專利名稱：核酸探針固定化基體和用其檢測標(biāo)記的核酸存在的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為檢測標(biāo)記的核酸存在的核酸探針固定化基體，以及使用該基體的核酸檢測方法。
背景技術(shù)：
近年來伴隨著基因工程學(xué)的發(fā)展，在醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)已能利用基因進(jìn)行疾病診斷和預(yù)防。這些稱之為基因診斷。例如通過檢測形成疾病原因的人類基因缺陷和變化，可在疾病發(fā)癥前或者極早期階段進(jìn)行該疾病的診斷和預(yù)測。開展了對人類染色體組破譯，及基因類型與疾病相關(guān)連的研究，與各種人的基因類型相吻合的治療(テ一ラ一メイド醫(yī)療)也正在成為現(xiàn)實(shí)。因此，簡便地進(jìn)行基因的檢測、和基因類型的確定是極為重要的。
在這種基因解析中尤為引人注意的是一般稱作DNA切片或DNA微陣列的裝置(此處將兩者統(tǒng)稱為DNA切片)。DNA切片是具有將由多種堿基基序列構(gòu)成的多個(gè)核酸探針固定在基板上的裝置。通過使用這樣的DNA切片，在一次試驗(yàn)中，可檢測出多種的標(biāo)記的核酸。然而，具有這樣的長處，另一方面，存在于試料中不同標(biāo)記的核酸的雜交效率不同，有時(shí)根據(jù)情況，只能得到非常低的雜交效率。
發(fā)明公開鑒于上述狀況，本發(fā)明的目的是提供可以高效率進(jìn)行雜交的探針固定化基體。
上述目的，通過如下本發(fā)明的形態(tài)即可達(dá)到。即，(1)核酸探針固定化基體，具有基體，和通過間隔基固定在上述基體上并含有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的堿基基序列的核酸探針，其特征是，上述間隔基是如下的間隔基，即，將其長度取為X，對于上述核酸探針在其一部分含有上述標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸進(jìn)行雜交時(shí)，從該雜交部位的基體側(cè)末端到上述標(biāo)記的核酸的基體側(cè)末端的長度取為Y時(shí)，X≥Y的關(guān)系成立。
(2)使用了上述(1)記載核酸探針固定化基體檢測標(biāo)記的核酸存在的方法，包括如下工序，即，使用選擇的引物，使其X和Y滿足X≥Y的關(guān)系，對試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序、在獲得適當(dāng)雜交的條件下，使利用上述擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與固定在上述(1)中記載的核酸探針固定化基體上的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)的工序、和通過檢測利用上述反應(yīng)工序生成的雜交，判斷在試料核酸中存在標(biāo)記的核酸的工序；和(3)核酸檢測方法，在使用具有基體、和固定在上述基體上，并含有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的序列的核酸探針的核酸探針固定化基體，檢測含該標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸的方法中，包括以下步驟(a)在用標(biāo)記的序列將該標(biāo)記的核酸與上述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，準(zhǔn)備用于擴(kuò)增該標(biāo)記的核酸的引物，使上述標(biāo)記的核酸的末端位于從該標(biāo)記的序列部位的基體側(cè)末端部到40堿基以內(nèi)，(b)使用上述(a)中準(zhǔn)備的引物，將試料核酸擴(kuò)增，(c)將上述(b)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物形成一個(gè)鏈，(d)將上述(c)中得到的一個(gè)鏈與上述核酸探針進(jìn)行反應(yīng)，(e)通過檢測上述(d)中生成的雜交，檢測出該試料核酸中標(biāo)記的核酸的存在。


圖1A是表示本發(fā)明核酸探針固定化基體一例的平面圖，圖1B是沿圖1A中B-B線剖切的剖面圖。
圖2是表示本發(fā)明核酸探針固定化基體一例的圖。
圖3是表示核酸探針和標(biāo)記的核酸結(jié)合狀態(tài)的圖。
圖4是實(shí)施例中表示所用核酸探針和標(biāo)記的核酸的模式圖。
圖5是表示X和Y的關(guān)系曲線圖。
圖6A是實(shí)施例中表示所用的含各種間隔基的核酸探針與標(biāo)記的核酸結(jié)合狀態(tài)的圖，圖6B是實(shí)施例中表示根據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果的圖。
圖7A是實(shí)施例中表示所用的含各種間隔基的核酸探針與標(biāo)記的核酸結(jié)合狀態(tài)的圖，圖7B是實(shí)施例中表示根據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果的圖。
圖8A是實(shí)施例中表示所用的含各種間隔基的核酸探針與標(biāo)記的核酸結(jié)合狀態(tài)的圖，圖8B是實(shí)施例中表示根據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果的圖。
圖9是實(shí)施例中表示所用擴(kuò)增片段與核酸探針的關(guān)系圖。
圖10是實(shí)施例中表示根據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果的曲線圖。
圖11是實(shí)施例中表示所用擴(kuò)增片段與核酸探針的關(guān)系圖。
圖12是實(shí)施例中表示根據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果的曲線圖。
圖13是實(shí)施例中表示根據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果的曲線圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳形態(tài)1.發(fā)明概要本發(fā)明基本上是具有基體和通過間隔基固定在上述基體上核酸探針的核酸探針固定化基體。本發(fā)明就是基于本發(fā)明者們的如下發(fā)現(xiàn)，即，利用特定間隔基的長度，可有效地獲得好的雜交。
即，在根據(jù)本發(fā)明形態(tài)的核酸探針固定化基體中，通過如下間隔基，使核酸探針對基體進(jìn)行固定。即，將間隔基的長度取為X，對于上述核酸探針，其一部分上含有上述標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸雜交時(shí)，從該雜交部位的基體側(cè)末端到上述標(biāo)記的核酸的基體側(cè)末端的長度取為Y時(shí)，X≥Y的關(guān)系成立。
