專利名稱：預(yù)防動物口蹄疫病毒的感染的重組蛋白疫苗及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程領(lǐng)域，具體地涉及基因工程重組蛋白疫苗(下文有時(shí)也稱為“基因工程重組蛋白”)，特別是涉及一種預(yù)防動物口蹄疫病毒感染的由卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的重組蛋白疫苗；編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有時(shí)也稱為“基因”)；“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白及其全編碼區(qū)的核苷酸序列；卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白的融合方式；含有編碼由卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的重組蛋白疫苗的核苷酸的表達(dá)載體；含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及該重組蛋白疫苗的制備方法；本發(fā)明還涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預(yù)防動物口蹄疫病毒感染的疫苗制品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。
口蹄疫的病原體是口蹄疫病毒，它是一種濾性小核糖核酸(ssRNA)病毒?？谔阋卟《疽话憧煞?種類型A、C、O、亞洲一型和南非一至三型。每一型之中又分出很多亞型。一般認(rèn)為，各型口蹄疫病毒之間不能誘生交互免疫。
FMD病毒的基因組約有7500-8000個(gè)堿基，病毒的核衣殼蛋白(亦稱殼蛋白，viral capsid protein VP)分四部分，依次為VP4、VP2、VP3、VP1。其中，VP1蛋白可誘導(dǎo)保護(hù)性的體液免疫應(yīng)答，其中的由第135-158位氨基酸構(gòu)成的肽段具有較強(qiáng)的免疫原性，可以誘發(fā)出高水平的蛋白抗體和病毒中和抗體；第141-159之間的肽段被認(rèn)為是B細(xì)胞和T細(xì)胞識別的強(qiáng)抗原決定簇。在1982年，Pfaff E，Mussgay M，Bohm HO等第一次證明，根據(jù)FMDV的VP1殼蛋白上的一段序列人工合成的小肽能夠產(chǎn)生具有保護(hù)作用的抗口蹄疫病毒的中和性抗體(Pfaff E，Mussgay M，BohmHO，Antibodies against a preselected peptide recognize andneutralize foot and mouth disease virus，EMBO J 1982；1(7)869-74)。其后，在豚鼠、豬、羊的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，僅在FMDV的VP1蛋白的141-160位氨基酸N末端融合了β-半乳糖甘酶的肽段并不能產(chǎn)生持久的免疫原性，然而，通過將VP1蛋白的141-160位氨基酸以某種融合蛋白(例如與乙型肝炎核心抗體)的方式表達(dá)于一些載體上(如KLH)，可以明顯提高這段小肽的免疫原性。VP1基因編碼的重組蛋白在動物體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全方位的免疫應(yīng)答(表現(xiàn)為產(chǎn)生特異性的中和抗體、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)和輔助T細(xì)胞(Th)，對口蹄疫病毒具有預(yù)防作用。
伴侶蛋白10(Chaperonin 10)是分子伴侶大家族的一個(gè)成員。人、牛、鼠的伴侶蛋白10氨基酸序列具有近100％的同源性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卡介苗伴侶蛋白10在豚鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)出針對“O1Lausanne”型口蹄疫病毒的抗體。這種伴侶蛋白10肽段的C-末端的組蛋白結(jié)構(gòu)與“O”性口蹄疫病毒的表位相似，這可能是伴侶蛋白10誘發(fā)機(jī)體對口蹄疫病毒保護(hù)性免疫反應(yīng)的一種機(jī)理(Amadori M，Archetti IL，Scaccaglia P，Chaperonin 10 ofmycobacterium tuberculosis induces a protective immune response tofoot-and-mouth disease virus).Arch Virol 1999；144(5)905-19)。
本發(fā)明的另一方面是提供一種編碼“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的全結(jié)構(gòu)基因序列和由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸的序列。
本發(fā)明的另一方面是提供一種編碼這種重組蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列。
本發(fā)明的另一方面是提供一種含有該核苷酸序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一方面是提供一種含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面是提供一種用卡介苗伴侶蛋白10基因融合口蹄疫病毒VP1基因生產(chǎn)預(yù)防口蹄疫病毒感染的基因工程疫苗的方法。
本發(fā)明的另一方面涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預(yù)防動物的口蹄疫病毒感染的疫苗制品中的用途。
本發(fā)明的又一方面涉及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。
因此，正是本發(fā)明人經(jīng)過長期的大量的研究，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)難題，首次開拓性地將卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原相連形成了全新的基因工程重組蛋白，從而提供了全新的用于預(yù)防動物的口蹄疫病毒感染的疫苗。
