1升按例7所述方法獲得的大腸桿菌HB101 pTH104培養(yǎng)液中收集微生物細胞，懸浮于1mM硫酸錳水溶液中，定容至60ml，將pH調(diào)至8.5，并通過超聲波破碎。向由此獲得的酶溶液中加入20g陰離子交換樹脂Duolite A-568，平衡至pH8.5，并在15℃下攪拌該混合物20小時，以吸附所述酶。向該混合物中加入戊二醛，使其終濃度為0.1％，攪拌混合物1小時，以便進行交聯(lián)反應。然后收集樹脂并洗滌，以獲得20g固定化乙內(nèi)酰脲酶。例10用固定化酶將5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成D-氨基甲酰基-(對羥苯基)甘氨酸將5g在例9中獲得的固定化乙內(nèi)酰脲酶加至溫度為40℃的100ml 1mM硫酸錳水溶液中，該溶液中用氮氣起泡。向該溶液中加3g 5-(對羥苯基)乙內(nèi)酰脲，在40℃下，在攪拌條件下反應3小時，同時用氮氣起泡。反應結(jié)束后，靜置反應混合物，并吸取收集反應混合物。按照與例8相同的方法純化上述氨基甲酰基氨基酸制品，獲得2.2g D-N-氨基甲酰基-(對羥苯基)甘氨酸。例11在枯草桿菌(Bacillus subtilis)中表達芽胞桿菌KNK245乙內(nèi)酰脲酶基因按照與例5相同的方法進行PCR，以芽胞桿菌KNK245基因組DNA為模板，并采用引物12和13(表1)，以便獲得1.7kb的片段。用BamHI和HindIII裂解該片段，并將其連接到以類似方法裂解過的質(zhì)粒pHY300PLK(Takara Shuzo)上，獲得質(zhì)粒pTHB301。其限制酶圖如圖6所示。
通過電擊法(用Shimadzu公司的GTE-10型，10KV/cm，2ms)將質(zhì)粒pTHB 301導入枯草桿菌ISW 1214(可從Takara Shuzo獲得)、枯草桿菌YS-11(IAM12019)或枯草桿菌3115(IAM12020)，并在添加了0.02g/l氯化鎂四水合物的例4的培養(yǎng)基中、在37℃下培養(yǎng)20小時。通過收集微生物細胞并通過超聲波將其破碎，以制備無細胞提取物。結(jié)果，各種乙內(nèi)酰脲酶的活性比在相同條件下培養(yǎng)芽胞桿菌KNK245所獲得的活性高大約2.2倍。例12在嗜熱生物中表達芽胞桿菌KNK245乙內(nèi)酰脲酶基因用J.Bacteriol，149，824(1982)中披露的原生質(zhì)體法，由在例11中制備的質(zhì)粒pTH301轉(zhuǎn)化嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus Stearother-mophilus)IFO12550，并以與例11相同的方法培養(yǎng)，以制備無細胞提取物。乙內(nèi)酰脲酶的活性比在相同條件下制備的芽胞桿菌KNK245的乙內(nèi)酰脲酶的活性高大約3.6倍。
如上所述，按照本發(fā)明可以創(chuàng)造一種具有極高的乙內(nèi)酰脲酶活性的微生物，以其為酶源可以有效生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
微生物保藏已按照布達佩斯條約分別將有關(guān)微生物保藏在下述保藏機構(gòu)。農(nóng)桿菌KNK712，保藏日1988年5月31日，保藏號為FERM BP-1900；假單胞菌KNK003A，保藏日1990年12月1日，保藏編號為FERM BP-3181；芽胞桿菌KNK245，保藏日1994年11月2日，保藏編號為FERM BP-4863；大腸桿菌HB101 pAH1043，保藏日1994年11月2日，保藏編號為FERM BP-4866。
保藏機構(gòu)名稱National Institute of Bioscience and Human-Technology(以前的Fermentation Research Institute)，Agency of In-dustrial Science&Technology，Ministry of International Trade&In-dustry。
地址1-3，Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，日本。
序列表序列1序列長度2518序列類型核酸序列10 203040 50 60GAGCTCGGCCTCGTCGGTGAAATGCCAGCGCGGGAAGAAGGTCGTAAGCGCGAGTTCGGG70 8090 100 110 120GAAGACAATGAAATTCGCGCCCCGGCTCGCGGCTTTCGTCAGCATGTCGAGAAGACGAAC130 140 150 160 170 180GACGACCTGTTCGCGTGTCTCCGCGCGCGCGATCGGACCTTGTTGTCCCACTGCAAGTAT190 200 210 220 230 240CATCTGACGTGTCATGAACCTCTGCTCCTTCCTAGGTGATGTCCGGCCCAGCGGCCGGGA250 260 270 280 290 300AAACGTTGTGAAACACATCGCCGAAAACCGGCTTTGTGACTCGCGGCGCAATGCAAATTC310 320 330 340 350 360TACATAAAGTACGAAATATTACATGCAGCACGACAATAACAGGCGTAAAATTTTTGATCT370 