專利名稱：轉化微生物、d-?；被崴饷傅闹苽浞椒?br> 技術領域：
本發(fā)明涉及將在D-?；被崴饷讣癓-酰化氨基酸水解酶中，選擇性生成D-酰化氨基酸水解酶的D-?；被崴饷干苫驅刖哂袖\耐受性的微生物中形成的轉化微生物，以及利用該轉化微生物的D-?；被崴饷钢苽浞椒?。
背景技術：
高光學純度的D-氨基酸是抗生物質的側鏈和多肽類藥物制備過程中所需的氨基酸，而D-?；被崴饷甘钱a業(yè)上用于制備D-氨基酸的酶。
目前，作為可同時生成D-酰化氨基酸水解酶和L-?；被崴饷傅奈⑸?， 已知如化學和藥學通報(Chemical andPharmaceutical Bulletinn)26，2698(1978)報道的假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)AAA6029株；特開昭53-59092號公報報道的橄欖鏈霉菌(Streptomyces olivaceus)S·62等放線菌。利用這些微生物時，姑且不論D-?；被崴饷干赡芰Γ捎谕瑫r可生成作為光學異構體的D-?；被崴饷负蚅-?；被崴饷?，因此明顯的缺點是分離兩者需要煩瑣且高成本的操作。
另一方面，作為選擇性生成D-酰化氨基酸水解酶的微生物，已知如特開平1-5488號公報報道的反硝化產堿菌木糖氧化亞種(Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans)MI-4株。利用該菌種時，雖省卻了分離D-?；被崴饷负蚅-酰化氨基酸水解酶的麻煩，但D-酰化氨基酸水解酶的生成能力卻顯得不足。并且，由于在特開平1-5488號公報中并未闡明D-?；被崴饷干苫虻膲A基序列，因此無法改變基因以提高D-?；被崴饷傅纳赡芰蛣?chuàng)建高生成性的轉化微生物。
鑒于以上所述，本申請的發(fā)明人森口等闡明了木糖氧化產堿菌木糖氧化亞種(Alcaligenes xylosoxydans subsp.xylosoxydans)A-6株具有的D-?；被崴饷干苫虻慕Y構，相關堿基序列示于序列表的序列號1中。進而，本發(fā)明人通過對該D-?；被崴饷干苫蚣右砸欢ǖ母淖儯@著提高了轉化微生物的D-?；被崴饷干赡芰?Protein Expression and Purification 7，395-399(1996))。

發(fā)明內容
隨后的研究表明，導入上述D-?；被崴饷干苫虻母鞣N轉化微生物在含鋅離子的培養(yǎng)基中，可大大提高D-?；被崴饷傅纳赡芰ΑＳ绕涫菍\離子濃度控制在一定范圍時，生成能力得以顯著提高。
再者，已知上述效果因宿主微生物的種類不同，其程度具有很大的差異。對于效果強的微生物，通常在轉化前即可表現出鋅耐受性。這種鋅耐受性是指，以菌體量(A660nm)為繁殖能力測定指標時，添加鋅離子難以抑制其繁殖能力。
基于上述認識，可指出以下①、②兩個事項。即，①其原因雖不明確，但存在一定量的鋅離子時，攜有序列表序列號1所示D-?；被崴饷干苫虻霓D化微生物的表達可得到增強。②由于鋅離子對于通常的微生物具有抑制作用，因此為確保鋅離子的效果，有必要將原本就具有鋅耐受性的微生物作為基因導入的宿主。
基于以上觀點，本發(fā)明提供用D-?；被崴饷干苫蜣D化的微生物，通過向培養(yǎng)基中添加鋅離子，該微生物的D-?；被崴饷干赡芰M一步大大增強。此外，本發(fā)明還提供利用上述轉化微生物的D-酰化氨基酸水解酶制備方法。
本發(fā)明的轉化微生物具有下列特征將因鋅離子的存在而使基因產物的表達得以增強的D-酰化氨基酸水解酶生成基因導入具有鋅耐受性的宿主微生物中，進而獲得在含鋅離子的培養(yǎng)基中的D-酰化氨基酸水解酶高表達性性狀；該轉化微生物是用D-?；被崴饷干苫蜻M行轉化的微生物，通過向培養(yǎng)基中添加鋅離子，可最大限度地增強D-酰化氨基酸水解酶生成能力。