另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面和其它具有創(chuàng)造性的有益效果對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
Code NoA1022，DL 2000；泳道2是caperonin(303bp)。附圖
5融合蛋白基因核苷酸酶切瓊脂糖電泳圖，其中泳道1是PET28+VP1酶切片段(片段大小約650 bp)，泳道2是Mark，TaKaRa Code NoA1033，DL 1500。附圖6融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建圖，其中圖6(1)為表達(dá)載體上目的基因插入片段的部位及酶切位點(diǎn)，圖6(2)為表達(dá)載體構(gòu)建成功后的質(zhì)粒圖譜。
伴侶蛋白10(Chaperonin10)是一種從卡介苗中分離出來的分子量為10kDa的熱激蛋白，它具有如SEQ ID NO 14所示的核苷酸序列，SEQ IDNO 15所示的氨基酸序列。
口蹄疫病毒VP1抗原是FMD病毒殼蛋白的一部分，它可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的口蹄疫病毒中和抗體。在本發(fā)明中，它具有SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
動物的口蹄疫病毒(FMDV)感染是由FMDV引起的偶蹄類動物共患的接觸性傳染病，最易感染的動物是牛、豬、羊、鹿等。FMDV是一種濾性小核糖核酸(ssRNA)病毒，病毒顆?；蚪M約包含7500-8000個(gè)堿基。FMDV主要以唾液的方式傳播，傳播的速度很快、易形成大面積的流行。
本發(fā)明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白，其中卡介苗伴侶蛋白10可以位于該融合蛋白的氨基端，“O”型口蹄疫病毒VP1抗原位于該融合蛋白的羧基端。本發(fā)明的重組蛋白疫苗中，所述的“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的編碼基因優(yōu)選地具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，該“O”型口蹄疫病毒VP1抗原優(yōu)選地具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而卡介苗伴侶蛋白10優(yōu)選地具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列。本發(fā)明的重組蛋白疫苗優(yōu)選地具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，而其編碼基因優(yōu)選地具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的重組蛋白疫苗具有選自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；和2)由在嚴(yán)緊的雜交條件下與編碼1)的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列，該核苷酸序列可以具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在嚴(yán)緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
“O”型口蹄疫病毒來自中國內(nèi)蒙古金宇集團(tuán)生物制藥廠，其VP1抗原的核苷酸序列由我們自行設(shè)計(jì)的引物通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得(序列如SEQ ID NO5-11所示)?？ń槊绨閭H蛋白10是一種來源于卡介苗的基因片段，它在和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原形成融合蛋白后(其基因編碼序列和氨基酸序列可以分別如SEQ ID NO3，4所示)，可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對FMDV的中和性抗體。
本發(fā)明的重組蛋白疫苗可通過本領(lǐng)域已知的方法，例如參考文獻(xiàn)Nilsson C，Sutter G，Walther-Jallow L，et al.Immunization with recombinantmodified vaccinia virus Ankara can modify mucosal simian immunodeficiencyvirus infection and delay disease progression in macaques(重組修飾的安卡拉病毒疫苗可以控制恒和猴黏膜免疫缺陷性病毒的感染及延遲疾病的進(jìn)展)。J Gen Virol 2002 Apr；83(Pt 4)807-18.所述進(jìn)行生產(chǎn)，以下的實(shí)施例詳細(xì)地例舉了一種生產(chǎn)本發(fā)明的重組蛋白疫苗的方法。
因此，本發(fā)明還提供了含有上述編碼本發(fā)明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列的表達(dá)載體；含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種原核細(xì)胞，真核細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞；以及該重組蛋白疫苗的基因工程制備方法。
另外，本發(fā)明還涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預(yù)防動物口蹄疫病毒的感染的疫苗制品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，這些疫苗制品可用本領(lǐng)域周知的各種常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的重組蛋白疫苗可通過皮下注射的方式給動物接種，接種的劑量為100-500μg。為了加強(qiáng)效果，可在第一次免疫后14或21天進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。