根據(jù)本發(fā)明形態(tài)的核酸探針固定化基體的測定原理如下。該核酸探針設(shè)計(jì)具有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的序列。試料核酸中存在標(biāo)記的序列時(shí)，在該核酸探針固定化基體上產(chǎn)生雜交。因此，本發(fā)明的裝置，基本上通過檢測該雜交的結(jié)果存在產(chǎn)生二個(gè)鏈核酸，或者通過檢測存在與該核酸探針進(jìn)行雜交的核酸，即可檢測出存在于試料核酸中的標(biāo)記的序列。此處使用的“檢測雜交”術(shù)語，是總括起來表示檢測產(chǎn)生的二個(gè)鏈核酸、或者預(yù)先利用某種標(biāo)識物質(zhì)對試料核酸進(jìn)行標(biāo)識中，檢測雜交后來自該標(biāo)識物質(zhì)的信號，或者利用其自身公知的其他方法，根據(jù)反應(yīng)檢測二個(gè)鏈核酸的存在或雜交的產(chǎn)生的術(shù)語。
這種雜交的檢測，例如可利用下述的電化學(xué)檢測或熒光檢測進(jìn)行。
這種電化學(xué)的檢測時(shí)，核酸探針固定化基體，基本是對于配置在基體上可檢測電化學(xué)信號的電極，可通過間隔基與所要求的核酸探針形成固定化而得到。
在使用熒光物質(zhì)等標(biāo)識物質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)，核酸探針固定化基體，基本是可通過間隔基使所要求的核酸探針形成固定化而得到。
2.用語的說明此處使用的核酸”的術(shù)語是總括表示核糖核酸(即，RNA)、脫氧核糖核酸(即，DNA)、肽核酸(即，PNA)、甲基磷酸酯核酸、S-低聚、cDNA和cRNA等、及任何低聚核苷酸和多核苷酸等、核酸及核酸類似體的術(shù)語。這樣的核酸可以是天然存在的，也可以是人工合成的。
此處所說的“核酸探針”是指在含有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的堿基基序列核酸中，用于向基體上固定的核酸片段。核酸探針具有與所要求的標(biāo)記的序列互補(bǔ)的序列。由此，可在適宜的條件下與標(biāo)記的序列進(jìn)行雜交。
此處所說的“標(biāo)記的序列”是指要檢測其存在的堿基基序列，或者利用核酸探針的堿基基序列要捕捉的序列。還有，將含有這種標(biāo)記的序列的核酸稱為標(biāo)記的核酸。
此處使用的“互補(bǔ)”“互補(bǔ)的”和“互補(bǔ)性”的術(shù)語是指可以在50％～100％范圍內(nèi)互補(bǔ)的，最好是100％互補(bǔ)的。
此處使用的“間隔基”的術(shù)語是指配置在基床與核酸探針之間的，具有某長度的鏈狀物質(zhì)。構(gòu)成間隔基的物質(zhì)是核酸時(shí)，與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的或進(jìn)行雜交部分為探針，除此之外的部分分類成間隔基。
此處使用的“間隔基長度”的術(shù)語是指在基體與核酸探針之間配置的鏈狀分子長度。在基體上使用如圖3所示的封閉劑時(shí)，將從上述間隔基的長度減去封閉劑的長度，取為“間隔基長度”。
3.發(fā)明的形態(tài)首先，以下說明本發(fā)明的基本構(gòu)成實(shí)例。
(1)第1種形態(tài)使用圖1，說明本發(fā)明的第1種形態(tài)。本發(fā)明的第1種形態(tài)核酸探針固定化基體1，在基體2上具有的電極3上，具有借助間隔基4固定的核酸探針5(圖1A和圖1B)。電極3與為讀出電信號的小塊6連接。圖1B中，為方便起見，用粗線示出間隔基4，用鏈狀線示出核酸探針5。
這種核酸探針固定化基體1，例如利用其自身公知的方法，將電極配置在硅基板上，對于該電極表面，通過間隔基使核酸探針固相化而使制造成為可能。
本形態(tài)中，雖然將電極數(shù)取為6，但配置在1個(gè)基體上的電極數(shù)并不限于這些。電極的配置圖案也不限定于圖1A所示，本領(lǐng)域人員可根據(jù)需要適當(dāng)變更設(shè)計(jì)。也可根據(jù)需要設(shè)置參照電極和對電極。這樣的核酸探針固定化基體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
(2)第2種形態(tài)圖2模式地示出了本發(fā)明第2種形態(tài)。本發(fā)明第2種形態(tài)的核酸探針固定化基體11，是在基體12上，具有借助間隔基13固定的核酸探針14(圖2)。為方便起見，圖2中也用粗線示出了間隔基13，用鏈狀線示出了核酸探針14。
這樣的核酸探針固定化基體11，例如利用其自身公知的方法，對于硅基板，借助間隔基使核酸探針固相化，可以此進(jìn)行制造。
本形態(tài)中，配置在1個(gè)基體上的核酸探針數(shù)，并不限于此數(shù)，可根據(jù)要求適當(dāng)變更，也可在1個(gè)基體上配置具有多種堿基基序列的核酸探針。多個(gè)和/或多種的核酸探針對基體的固相圖案，本技術(shù)領(lǐng)域人員可根據(jù)需要作適當(dāng)變更設(shè)計(jì)。這樣的核酸探針固定化基體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
4.構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的形態(tài)，雖然具有上述的基本構(gòu)成，但借助于間隔基固定核酸探針時(shí)，存在如下特征。詳細(xì)講，本發(fā)明中使用的間隔基是如下的間隔基，即，將間隔基的長度取為X并在其一部分含有上述標(biāo)記的序列的標(biāo)記核酸對上述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，從該雜交部位的基體側(cè)末端到上述標(biāo)記的核酸的基體側(cè)末端的長度取為Y時(shí)，X≥Y的關(guān)系成立。
圖3中示出一例核酸探針與標(biāo)記的核酸的結(jié)合狀態(tài)。在圖3的左側(cè)，模式地示出了核酸探針固定化基體30和一般標(biāo)記的核酸的實(shí)例。對配置在基體31上的電極32表面，進(jìn)行磷酸二氫鉀劑33a和封閉劑33b的處理。通過該磷酸二氫鉀劑33a，借助于間隔基34使核酸探針35固定在電極32上。對于這樣的核酸探針35的序列，其一部分上具有使互補(bǔ)的標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸36排列示出在其附近。
認(rèn)為從個(gè)體和組織以及細(xì)胞等對象獲得的試料，或從根據(jù)要求對其處理獲得的試料，由這些試料獲得的試料核酸中，即使是含有要檢測的標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸，存在標(biāo)記的核酸的位置也是各式各樣的。圖3中左圖的試料核酸36作為這種多樣的標(biāo)記的核酸中平均的一個(gè)實(shí)例在這里表示。
將這樣固定化的核酸探針35和標(biāo)記的核酸36進(jìn)行雜交時(shí)的狀態(tài)示于圖3右側(cè)，比較基線37以上的部分。從圖可明確知道，間隔基34的長度為“X”，對于核酸探針35，借助標(biāo)記的序列與標(biāo)記的核酸36進(jìn)行雜交時(shí)，從標(biāo)記的序列部分的基體側(cè)末端到該標(biāo)記的核酸的基體側(cè)末端的長度為“Y”。
X＜Y時(shí)，具有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的序列的核酸探針35和標(biāo)記的核酸36的雜交效率很低，即，這種情況下，考慮標(biāo)記的核酸的長度和該標(biāo)記的核酸中標(biāo)記出的序列位置時(shí)，被固定的核酸探針過度存在于基體表示附近。由此成為核酸探針彼此互為立體障礙的原因，固相的基體成為立體障礙的原因。結(jié)果，可以推知核酸探針和標(biāo)記的核酸的雜交效率不可能充分。