本發(fā)明的轉化微生物中，更優(yōu)選上述D-?；被崴饷干苫蚧蚓哂行蛄斜淼男蛄刑?所示的堿基序列，或者具有可與序列表的序列號1所示的堿基序列在嚴格條件下雜交的同時，有效地編碼D-?；被崴饷傅膲A基序列。已知具有序列表的序列號1所示堿基序列的D-?；被崴饷干苫颍诖嬖阡\離子的條件下，可更為顯著地增強基因產物的表達。因此，可與序列表的序列號1所示堿基序列在嚴格條件下雜交的同時，有效地編碼D-?；被崴饷傅膲A基序列也有望具有同樣的特征。
本發(fā)明的轉化微生物中，更優(yōu)選的宿主微生物為大腸桿菌。已知大腸桿菌具有鋅耐受性。并且，對于大腸桿菌的菌體學性質、生理性質、培養(yǎng)條件和管理條件等也已熟知。因此，D-?；被崴饷傅母咝a可在相對容易的生產管理條件下進行。
本發(fā)明的轉化微生物中，更優(yōu)選對于導入宿主微生物的D-?；被崴饷干苫蜻M行以下(1)和/或(2)的修飾。(1)在核糖體結合區(qū)域設計特定的堿基序列(GAAGGA)，并導入基因的翻譯起始位點上游9個堿基的位置，進而提高翻譯效率。通過這種修飾，可提高D-?；被崴饷干苫虻姆g效率。(2)在基因的上游和下游設置大腸桿菌的Hind III識別位點，純化該基因并酶切后連接于表達載體，進而提高基因的表達效率。通過這種修飾，可提高D-?；被崴饷干苫虻谋磉_效率。
可應用鋅耐受性微生物作為以獲得本發(fā)明轉化微生物為目的的宿主微生物。更為具體地說，可應用以菌體量(A660nm)的增加或減少為指標測定培養(yǎng)基中的繁殖能力時，添加鋅不會過于抑制其繁殖能力的微生物。作為鋅耐受性的一個判斷標準，例如相對于該微生物在未添加鋅的培養(yǎng)基中的菌體量(A660nm)，添加2mM鋅的同一條件培養(yǎng)基中的菌體量的增加或減少程度止于10％以內。或者，例如添加5mM鋅的同一條件培養(yǎng)基中的菌體量的增加或減少程度止于20％以內。
對于宿主微生物的分類上的種類沒有特殊的限制，一般來說，優(yōu)選形態(tài)學性質和生理學性質均已熟知，且其培養(yǎng)條件和管理條件已知的宿主微生物。作為宿主微生物的優(yōu)選例，例如大腸桿菌(Eschericiacoli)。相反，含有上述A-6株的木糖氧化產堿菌種的微生物與大腸桿菌相比，不具備鋅耐受性。
對于D-酰化氨基酸水解酶生成基因導入宿主微生物的方法沒有特殊的限定，例如可根據情況任意選擇連接質粒后導入的方法，及連接于噬菌體DNA后導入的方法等。
本發(fā)明的D-?；被崴饷干苫蚴窃贒-?；被崴饷讣癓-?；被崴饷钢羞x擇性生成D-?；被崴饷傅幕?，該基因的表型為，培養(yǎng)基中存在鋅離子時，其活性表達可進一步得到增強。作為已確定為該類型D-?；被崴饷干苫蚨鴥?yōu)選的一個例子，例如具有序列表的序列號1所示堿基序列?；蛘?，具有在嚴格條件下，可與序列表序列號1所示堿基序列雜交的同時，有效地編碼D-?；被崴饷傅膲A基序列，但實際上其活性表達不能因培養(yǎng)基中存在鋅離子而得以增強的除外。
具有序列表的序列號1所示堿基序列的D-酰化氨基酸水解酶生成基因由上述木糖氧化產堿菌木糖氧化亞種(Alcaligenesxylosoxydans subsp.xylosoxydans)A-6株獲得。該A-6株是從自然界的土壤中篩選得到的D-?；被崴饷干删?br> 本發(fā)明的D-?；被崴饷傅闹苽浞椒?，在含鋅培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的任一轉化微生物，并從該培養(yǎng)物獲得D-?；被崴饷?。鋅離子的供給，例如可通過向培養(yǎng)基中適量添加氯化鋅、硫酸鋅等鋅化合物來實現。通過這種方法，可高效制備D-?；被崴饷?。
