專利名稱：靶物質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工業(yè)，更具體的說，是賦予原本不會(huì)利用甲醇的微生物能夠利用甲醇的能力，或者將甲醇利用能力低的微生物的甲醇利用能力提高的技術(shù)，以及用上述技術(shù)所獲得的微生物利用甲醇生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的物質(zhì)包括通常由微生物產(chǎn)生的L氨基酸，核酸，抗生素，維生素，生長因子，生理活性因子等等。
甲醇易溶于水，價(jià)廉，能以高純度獲得。而且可以比較簡單地從天然氣的主要成分甲烷制得。所以甲醇就成為了物質(zhì)生產(chǎn)中很具吸引力的原料。如果將甲醇作為微生物發(fā)酵的原料，不僅主要原料的成本可以降低，而且發(fā)酵液中產(chǎn)品的純化和廢液處理過程都可以得到簡化。所以，可以降低總生產(chǎn)成本。
作為以甲醇為原料利用微生物生產(chǎn)物質(zhì)，特別是氨基酸的方法，已知的有利用無色細(xì)菌(Achromobacter)屬或假單胞菌(Pseudomonas)屬的微生物的方法(Japanese Patent Publication(Kokoku)No.45-25273)，利用精朊桿菌屬(Protaminobacer)或甲烷單胞菌屬(Methanomonas)微生物的方法(JapanesePatent Laid-open Publication(kokai)No.50-25790)，利用甲基芽孢桿菌屬(Methylobacillus)微生物的方法(Japanese Patent Laid-open Publication(Kokai)No.4-91793)，利用屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的甲基營養(yǎng)菌的方法(JapanesePatent Laid-opean Publication No.3-505284，U.S.Patent No.6,083,728)等等。但是，所有這些細(xì)菌菌株都不能作為高產(chǎn)氨基酸的實(shí)用菌株。
同時(shí)，利用短芽孢桿菌屬(Brevibacterium)，棒桿菌屬(Corynebacterium)，芽孢桿菌屬(Bacillus)或者埃希氏菌屬(Escherichia)構(gòu)成了從葡萄糖生產(chǎn)氨基酸的方法中的主流(“Amino Acid Fermentation”，Ed.by H.Aida et al.GakkaiShuppan Center)。為獲得氨基酸的最大產(chǎn)量，這些氨基酸生產(chǎn)菌株是從其被發(fā)現(xiàn)開始，在長期的育種實(shí)踐中通過引入大量的突變而培育出的寶貴菌株。但是，這些工業(yè)菌株是不能利用甲醇的微生物。
為達(dá)到前述目的，本發(fā)明者進(jìn)行了潛心研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過向微生物中導(dǎo)入甲醇脫氫酶基因并且提高微生物己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖異構(gòu)酶(phosphohexuloisomerase)的活性，就可以賦予微生物利用甲醇的能力，或提高微生物利用甲醇的能力。這樣，就完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供下述(1)一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生靶物質(zhì)能力的微生物，以產(chǎn)生并在培養(yǎng)基中或微生物細(xì)胞中積累靶物質(zhì)，再從培養(yǎng)基或微生物細(xì)胞中收集靶物質(zhì)，所述的微生物中引入了甲醇脫氫酶基因并且經(jīng)修飾使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性得以提高，進(jìn)而被賦予或提高了利用甲醇的能力，培養(yǎng)基中含有甲醇作為碳源。
(2)根據(jù)(1)的方法，其中靶物質(zhì)是L-氨基酸。
(3)根據(jù)(2)的方法，其中L-氨基酸是L-賴氨酸。
(4)根據(jù)(3)的方法，其中微生物是芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌。
(5)一種導(dǎo)入了甲醇脫氫酶基因的微生物，其中該微生物經(jīng)修飾使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖異構(gòu)酶(phosphohexuloisomerase)得以提高，從而被賦予或提高了利用甲醇的能力。
(6)根據(jù)(5)的微生物，其為革蘭氏陽性細(xì)菌。
(7)根據(jù)(6)的微生物，其為芽孢桿菌屬細(xì)菌。
(8)根據(jù)(7)的微生物，其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
根據(jù)本發(fā)明，可以賦予原本不能利用甲醇的微生物利用甲醇的能力，或者使利用甲醇能力較低的微生物該能力得以提高，這樣，就可以提供一種微生物，其可以利用廉價(jià)的甲醇作為碳源或微生物可以利用的能源。更進(jìn)一步，利用所獲的微生物，可以在加入了甲醇的培養(yǎng)基中獲得從甲醇產(chǎn)生的各種發(fā)酵產(chǎn)物。
本發(fā)明的微生物是導(dǎo)入了甲醇脫氫酶基因的微生物，并且經(jīng)過修飾使其中的己酮糖磷酸合成酶口磷酸己酮糖異構(gòu)酶的活性得以提高，并賦予或提高了利用甲醇的能力。盡管用于構(gòu)建本發(fā)明微生物的親本菌株可以是原本甲醇利用能力很微弱的微生物，但是優(yōu)選使用原本利用糖而不能利用甲醇的微生物。
可以利用甲醇的微生物具有甲醇氧化酶(如甲醇脫氫酶)，并且其通過精確的代謝調(diào)節(jié)而異化或同化由甲醇氧化而產(chǎn)生的甲醛。這是因?yàn)榧兹τ谟袡C(jī)體的毒性更大，所以細(xì)胞必須快速地將其作為碳源或能源而利用掉，或通過解毒而處理掉。所以，如果要賦予不能利用甲醇的微生物利用甲醇的能力，當(dāng)然必需導(dǎo)入甲醇氧化酶。但是，適當(dāng)處理由于甲醇氧化酶活性表達(dá)而產(chǎn)生的甲醛的特異性方法很少，所以人們認(rèn)為不可能賦予任意微生物利用甲醇的能力。
但是，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)如果使一種具有甲醇氧化能力的酶存在于微生物的細(xì)胞中，并且使該微生物的己酮糖磷酸合成酶活性以及磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性提高，則可以賦予原本不能利用甲醇的微生物利用甲醇的能力。
本發(fā)明所用的微生物沒有特別限制，只要能夠賦予本發(fā)明的微生物前述的屬性特征，可以特別提及的有芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，埃希氏菌屬細(xì)菌(Escherichia)如大腸桿菌(Escherichia coli)，棒狀細(xì)菌如乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacteriumglutamicum))，沙雷氏菌屬(Serratia)細(xì)菌如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)等等。其中，優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)菌，特別是芽孢桿菌屬細(xì)菌。