380 390 400 410 420GTCAACCGGAGCGGAACCGGAATTTGCGCTGCTTGACAAGCTCTCGCGCGAGCCCGCCGT430 440 450 460 470 480CGACTTCAACTCGTTCCGCCTCGAACGAGAGCGCTCTGCACAGAATCGTCTTCGCTAGGC490 500 510 520 530 540CGCCGTTCCGCTTGACAGCTTCAAAACACCATGCAAACTTGTATAAAGAATTACATTCCA550 560 570 580 590 600TATACGGAACAAACTCTTCAATCCTGAGAGCGACATCATGGACATCATTATCAAAAACGGMetAspIleIleIleLysAsnGly610 620 630 640 650 660AACCATCGTGACCGCGGATGGCATTTCTCGCGCCGATCTCGGGATCAAGGATGGCAAGATThrIleValThrAlaAspGlyIleSerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLysIle670 680 690 700 710 720CACCCAGATCGGCGGCGCGCTCGGCCCAGCGGAGCGGACGATCGACGCGGCCGGCCGCTAThrGlnIleGlyGlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArgTyr730 740 750 760 770 780CGTCTTTCCGGGCGGCATAGACGTTCACACGCATGTCGAAACGGTCAGCTTCAACACGCAValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSerPheAsnThrGln790 800 810 820 830 840GTCGGCCGACACGTTCGCAACAGCGACGGTCGCGGCCGCCTGTGGCGGAACGACAACCATSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAlaAlaCysGlyGlyThrThrThrIle850 860 870 880 890 900CGTCGATTTCTGTCAGCAGGATCGCGGCCACAGCCTGGCGGAACCCGTCCCCAAGTGGGAValAspPheCysGlnGlnAspArgGlyHisSerLeuAlaGluProValProLysTrpAsp910 920 930 940 950 960CGGTATGGCCGGCGGCAAGTCGGCGATCGATTACGGCTACCACATCATCGTGCTCGACCCGlyMetAlaGlyGlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAspPro970 980 990 1000 1010 1020GACCGACAGCGTGATTGAGGAGCTGGAGGTGCTTCCCGATCTTGGCATTACCTCCTTCAAThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIleThrSerPheLys1030 1040 1050 1060 1070 1080GGTCTTCATGGCCTATCGCGGCATGAACATGATCGACGACGTGACGCTGCTGAAGACGCTValPheMetAlaTyrArgGlyMetAsnMetIleAspAspValThrLeuLeuLysThrLeu1090 1100 1110 1120 1130 1140CGACAAGGCGGTCAAGACCGGATCGCTCGTCATGGTGCACGCGGAAAACGGCGACGCCGCAspLysAlaValLysThrGlySerLeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAlaAla1150 1160 1170 1180 1190 1200CGACTATCTGCGCGACAAGTTCGTGGCCGAGGGCAAAACCGCGCCGATCTACCACGCGCTAspTyrLeuArgAspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAlaLeu
1210 1220 1230 1240 1250 1260CAGCCGCCCGCCCCGGGTCGAAGCCGAGGCAACCGCGCGGGCCCTCGCCCTGGCCGAAATSerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAlaLeuAlaGlulle1270 1280 1290 1300 1310 1320CGTCAACGCCCCGATCTACATAGTCCATGTGACCTGCGAGGAGTCCCTTGAGGAGGTGATValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCysGluGluSerLeuGluGluValMet1330 1340 1350 1360 1370 