本發(fā)明的D-酰化氨基酸水解酶制備方法中，更優(yōu)選將上述培養(yǎng)基中所含鋅離子濃度控制在0.1～10mM。通過該方法，培養(yǎng)基中的鋅離子濃度得以最優(yōu)化，并可尤為高效地制備D-?；被崴饷?。
對于D-?；被崴饷傅闹苽浞椒ㄖ校鲜龇椒ㄒ酝獾膶嵤┓椒ê蛯嵤l件沒有特殊的限制，但優(yōu)選將tac啟動子的誘導物(例如異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、乳糖等)作為誘導物，并在營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，更優(yōu)選將培養(yǎng)時的乳糖濃度控制在0.1～1％程度。
附圖的簡單說明


圖1為用于連接D-?；被崴饷干苫虻馁|粒的概念化圖。
圖2為連接了D-?；被崴饷干苫虻馁|粒的概念化圖。
實施發(fā)明的最佳方案以下，對實施本發(fā)明的最佳方案和比較例進行說明，但本發(fā)明并不受限于這些實施方案。
(基因的獲得和堿基序列的測定)用限制酶Sau 3AI部分酶解從木糖氧化產堿菌木糖氧化亞種A-6株得到的染色體DNA，得到2～9Kb的DNA片斷。將得到的DNA片斷插入連接于已知的質粒pUC118的BamHI識別位點。用該連接質粒轉化大腸桿菌JM109，得到氨芐青霉素抗性轉化株。進而由通過上述方法得到的轉化株得到具有選擇性生成D～酰化氨基酸水解酶能力的菌株。具有這種能力的轉化株攜有含5.8Kb插入片斷的質粒。
酶切上述質粒中5.8Kb的插入片斷，以測定D-酰化氨基酸水解酶生成基因的位置。然后按常規(guī)方法，測定約2.0Kb DNA的堿基序列，測定出的堿基序列如序列表的序列號1所示。序列表中同時附有對應的氨基酸序列。其結果，可確認出由ATG起始的、由1452個核苷酸組成的開放閱讀框架(Open Reading Frame；ORF)。
(基因的修飾)用BamHI-HindIII酶切攜有上述5.8Kb插入片斷的質粒，得到4Kb的DNA片斷，將此片斷與已知的質粒pUC118連接，進而構建連接質粒pAND118。以pAND118為模板，通過應用引物的定點誘變，制備對核糖體結合位點(Ribosome Binding Site；RBS)進行過修飾的質粒pANSD1。
隨后，以pANSD1為模板，通過應用引物的定點誘變，分別在上述RBS的上游設置EcoRI的識別位點、在ORF的下游設置HindIII的識別位點，進而構建pANSD1HE。
其次，用限制酶EcoRI-HindIII酶切質粒pANSD1HE，得到1.8Kb的DNA片斷。將該DNA片斷插入連接于
圖1所示質粒pKK223-3的EcoRI-HindIII位點，得到圖2所示的質粒pKNSD2。
(轉化大腸桿菌)以源自大腸桿菌(Eschericia coli)K12的菌株為宿主，按D.HANAHAN的方法(DNA cloning Vol.1109～136 1985)導入質粒DNA，得到轉化大腸桿菌E.coli TG1/pKNSD2。
(基因獲得源菌株的鋅耐受性)在含0.2％磷酸二氫鉀、0.2％磷酸氫二鉀、2％聚胨、0.01％硫酸鎂、1％甘油、pH7.2的未添加鋅的培養(yǎng)基，及在與此同一組成的培養(yǎng)基中分別加入濃度為0.2mM、2.0mM、5.0mM氧化鋅的添加鋅的培養(yǎng)基中，30℃、24小時培養(yǎng)上述木糖氧化產堿菌木糖氧化亞種A-6株。培養(yǎng)后，通過測定菌體量(A660nm)評價其鋅耐受性。同時，測定培養(yǎng)后培養(yǎng)基的pH。其結果示于表1的“A-6菌”所示一欄中。
表1

由表1可知，相對于未添加鋅的培養(yǎng)基中A-6株的菌體量，添加鋅的培養(yǎng)基中A-6株的菌體量顯著減少(添加2.0mM鋅的培養(yǎng)基中減少約35％，添加5.0mM鋅的培養(yǎng)基中減少約60％)，上述A-6株不具有鋅耐受性。