特別地，當(dāng)L-蘇氨酸作為發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)，需要提及大腸桿菌VKPM B-3996(RIA 1867，參見U.S.Patent No.5,175,107)，嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynbacteriumacetoacidophilum)AJ12318(FERM BP-1172，參見U.S.Patent No.5,188,949)等；同樣，當(dāng)L-賴氨酸作為發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)，要提及的是枯草芽孢桿菌AJ11779(FERMP-18453)，枯草芽孢桿菌AJ13291(FERMP-6722，參見Japanese PatentLaid-open Publication No.59-63193)，大腸桿菌AJ11442(NRRL B-12185，F(xiàn)ERMBP-1543，參見US.Patent No.4,346,170)，大腸桿菌W3110(tyrA)(該菌株可通過從大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERMBP-3653)中去除質(zhì)粒pHATerm而獲得，參見International Patent Publication WO95/16042)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12435 (FERM BP-2294，U.S.Patent No.5,304,476)，乳發(fā)酵短桿菌AJ3990(ATCC 31269，參見US.Patent No.4,066,501)等；當(dāng)L-谷氨酸作為發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)要提及的是，大腸桿菌AJ12624 FERM BP-3853，參見French Patent Laid-openPublication No.2,680,178)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12821(FERM BP-4172，JapanesePatent Laid-open Publication No.5-26811，F(xiàn)rench Patent Laid-open PublicationNo.2,701,489)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12475(FERM BP-2922，參見U.S.Patent No.5,272,067)，乳發(fā)酵短桿菌AJ13029(FERM BP-5189，參見International PatentPublication JP95/01586)等；當(dāng)L-亮氨酸作為發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)要提及的是，大腸桿菌AJ11478(FERM P-5274，參見Japanese Patent Publication No.62-34397)，乳發(fā)酵短桿菌AJ3718(FERM P-2516，參見U.S.Patent No.3,970,519)等；當(dāng)L-異亮氨酸時(shí)要提及的是，大腸桿菌KX141(VKPM B-4781，參見EuropeanPatent Laid-open Publication No.519,113)，黃色短芽孢桿菌AJ12149(FERMBP-749，參見U.S.Patent No.4,656,135)等；當(dāng)L-纈氨酸時(shí)要提及的是，大腸桿菌VL1970(VKPM B-4411，參見European Patent Laid-open Publication No.519,113)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12341(FERM BP-1763，參見U.S.Patent No.5,188,948)等；當(dāng)L-苯丙氨酸時(shí)要提及的是，枯草芽孢桿菌AJ12000(FERMP-6895，參見Japanese Patent Laid-open Publication No.59-143596)，大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579，參見Japanese Patent Laid-open Publication No.5-236947，European Patent Laid-open Publication No.488,424)，乳發(fā)酵短桿菌AJ12637(FERM BP-4160，參見French Patent Laid-open Publication No.2,686,898)等；當(dāng)L-色氨酸時(shí)要提及的是，枯草芽孢桿菌AJ11488(FERM P-5290，參見Japanese Patent No.1426798)，大腸桿菌KB862(DSM7196，參見European Patent No.662,143)等等。
仔細(xì)研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明者設(shè)想在細(xì)胞中使甲醇脫氫酶活性的充分發(fā)揮，并提高同化由酶反應(yīng)而產(chǎn)生的甲醛的能力，作為基本條件賦予利用甲醇的能力。本發(fā)明的發(fā)明者還進(jìn)一步設(shè)想提高核酮糖單磷酸途徑的關(guān)鍵酶己酮糖磷酸合成酶(HPS)和磷酸己酮糖異構(gòu)酶(PHI)的酶活性，對于有效的同化甲醛很有作用。這樣，他們發(fā)現(xiàn)通過向原本不能利用甲醇的微生物中導(dǎo)入甲醇脫氫酶基因并且提高HPS和PHI的活性，賦予該微生物利用甲醇的能力。
本發(fā)明所用的甲醇脫氫酶(MDH)是具有可氧化甲醇使之轉(zhuǎn)化為甲醛的酶活性的酶。例如，PQQ(pyrroloquinolinequinone)依賴型MDH，其主要見于革蘭氏陰性微生物，可作為用于本發(fā)明的MDH。特別要提及的是，扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)AMl菌株的MDH(Biochim.Biophys.Acta，111997-106(1992))等。進(jìn)一步的，見于革蘭氏陽性微生物的NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)依賴型MDH，特別要提及的是甲醇芽孢桿菌(Bacillusmethanoliocus)的MDH(J.Bacteriol.，1745346-5353(1992))，來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)DSM 2334菌株的醇脫氫酶(ADH)(Biochem.J.，252661-666)等。此外可提到的是，牛肝臟(Biochem.J.，10034-46(1996))和人肝臟(Arch.Toxico1.，72604-607(1998))的ADH。進(jìn)一步的，可通過向原本不對甲醇起作用的醇脫氫酶基因中引入突變來修飾其底物特異性，從而新創(chuàng)造出明顯對甲醇也起作用的突變型醇脫氫酶，并進(jìn)行了使用。但是，作為本發(fā)明適用的MDH，可以特別提及的是來自例如，短芽孢桿菌(Bacillus brevis)NCIMB No.12524，該菌株是屬于芽孢桿菌屬的甲醇同化細(xì)菌。
編碼MDH(mdh)的基因可以通過常規(guī)的基因克隆方法由產(chǎn)生MDH的微生物獲得。例如，MDH基因可通過使用短芽孢桿菌S1菌株(NCIMB 12524)染色體DNA作為模板，以具有SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))而制得。用于基因克隆，雜交，PCR，質(zhì)粒DNA的制備，DNA的消化和連接，轉(zhuǎn)化等所用的染色體DNA文庫的制備方法在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1.21(1989)中描述。另外，導(dǎo)入了MDH基因的微生物中該基因是否具有功能可以通過測定微生物的溶菌產(chǎn)物中MDH活性而確定?？赏ㄟ^例如，通過測定340nm波長下光吸收測定伴隨甲醇氧化成甲醛過程中NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的還原來測定MDH的活性。
作為本發(fā)明所用的mdh基因的一個(gè)特別實(shí)施例可提到的是，短芽孢桿菌S1菌株的mdh基因。甲醇芽孢桿菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株的mdh基因(NCIMB13114，Em.J.Biochem.，244426-433(1997))已經(jīng)登記在GenBank，其登記號(hào)為M65004(BACMDH的登錄號(hào))。