下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和生物學(xué)效果實(shí)施例，并參照附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
提取卡介苗基因組DNA的方法參照Molecular Cloning一書(J.Sambrook，從哺乳動物分離高分子量DNA(Isolat ion of high-molecular-weight DNA from mammalian cells)，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
采用PCR方法自卡介苗分離伴侶蛋白10結(jié)構(gòu)基因。采用的5’端引物序列為5’CCATGGCGAAGGTGAACATCAA 3’(SEQ ID NO12)，3’端引物序列為5’CTAGAATTCCTTGGAAACGACGGCCAGC 3’(SEQ ID NO13)。
所述PCR操作程序是在一500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA5μl(mmol/L)10×PCR緩沖液 5μl(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，15mmol/L MgCl2)dNTPs(10mmol/L) 1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各 0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl) 0.25μl加去離子水至終體積 50μl混合后加入礦物油3滴反應(yīng)條件94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30個(gè)循環(huán)周期后，72℃延伸10分鐘。序列如SEQ ID No14所示。實(shí)例2采用TA克隆方法克隆PCR產(chǎn)物TA克隆的載體為PMD18-TVector(pMD 18-TVector Code NoD504A，TaKaRa)。方法如下一DNA的回收(下列回收試劑均來自中國大連寶生物工程有限公司，TaKaRa-DNA回收試劑盒Code NoD301)1將PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳(1xTAE，150-200mA，20分鐘)；2從瓊脂糖凝膠上切下含DNA片段的凝膠，放入一離心管中；3加入3倍體積的溶膠液B，45-55°水浴10min使膠完全融化；4將含有DNA凝膠的溶液B移入過濾柱中，室溫靜止2分鐘；5加入500毫升溶液C于過濾柱中，洗脫一次5000g離心60秒，棄濾液；6再次加入500毫升溶液C于過濾柱中，洗脫后同上離心，棄濾液；7將過濾柱至于室溫下干燥30-60分鐘，加入溶液D30-50毫升，室溫靜止2分鐘；812000g離心1分鐘，收集的濾液為含有DNA片段的溶液D；9-20℃保存收集液，備用。二連接反應(yīng)1取3-5ul上清液電泳，并在紫外燈下觀察電泳帶，與marker(10ng/ul)相比較，估計(jì)回收DNA濃度；2連接反應(yīng)體系Insert DNA(SEQ ID NO 14) 0.05-0.3pmolpMD18-TVector 0.5-1ulSolution I5ul(Ligation Solutionl Code NoD504A，TaKaRa)DH2O加至 10ul16℃反應(yīng)1小時(shí)三轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化的方法是將100ul感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO，混合后，加入10μl連接反應(yīng)液(含重組質(zhì)粒)，溫和混勻，置冰上30分鐘；42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分鐘；加入1ml LB培養(yǎng)液，37℃以225rpm的速度搖蕩培養(yǎng)1小時(shí)；4,000Xg離心10秒鐘，棄上清，用200ul LB培養(yǎng)液重懸菌體；將菌液鋪于含有適當(dāng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，涂勻，室溫放置10分鐘，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。
感受態(tài)細(xì)胞的制備方法是將大腸桿菌GM109(JM109 Code NoY001，北京鼎國生物)在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)；次日從瓊脂平板上取一單菌落于2ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm速度震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)；取1ml上述培養(yǎng)物接種于100ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(約3小時(shí))；將菌液冰浴2小時(shí)，然后2,500Xg，4℃離心20分鐘收集菌體；加入100ml冰冷的Trituration緩沖液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸鈉，pH5.5)，混勻，置冰上45分鐘；1800Xg，4℃離心10分鐘，棄上清，加入10ml冰冷的Trituration緩沖液懸浮細(xì)胞；按每份200ul分裝，4℃可保存1-2周。若需長期保存，可加甘油至終濃度為15％，置-70℃?zhèn)溆谩?br> 四鑒定由北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心進(jìn)行DNA的測序。測序結(jié)果無誤(具體序列參見SEQ ID No14，其瓊脂糖電泳圖見附圖4)。
五菌種及保存重組質(zhì)粒冰凍保存于-20℃。含重組質(zhì)粒的菌株在含20％甘油培養(yǎng)液中保存于-20℃或-70℃。