與其相反，X≥Y時(shí)，具有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的序列的核酸探針35與標(biāo)記的核酸36的雜交效率很高。X≥Y時(shí)，從圖3的右側(cè)可知，標(biāo)記的序列與核酸探針雜交時(shí)，存在于基體31側(cè)的標(biāo)記的核酸36比標(biāo)記的序列形成部分過剩，即使如此，該過剩部分也很短，或者這種過剩部分就不存在。從標(biāo)記的核酸的長度和標(biāo)記的序列的位置看，間隔圖34具有充分的長度，核酸探針在反應(yīng)溶劑中自由活動的范圍很寬(即，自由度充分大)。認(rèn)為可提高在雜交反應(yīng)中與標(biāo)記的序列相遇的概率。
圖5中示出X和Y的關(guān)系。圖5的曲線圖，橫軸為X的長度，縱軸為Y的長度。中央的直線是Y＝X的曲線圖。根據(jù)本發(fā)明的形態(tài)，Y與X的最好關(guān)系是X≥Y。圖中，為了標(biāo)記的核酸和固相的立體障礙變小，區(qū)域A是滿足X≥Y的區(qū)域。區(qū)域B包含在區(qū)域A內(nèi)，為了提高了核酸探針的自由度，是滿足X-50?！軾的區(qū)域。區(qū)域C包含在區(qū)域B內(nèi)，是考慮合成核酸探針時(shí)的費(fèi)用和數(shù)量時(shí)優(yōu)選區(qū)域。區(qū)域D是即使Y短于數(shù)10時(shí)，為確保自由度，考慮到X需要一定長度以上時(shí)可回避的優(yōu)選區(qū)域。再有區(qū)域E是Y為0、或者由于極短，有無間隔基或其長度對雜交效率不產(chǎn)生影響的區(qū)域。
實(shí)際上進(jìn)行檢測時(shí)，多數(shù)情況是區(qū)域A，B，C和D，但本發(fā)明的形態(tài)中，優(yōu)選區(qū)域是區(qū)域C和區(qū)域D。
根據(jù)本發(fā)明的旨意，例如X的長度界限可在20000以下，也可在10000以下。從合成核酸探針的側(cè)面考慮時(shí)，X長度的上限可為2000(這相當(dāng)于核酸中約400個(gè)堿基)，優(yōu)選為1000更優(yōu)選為500即，X的長度設(shè)定很長時(shí)，在合成核酸探針時(shí)，有可能降低產(chǎn)量和純度。
為了滿足根據(jù)上述本發(fā)明形態(tài)的條件，可在選擇標(biāo)記的序列時(shí)下工夫，也可在對含標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，在從試料選擇所用引物序列時(shí)下工夫。不僅調(diào)節(jié)間隔基的長度，而且通過這種調(diào)整，可達(dá)到更好的雜交效率。
用作該間隔基的物質(zhì)實(shí)例，可以是有機(jī)鏈狀分子，例如可以是核酸、烷烴和聚乙二醇、聚肽等。
例如間隔基是由核酸構(gòu)成的核酸間隔基時(shí)，其堿基基序列優(yōu)選是不與標(biāo)記的核酸和可含在試料中的核酸相結(jié)合的序列。在利用下述電化學(xué)檢測進(jìn)行檢測產(chǎn)生雜交的情況時(shí)，其中選取序列，最好考慮到與所用二個(gè)鏈的識別體核酸堿基的結(jié)合傾向。例如ヘキスト33258與胞嘧啶和烏嘌呤很難結(jié)合，與胸腺嘧啶和腺嘌呤很容易結(jié)合。另一方面，烏嘌呤的連接序列難以合成。因此，更優(yōu)選只含有胞嘧啶或含有很多胞嘧啶的堿基基序列，優(yōu)選由胸腺嘧啶形成的或含有很多胸腺嘧啶的堿基基序列，只含有烏嘌呤或腺嘌呤的或含有很多這些的堿基基序列不太好。
通過配置這樣的間隔基，可使核酸探針和標(biāo)記的核酸達(dá)到更高效率的雜交。
本發(fā)明中使用的核酸探針，可以是一般用作探針的長度。例如核酸探針的長度可從約3個(gè)堿基長到約1000個(gè)堿基長，優(yōu)選從10～200個(gè)堿基長。
本發(fā)明中使用的基體，可以是為與標(biāo)記的序列進(jìn)行雜交可固定核酸探針的基體。這種基體的實(shí)例，例如可以是非多孔性、硬質(zhì)或半硬質(zhì)的材質(zhì)，可以是具有坑、溝或平表面的板狀，也可以是由球體和立方體等立體形狀構(gòu)成的形態(tài)?；w并不限于這些，也可以用硅、玻璃等含氧化硅的基質(zhì)材料，及聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚碳酸酯等塑料和聚合物等進(jìn)行制造。然而，也可以不使用基體，如下述將電極自身用作基體。
為進(jìn)行熒光檢測的核酸探針固定化基體時(shí)，對于上述任何基體，可借助間隔基固定核酸探針。為進(jìn)行電化檢測的核酸探針固定化基體時(shí)，可以在上述任何基體上配置可進(jìn)行電化學(xué)檢測的電極，再將核酸探針固定在該電極上。
本發(fā)明中可使用的電極，沒有特殊限定，但可舉出，例如石墨、精碳、熱解石墨、碳糊、碳纖維一類的碳電極、鉑、鉑黑、金、鈀、銠一類的貴金屬電極、氧化鈦、氧化錫、氧化錳、氧化鉛一類的氧化物電極、Si、Ge、ZnO、CdS、TiO2、GaAs一類的半導(dǎo)體電極、鈦等。這些電極可用導(dǎo)電性高分子被覆，也可用單分子膜被覆，根據(jù)要求還可用其他表面處理劑進(jìn)行處理。
借助間隔基對核酸探針的固定，可利用其自身公知的任何方法進(jìn)行。例如也可以將間隔基對電極進(jìn)行固定，之后，再對間隔基固定核酸探針?；蛘咭部梢灶A(yù)先使間隔基與核酸探針結(jié)合，再通過該間隔基固定在電極上。或者也可以利用其自身公知的方法，在電極上使核酸探針與間隔基進(jìn)行合成。借助間隔基對核酸探針的固定，對于處理或沒有處理的基體或電極表面也可以通過共有結(jié)合、離子結(jié)合或物理吸附等直接固定該間隔基?；蛘咭部梢越柚g隔基，使用磷酸二氫鉀劑邦助核酸探針固定，也可以利用這樣的磷酸二氫鉀劑，借助于間隔基，對基板或電極固定核酸探針。為防止試料核酸對電極的非特異結(jié)合，也可使封閉劑和磷酸二氫鉀劑一起對電極進(jìn)行處理。此處使用的磷酸二氫鉀劑和封閉劑，例如可以是有利于進(jìn)行電化學(xué)檢測的物質(zhì)。
具有不同堿基的序列的核酸探針，也可分別借助間隔基對不同的電極進(jìn)行固定，在混合具有不同堿基基序列的多種核酸探針的狀態(tài)下，也可借助間隔基對電極進(jìn)行固定。
5.檢測根據(jù)本發(fā)明的核酸探針固定化基體，作為用于檢測固定在上述基體上核酸探針和標(biāo)記的核酸之間存在雜交反應(yīng)結(jié)果生成的二個(gè)鏈的方法，可利用電化學(xué)方法和熒光檢檢測法。
(1)電化學(xué)檢測利用電化學(xué)對二個(gè)鏈核酸的檢測，例如可用其自身公知的二個(gè)鏈識別物質(zhì)進(jìn)行。
此處使用的二個(gè)鏈識別體，沒有特殊限定，例如可使用ヘキスト33258、吖啶橙、喹吖因、道諸霉素、金屬嵌入劑、二吖啶等雙嵌入劑、三嵌入劑和多嵌入劑等。也可用電化學(xué)活性的金屬絡(luò)合物，例如二茂鐵、生物原等對這些嵌入劑進(jìn)行修飾。其他公知的任何二個(gè)鏈的識別物質(zhì)也可用于本發(fā)明。