1380GCGCGCAAAATCGCGAGGCGTCCGCGCTCTGGCGGAAACCTGCACGCATTACCTTTACCTArgAlaLysSerArgGlyValArgAlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyrLeu1390 1400 1410 1420 1430 1440CACCAAGGAAGACCTGGAGCGGCCGGATTTCGAAGGTGCGAAATACGTTTTCACACCGCCThrLysGluAspLeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrProPro1450 1460 1470 1480 1490 1500GGCCCGCGCGAAGAAAGACCATGACGTTCTCTGGAACGCACTCAGAAACGGTGTGTTCGAAlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsnGlyValPheGlu1510 1520 1530 1540 1550 1560AACGGTTTCCTCCGACCATTGCTCCTGGCTCTTCAAGGGGCACAAGGACCGGGGCCGGAAThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLysGlyHisLysAspArgGlyArgAsn1570 1580 1590 1600 1610 1620CGACTTTCGCGCCATCCCGAACGGCGCGCCGGGCGTCGAGGAACGGTTGATGATGGTCTAAspPheArgAlaIleProAsnGlyAlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetValTyr1630 1640 1650 1660 1670 1680TCAGGGCGTCAACGAAGGCCGGATTTCCCTTACCCAGTTCGTGGAACTGGTCGCCACGCGGlnGlyValAsnGluGlyArgIleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThrArg1690 1700 1710 1720 1730 1740CCCGGCCAAGGTCTTCGGAATGTTTCCGCAAAAGGGGACGATCGCGGTCGGTTCGGACGCProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaValGlySerAspAla1750 1760 1770 1780 1790 1800CGACATCGTCCTTTGGGACCCCGAGGCCGAAATGGTGATCGAACAGACCGCCATGCACAAAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetValIleGluGlnThrAlaMetHisAsn1810 1820 1830 1840 1850 1860CGCCATGGATTACTCCTCCTACGAGGGACACAAGGTCAAGGGCGTGCCGAAGACGGTGCTAlaMetAspTyrSerSerTyrGluGlyHisLysValLysGlyValProLysThrValLeu1870 1880 1890 1900 1910 1920CCTGCGTGGCAAGGTTATCGTCGACGAAGGTTCCTATGTCGGCGAACCGACGGACGGGAALeuArgGlyLysValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGlyLys1930 1940 1950 1960 1970 1980ATTCCTGAAACGTCGCAAATACAAGCAGTAAACCGGCATTCTACGAGAACGATGATGACAPheLeuLysArgArgLysTyrLysGln***4571990 2000 2010 2020 2030 2040ATACACACTTCGACAAGTGTCGTCGCGCCTGACGGCGACAGCGTTGCAAGCGGCTTCGAC2050 2060 2070 2080 2090 2100AGGCGTTACGGCGCACCGACATTCAATCAGATACCATCGGGCGAACGGCTGGTGTCGGAC2110 2120 2130 2140 2150 2160TGCATCGCGCTGATGCTGAAGCACCGTTCCGTCAGACGCTACACGGGGGAACCTCTCCCC2170 2180 2190 2200 2210 2220CCAGGCACGCTGGAAATGCTGATGGCGGCGGGTCAGTCGGCTGCGACATCCTCCAACATG2230 2240 2250 2260 2270 2280CAGACCGTGTCGGTCATCGCGGTGACGGACCCCGAGAAAAAGACCCGTCTCGCGAAGACA2290 2300 2310 2320 2330 2340TGCGCCGGGCAGGACTTCATCGCCAACGCTCCTGTGCTCCTGTGTTTCGTGACGGATCTT2350 2360 2370 2380 2390 2400GCGCGCCCCGCCAGGGTCGCCTCCACGATTGGCGCCGATCTTTTCGCGTTGCCGATGATC2410 2420 2430 2440 2450 