按常規(guī)方法(J.Sambrook，聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamidegel electrophoresis)1.21-1.32，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Molecular cloning，1989)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進(jìn)行序列測定。實(shí)施例3.“O”型口蹄疫病毒RNA的獲得利用Trizol試劑(美國Gibco公司產(chǎn)品)提取細(xì)胞培養(yǎng)液中的口蹄疫病毒(中國內(nèi)蒙古金宇集團(tuán)生物制藥廠)的RNA；具體的步驟如下1.將300ul含口蹄疫病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液與600ul無水乙醇混合后室溫靜止10分鐘，10000Xg離心10分鐘。
2.棄上清，用1ml Trizol試劑裂解細(xì)胞沉淀，搖動混合后，室溫孵育10分鐘。
3.加入200ul氯仿震蕩混勻15秒，室溫3分鐘。
4.10000Xg，4℃離心15分鐘，將水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入500ul異丙醇，混合后室溫下沉淀10分鐘，10000Xg，離心10分鐘。
5.棄上清，加入1ml 75％乙醇，8000Xg，離心10分鐘。
6.棄上清，室溫下空氣蒸發(fā)殘余乙醇，無色、透明的FMD病毒RNA附著于試管底部。實(shí)施例4.采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及兩輪PCR獲得“O”型口蹄疫病毒的VP1抗原核苷酸序列。一.采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得“O”型口蹄疫病毒的cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特異性引物由我們自行設(shè)計(jì)，序列為5’AAAGGCCCAGGGTTGGACTC 3’(SEQ ID NO5)逆轉(zhuǎn)錄方法1.在提取的病毒RNA沉淀中加入特異性引物(10uM)1ulDEPC-水 9ul混合后置65℃水浴10分鐘，然后冰浴2分鐘。2.向上述溶液中加入下列試劑5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 4ul(AMV RT 5×Reaction Buffer and Solutions Code NoM5 101，Promegacorporation USA)Rnasin 0.25ul(Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega corporation USA)dNTPs(10mmol/L)4.0ul逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5ul(AMV-RT Code NoM5101，Promega corporation USA)DEPC-水至終體積為 20ul混合后37℃水浴1小時(shí)。3.將上述反應(yīng)液移入68℃水浴10分鐘(滅活逆轉(zhuǎn)錄酶)，-20℃保存。二.PCR反應(yīng)1.第一輪PCR(模板為為“反應(yīng)一”中獲得的口蹄疫病毒的cDNA)引物1的序列為5’GGCTGATTACGCGTACAC 3′(SEQ ID NO6)引物1’的序列為5’AAAGGCCCAGGGTTGGACTC 3’(SEQ ID NO7)第一輪PCR合成的產(chǎn)物的序列是5’ CGCGTCCGACGTCGCCGAAACCACAAACGTGCAGGGATGGGTCTGCTTGTTCCAGATAACACACGGGAAAGCCGACGGCGATGCTCTGGTTGTGCTAGCTAGTGCTGGCAAAGACTTTGACCTACGCCTACCGGTTGACGCCCGCACGCAGACCACCTCTGCGGGCGAGTCCGCGGACCCCGTTACCGCCACCGTTGAGAATTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAGCACACGGATATCTCGTTTATACTAGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACCAAATCAATGTGCTGGACCTGATGCAGATCCCTGCCCACACTTTAGTAGGGGCCCTCCTGCGGACGGCCACCTACTACTTCTCCGACTTGGAGTTGGCTGTCAAACACGAGGGTGATCTCACCTGGGTTCCGAACGGGGCCCCTGAGACAGCTTTGGACAACACCACCAACCCAACAGCTTACCACAAAGCACCACTCACGCGACTGGCCTTGCCTTACACGGCCCCACACCGCGTCTTAGCGACCGTCTACAACGGAGGTTGTAAGTACAGTGACGCCCGCGTGAGCAACGTGAGGGGTGACCTTCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCAAAAAGAGCTCTGCCCACCTCCTTTAACTATGGTGCCATTAAGGCAACCCGGGTGACTGAGTTACTCTACCGAATGAAGAGAGCCGAGACATACTGCCCCAGGCCCCTTCTTGCCATTCAACCGAGTGACGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTGGCACCCGCAAAACAGCTTCTGAACTTCGACCTCCTCAAGCTGGCGGGAGACGTC 3’(SEQ ID NO8)2第二輪PCR(模板為第一輪PCR合成的產(chǎn)物)引物2的序列是5’GAATTCACCACCTCTGCGGG 3’(SEQ ID NO9)引物2’的序列是5’AAGCTTCAGAAGCTGTTTTGC 3’(SEQ ID