在按照本發(fā)明的核酸探針固定化基體中，借助于間隔基將核酸探針固定在電極上。使用這種電極的二個(gè)鏈核酸的檢測，和其他一般的電化學(xué)檢測法相同，進(jìn)而也可使用配極和參照極。配置參照極時(shí)，例如可使用銀/氯化銀電極和汞/氯化汞電極等一般的參照電極。
例如在檢測試料核酸中是否含有標(biāo)記的核酸時(shí)，可進(jìn)行如下試驗(yàn)。例如從包括人在內(nèi)的動物等個(gè)體、組織或細(xì)胞等對象中采取的試料，提取核酸成分作為試料核酸。得到的試料核酸，根據(jù)需要進(jìn)行逆復(fù)制、延伸、擴(kuò)增和/或酶處理等處理。將前處理的試料核酸與固定在核酸探針固定化基體上的核酸探針接觸，在可適宜雜交的條件下進(jìn)行反應(yīng)。這種適宜條件，本技術(shù)領(lǐng)域人員可根據(jù)如下諸條件作適當(dāng)選擇，即，標(biāo)記的序列中所含堿基的種類、核酸探針固定化基體上具有的間隔基和核酸探針的種類、試料核酸的種類以及它們的狀態(tài)等。并不限定于這些，例如也可在如下條件下進(jìn)行反應(yīng)。
即，雜交反應(yīng)溶液，在離子強(qiáng)度為0.01～5的范圍、pH5～10的范圍的緩沖液中進(jìn)行。在這種溶液中，也可添加雜交促進(jìn)劑的硫酸葡聚糖、鮭魚精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性劑等。向其中添加得到的試料核酸，90℃以上進(jìn)行熱變性。向熱變性的試料核酸插入核酸探針固定化基體，可在剛變性后或急冷到0℃后進(jìn)行。還有，可向基體上滴加液進(jìn)行雜交反應(yīng)。
反應(yīng)中用攪拌、或振蕩等操作，可提高反應(yīng)速度。反應(yīng)溫度，例如在10℃～90℃的范圍，反應(yīng)時(shí)間可進(jìn)行1分鐘以上到1夜。雜交反應(yīng)后，洗凈電極。洗凈，例如可使用離子強(qiáng)度0.01～5的范圍，pH5～10的范圍的緩沖液。試料核酸中存在含標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸時(shí)，與核酸探針進(jìn)行雜交，由此生成二個(gè)鏈核酸。
接著，利用電化學(xué)方法，按以下順序檢測生成的二個(gè)鏈核酸。一般是在雜交反應(yīng)后，洗凈基體，使二個(gè)鏈識別體作用于電極表面形成的二個(gè)鏈部分，以電化學(xué)測定由此產(chǎn)生的信號。
二個(gè)鏈識別體的濃度，隨其種類不同，一般使用范圍為1ng/ml～1mg/ml。此時(shí)可使用的緩沖液，離子強(qiáng)度0.01～5的范圍，pH5～10的范圍。
例如電化學(xué)的測定可以是施加使二個(gè)鏈識別體進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)電位以上的電壓，測定來自二個(gè)鏈識別體的反應(yīng)電流值。這時(shí)，電壓以定速掃描，或以脈沖施加，或施加定電壓。測定時(shí)，例如使用恒電位計(jì)、數(shù)字萬用表和函數(shù)發(fā)生器等裝置，可控制電流、電壓。例如可根據(jù)得到的電流值，從檢量線算出標(biāo)記的核酸的濃度。
其自身公知的電化學(xué)檢測方法，例如以下文獻(xiàn)中公開的(Hashimoto et al.1994，Wang et al.1998)方法等，也可適用于本發(fā)明的方法中。該文獻(xiàn)中橋本等人報(bào)導(dǎo)了使用由DNA探針修飾的金電極和電化學(xué)活性色素檢測序列特異的基因。來自色素的陽極電流與標(biāo)記的DNA的濃度相關(guān)。王等人報(bào)導(dǎo)了無指示劑的電化學(xué)DNA的雜交。這種生物傳感器的構(gòu)成包括向碳糊電極固定肌苷置換探針(不含烏嘌呤)，和利用該標(biāo)識的烏嘌呤氧化峰的存在檢測二重鏈形成的定時(shí)電位。這些文獻(xiàn)中記載的檢測方法也可在本發(fā)明中使用。
(2)熒光檢測法在使用熒光標(biāo)識物質(zhì)的方法中，試料核酸可用以下物質(zhì)標(biāo)識，即，F(xiàn)ITC、Cy3、Cy5或羅丹明等熒光色素、或生物素、半抗原、氧化酶或磷脂酶等酶、或者二茂鐵或苯醌類等電化學(xué)活性物質(zhì)?；蛘呤褂糜蒙鲜鑫镔|(zhì)標(biāo)識的第二探針進(jìn)行檢測。也可同時(shí)使用多種標(biāo)識物質(zhì)。
在幾種形態(tài)中，從試料物質(zhì)提取的核酸成分和固定在探針固定化切片上的探針的雜交反應(yīng)，例如可按如下進(jìn)行。即，雜交反應(yīng)溶液，在離子強(qiáng)度0.01～5的范圍、pH5～10的范圍的緩沖液進(jìn)行。在該溶液中還可添加雜交促進(jìn)劑的硫酸葡聚糖、及鮭魚精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性劑等。向其中添加提取的核酸成分，在90℃以上進(jìn)行熱變性。插入探針固定化切片，可在剛變性后或急冷到0℃后進(jìn)行。也可將液體滴加在基體上進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)中可進(jìn)行攪拌或振蕩等作業(yè)，以提高反應(yīng)速度。反應(yīng)溫度，例如10～90℃的范圍，反應(yīng)時(shí)間，可進(jìn)行1分鐘以上到一夜。雜交反應(yīng)后，進(jìn)行洗凈。洗凈時(shí)，例如使用離子強(qiáng)度0.01～5的范圍、pH5～10的范圍的緩沖液。
熒光檢測時(shí)，檢測雜交反應(yīng)，可根據(jù)標(biāo)識的種類，使用適宜的檢測裝置，通過檢測試料中標(biāo)識的堿基基序列或2次探針中的標(biāo)識進(jìn)行。標(biāo)識為熒光物質(zhì)時(shí)，例如使用熒光檢測器，檢測標(biāo)識。
使用上述的本發(fā)明核酸探針檢測任何標(biāo)記的核酸或標(biāo)記的序列存在的方法，也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
特別是使用為獲得上述X和Y的關(guān)系的引物對試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與根據(jù)本發(fā)明形態(tài)在核酸探針固定化基體上固定的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)，通過檢測生成的雜交，通過檢測標(biāo)記的核酸的存在，可更有效地獲得雜交效率。這樣的方法也包含在本發(fā)明中。在這樣的方法中可使用的擴(kuò)增，例如是聚合酶連鎖反應(yīng)(一般稱為PCR，以下記作PCR)等的擴(kuò)增，也可是使用逆復(fù)制酶的逆復(fù)制擴(kuò)增等的逆復(fù)制PCR，此外，還包括任何自身公知的擴(kuò)增。
根據(jù)本發(fā)明的形態(tài)可使用的擴(kuò)增，例如是Nucleic acid strandamplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primerinitiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)、Rolling circle amplication(RCA)法等擴(kuò)增法。