2460GACACCTTTCTGGCGTCCATCAGCGATTGTTCCATCTTCGCGCAAAACCTTGTTCTCGCC2470 2480 2490 2500 2510GCGGAATCGCTCGGCATGGGCACCTGCTATGTCGGGAGCCTGCGCAACCGGCCTGATC序列2序列長度2105序列類型核酸序 列102030405060GTCGACTTCAACTCGTTCCGCCTCGAACGAGAGCGCTCTGCACAGAATCGTCTTCGCTAG708090 100 110 120GCCGCCGTTCCGCTTGACAGCTTCAAAACACCATGCAAACTTGTATAAAGAATTACATTC130 140 150 160 170 180CATATACGGAACAAACTCTTCAATCCTGAGAGCGACATCATGGACATCATTATCAAAAACMetAspIleIleIleLysAsn190 200 210 220 230 240GGAACCATCGTGACCGCGGATGGCATTTCTCGCGCCGATCTCGGGATCAAGGATGGCAAGGlyThrIleValThrAlaAspGlyIleSerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLys
250 260 270 280 290 300ATCACCCAGATCGGCGGCGCGCTCGGCCCAGCGGAGCGGACGATCGACGCGGCCGGCCGCIleThrGlnIleGlyGlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArg310 320 330 340 350 360TACGTCTTTCCGGGCGGCATAGACGTTCACACGCATGTCGAAACGGTCAGCTTCAACACGTyrValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSerPheAsnThr370 380 390 400 410 420CAGTCGGCCGACACGTTCGCAACAGCGACGGTCGCGGCCGCCTGTGGCGGAACGACAACCGlnSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAlaAlaCysGlyGlyThrThrThr430 440 450 460 470 480ATCGTCGATTTCTGTCAGCAGGATCGCGGCCACAGCCTGGCGGAACCCGTCCCCAAGTGGIleValAspPheCysGlnGlnAspArgGlyHisSerLeuAlaGluProValProLysTrp490 500 510 520 530 540GACGGTATGGCCGGCGGCAAGTCGGCGATCGATTACGGCTACCACATCATCGTGCTCGACAspGlyMetAlaGlyGlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAsp550 560 570 580 590 600CCGACCGACAGCGTGATTGAGGAGCTGGAGGTGCTTCCCGATCTTGGCATTACCTCCTTCProThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIleThrSerPhe610 620 630 640 650 660AAGGTCTTCATGGCCTATCGCGGCATGAACATGATCGACGACCTGACGCTGCTGAAGACGLysValPheMetAlaTyrArgGlyMetAsnMetIleAspAspValThrLeuLeuLysThr670 680 690 700 710 720CTCGACAAGGCGGTCAAGACCGGATCGCTCGTCATGGTGCACGCGGAAAACGGCGACGCCLeuAspLysAlaValLysThrGlySerLeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAla730 740 750 760 770 780GCCGACTATCTGCGCGACAAGTTCGTGGCCGAGGGCAAAACCGCGCCGATCTACCACGCGAlaAspTyrLeuArgAspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAla790 800 810 820 830 840CTCAGCCGCCCGCCCCGGGTCGAAGCCGAGGCAACCGCGCGGGCCCTCGCCCTGGCCGAALeuSerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAlaLeuAlaGlu850 860 870 880 890 900ATCGTCAACGCCCCGATCTACATAGTCCATGTGACCTGCGAGGAGTCCCTTGAGGAGGTGIleValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCysGluGluSerLeuGluGluVal910 920 930 940 950 