NO10)產(chǎn)物的序列是5’GAATTCACCACCTCTGCGGGCGAGTCCGCGGACCCCGTTACCGCCACCGTTGAGAATTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAGCACACGGATATCTCGTTTATACTAGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACCAAATCAATGTGCTGGACCTGATGCAGATCCCTGCCCACACTTTAGTAGGGGCCCTCCTGCGGACGGCCACCTACTACTTCTCCGACTTGGAGTTGGCTGTCAAACACGAGGGTGATCTCACCTGGGTTCCGAACGGGGCCCCTGAGACAGCTTTGGACAACACCACCAACCCAACAGCTTACCACAAAGCACCACTCACGCGACTGGCCTTGCCTTACACGGCCCCACACCGCGTCTTAGCGACCGTCTACAACGGAGGTTGTAAGTACAGTGACGCCCGCGTGAGCAACGTGAGGGGTGACCTTCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCAAAAAGAGCTCTGCCCACCTCCTTTAACTATGGTGCCATTAAGGCAACCCGGGTGACTGAGTTACTCTACCGAATGAAGAGAGCCGAGACATACTGCCCCAGGCCCCTTCTTGCCATTCAACCGAGTGACGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTGGCACCCGCAAAACAGCTTCTGAAGCTT3′(SEQ ID NO11)此序列代表的是兩端加入酶切位點(diǎn)的“O”型口蹄疫病毒VP1基因序列。
PCR的反應(yīng)條件為94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30個(gè)循環(huán)周期后，72℃延伸10分鐘。
卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因的測序結(jié)果表明，所得到的卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因和設(shè)計(jì)的完全一致，具體序列參見SEQ ID NO14和SEQ ID NO16。
用NcoI(Nco I Code NoD1160A，TaKaRa，下同)和EcoRI(EcoRICode NoD1040A，TaKaRa，下同)在37℃消化得自實(shí)施例5的伴侶蛋白10連接物，用EcoRI和HindIII(HindIII Code NoD1060A，TaKaRa，下同)在37℃消化得自實(shí)施例5的“O”型口蹄疫病毒VP1連接物，時(shí)間為2小時(shí)。消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳的條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1小時(shí)。20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base，0.4mol/L NaOAc，0.04mol/LNa2EDTA，用冰醋酸調(diào)pH 8.3。
在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的DNA電泳帶(分別含Chaperonin10和口蹄疫病毒VP1基因)。純化回收DNA片段(方法同實(shí)施例2，電泳圖見附圖2；附圖4)
含卡介苗伴侶蛋白10質(zhì)粒DNA的消化反應(yīng)質(zhì)粒DNA1μg10×緩沖液(10×K buffer LotA1018，TaKaRa)1μl限制性內(nèi)切酶NcoI(10單位/μl) 1μl限制性內(nèi)切酶EcoRI(10單位/μl) 1μl用雙蒸水補(bǔ)齊至 10μl混合后37℃溫育30-120分鐘。
含“O”型口蹄疫病毒VP1質(zhì)粒DNA的消化反應(yīng)
質(zhì)粒DNA 1μg10×緩沖液(10×M buffer LotA1032，TaKaRa) 1μl限制性內(nèi)切酶HindIII(10單位/μl) 1μl限制性內(nèi)切酶EcoRI(10單位/μl) 1μl用雙蒸水補(bǔ)齊至10μl混合后37℃溫育30-120分鐘。
連接反應(yīng)質(zhì)粒DNA(0.5μg/μl) 2μlDNA插入片段(300ng/μl)5μl10×連接緩沖液(T4Ligation Solution LotCA2901，TaKaRa) 1μlT4 DNA連接酶(T4 Ligation Code NoD2011A，TaKaRa)1μl用雙蒸水補(bǔ)齊至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小時(shí)。
將含卡介苗伴侶蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1融合基因的重組pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌BL21(BL21(DE3)Code NoY016，北京鼎國生物，下同)。
鑒定由北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心對pET-28a(+)質(zhì)粒上的含卡介苗伴侶蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1的融合基因進(jìn)行DNA的測序。測序結(jié)果無誤。(具體序列參見SEQ ID No16)。
用酶切的方法(HindIII、EcoRI)對pET-28a(+)質(zhì)粒上的含卡介苗伴侶蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1的融合基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果切除大小約650bp的片段，證實(shí)“O”型口蹄疫病毒VP1連接成功。(附圖5)
將單菌落的細(xì)菌接種于50ml LB培養(yǎng)基中，于250ml三角燒瓶中，37C水浴震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6。加入IPT6使其終濃度為1mM，37C水浴震蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。三角燒瓶于冰上5分鐘，4C離心5分鐘(5000xg)。吸棄上清，收集細(xì)菌，立即使用或凍存。