另外，還有報(bào)道，存在激活甲醇脫氫酶活性的因子(Amd甲醇脫氫酶激活劑)。例如，存在甲醇芽孢桿菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株的甲醇脫氫酶(Eur.J.Biochem.，244426-433(1997))和枯草芽孢桿菌168菌株的YqkG基因產(chǎn)物的激活劑(Japanese Patent Laid-open Publication No.2000-69976)。使用這些都是提高M(jìn)DH活性的有效方法。通過向含有MDH基因的微生物中導(dǎo)入編碼這些MDH激活劑中任一種的DNA，可以提高這些微生物細(xì)胞中MDH活性。編碼Amd(amd)的基因，如YqkG基因可以利用枯草芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌168菌株的染色體DNA作為模板，具有序列表中SEQ ID NO10和11所示核苷酸序列作為引物，通過PCR獲得。
作為本發(fā)明所用yqkG的特別實(shí)施例，應(yīng)該提及枯草芽孢桿菌168菌株的YqkG基因。該基因的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO14和15所示。
提高微生物HPS和PHI活性的方法將在下述說明。
為在靶微生物中增強(qiáng)HPS或PHI的活性，可以將編碼HPS(hps)或PHI(phi)的基因與在靶微生物中具有功能的載體，優(yōu)選多拷貝型載體相連接，而制備得到重組DNA，并將其導(dǎo)入靶微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從而，增加該轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)胞中hps或phi基因的拷貝數(shù)，結(jié)果，這兩個(gè)酶中之一的酶活性得以增強(qiáng)。
象MDH基因一樣，所述的hps或phi基因可采用常規(guī)的基因克隆方法從生產(chǎn)HPS或PHI的微生物中得到。
作為生產(chǎn)HPS的微生物，已知莢膜甲基球菌(Methylomonas capsulatus)(J.R.Quayle，Methods in Enzemology，188，p.314，1990)，甲基單胞菌M15菌株(Methods in Enzymology，188，p.319，1990)，Methylomonas aminofaciens77a菌株(Biochim.Biophys.Acta.，523，p.236，1978)，胃分枝桿菌(Mycobacteriumgastri)MB19(Methods in Enzymology，188，p.393，1990)，甲醇醋桿菌(Acetobacter methanolicus)MB58(Methods in Enzymology，188，p.401，1990)等等。進(jìn)一步的，作為生產(chǎn)PHI的微生物，已知Methylomonas aminofaciens 77a菌株(Agric.Biol.Chem.，41(7)，p1133，1977)，革蘭氏陽性兼性甲醇同化細(xì)菌的胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)(Japanese Patent Laid-open PublicationNo.11-127869)等。進(jìn)一步，已報(bào)道了枯草芽孢桿菌的hps和phi基因(J.Bacteriol.，1817145-7160(1999))。而且，還有報(bào)道說在短芽孢桿菌S1菌株中，該菌株是屬于芽孢桿菌屬的甲醇同化細(xì)菌，hps基因和phi基因是串聯(lián)在DNA染色體上(Annual Meeting of the Society for Fermentation andBioengineering Japan，Lecture Abstracts，p.113(2000))。含有hps和phi基因的DNA片段可利用該菌株的染色體DNA作為模板，具有SEQ ID NO12和13所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，通過PCR制備。
作為本發(fā)明所用hps基因和phi基因的一個(gè)特別實(shí)施例，應(yīng)該提及枯草芽孢桿菌168菌株的hps基因和phi基因。含有短芽孢桿菌S1菌株的hps基因和phi基因的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO16所示。該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NOS17和18所示。
甲醇芽孢桿菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株(NCIMB 13114)和短芽孢桿菌S1菌株(NCIMB 12524)可以從國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(National Collections of Industrial and Marine Bacteria)，地址NCIMB Lts.，TorryResearch Station135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)獲得。
HPS的活性可以通過Methods in Enzymology，188，397401(1990)中所描述的方法進(jìn)行測定。進(jìn)一步的，PHI活性可通過Journal of Bacteriology，181，p.7154-7160(1999)中所描述的方法測定。
也可以通過向靶微生物的染色體DNA中導(dǎo)入多拷貝的hps基因或phi基因?qū)崿F(xiàn)HPS或PHI活性的增強(qiáng)。為向靶微生物的染色體DNA中導(dǎo)入多拷貝hps基因或phi基因，可用染色體DNA中以多拷貝存在的序列作為靶位進(jìn)行同源重組。對于在染色體DNA中以多拷貝存在的序列，可以使用重復(fù)DNA或存在于轉(zhuǎn)座元件末端的倒轉(zhuǎn)重復(fù)。進(jìn)一步的，如在Japanese Patent Laid-openPublication No.2-109985中所公開的，還可以將hps基因或phi基因整合到轉(zhuǎn)座子中，并允許其轉(zhuǎn)移，將所述的多拷貝基因?qū)氲饺旧wDNA中。根據(jù)這些方法中的任一種，都可以使轉(zhuǎn)化株中hps基因或phi基因的拷貝數(shù)增多，從而使HPS或PHI活性增強(qiáng)。
除基于前述的基因擴(kuò)增方法之外，還可通過替換表達(dá)調(diào)節(jié)序列使HPS或PHI活性的增強(qiáng)，如用更強(qiáng)的啟動(dòng)子替代hps基因或phi基因的啟動(dòng)子(參見Japanese Patent Laid-open Publication No.1-215280)。例如，lac啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，trc啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子，λ噬菌體的PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子，tet啟動(dòng)子，amyE啟動(dòng)子，veg啟動(dòng)子等等已知的強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的替換提高了hps基因或phi基因的表達(dá)，從而使HPS或PHI活性。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的增強(qiáng)可與HPS或PHI的拷貝數(shù)量的增加相結(jié)合。