(宿主菌的鋅耐受性)對于作為宿主菌應用的源于上述大腸桿菌K12株的菌株，用與上述A-6株同一組成的培養(yǎng)基，同樣地進行菌體量(A660nm)的測定，并對其鋅耐受性進行評價。其結果示于表1的“TG1(宿主菌)”所示一欄中。
由表1可知，相對于未添加鋅的培養(yǎng)基中宿主菌的菌體量，添加鋅的培養(yǎng)基中宿主菌的菌體量沒有過多減少(添加2.0mM鋅的培養(yǎng)基中減少約3％，添加5.0mM鋅的培養(yǎng)基中減少約12％；而添加0.2mM鋅的培養(yǎng)基中菌體量卻有所增加)，上述宿主菌具有鋅耐受性。
(轉化大腸桿菌的鋅耐受性)對于轉化大腸桿菌E.coli TG1/pKNSD2，用與上述A-6株同一組成的培養(yǎng)基，同樣地進行菌體量(A660nm)的測定，并對其鋅耐受性進行評價。其結果示于表1的“pKNSD2/TG1(重組菌)”所示一欄中。
由表1可知，相對于未添加鋅的培養(yǎng)基中轉化大腸桿菌的菌體量，添加鋅的培養(yǎng)基中轉化大腸桿菌的菌體量沒有過多減少(添加2.0mM鋅的培養(yǎng)基中減少約5％，添加5.0mM鋅的培養(yǎng)基中減少約15％；而添加0.2mM鋅的培養(yǎng)基中菌體量卻有所增加)，上述轉化大腸桿菌具有鋅耐受性。
(對于轉化大腸桿菌的鋅添加效果)在含1％細菌用胰化蛋白胨、0.5％細菌用酵母提取物、0.5％氯化鈉、100μg/ml氨芐青霉素、pH7.0的培養(yǎng)基中，30℃、16小時預培養(yǎng)轉化大腸桿菌E.coli TG1/pKNSD2。
隨后，在含0.2％磷酸二氫鉀、0.2％磷酸氫二鉀、2％聚胨、0.01％硫酸鎂、1％甘油、作為誘導物的0.1％乳糖、pH7.0的未添加鋅的培養(yǎng)基，及在與此同一組成的培養(yǎng)基中分別加入濃度為0.2mM、2.0mM氧化鋅的添加鋅的培養(yǎng)基中，30℃、24小時培養(yǎng)預培養(yǎng)后的轉化大腸桿菌。并且，測定培養(yǎng)后培養(yǎng)液的pH(Broth-out pH)和培養(yǎng)液(A660nm)中D-?；被崴饷富钚?U/mL)。
其結果，相對于未添加鋅的培養(yǎng)基中的酶活性為21.78U/mL(Broth-out pH5.05)，添加0.2mM鋅的培養(yǎng)基中的酶活性為58.85U/mL(Broth-out pH5.03)，添加2.0mM鋅的培養(yǎng)基中的酶活性為109.79U/mL(Broth-out pH5.11)。因此可確認，通過添加至少處于一定濃度范圍的鋅離子，可顯著提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力。
作為比較，用上述預培養(yǎng)用培養(yǎng)基(但未加入氨芐青霉素)在相同的條件下預培養(yǎng)上述A-6株，隨后，除了誘導物用0.1％N-乙?；?D，L-亮氨酸代替上述0.1％乳糖之外，在其余組成與上述培養(yǎng)用培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，用與以上述相同的條件進行培養(yǎng)。并且，測定培養(yǎng)后培養(yǎng)液的pH和培養(yǎng)液(A660nm)中D-酰化氨基酸水解酶活性(U/mL)。
其結果，相對于未添加鋅的培養(yǎng)基中的酶活性為0.29U/mL(Broth-out pH7.47)，添加0.2mM鋅的培養(yǎng)基中的酶活性為0.12U/mL(Broth-out pH7.48)，添加2.0mM鋅的培養(yǎng)基中的酶活性為0.29U/mL(Broth-out pH7.43)。因此可確認，通過添加鋅離子，獲得了提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力的效果。