根據(jù)本發(fā)明形態(tài)的核酸解析方法，可利用在實(shí)施樣品中所含檢體核酸的解析，例如通過標(biāo)記的序列存在的檢測和定量、基因發(fā)現(xiàn)的出現(xiàn)消失等的發(fā)現(xiàn)解析、染色體組中單堿基多型(Single Nucleotide Polymorphism，即，SNP)和微附屬序列等的多型解析、與病患相關(guān)基因的解析而對病患診斷和并發(fā)癥危險(xiǎn)率的預(yù)測、感染存在的檢測、病毒型解析、以及毒性試驗(yàn)等場合。因此，可應(yīng)用于臨床診斷和并發(fā)癥預(yù)測等各種臨床的目的。例如可廣泛應(yīng)用于食品的檢測、檢疫、藥品檢查、法醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、漁業(yè)及林業(yè)等各種基礎(chǔ)的研究和應(yīng)用研究等中。
實(shí)施例以下對本發(fā)明核酸檢測方法的實(shí)施例進(jìn)行說明。
本實(shí)施例是研究核酸探針的間隔基長度(X)與標(biāo)記的核酸中從核酸探針結(jié)合部位到該基體側(cè)末端的長度(Y)之間的關(guān)系，和雜交效率的關(guān)系。
(1)核酸探針和標(biāo)記的核酸的關(guān)系本實(shí)施例中使用的核酸探針和標(biāo)記的核酸的關(guān)系示于圖4。以下講述標(biāo)記的核酸與核酸探針的詳細(xì)序列，但開始對它們的大概構(gòu)成和相關(guān)性進(jìn)行說明。
圖4是同時(shí)以20堿基的標(biāo)記的序列及與標(biāo)記的序列互補(bǔ)序列作為基準(zhǔn)，一同繪制核酸探針C-0、核酸探針C-10、核酸探針C-20及核酸探針C-30、和標(biāo)記的核酸70-0、標(biāo)記的核酸70-20及標(biāo)記的核酸70-40的圖。
此處使用的核酸探針為4種。與核酸探針的標(biāo)記的序列互補(bǔ)的序列是20堿基，在圖4中相當(dāng)于斜線所示部分。
核酸探針C-0，在其5′末端上不付與間隔基。
核酸探針C-10，在其5′末端上付與由10堿基構(gòu)成的間隔基X1。
核酸探針C-20，在其5′末端上付與由20堿基構(gòu)成的間隔基X2。
核酸探針C-30，在其5′末端上不付與由30堿基構(gòu)成的間隔基X3。這些4種核酸探針，關(guān)于除間隔基外都是相等的。這些核酸探針，任何一個(gè)都是以5′端固定在基體上。
此處使用的標(biāo)記的核酸為3種。這3種具有標(biāo)記的核酸的標(biāo)記的序列，是長度相等為20堿基。圖4中，標(biāo)記的序列相當(dāng)于網(wǎng)狀部分。3種標(biāo)記的核酸中所含標(biāo)記的序列的堿基基序列相等。
標(biāo)記的核酸70-0，全長為70堿基的核酸，在其3′端存在20堿基的標(biāo)記的序列。
標(biāo)記的核酸70-20，全長為70堿基的核酸，在標(biāo)記的序列的5′側(cè)存在30堿基，標(biāo)記的序列3′側(cè)存在20堿基的序列Y1。
標(biāo)記的核酸70-40，全長為70堿基的核酸，在標(biāo)記的序列5′側(cè)存在10堿基，標(biāo)記的序列3′側(cè)存在40堿基的序列Y2。
(2)核酸探針與核酸探針?biāo)瑯?biāo)記的序列互補(bǔ)的序列為20堿基。核酸探針C-0、C-10、C-20、C-30，是在上述20堿基的核酸探針序列5′末端上，分別以0堿基、10堿基、20堿基和30堿基作為間隔基加成上C(即，胞嘧啶)的探針。序列如下。
C-05′-SH-TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列號1)C-105′-SH-(C10)TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列號2)C-205′-SH-(C20)TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列號3)C-305′-SH-(C30)TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列號4)上述4種探針，即，在C-0、C-10、C-20和C-30的5′末端上由硫醇基修飾的。核酸探針C-0、C-10、C-20、C-30的X，分別是0堿基、10堿基、20堿基和30堿基。
(3)標(biāo)記的核酸另一方面，作為標(biāo)記的核酸的模型，對上述20堿基的序列含有互補(bǔ)的序列，準(zhǔn)備70堿基的低核苷酸。這種低核苷酸，從探針結(jié)合部位的末端到3′末端的長度，為0堿基20堿基、40堿基的3種。各個(gè)序列如下所示。
標(biāo)記的核酸70-0(序列號5)5′CTATAAACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)標(biāo)記的核酸70-20(序列號6)5′CTATAAACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAA(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)CAAATGGGACCGTGCATTGC標(biāo)記的核酸70-40(序列號7)5′CTATAAACAT(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)
GCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC用括號“()”括著的序列是探針結(jié)合部位，5′末端上標(biāo)識熒光色素。這些標(biāo)記的核酸序列號5、序列號6和序列號7的Y分別為0堿基、20堿基、和40堿基。
(4)核酸探針的固定化本實(shí)施例中，作為基體使用金基板。將金基板分別在含有核酸探針C-0、C-10、C-20和C-30的緩沖液中浸漬，在室溫靜置1小時(shí)。之后，用蒸餾水洗，干燥，制作成核酸探針固定化金基板。
(5)標(biāo)記的核酸的雜交將分別含3種標(biāo)記的核酸的緩沖液，在95℃延續(xù)5分鐘進(jìn)行熱變性。之后，在冰水中急冷，形成標(biāo)記的核酸溶液。將固定了各核酸探針的核酸探針固定化金基板浸漬在該標(biāo)記的核酸溶液中。將其在35℃靜置1小時(shí)。之后，將上述核酸探針固定化金基板，在不含任何核酸的緩沖液中浸漬，在35℃靜置1小時(shí)進(jìn)行洗凈。
(6)雜交的標(biāo)記的核酸檢測通過檢測來自在標(biāo)記的核酸5′末端修飾的熒光色素的熒光強(qiáng)度，可對該固定化的核酸探針，檢測出雜交的標(biāo)記的核酸的存在。
(7)結(jié)果(i)使用標(biāo)記的核酸70-0的情況使用標(biāo)記的核酸70-0時(shí)的結(jié)果示于圖6。標(biāo)記的核酸70-0和核酸探針C-0、C-10、C-20和C-30結(jié)合形式模式地示于圖6A。任何核酸探針時(shí)都是X≥Y。這時(shí)，如圖6B所示，從檢測出的熒光強(qiáng)度，可知各個(gè)核酸探針C-0、核酸探針C-10、核酸探針C-20、核酸探針C-30、與雜交標(biāo)記的核酸70-0的量大致相等。
(ii)使用標(biāo)記的核酸70-20的情況使用標(biāo)記的核酸70-20時(shí)的結(jié)果示于圖7。標(biāo)記的核酸70-20和核酸探針C-0、C-10、C-20和C-30結(jié)合形式模式地示于圖7A。在核酸探針C-0和C-10中，X＜Y，在核酸探針C-20中，X＝Y(jié)，在核酸探針C-30中，X＞Y。