本發(fā)明所用mdh，hps，phi和amd基因并不限于野生型基因，可以是突變體或編碼基因產(chǎn)物的人工修飾基因，這些修飾包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸在一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的替換，缺失，插入，添加或倒轉(zhuǎn)，只要被編碼的MDH，HPS，PHI或Amd蛋白功能不退化即可。盡管“幾個(gè)”所表示的氨基酸的數(shù)目在此根據(jù)氨基酸在蛋白的三維結(jié)構(gòu)中位置或類型的不同而不同，但可以是2-20個(gè)，優(yōu)選2-10個(gè)，更優(yōu)選2-5個(gè)。
編碼實(shí)質(zhì)上與前述Amd蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是能與包含SEQ ID NO16的1-555位的核苷酸的序列，或由該核苷酸制備的探針在嚴(yán)緊條件下雜交，并且編碼具有Amd類似活性的蛋白的DNA。
進(jìn)一步，作為編碼實(shí)質(zhì)上與HPS蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是可以與包含SEQ ID NO16 508-1140位核苷酸的序列或由該核苷酸序列產(chǎn)生的探針在嚴(yán)緊條件下雜交的，且編碼具有HPS類似活性的蛋白的DNA。
進(jìn)一步，作為編碼實(shí)質(zhì)上與PHI蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是可以與包含SEQ ID NO16 1149-1700位核苷酸的序列，或由該核苷酸產(chǎn)生的探針在嚴(yán)緊條件下雜交的，且編碼具有HPI類似活性的蛋白的DNA。
進(jìn)一步，作為編碼實(shí)質(zhì)上與MDH蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是可以與GenBank中登記的號(hào)碼為M65004(BACMDH的登錄號(hào))的核苷酸序列或由該核苷酸產(chǎn)生的探針在嚴(yán)緊條件下雜交的，編碼具有MDH類似活性的蛋白的DNA。
前述“嚴(yán)緊條件下”是指一種條件，在該條件下，所謂的特異性雜交進(jìn)行而非特異性雜交不能進(jìn)行。使用任何數(shù)值很難清楚的表達(dá)這個(gè)條件。但是，嚴(yán)緊條件可通過舉例說明，例如某條件，在該條件下，具有高同源性如50％或更高的DNA相互之間雜交，但是同源性低于上述的DNA則不能互相雜交?？蛇x擇的，嚴(yán)緊條件還可以通過舉例說明，在某條件下，DNA可以在鹽濃度相應(yīng)于通常的Southern雜交洗滌條件下相互雜交，該條件即60℃，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS。
為向微生物中導(dǎo)入上述制備的各種基因，可利用已知的方法，例如對于大腸桿菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，可用氯化鈣處理受體細(xì)胞以提高DNA的滲透率的方法，對于枯草芽孢桿菌，可從生長期的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞，再將DNA導(dǎo)入其中的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F(xiàn). E.Gene，1，153(1997))。除此之外，還可以先將DNA-受體細(xì)胞制成易于吸收DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，然后再將重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞，已知其可用于枯草芽孢桿菌，放線菌或酵母(Chang，S.andChoen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。另外還可以使用電穿孔方法(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))?？梢愿鶕?jù)所用受體的細(xì)胞從這些方法中選擇出合適的方法。
本發(fā)明所用微生物，根據(jù)靶物質(zhì)的不同類型，可以提高靶物質(zhì)的生物合成中相關(guān)的酶活性。另外還可以減少或消除不利于靶物質(zhì)生產(chǎn)的酶活性。
當(dāng)所需的mdh，hps，phi基因和amd基因?qū)胛⑸飼r(shí)，這些基因的導(dǎo)入順序并沒有特別限制。進(jìn)一步的，本發(fā)明的微生物可以通過導(dǎo)入這些基因到能夠產(chǎn)生靶物質(zhì)的微生物中而得到，或者通過賦予導(dǎo)入了這些基因的微生物產(chǎn)生靶物質(zhì)的能力而得到。
使用甲醇產(chǎn)生靶物質(zhì)可以通過下述方式進(jìn)行，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述得到的本發(fā)明微生物，使其生產(chǎn)并在培養(yǎng)基或微生物的細(xì)胞中累積靶物質(zhì)，再從培養(yǎng)基中或微生物中收集靶物質(zhì)。
本發(fā)明的方法適用的靶物質(zhì)包括，例如，甲醇代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，和使用甲醇代謝產(chǎn)生的能量而產(chǎn)生的物質(zhì)。特別該提及的是例如，氨基酸如谷氨酸，賴氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸和色氨酸，維生素如維生素C，大分子物質(zhì)如各種酶等。
本發(fā)明所用術(shù)語“產(chǎn)生靶物質(zhì)的能力”指本發(fā)明的微生物在在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能夠產(chǎn)生并在培養(yǎng)基或微生物細(xì)胞中積累靶物質(zhì)至可從中收集該靶物質(zhì)的量。
盡管本發(fā)明的培養(yǎng)方法中所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可跟據(jù)所用微生物的類型而進(jìn)行合適的選擇，通?？墒褂煤械矗瑹o機(jī)離子和其它所需的痕量有機(jī)營養(yǎng)素的常規(guī)培養(yǎng)基。
使用甲醇作為碳源。與甲醇一起，可以使用的糖如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖和淀粉水解物，醇如甘油和山梨醇，或有機(jī)酸如延胡索酸，檸檬酸和琥珀酸。
作為氮源，可以使用無機(jī)銨鹽如硫酸銨，氯化銨和磷酸銨，有機(jī)氮如大豆蛋白水解物，氨氣，液體氨等。
作為無機(jī)離子或其來源，加入少量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等等。作為痕量的有機(jī)營養(yǎng)素，需要加入合適數(shù)量的所需物質(zhì)如L-高絲氨酸和維生素B1，酵母提取物等等。
培養(yǎng)優(yōu)選在適于所用微生物的條件下進(jìn)行。通常，培養(yǎng)優(yōu)選在有氧條件下進(jìn)行16-72小時(shí)。培養(yǎng)溫度優(yōu)選控制在20℃到45℃，培養(yǎng)中pH優(yōu)選控制在5-8.5。無機(jī)或有機(jī)，酸或堿性物質(zhì)以及氨氣等等可用作調(diào)節(jié)PH。如果使用嗜熱細(xì)菌作為宿主，可以在42℃到60℃的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)。
培養(yǎng)結(jié)束后從培養(yǎng)基中收集代謝產(chǎn)物，本發(fā)明不需要任何特別的方法。即是說，可通過結(jié)合各種公知的技術(shù)來進(jìn)行，如使用離子交換樹脂的方法，沉淀和其它技術(shù)。另外，與使用農(nóng)業(yè)產(chǎn)品來源的糖相比當(dāng)使用甲醇作為碳源時(shí)，靶物質(zhì)的純化和廢液的處理過程可以簡化。