960ATGCGCGCAAAATCGCGAGGCGTCCGCGCTCTGGCGGAAACCTGCACGCATTACCTTTACMetArgAlaLysSerArgGlyValArgAlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyr970 980 990 1000 1010 1020CTCACCAAGGAAGACCTGGAGCGGCCGGATTTCGAAGGTGCGAAATACGTTTTCACACCGLeuThrLysGluAspLeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrPro1030 1040 1050 1060 1070 1080CCGGCCCGCGCGAAGAAAGACCATGACGTTCTCTGGAACGCACTCAGAAACGGTGTGTTCProAlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsnGlyValPhe1090 1100 1110 1120 1130 1140GAAACGGTTTCCTCCGACCATTGCTCCTGGCTCTTCAAGGGGCACAAGGACCGGGGCCGGGluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLysGlyHisLysAspArgGlyArg1150 1160 1170 1180 1190 1200AACGACTTTCGCGCCATCCCGAACGGCGCGCCGGGCGTCGAGGAACGGTTGATGATGGTCAsnAspPheArgAlaIleProAsnGlyAlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetVal1210 1220 1230 1240 1250 1260TATCAGGGCGTCAACGAAGGCCGGATTTCCCTTACCCAGTTCGTGGAACTGGTCGCCACGTyrGlnGlyValAsnGluGlyArglleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThr1270 1280 1290 1300 1310 1320CGCCCGGCCAAGGTCTTCGGAATGTTTCCGCAAAAGGGGACGATCGCGGTCGGTTCGGACArgProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaValGlySerAsp1330 1340 1350 1360 1370 1380GCCGACATCGTCCTTTGGGACCCCGAGGCCGAAATGGTGATCGAACAGACCGCCATGCACAlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetValIleGluGlnThrAlaMetHis
1390 1400 1410 1420 1430 1440AACGCCATGGATTACTCCTCCTACGAGGGACACAAGGTCAAGGGCGTGCCGAAGACGGTGAsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGluGlyHisLysValLysGlyValProLysThrVal1450 1460 1470 1480 1490 1500CTCCTGCGTGGCAAGGTTATCGTCGACGAAGGTTCCTATGTCGGCGAACCGACGGACGGGLeuLeuArgGlyLysValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGly1510 1520 1530 1540 1550 1560AAATTCCTGAAACGTCGCAAATACAAGCAGTAAACCGGCATTCTACGAGAACGATGATGALysPheLeuLysArgArgLysTyrLysGln***1570 1580 1590 1600 1610 1620CAATACACACTTCGACAAGTGTCGTCGCGCCTGACGGCGACAGCGTTGCAAGCGGCTTCG1630 1640 1650 1660 1670 1680ACAGGCGTTACGGCGCACCGACATTCAATCAGATACCATCGGGCGAACGGCTGGTGTCGG1690 1700 1710 1720 1730 1740ACTGCATCGCGCTGATGCTGAAGCACCGTTCCGTCAGACGCTACACGGGGGAACCTCTCC1750 1760 1770 1780 1790 1800CCCCAGGCACGCTGGAAATGCTGATGGCGGCGGGTCAGTCGGCTGCGACATCCTCCAACA1810 1820 1830 1840 1850 1860TGCAGACCGTGTCGGTCATCGCGGTGACGGACCCCGAGAAAAAGACCCGTCTCGCGAAGA1870 1880 1890 1900 1910 1920CATGCGCCGGGCAGGACTTCATCGCCAACGCTCCTGTGCTCCTGTGTTTCGTGACGGATC1930 1940 1950 1960 1970 1980TTGCGCGCCCCGCCAGGGTCGCCTCCACGATTGGCGCCGATCTTTTCGCGTTGCCGATGA1990 2000 2010 2020 2030 2040TCGACACCTTTCTGGCGTCCATCAGCGATTGTTCCATCTTCGCGCAAAACCTTGTTCTCG2050 2060 2070 2080 2090 2100CCGCGGAATCGCTCGGCATGGGCACCTGCTATGTCGGGAGCCTGCGCAACCGGCCTGATCCCGGG序列3序列長度1569序列類型核酸序列1020304050 60TCGGAACCTGAAAACGAAATATCCCGCCGGACGGTGGGAAGGTGAAAGGAGGAGTCTCCA