此時(shí)，檢測的熒光強(qiáng)度，如圖7B所示，核酸探針依賴于間隔基的長度而增強(qiáng)。同樣，依賴于間隔基的長度，標(biāo)記的核酸70-20的雜交量增加，使用含有與從核酸探針結(jié)合部位到標(biāo)記的核酸3′末端的堿基數(shù)相同的胞嘧啶20堿基(即，C20)間隔基的核酸探針時(shí)，達(dá)到最大，與使用含其以上堿基間隔基時(shí)比較大致相等(圖7B)。
(iii)使用標(biāo)記的核酸70-40的情況作為標(biāo)記的核酸使用標(biāo)記的核酸70-40時(shí)，標(biāo)記的核酸70-20和核酸探針C-0、C-10、C-20和C-30結(jié)合的形式模式地示于圖8A。任何核酸探針時(shí)都是X＜Y。此時(shí)，與各核酸探針雜交的標(biāo)記的核酸，任何一種情況都大致相同，雜交效率降低(圖8B)。
(iv)總結(jié)從以上結(jié)果可以確認(rèn)，在將核酸探針與固定載體結(jié)合時(shí)使用的間隔基長度(X)，和對于上述核酸探針與其一部分上含有標(biāo)記的序列標(biāo)記的核酸進(jìn)行雜交時(shí)，從該雜交部位的基體側(cè)末端到上述標(biāo)記的核酸的基體側(cè)末端的長度(Y)之間成立X≥Y的關(guān)系時(shí)，可提高雜交效率。通過提高雜交效率，可以更高精度檢測標(biāo)記的核酸的存在。
(8)通過使用了引物的試料核酸擴(kuò)增的調(diào)節(jié)1根據(jù)本發(fā)明的又一形態(tài)、是基于上述本發(fā)明的形態(tài)，在使核酸探針固定化基體和試料核酸反應(yīng)之前，提供具備使用可獲得最好標(biāo)記的核酸的核酸探針擴(kuò)增試料核酸的工序的方法。這樣的核酸探針在用標(biāo)記的序列使標(biāo)記的核酸與核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，可以是用于擴(kuò)增試料核酸的引物，上述標(biāo)記的核酸的末端位于從該標(biāo)記的序列部位的基體側(cè)末端部到約40堿基以內(nèi)，優(yōu)選26堿基～12堿基以內(nèi)。
圖9是表示本發(fā)明另一形態(tài)的擴(kuò)增片段和核酸探針的關(guān)系圖。此處示出了檢測人類染色體組中MxA基因的體系。圖9中示出了序列號8的核酸探針和兩種PCR產(chǎn)物。序列號8的核酸探針具有20堿基的間隔基部分(圖中，記作“Spacer-20”。PCR產(chǎn)物A(以下記作“A”)，用以將5′末端生物素化的序列號9的堿基基序列示出的引物，和以cy5標(biāo)識的序列號10的堿基基序列示出的引物，進(jìn)行制作。PCR產(chǎn)物B(以下記作“B”)，用以將5′末端生物素化的序列號11的堿基基序列示出的引物，和以cy5標(biāo)識的序列號12的堿基基序列示出的引物，進(jìn)行制作。用卵白素標(biāo)識磁微粒子進(jìn)行一個(gè)鏈的調(diào)制。圖9中，A是離核酸探針結(jié)合部位末端的距離為12堿基(圖中記作“12mer”)，B是26堿基(“26mer”)。使用這種靶子進(jìn)行雜交反應(yīng)，測定熒光強(qiáng)度。結(jié)果示出A是B約10倍的熒光強(qiáng)度(圖10)。
B約在1小時(shí)內(nèi)反應(yīng)達(dá)到飽和，與其相反，A約在10分鐘反應(yīng)達(dá)到飽和。研究SNP檢測的特異性，結(jié)果是在A、B之間，S/N約形成2倍差異。
(9)通過使用了引物的試料核酸擴(kuò)增的調(diào)節(jié)2圖11是表示根據(jù)本發(fā)明另一形態(tài)的擴(kuò)增片段與探針關(guān)系圖。圖11中示出為確定人類染色體組中MBL基因的多型進(jìn)行擴(kuò)增所得擴(kuò)增產(chǎn)物和核酸探針實(shí)例的結(jié)果。圖11中示出以序列號13的堿基基序列表示的核酸探針和三種PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物C(以下記作“C”)，用以5′末端磷酸化的序列號14堿基基序列表示的引物、和以cy5標(biāo)識的序列號15堿基基序列表示的引物進(jìn)行制作。PCR產(chǎn)物D(以下記作“D”)，用以5′末端磷酸化的序列號16堿基基序列表示的引物、和以cy5標(biāo)識的序列號15堿基基序列表示的引物進(jìn)行制作。PCR產(chǎn)物E(以下記作“E”)，用以5′末端磷酸化的序列號18堿基基序列表示的引物、和以cy5標(biāo)識的序列號17堿基基序列表示的引物進(jìn)行制作。進(jìn)而使用離PCR產(chǎn)物的核酸探針結(jié)合部位末端的距離達(dá)到40堿基的引物。使用λ核酸酶進(jìn)行一個(gè)鏈的調(diào)制。圖11所示PCR的各產(chǎn)物，C離探針結(jié)合部位末端的距離為13堿基(圖中記作“13mer”)，D為33堿基(圖中記作“33mer”)、E為48堿基(圖中記作“48mer”)。雖然沒有圖示，但也可以獲得離探針結(jié)合部位末端的距離達(dá)到40堿基的PCR產(chǎn)物。用這些靶子測定進(jìn)行雜交反應(yīng)的熒光強(qiáng)度。結(jié)果是，C是D約6倍、E的約40倍熒光強(qiáng)度(圖12)。
圖13示出了使用電化學(xué)方法的MBL檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果。與各個(gè)靶子進(jìn)行雜交反應(yīng)后，進(jìn)行ヘキスト33258的電流測定。結(jié)果是，靶子C是D的約3倍、E的約10倍以上的電流值。
從以上結(jié)果可知，從核酸探針結(jié)合部位的中心40堿基以上引物的3′末端位于離開的部位時(shí)，雜交效率大幅度降低。也見到了特異性降低的現(xiàn)象，為了以高速、高選擇性、高感度進(jìn)行核酸檢測，最重要的是使用位于離核酸探針結(jié)合部位中心40堿基以內(nèi)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。
根據(jù)上述的本發(fā)明，提供了一種檢測感度和特異性高的檢測核酸序列的方法以及該方法中使用的引物。
本技術(shù)領(lǐng)域中的人員還可能更容易地發(fā)現(xiàn)其他優(yōu)點(diǎn)和變更。因此，從更廣范圍看，本發(fā)明并不限于此處所示的詳細(xì)說明和典型的形態(tài)。因此，根據(jù)附上的權(quán)利要求范圍及其等同物，可作的種種變更，很明顯都不會脫離整個(gè)發(fā)明的思想精神或范圍。
序列表<110>株式會社 東芝高橋匡慶岡田純橋本幸二<120>核酸探針固定化基體和用其檢測標(biāo)記的核酸存在的方法<130>02S1022P<150>JP 2002-218644<151>2002-7-26<160>18<210>1<211>19<212>DNA<213>E.Coli<400>1TGGACGAAGA CTGACGCTC 19<210>2<211>29<212>DNA<213>人工合成<400>2CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC29<210>3<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>3CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 39