所用的DNA引物為MDH-BM-1(SEQ ID NO1)和MDH-BM-2(SEQ IDNO2)。其通過參見已知的甲醇芽孢桿菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株的MDH基因核苷酸序列制備(登記在GenBank中，登記號(hào)M65004，BACMDH的登錄名)。使用LA-Taq(Takara Shuzo)進(jìn)行PCR，94℃ 90秒，98℃反應(yīng)10秒，55℃30秒，70℃4分鐘，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，然后再在72℃孵育10分鐘。通過這些反應(yīng)得到所期望長度的DNA片段。該DNA片段被純化后克隆到可商購的載體pCR2.1中，得到pCR-mdh24-1。
為向枯草芽孢桿菌染色體中導(dǎo)入含于前述的pCR-mdh24-1中的mdh基因，將mdh基因摻入到用于將該基因?qū)氲饺旧w的載體，質(zhì)粒pDLT3中。pDLT3質(zhì)粒的制備是通過常規(guī)DNA重組技術(shù)，將靶基因?qū)氲娇莶菅挎邨U菌染色體amyE位點(diǎn)，其全部核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
pDLT3按下述制備(

圖1)。首先，為去除pMUTIN3中l(wèi)acZ基因片段(MolecularMicrobiology中描述，29(1)，179-187(1998))，用限制性酶ClaI和Bpu1102I消化質(zhì)粒。然后消化的末端用Klenow酶處理成平頭末端，然后較大的DNA片段使用T4連接酶自連。然后，pDLd(Molecular Microbiology中描述，29(2)，505-513(1998))也類似的由限制性酶消化，分離出較大的DNA片段(Tth11I-BamHI)。含有l(wèi)acI和spac啟動(dòng)子的質(zhì)粒Tth11I-BamHI DNA片段與上述較大的DNA片段連接來構(gòu)建pDLT3。
以常規(guī)手段，用限制性酶BamHI和EcoRI處理質(zhì)粒pDLT3，制備較大DNA片段。分別地，用限制性酶BamHI和EcoRI以同樣手段類似地處理PCR-mdh24-1來制備含有mdh基因的DNA片段。使用T4連接酶連接這兩個(gè)DNA片段來構(gòu)建質(zhì)粒Pdlt-MD11，其中mdh基因被并入到pDLT3的amyE基因的第一個(gè)半?yún)^(qū)和第二個(gè)半?yún)^(qū)之間。
所獲的環(huán)狀質(zhì)粒，pDLT-MD11和pDLT3，通過用限制性酶Bst1107I處理而線性化，然后將這些質(zhì)粒通過常規(guī)方式分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株。選擇具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化株。由于每種情況都可以得到很多氯霉素抗性株，因此僅從每種情況中選出6個(gè)克隆，然后研究是否只有mah基因或載體如所預(yù)期導(dǎo)入了染色體的amyE位點(diǎn)。通過菌落PCR來證實(shí)是否線性化的mdh基因通過兩次重組過程而被導(dǎo)入。所用的DNA引物是N1，N2，N3，C1，C2，和C3(按該順序分別是SEQ ID NOS4，5，6，7，8和9)。根據(jù)PCR擴(kuò)增的DNA片段的分析結(jié)果，選擇了AM101菌株，其具有摻入到所期望區(qū)域的mdh基因結(jié)構(gòu)。另一方面，選出摻入了載體區(qū)域的菌株作為對照菌株，并命名為DT101菌株。
然后，使用DT101菌株作為對照測定AM101菌株中表達(dá)的MDH活性。兩種菌株都接種到30ml含有5μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中并在30℃培養(yǎng)約16小時(shí)。離心培養(yǎng)的肉湯(10,000g，10分鐘)來收集沉淀的細(xì)胞，然后在0.8ml懸浮緩沖液中重懸細(xì)胞(組份每10ml中5ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.6)，1mml 50mM硫酸鎂，0.1ml 0.2M二硫蘇糖醇，3.3ml 60％蔗糖和0.6ml無菌水)，并維持懸液溫度在低于4℃的溫度下，超聲波破碎細(xì)胞。然后在4℃離心(17000g，10分鐘)去除懸浮液中的固體，制備細(xì)胞提取物。
按下述測定MDH酶活性。首先，將0.9ml反應(yīng)緩沖液(每20ml中10ml0.1M甘油/氫氧化鉀(pH9.5)，2ml 50mM硫酸鎂，0.1ml 0.2M二硫蘇糖醇，0.5ml40mM NAD，7.4ml無菌水)加入到1.5-ml體積的石英比色杯中，將比色杯置于分光光度計(jì)中。分光計(jì)中，反應(yīng)混合物的孵育溫度控制在47℃ 3分鐘。然后，50μl所述方法制備的細(xì)胞提取物加入到反應(yīng)混合物中并充分?jǐn)嚢?。同時(shí)，在340nm下，開始測定反應(yīng)混合物的光吸收，在340nm下NADH具有最大的光吸收，來研究不存在甲醇的條件下光吸收的變化。進(jìn)一步的，約60秒后，向反應(yīng)混合物中加入50μl甲醇并充分?jǐn)嚢?，然后觀察并記錄340nm下光吸收的增加，即產(chǎn)生的NADH。當(dāng)使用對照菌株DT101的細(xì)胞提取物時(shí)，未觀察到MDH引起的340nm光吸收增加。但是，當(dāng)使用菌株AM101的細(xì)胞提取物時(shí)，在340nm下觀察到依賴于甲醇加入量的光吸收增加，并且被證實(shí)MDH應(yīng)該存在于該菌株中。這樣，發(fā)現(xiàn)摻入到枯草芽孢桿菌染色體中的的mdh基因編碼可以顯示出酶活性的MDH酶。NAD和NADH分別代表氧化型和還原型的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。實(shí)施例2mdh摻入到枯草芽孢桿菌L-賴氨酸產(chǎn)生菌株的染色體中被修飾為能夠產(chǎn)生L-賴氨酸的枯草芽孢桿菌AJ11779菌株是JapanesePatent Laid-open Pubication No.5 8-149689中描述的一個(gè)菌株。通過賦予該生物對由AEC引起的生長抑制的抗性而賦予其L-賴氨酸生產(chǎn)能力，AEC是賴氨酸類似化合物和蘇氨酸。該菌株于2001年9月9日保藏在獨(dú)立管理機(jī)構(gòu)，國立高級(jí)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，國際專利生物保藏(independent administrativeinstitution，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，Intemational Patent Organism Depoisitory)(地址郵編305-5466，Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，其登記號(hào)為FERM P-18453。然后，該保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約下，在2002年8月19日改為國際保藏，登記號(hào)為FERM BP-8155。
計(jì)劃將實(shí)施例1中描述的mdh基因摻入到AJ11779菌株染色體中amyE位點(diǎn)。首先，環(huán)狀質(zhì)粒pDLT-MD11用限制性酶Bst1107I處理而線性化，再通過常規(guī)手段轉(zhuǎn)化到AJ11779菌株中。選擇具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化株。
由于可以得到許多氯霉素抗性菌株，從中選擇2或更多菌落，按與實(shí)施例1中相同的方式選擇出在染色體amyE位點(diǎn)摻入了mdh基因的菌株。所獲菌株命名為L-217M1菌株。
從該L-217M1菌株制備細(xì)胞提取物并按與實(shí)施例1相同的方式測定MDH活性。結(jié)果可以檢測到MDH的活性。實(shí)施例3編碼來源于枯草芽孢桿菌的MDH激活劑基因的克隆已知存在來源于芽孢桿菌屬的甲醇-同化細(xì)菌的NAD依賴型甲醇脫氫酶的酶活性激活因子。Japanese Patent Laid-open Publication No.2000-69976(OP884)公開了一種存在于枯草芽孢桿菌中的這類因子。該因子被命名為Amd(甲醇脫氫酶激活劑)。