Met708090 100 110 120TGACAACAGTTATCAAGGGTGGAACGATCGTCGCCGCCGATCGCAGCTATGAAGCCGATAThrThrValIleLysGlyGlyThrIleValAlaAlaAspArgSerTyrGluAlaAspIle130 140 150 160 170 180TCCTGATCGAAGGCGAAAAGATCGCCCAGATCGGCAGGGATCTGCAGGGCGACAAGATTGLeuIleGluGlyGluLysIleAlaGlnIleGlyArgAspLeuGlnGlyAspLysIleVal190 200 210 220 230 240TAGACGCCGAGGGTGCCTATATCATTCCCGGCGGCATCGATCCTCACACGCATCTTGAAAAspAlaGluGlyAlaTyrIleIleProGlyGlyIleAspProHisThrHisLeuGluMet250 260 270 280 290 300TGCCCTTTATGGGCACGACCACTGCCGAGACCTGGGAGTCCGGCACTTTCGCGGCTCTCTProPheMetGlyThrThrThrAlaGluThrTrpGluSerGlyThrPheAlaAlaLeuSer310 320 330 340 350 360CCGGCGGCACCACGATGGTTGTGGATTTCGTCATTCCCGGGCCGGCGGGAATGCTTGCCGGlyGlyThrThrMetValValAspPheValIleProGlyProAlaGlyMetLeuAlaAla370 380 390 400 410 420CCTTCGATCAATGGCAGGAGAGGGCAGCGCGCCAGGCTTCGTCCGACTACTCGCTGCATAPheAspGlnTrpGlnGluArgAlaAlaArgGlnAlaSerSerAspTyrSerLeuHisMet
430 440 450 460 470 480TGTGCGTGACCGGCTGGTCAAAGCAGATCTTCGAGGACATGGCGAAGGTGGTCGAGCGCGCysValThrGlyTrpSerLysGlnIlePheGluAspMetAlaLysValValGluArgGly490 500 510 520 530 540GTGTCAACACCTTCAAGCATTTCATGGCCTATAAGGGCGCGCTGATGGTGAACGACGACGValAsnThrPheLysHisPheMetAlaTyrLysGlyAlaLeuMetValAsnAspAspGlu550 560 570 580 590 600AGATGTTCGCCTCCTTCCAGCGCTGCGCCGCCCTGGGCGCCCTCCCGCTCGTGCATGCGGMetPheAlaSerPheGlnArgCysAlaAlaLeuGlyAlaLeuProLeuValHisAlaGlu610 620 630 640 650 660AAAACGGCGACATCGTCGCCTCGCTGCAGCAGAAATATATGCAGGAAGGCCTCACGGGTCAsnGlyAspIleValAlaSerLeuGlnGlnLysTyrMetGlnGluGlyLeuThrGlyPro670 680 690 700 710 720CGGAGGCTCATGCCTATTCCCGCCCGCCGGAGGTCGAGGGCGAGGCCACCAACCGCGCCAGluAlaHisAlaTyrSerArgProProGluValGluGlyGluAlaThrAsnArgAlaIle730 740 750 760 770 780TCATGATCGCCGATGCCGCAGGCGTGCCGGTCTATATCGTGCATGTCTCCTGTGAACAGGMetIleAlaAspAlaAlaGlyValProValTyrIleValHisValSerCysGluGlnAla790 800 810 820 830 840CGCACGAAGCGATCCGCCGCGCACGCCAGAAGGGAATGCGCGTCTATGGCGAGCCGCTCAHisGluAlaIleArgArgAlaArgGlnLysGlyMetArgValTyrGlyGluProLeuIle850 860 870 880 890 900TCCAGCACCTGCTGCTTGACGAGTCCGAGTACAAGAGAGCCGACTGGGACGAGGCGGCTCGlnHisLeuLeuLeuAspGluSerGluTyrLysArgAlaAspTrpAspGluAlaAlaArg910 920 930 940 950 960GGCGGGTGATGTCCGCGCCATTCCGCGATAAAAGCCATCAGGACAGCCTCTGGGCTGGGCArgValMerSerAlaProPheArgAspLysSerHisGlnAspSerLeuTrpAlaGlyLeu970 