<210>4<211>45<212>DNA<213>人工合成<400>4CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 45<210>5<211>70<212>DNA<213>人工合成<400>5CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC CGTGCATTGC GAGCGTCAGT 60CTTCGTCCAG 70<210>6<211>70<212>DNA<213>人工合成<400>6CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG CAAATGGGAC 60CGTGCATTGC 70<210>7<211>70<212>DNA<213>人工合成<400>7CTATAAACAT GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC 60CGTGCATTGC 70<210>8<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>8CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GTTTCTGCTC CCGGA 35
<210>9<211>20<212>DNA<213>人類<400>9GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC 20<210>10<211>22<212>DNA<213>人類<400>10GGCCTCCGCT CTCGCTTCGC CT 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人類<400>11AGGTGCGGGG CCAGGAGCTA GG 22<210>12<211>20<212>DNA<213>人類<400>12TCCGCTCTCG CTTCGCCTCT 20<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>13CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CTTGGTGTCA TCACG35<210>14<211>20<212>DNA
<213>人類<400>14CCCCCTTTTC TCCCTTGGTG 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人類<400>15TGTGAGGATG CCCAAAAGAC 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人類<400>16AGCCCAACAC GTACCTGGTT 9<210>17<211>20<212>DNA<213>人類<400>17TTGCCTGTAG CTCTCCAGGC 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人類<400>18TTGCAGAGAC AGAACAGCCC 20
權(quán)利要求
1.核酸探針固定化基體，具有基體、和借助間隔基固定在上述基體上并含有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的堿基基序列的核酸探針，其特征是上述間隔基是如下的間隔基，即，將其長度取為X，在其一部分含有上述標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸對上述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，從該雜交部位的基體側(cè)末端到上述標(biāo)記的核酸的基體側(cè)末端的長度取為Y時(shí)，X≥Y的關(guān)系成立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述X和Y的關(guān)系是X≥Y，而且Y≥10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述X和Y的關(guān)系是X≥Y，且Y≥10，且X-10?！軾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述X和Y的關(guān)系是X≥Y，且Y≥10，且X-10≥Y，且200?！軽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述X和Y的關(guān)系是X≥Y，且Y≥10，且X-10?！軾，且200?！軽，且X≥100。
6.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述X和Y的關(guān)系是X≥Y，且Y≥10，且X-10?！軾，且100?！軽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述X和Y的關(guān)系是X≥Y，10≥Y。
8.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述間隔基是有機(jī)鏈狀分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述間隔基是從核酸、乙二醇和烷烴構(gòu)成的群中選出。
10.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述基體具有可進(jìn)行電化學(xué)檢測的電極，該核酸探針錯(cuò)助間隔基固定在上述電極上。
11.根據(jù)權(quán)利要求8記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述基體具有可進(jìn)行電化學(xué)檢測的電極，該核酸探針借助間隔基固定在上述電極上。
12.根據(jù)權(quán)利要求9記載的核酸探針固定化基體，其特征是上述基體具有可進(jìn)行電化學(xué)檢測的電極，該核酸探針借助間隔基固定在上述電極上。
13.利用權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體檢測標(biāo)記的核酸存在的方法，其特征是包括以下工序，即，使用選擇的引物，使上述X和Y的X≥Y關(guān)系成立，對試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序、在獲得適宜雜交的條件下，使上述由擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與權(quán)利要求1記載的在核酸探針固定化基體上固定的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)的工序、和通過檢測由上述反應(yīng)工序生成的雜交，判斷試料核酸中存在標(biāo)記的核酸的工序。
14.利用權(quán)利要求8記載的核酸探針固定化基體檢測標(biāo)記的核酸存在的方法，其特征是包括以下工序，即，使用選擇的引物，使上述X和Y的X≥Y關(guān)系成立，對試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序、在獲得適宜雜交的條件下，使上述由擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與權(quán)利要求8記載的在核酸探針固定化基體上固定的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)的工序、和通過檢測由上述反應(yīng)工序生成的雜交，判斷試料核酸中標(biāo)記的核酸存在的工序。