編碼Amd(amd)的基因通過已知方法從枯草芽孢桿菌中克隆出來。特別地，該克隆按下述進(jìn)行。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌168菌株，從所獲的細(xì)胞中用常規(guī)方法提取染色體DNA(Biochem.Biophys.Acta.，72，619-629(1963))。該染色體DNA在PCR中用作模板，用可使靶DNA片段兩端具有EcoRI限制性酶位點(diǎn)(SEQ ID NO10和11)的寡核苷酸來擴(kuò)增含有靶基因amd的DNA片段。擴(kuò)增的步驟為在98℃變性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，該過程重復(fù)30個(gè)循環(huán)。所用的酶是Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)，依據(jù)使用說明進(jìn)行使用。
通過苯酚/氯仿處理并用乙醇沉淀來純化擴(kuò)增的DNA片段，然后再用限制性酶EcoRI消化，來制備在兩端都具有EcoRI位點(diǎn)的amd片段。另外，用限制性酶EcoRI對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的穿梭載體pHY300PLK(TakaraShuzo)，進(jìn)行類似的處理。使用堿性磷酸酶去除末端的磷酸基團(tuán)后，與前述amd片段相連。用上述連接反應(yīng)混合物根據(jù)操作手冊轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo)的感受態(tài)細(xì)胞，選出幾個(gè)四環(huán)素抗性菌落。
從這些菌落中提取質(zhì)粒DNA并分析其結(jié)構(gòu)。然后，含有，與載體上的四環(huán)素抗性基因相同以及相反方向存在的amd基因的質(zhì)粒分別命名為pHY-A2和pHY-A1，用于下述實(shí)驗(yàn)。
提高M(jìn)DH活性的Amd活性按下述測定。如實(shí)施例1中構(gòu)建的摻入了mdh基因的枯草芽孢桿菌AM101菌株通過常規(guī)方法用pHY-A2和pHY-A1以及pHY300PLK轉(zhuǎn)化，后者為載體質(zhì)粒。然后按下述從每個(gè)轉(zhuǎn)化株中制備細(xì)胞提取物。
每個(gè)轉(zhuǎn)化株在30ml含有5μg/ml氯霉素和10μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)約16小時(shí)。離心(在10,000g，10分鐘)每個(gè)培養(yǎng)液收集沉淀的細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮于0.8ml懸浮液(每10ml中含5ml 0.1M磷酸緩沖液(pH7.6)，1ml 50mM硫酸鎂，0.1ml 0.2M二硫蘇糖醇，3.3ml 60％蔗糖和0.6ml無菌水)，并維持懸浮溫度在低于4℃的溫度下，超聲波破碎細(xì)胞來制備細(xì)胞提取物。
按下述方法測定Amd提高的MDH酶活性。0.9ml體積的反應(yīng)緩沖液(每20ml中10ml 0.1M甘油/氫氧化鉀(pH9.5)，2ml 50mM硫酸鎂，0.1ml 0.2M二硫蘇糖醇，0.5ml 40mM NAD，7.4ml無菌水)，在石英比色杯中37℃孵育3分鐘。然后，50μl上述制備的細(xì)胞提取物加入到反應(yīng)混合物中并攪拌。同時(shí)，在340nm下，開始反應(yīng)混合物的光吸收的時(shí)程測定，在340nm下NADH具有最大的光吸收，記錄340m下光吸收的變化，該變化與甲醇的加入無關(guān)。約60秒后，向反應(yīng)混合物中加入50μl甲醇并攪拌，然后研究340nm下光吸收的增加，即產(chǎn)生的NADH。結(jié)果顯示，與使用導(dǎo)入了pHY300PLK的菌株細(xì)胞提取物的情況下所觀察到MDH引起的340nm光吸收增加率相比，使用導(dǎo)入了pHY-A1的菌株細(xì)胞提取物時(shí)，在340nm下光吸收增加率基本沒有變化，而使用導(dǎo)入了pHY-A2的菌株時(shí)，觀察到5倍的NADH產(chǎn)生率。這樣，證實(shí)pHY-A2編碼的Amd基因確實(shí)具有提高M(jìn)DH活性的活性。實(shí)施例4來源于芽孢桿菌屬的甲醇-同化細(xì)菌的hps基因和phi基因的克隆按與前述相同的方法從短芽孢桿菌S1菌株中制備染色體DNA，該菌株為芽孢桿菌屬的甲醇同化細(xì)菌。該染色體DNA用作PCR擴(kuò)增靶DNA區(qū)域的模板。PCR所用的寡核苷酸序列(SEQ ID NOS12和13)能夠在擴(kuò)增后的DNA片段的兩端引入HindIII限制性酶位點(diǎn)。PCR條件與上述所用的相同。然后，所獲的DNA片段用常規(guī)方法純化再用限制性酶HindIII處理以制備在兩端都具有HindIII消化末端的靶DNA。
另外，用限制性酶HindIII處理pHY300PLK，再用堿性磷酸酶處理并與前述DNA片段用T4連接酶(Takara Shuzo)連接。按與前述相同的方法將其用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，獲得了許多四環(huán)素抗性菌落。從中選出幾個(gè)菌落，研究其中含有的質(zhì)粒，選出一個(gè)其中與載體中四環(huán)素抗性基因相同方向存在靶基因，hps基因和phi基因的質(zhì)粒。該質(zhì)粒被命名為pHY-H4。
然后，實(shí)施例1中提及的AM101菌株通過常規(guī)方法分別用上述構(gòu)建的pHY-H4和用于構(gòu)建pHY-H4的載體pHY300PLK轉(zhuǎn)化，制備轉(zhuǎn)化株，pHY-H4/AM101菌株和pHY300PLK/AM101菌株。選出每個(gè)菌株的菌落，在5ml含有10μg/ml四環(huán)素和5μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中孵育并在30℃培養(yǎng)約16小時(shí)。然后將0.1ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到5ml新鮮的含有與上述相同抗生素的LB培養(yǎng)基中并進(jìn)一步在37℃培養(yǎng)8小時(shí)。離心該培養(yǎng)液(10,000g，10分鐘)收集細(xì)胞。
所獲的細(xì)胞懸浮于0.9ml懸浮液(每10ml組份5ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.6)，0.3ml 0.1M氯化鎂，50μl 0.2M二硫蘇糖醇，無菌水補(bǔ)足到10ml)，維持溫度在4℃超聲波破碎細(xì)胞并在4℃離心(20000g10分鐘)收集上清部分來制備細(xì)胞提取物。然后，按下述測定每種提取物中HPS活性和PHI活性。
0.9ml體積的反應(yīng)液(組份在下述顯示)在石英比色杯中47℃孵育3分鐘。然后，50μl上述制備的細(xì)胞提取物加入到反應(yīng)混合物中并充分?jǐn)嚢?。同時(shí)，在340nm下，開始反應(yīng)混合物的光吸收的時(shí)程測定，在340nm下NADH具有最大的光吸收。加入細(xì)胞提取物60秒后，向反應(yīng)混合物中加入50μl 1M甲醛液體溶液并充分?jǐn)嚢?，然后記?40nm下反應(yīng)混合物光吸收的增加，即產(chǎn)生的NADH。當(dāng)使用對照菌株，含有pHY300PLK的AM101的細(xì)胞提取物時(shí)，基本上沒有觀察到由于甲醛的加入所引起的340nm下光吸收的增加，而當(dāng)使用含有pHY-H4的菌株時(shí)，觀察到光吸收的快速增加。這說明pHY-H4上克隆的hps基因和phi基因都能在大腸桿菌中表達(dá)酶活性而最終從甲醛產(chǎn)生果糖6-磷酸和核酮糖5-磷酸。這樣，證實(shí)了hps基因和phi基因已被克隆。