980 990 1000 1010 1020TCGCAGCGGGCTCGCTGCAGGTCGTGGCAACGGACCACTGCGCCTTTACCACTGAACAGAAlaAlaGlySerLeuGlnValValAlaThrAspHisCysAlaPheThrThrGluGlnLys1030 1040 1050 1060 1070 1080AGCGGCTGGGACTCAACGACTTCACGAAAATCCCGAACGGCACCGGGGGGTTAGAGGACCArgLeuGlyLeuAsnAspPheThrLysIleProAsnGlyThrGlyGlyLeuGluAspArg1090 1100 1110 1120 1130 1140GGTTGTCGCTGCTCTGGACCTATGGCGTGAAGACGGGGCGGCTCACGCCTAACGAATTCGLeuSerLeuLeuTrpThrTyrGlyValLysThrGlyArgLeuThrProAsnGluPheVal1150 1160 1170 1180 1190 1200TCGCCGTCACCTCCACCAATATCGCACAAATCCTGAACATCTATCCGCAAAAGGGCGCAAAlaValThrSerThrAsnIleAlaGlnIleLeuAsnIleTyrProGlnLysGlyAlaIle1210 1220 1230 1240 1250 1260TCCTGCCTGGGTCCGATGCCGACCTCGTCGTCTGGGATCCAGCCAAATCGAAGAAGATCALeuProGlySerAspAlaAspLeuValValTrpAspProAlaLysSerLysLysIleThr1270 1280 1290 1300 1310 1320CTGCTTCCGCTCAGAAATCCATCATCGACTACAATATCTTCGAGGGCTACGAGGTGACCGAlaSerAlaGlnLysSerIleIleAspTyrAsnIlePheGluGlyTyrGluValThrGly1330 1340 1350 1360 1370 1380GCATGCCGCGATACACGCTCTCACGCGGCGAGGTCGTATGGGGCGAGGAAGGCAGCAACGMetProArgTyrThrLeuSerArgGlyGluValValTrpGlyGluGluGlySerAsnGlu1390 1400 1410 1420 1430 1440AACCGCGGCCCGGTCGCGGTAGGTTCGTCGAGCGCCGGCCCTTTGCCGCCGTCAGCCGTGProArgProGlyArgGlyArgPheValGluArgArgProPheAlaAlaValSerArgAla1450 1460 1470 1480 1490 1500CCCTTTCAACCTGGAAGGAGATCGTCGCTCCGCGTGCGGTGGAGCGCTCGGCAAAGCATALeuSerThrTrpLysGluIleValAlaProArgAlaValGluArgSerAlaLysHisMet1510 1520 1530 1540 1550 1560TGCCGATCGGCGTTTGAATTTTGGGAGGCAGGCTCGAACTACGGTTTGGCCTGTCTCAGGProIleGlyVal***ACAATCCAT
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化型微生物，它是用含有編碼一種酶的基因的DNA片段和一種載體DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主微生物所獲得的，所述基因源于芽胞桿菌KNK245(FERM BP-4863)、農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)或假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)，所述酶(以下稱之為乙內(nèi)酰脲酶)能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸。
2.如權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化型微生物，其特征在于所述宿主微生物選自屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、沙雷菌屬(Serrati-a)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibactrium)的微生物。
3.如權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)化型微生物，其特征在于所述轉(zhuǎn)化型微生物是大腸桿菌HB101 pTH102，大腸桿菌HB101 pTH103，大腸桿菌HB101 pTH104(FERM BP-4864)，大腸桿菌HB101 pAH1043(FERM BP-4865)或大腸桿菌HB101 pPHD301(FERM BP-4866)。
4.一種生產(chǎn)一種能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶的方法，包括使用權(quán)利要求1-3中任一項的轉(zhuǎn)化型微生物。