15.使用權(quán)利要求9記載的核酸探針固定化基體檢測存在標(biāo)記的核酸的方法，其特征是包括以下工序，即，使用選擇的引物，使上述X和Y的X≥Y關(guān)系成立，將試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序、在獲得適宜雜交的條件下，使上述由擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與權(quán)利要求9記載的核酸探針固定化基體上固定的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)的工序、和通過檢測由上述反應(yīng)工序生成的雜交，判斷試料核酸中存在標(biāo)記的核酸的工序。
16.利用權(quán)利要求10記載的核酸探針固定化基體檢測標(biāo)記的核酸存在的方法，其特征是包括以下工序，即，使用選擇的引物，使上述X和Y的X≥Y關(guān)系成立，將試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序、在獲得適宜雜交的條件下，使上述由擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與權(quán)利要求10記載的核酸探針固定化基體上固定的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)的工序、和通過檢測由上述反應(yīng)工序生成的雜交，判斷試料核酸中存在標(biāo)記的核酸的工序。
17.檢測存在標(biāo)記的核酸的方法，使用具有基體和固定在該基體上并含有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)序列的核酸探針的核酸探針固定化基體，檢測存在含有該標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸，包括如下(a)用標(biāo)記的序列使該標(biāo)記的核酸與上述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，準(zhǔn)備用于擴(kuò)增該標(biāo)記的核酸的引物，使上述標(biāo)記的核酸的末端位于從該標(biāo)記的序列部位的基體側(cè)末端部分到40堿基以內(nèi)，(b)使用上述(a)中準(zhǔn)備的引物，對試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增、(c)將上述(b)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物形成一個(gè)鏈、(d)使上述(c)中得到的一個(gè)鏈與上述核酸探針進(jìn)行反應(yīng)、(e)通過檢測上述(d)中生成的雜交，檢測出該試料核酸中存在標(biāo)記的核酸。
18.檢測存在標(biāo)記的核酸的方法，使用權(quán)利要求1記載的核酸探針固定化基體，檢測存在含有該標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸，包括以下(a)用標(biāo)記的序列使該標(biāo)記的核酸與上述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，準(zhǔn)備用于擴(kuò)增該標(biāo)記的核酸的引物，使上述標(biāo)記的核酸的末端位于從該標(biāo)記的序列部位的基體側(cè)末端部分到40堿基以內(nèi)，(b)使用上述(a)中準(zhǔn)備的引物將試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增、(c)將上述(b)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物形成一個(gè)鏈、(d)將上述(c)中得到的一個(gè)鏈與上述核酸探針進(jìn)行反應(yīng)、(e)通過檢測上述(d)中生成的雜交，檢測出該試料核酸中存在標(biāo)記的核酸。
19.檢測存在標(biāo)記的核酸的方法，使用權(quán)利要求8記載的核酸探針固定化基體，檢測存在含有該標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸，包括如下(a)在用標(biāo)記的序列使該標(biāo)記的核酸與上述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，準(zhǔn)備用于擴(kuò)增該標(biāo)記的核酸的引物，使上述標(biāo)記的核酸的末端位于從該標(biāo)記的序列部位的基體側(cè)末端部分到40堿基以內(nèi)，(b)使用上述(a)中準(zhǔn)備的引物將試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增、(c)將上述(b)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物形成一個(gè)鏈、(d)將上述(c)中得到的一個(gè)鏈與上述核酸探針進(jìn)行反應(yīng)、(e)通過檢測上述(d)中生成的雜交，檢測出該試料核酸中存在標(biāo)記的核酸。
20.檢測標(biāo)記的核酸存在的方法，使用權(quán)利要求10記載的核酸探針固定化基體，檢測存在含有該標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸，包括如下(a)在用標(biāo)記的序列使該標(biāo)記的核酸與上述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)，準(zhǔn)備用于擴(kuò)增該標(biāo)記的核酸的引物，使上述標(biāo)記的核酸的末端位于從該標(biāo)記的序列部位的基體側(cè)末端部分到40堿基以內(nèi)，(b)用上述(a)中準(zhǔn)備的引物將試料核酸進(jìn)行擴(kuò)增、(c)將上述(b)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物形成一個(gè)鏈、(d)將上述(c)中得到的一個(gè)鏈與上述核酸探針進(jìn)行反應(yīng)、(e)通過檢測上述(d)中生成的雜交，檢測出該試料核酸中存在標(biāo)記的核酸。
全文摘要
核酸探針固定化基體，具有基體、和借助間隔基固定在上述基體上并含有與標(biāo)記的序列互補(bǔ)的堿基基序列的核酸探針，其特征是，上述間隔基是如下的間隔基，即，將其長度取為X，在其一部分含有上述標(biāo)記的序列的標(biāo)記的核酸與上述核酸探針雜交時(shí)，從該雜交部位的基體側(cè)末端到上述標(biāo)記的核酸的基體側(cè)末端的長度取為Y時(shí)，X≥Y的關(guān)系成立。
文檔編號C12Q1/68GK1531593SQ0280013
公開日2004年9月22日 申請日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者高橋匡慶, 岡田純, 橋本幸二, 二 申請人:株式會社東芝