產業(yè)上的實用性如上所述，通過應用本發(fā)明的轉化微生物，可有選擇性地、且高效地生成產業(yè)上有用的D-?；被崴饷?。
序列表<110>天野酶株式會社(Amano Enzyme Inc.)<120>轉化微生物、D-酰化氨基酸水解酶的制備方法<130>IPOK-00-010WO<160>1<210>1<211>1758<212>DNA<213>木糖氧化產堿菌木糖氧化亞種(Alcaligenes xylosoxydans subsp. Xylosoxydans)<400>1gaattccact tgatcgcgga aggagagatt tcc atg tcc caa tcc gat tcc cag ccc 57Met Ser Gln Ser Asp Ser Gln Pro1 5ttc gac ctg ctg ctc gcg ggc ggc acc ctc atc gac ggc agc aac acc 105Phe Asp Leu Leu Leu Ala Gly Gly Thr Leu Ile Asp Gly Ser Asn Thr10 15 20ccg ggg cgg cgc gcc gac ctg ggc gtg cgc ggc gac cgc atc gcc gcc 153Pro Gly Arg Arg Ala Asp Leu Gly Val Arg Gly Asp Arg Ile Ala Ala25 30 35 40atc ggc gat ctg tcg gac gcc gcc gcg cac acc cgg gtc gac gtg tcg 201Ile Gly Asp Leu Ser Asp Ala Ala Ala His Thr Arg Val Asp Val Ser45 50 55
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權利要求
1.一種轉化微生物，其特征在于，將因鋅離子的存在而使基因產物的表達得以增強的D-?；被崴饷干苫驅刖哂袖\耐受性的宿主微生物中，進而獲得在含鋅離子的培養(yǎng)基中的D-?；被崴饷父弑磉_性性狀。
2.根據權利要求1所述的轉化微生物，其中，上述D-?；被崴饷干苫蚧蛘呔哂行蛄斜硇蛄刑?所示的堿基序列，或者具有在嚴格條件下可與序列表序列號1所示的堿基序列雜交的同時，有效地編碼D-酰化氨基酸水解酶的堿基序列。
3.D-?；被崴饷傅闹苽浞椒?，其特征在于，將因鋅離子的存在而使基因產物的表達得以增強的D-?；被崴饷干苫驅刖哂袖\耐受性的宿主微生物中，由此獲得的轉化微生物在含鋅離子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，進而從培養(yǎng)物中獲得D-?；被崴饷?。
4.根據權利要求3所述的D-酰化氨基酸水解酶的制備方法，其中，將上述培養(yǎng)基中所含鋅離子濃度控制在0.1～10mM。
全文摘要
將在D－?；被崴饷讣癓－?；被崴饷钢?，選擇性生成D－酰化氨基酸水解酶的D－?；被崴饷干苫驅刖哂袖\耐受性的微生物中，進而獲得轉化微生物。將該轉化微生物在含鋅離子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物中高效率地獲得D－酰化氨基酸水解酶的方法。
文檔編號C12N9/78GK1514876SQ00811610
公開日2004年7月21日 申請日期2000年6月15日 優(yōu)先權日1999年6月17日
發(fā)明者竹內賢一, 小出芳直, 廣瀨芳彥, 森口充瞭, 磯部公安, , 安, 彥, 直 申請人:天野酶株式會社