表1反應(yīng)緩沖液組成0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.6) 5ml0.1M氯化鎂 0.5ml0.1M核糖5-磷酸 0.5ml10mM NADH 2.5ml磷酸核糖異構(gòu)酶 30μl磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(phosphoglucoisomerase) 20μl葡萄糖6-磷酸脫氫酶 20μl無菌水 0.5ml總計(jì)9.07ml實(shí)施例5含有hps，phi和amd的質(zhì)粒的構(gòu)建實(shí)施例3和4產(chǎn)生的質(zhì)粒pHY-A2和pHY-H4都經(jīng)過兩種限制性酶BglII和EcoT22I處理。從pHY-A2中制備得到一個(gè)較小的含有amd基因的DNA片段。另一方面，用常規(guī)方法從pHY-H4制備得到一個(gè)較大的含有hps和phi基因的DNA片段并用T4連接酶將其與amd基因片段連接。
用上述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株的感受態(tài)細(xì)胞。使用四環(huán)素抗性作為標(biāo)記選出轉(zhuǎn)化株。從瓊脂平板上的幾十個(gè)菌落中，任意選出6個(gè)菌落，并分析其中所含質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實(shí)了所有的質(zhì)粒都具有期望的結(jié)構(gòu)，即在pHY300PKL載體中含有3種基因amd，hps和phi。該質(zhì)粒被命名為pHY-A2H4。實(shí)施例6賦予了甲醇利用能力的枯草芽孢桿菌菌株的制備以及甲醇利用能力的測定實(shí)施例2中構(gòu)建的L-217M1菌株在30℃在含有5μl/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜。將0.1ml體積的培養(yǎng)液加入到5ml含有5μl/ml氯霉素的CI培養(yǎng)基(組份如下所示)中并攪拌，然后在37℃振蕩培養(yǎng)。以合適的間隔測定(660nm)培養(yǎng)液的光吸收，當(dāng)光吸收值超過1之后60分鐘，離心培養(yǎng)液(3000g，10分鐘)收集細(xì)胞。
然后，在10ml CII培養(yǎng)基(含有5μg/ml氯霉素，組份如下所示)中懸浮收集的細(xì)胞，并在含有CII培養(yǎng)基的該培養(yǎng)液中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)40分鐘。然后，提取500μl該培養(yǎng)液并加入1μg pHY-A2H4，然后在37℃振蕩培養(yǎng)90分鐘。將該培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種在含有5μg/ml氯霉素以及10μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，細(xì)胞在37℃培養(yǎng)過夜作為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物來選擇對兩種抗生素都顯示出抗性的菌落。其中之一為pHY-A2H4/L-217M1菌株。
該pHY-A2H4/L-217M1菌株被命名為AJ13855，并于2001年8月2日保藏在獨(dú)立管理機(jī)構(gòu)，國立高級(jí)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，國際專利生物保藏，(independent administrative institution，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，International Patent Organism Depository)(保藏號(hào)305-5466，Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并獲登錄號(hào)FERM P-18447。然后，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2002年8月19日改為國際保藏并獲得登錄號(hào)FERMBP-8154。
5ml體積的CI培養(yǎng)基按下述制備。首先，向2.5ml 2×A液(K2HPO42.8％，KH2PO41.2％，(NH4)2SO40.4％)中加入5μl痕量元素溶液(每100mlCaCl20.55g，ZnCl20.17g，CuCl2·2H2O0.043g，CoCl2·6H2O0.06g，NaMoO4·2H2O0.06g)，1μl FeCl3溶液和1μl MnSO4溶液，混合，然后加入2.5ml 2×B液(MgSO4·7H2O10Mm，葡萄糖1％)，50μl 5％(w/v)酵母提取物，10μl 10％(w/v)酪蛋白氨基酸，50μl 5mg/ml L-色氨酸溶液，50μl 5mg/ml L-甲硫氨酸溶液和50μl 2.5mg/ml胸腺嘧啶溶液。K2HPO4和KH2PO4可購自Nakarai Tesque，(NH4)2SO4，MnSO4·7H2O和葡萄糖可購自Junsei Chemical，酵母提取物和酪蛋白氨基酸可購自DIFCO。CaCl2，ZnCl2，CuCl2·2H2O，CoCl2·6H2O，和NaMoO4·2H2O可購自Wako Pure Chemical Industries。
10ml體積的CII培養(yǎng)基按下述制備。首先，向5ml 2×A液中加入10μl痕量元素溶液，2μl FeCl3溶液和2μl MnSO4溶液，混合。然后加入5μl2×B液，10μl5％(w/v)酵母提取物，10μl 10％(w/v)酪蛋白氨基酸，10μl 5mg/ml L-色氨酸溶液，10μl 5mg/ml L-甲硫氨酸溶液和10μl 2.5mg/ml胸腺嘧啶溶液。
然后，使用穩(wěn)定的同位素13C標(biāo)記甲醇來檢測構(gòu)建的AJ13855(pHY-A2H4/L-217M1)菌株是否能夠利用甲醇。在30℃，含有5μg/ml氯霉素和10μg/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)AJ13855菌株過夜。該培養(yǎng)液以1％(v/v)比率接種到含有5μg/ml氯霉素和10μg/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，然后在37℃振蕩培養(yǎng)6小時(shí)，培養(yǎng)液以3％(v/v)比率被接種到下述的每種培養(yǎng)基中，即含有13C-標(biāo)記甲醇的A培養(yǎng)基和含有普通甲醇的A培養(yǎng)基。
A培養(yǎng)基的組份在表2中說明。應(yīng)用通過向50ml A培養(yǎng)基中加入13℃-標(biāo)記甲醇使終濃度達(dá)到終濃度的0.4％(v/v)獲得的培養(yǎng)基，以及通過向50ml A培養(yǎng)基中加入非13C-標(biāo)記的普通甲醇使終濃度達(dá)到0.4％(v/v)獲得的培養(yǎng)基。接種后，將所述細(xì)胞在47℃振蕩培養(yǎng)30小時(shí)。培養(yǎng)后，兩種培養(yǎng)液在660nm的光吸收達(dá)到約2.3，這個(gè)光吸收指示生長的程度，這樣，在兩種培養(yǎng)基之間細(xì)菌的生長沒有明顯的差別。然后，兩種培養(yǎng)液都被離心(8000rpm，15分鐘)來得到上清，并冷凍干燥。
將62mg獲自每種培養(yǎng)液的凍干粉溶解于500μl重水中。當(dāng)測定每種溶液中L-賴氨酸的數(shù)量時(shí)，在兩種溶液均約為0.55mg，這就發(fā)現(xiàn)兩種溶液中L-賴氨酸的數(shù)量幾乎相同。然后，通過13C-NMR(核磁共振分析儀)分析溶液來研究產(chǎn)生的L-賴氨酸分子中13C的比率。結(jié)果顯示，與使用加入了非標(biāo)記甲醇的培養(yǎng)物產(chǎn)生的L-賴氨酸中碳原子信號(hào)相比，在加入了13C標(biāo)記甲醇的培養(yǎng)物產(chǎn)生的L-賴氨酸中檢測到的信號(hào)約強(qiáng)了3.8-13倍。這說明構(gòu)建的AJ13855(pHY-A2H4/L-217M1)菌株新獲得了吸收培養(yǎng)基中加入的13C-標(biāo)記甲醇的能力，甚至利用其產(chǎn)生L-賴氨酸。
表2A培養(yǎng)基的組份(每130ml)5×MM培養(yǎng)基(組份如下所示) 26ml50mM MgSO42.6ml痕量元素溶液 1.3ml2mg/ml FeSO4260μl0.1mg/ml MnSO4260μl5mg/ml L-色氨酸1.3ml5mg/ml L-甲硫氨酸 1.3ml2.5mg/ml胸腺嘧啶 1.3ml50％(w/v)葡萄糖1.3ml50％(w/v)核糖 1.3ml10mg/ml(w/v)四環(huán)素 65μl無菌水 93ml