5.一種用于生產(chǎn)D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的方法，包括使用按權(quán)利要求4的方法所獲得的酶。
6.如權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述5-取代乙內(nèi)酰脲是一種由下面的通式(1)所代表的化合物
其中，R是苯基，由羥基取代的苯基，烷基，取代烷基，芳烷基或噻吩基。
7.一種通過重組源于芽胞桿菌KNK245(FERM BP-4863)的編碼乙內(nèi)酰脲酶的DNA片段和一種質(zhì)粒pUCNT所獲得的重組質(zhì)粒，它具有圖2-4中任一個所示的限制酶圖。
8.如權(quán)利要求7的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是pTH102、pTH103或pTH104。
9.一種通過重組源于農(nóng)桿菌KNK712(FERM BP-1900)的編碼乙內(nèi)酰脲酶的DNA片段和一種質(zhì)粒pUC18所獲得的重組質(zhì)粒，它具有圖1所示的限制酶圖。
10.如權(quán)利要求9的重組質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒是pAH1043。
11.一種通過重組源于假單胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的編碼乙內(nèi)酰脲酶的DNA片段所獲得的重組質(zhì)粒，它具有圖5所示的重組酶圖。
12.如權(quán)利要求11的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒是pPHD301。
13.一個編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因編碼序列2所示氨基酸序列從第一個氨基酸至第472個氮基酸的全部或部分氨基酸序列。
14.一個DNA片斷，它含有編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因具有序列2所示核苷酸序列的從第1個核苷酸至第1776個核苷酸的全部或部分核苷酸序列，或等同于它的序列。
15.一個編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因編碼序列1所示氨基酸序列的從第1個氨基酸至第457個氨基酸的全部或部分氨基酸序列。
16.一種DNA片斷，它含有編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因具有序列1所示核苷酸序列的第1個核苷酸至第2518個核苷酸的全部或部分核苷酸序列，或等同于它的序列。
17.一種酶蛋白，它含有序列2所示氨基酸序列的第1至第472個氨基酸的全部或部分氨基酸序列，并具有通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性。
18.一種酶蛋白，它含有序列1所示氨基酸序列的第1至第457個氨基酸的全部或部分氨基酸序列，并具有通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性。
19.一個編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因編碼序列3所示氨基酸序列的第1至第485個氨基酸的全部或部分氨基酸序列。
20.一個DNA片斷，它含有編碼一種具有能通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲酰基-α-氮基酸的酶促活性的蛋白的基因，該基因具有序列3所示核苷酸序列的第1至第1569個核苷酸的全部或部分核苷酸序列或等同于它的序列。
21.一種酶蛋白，它含有序列3所示氨基酸序列的第1至第485個氨基酸的全部或部分氨基酸序列，并具有通過不對稱裂解水解作用將5-取代乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)化成相應的D-N-氨基甲?；?α-氨基酸的酶促活性。
全文摘要
披露了用一種乙內(nèi)酰脲酶由5－取代的乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)D－N－氨基甲?；粒被岬姆椒?所述乙內(nèi)酰脲酶由一種用含有編碼乙內(nèi)酰脲酶的基因的DNA片段和一種載體DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化型微生物生產(chǎn),所述乙內(nèi)酰脲酶源自芽胞桿菌屬(Bacillus)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)或假單胞菌屬的一種具體微生物。
文檔編號C12P13/04GK1171812SQ9519713
公開日1998年1月28日 申請日期1995年12月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月28日
發(fā)明者難波弘憲, 矢島麗嘉, 高野昌行, 山田勇喜雄, 池中康裕, 高橋里美 申請人:鐘淵化學工業(yè)株式會社