5×MM培養(yǎng)基(每200ml)(NH4)2SO42gK2HPO414gKH2PO46g二水合檸檬酸鈉 1gMgSO4·7H2O0.2g用無菌水補(bǔ)足到總體積為200ml
序列表<110>味之素株式會(huì)社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法<130>OP1386<140><141>2002-09-06<140>JP 2001-270902<151>2001-09-06<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物MDH-BM-1<400>1taaaaaggat ccccgatgat acaacaccaa acgg 34<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物MDH-BM-2<400>2gaccgaattc catgtagttt ttcctcattc acc33<210>3<211>10186<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明重組載體<400>3aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 60ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 120tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 180atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 240attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 300gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 360agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 420aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 480cgccgcatac actattctca 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3060tccgttagcg aggtgccgcc ggcttccatt caggtcgagg tggcccggct ccatgcaccg 3120cgacgcaacg cggggaggca gacaaggtat agggcggcgc ctacaatcca tgccaacccg 3180ttccatgtgc tcgccgaggc ggcataaatc gccgtgacga tcagcggtcc agtgatcgaa 3240gttaggctgg taagagccgc gagcgatcct tgaagctgtc cctgatggtc gtcatctacc 3300tgcctggaca gcatggcctg caacgcgggc atcccgatgc cgccggaagc gagaagaatc 3360ataatgggga aggccatcca gcctcgcgtc gcgactaaga aaatgccgtc aaatccgctc 3420gccatgactt cactaacgat gcctttgaaa atcttcaagt tcttttctac taattcaagg 3480cgtgtctcac caggtttttg gtttgctccg gcgcaaatgc agacaatatc agcatccttg 3540cagggtatgt ttctctttga tgtctttttg tttgtgaagt atttcacatt tatattgtgc 3600aacacttcac aaacttttgc aagagaaaag ttttgtctga tttatgaaca aaaaagaaac 3660catcattgat ggtttctttc ggtaagtccc gtctagcctt gccctcaatg gggaagagaa 3720ccgcttaagc ccgagtcatt atataaacca tttagcacgt aatcaaagcc aggctgattc 3780tgaccgggca cttgggcgct gccattatta aaaatcactt ttgcgttggt tgtatccgtg 3840tccgcaggca gcgtcagcgt gtaaattccg tctgcatttt tagtcattgg ttttccaggc 3900caagatccgg 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165 170175Tyr Gly Arg His Ala Asn Leu Glu180
權(quán)利要求
1.一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生并能在培養(yǎng)基中或微生物細(xì)胞中積累該靶物質(zhì)能力的微生物，并從所述培養(yǎng)基或所述微生物細(xì)胞中收集靶物質(zhì)，其中，所述的微生物是導(dǎo)入了甲醇脫氫酶基因，并且該微生物經(jīng)修飾后使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖異構(gòu)酶的活性得以提高，從而賦予或提高了其利用甲醇的能力，該培養(yǎng)基中含有甲醇作為碳源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物是進(jìn)一步導(dǎo)入了編碼甲醇脫氫酶激活劑基因的微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中靶物質(zhì)是L-氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中L-氨基酸是L-賴氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中微生物屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌。
6.一種導(dǎo)入了甲醇脫氫酶基因的微生物，其中，該微生物經(jīng)修飾后使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖異構(gòu)酶得以增強(qiáng)，從而賦予或提高了該微生物利用甲醇的能力。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的微生物，其中進(jìn)一步引入了編碼甲醇脫氫酶每激活劑的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的微生物，其為革蘭氏陽性細(xì)菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的微生物，其為芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的微生物，其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
全文摘要
一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生并能在培養(yǎng)基中或微生物細(xì)胞中積累靶物質(zhì)能力的微生物，并從該培養(yǎng)基或該微生物細(xì)胞中收集靶物質(zhì)，所使用的微生物是導(dǎo)入了甲醇脫氫酶基因，并且提高了己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖異構(gòu)酶的活性，該微生物經(jīng)修飾后被賦予甲醇利用能力或提高了甲醇利用能力，所用的培養(yǎng)基中含有甲醇作為碳源。
文檔編號(hào)C12P13/08GK1408877SQ0214372
公開日2003年4月9日 申請日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者安枝壽, 竹下亮 申請人:味之素株式會(huì)社