咪唑洗脫液20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl1M imidazole，6M urea。實(shí)施例8C57小鼠的疫苗免疫一.材料1.C57雌性小鼠(C57小鼠，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供下同)，6-8周齡2.“伴侶蛋白10-VP1”融合蛋白(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室提供下同)3.PBS二.方法1.將20只小鼠隨機(jī)分兩組，一組為伴侶蛋白10-VP1融合蛋白疫苗免疫組，一組為PBS免疫組，疫苗組于0、14、28天，每只鼠在二下肢股四頭肌處共注射“伴侶蛋白10-VP1”融合蛋白疫苗200ug(150ul)，1.3ug/ul；PBS組用同樣的方法等量注射PBS。
2.距第三次免疫后6天，小鼠眼球取血約1ml，4000g離心10秒后分離上清。實(shí)施例9ELISA檢測免疫后的C57小鼠抗體效價(jià)一.材料C57小鼠(雄性6-8周齡)、“伴侶蛋白10-VP1”融合蛋白、“HSP-VP1”融合蛋白、PBS、包被緩沖液1％BSA、羊抗鼠IgG-HRP(編號H005北京鼎國生物，下同)、OPD-底物緩沖液(OPD-底物緩沖液CodeNoP002，北京鼎國生物，下同)二.方法1.將純化后的“HSP-VP1”融合蛋白(6.5ng/ml)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后，180用包被緩沖液稀釋。
2.包被加入96孔板，100ul/孔。4℃，過夜。
3.洗滌洗液洗板3次，5分鐘/次。
4.封閉加1％BSA封閉，200ul/孔。37℃，1.5小時(shí)。
5.洗滌洗液洗板3次，5分鐘/次。
6.加樣將PBS免疫及“伴侶蛋白10-VP1”融合蛋白疫苗免疫鼠(免疫方法同前)各10只的血清用樣品稀釋液做100、200、400、800、1600、3200及6400倍稀釋，100ul/孔。設(shè)復(fù)孔。37℃，60分鐘。
7.加酶標(biāo)抗體將羊抗鼠IgG-HRP(0.1ml，1∶1000)用洗液稀釋500倍，100ul/孔。37℃，60分鐘。
8.洗滌洗液洗板三次，5分鐘/次。
9.顯色新鮮配制OPD-底物緩沖液，100ul/孔。室溫避光反應(yīng)10分鐘。
10.終止加2mol/L H2SO4，50ul/孔11.測A490。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論A490OD值空白對照OD值0.005±0.0005正常對照組稀釋度(1∶80)OD值0.213±0.003免疫組稀釋度(1∶100)OD值3.564±0.012稀釋度(1∶200)OD值2.531±0.023稀釋度(1∶400)OD值1.971±0.011稀釋度(1∶800)OD值1.003±0.014稀釋度(1∶1600)OD值0.899±0.012稀釋度(1∶3200)OD值0.719±0.009稀釋度(1∶6400)OD值0.621±0.006判斷標(biāo)準(zhǔn)用ELISA方法檢測免疫血清抗體滴度時(shí)，當(dāng)免疫組不同的稀釋度時(shí)OD值高于對照組OD值的2倍時(shí)，判斷為陽性。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)免疫組稀釋度為1∶1600時(shí)，免疫組OD較對照組OD提高2倍以上，據(jù)此判斷免疫組的有效抗體效價(jià)1∶1600。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明疫苗免疫組的抗體效價(jià)明顯高于PBS免疫組。
序列表<110>北京迪成華宇生物技術(shù)有限公司<120>預(yù)防動物口蹄疫病毒的感染的重組蛋白疫苗及其用途<130>I020107<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>639<212>DNA<213>Foot-and-mouth disease virus<220><221>CDS<222>(1)..(639)<223><400>1acc acc tct gcg ggc gag tcc gcg gac ccc gtt acc gcc acc gtt gag48Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu1 5 10 15aat tac ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc cag cac acg gat atc96Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile20 25 30tcg ttt ata cta gac aga ttt gtg aaa gtc aca cca aaa gac caa atc144Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile35 40 45aat gtg ctg gac ctg atg cag atc cct gcc cac act tta gta ggg gcc192Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala50 55 60ctc ctg cgg acg gcc acc tac tac ttc tcc gac ttg gag ttg gct gtc240Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val65 70 75 80aaa cac gag ggt gat ctc acc tgg gtt ccg aac ggg gcc cct gag aca288Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly 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1.一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的重組蛋白疫苗，其具有選自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID No4所示的氨基酸序列；和2)由在嚴(yán)緊的雜交條件下與編碼1)的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
3.按照權(quán)利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中所述的“O”型口蹄疫病毒VP1抗原具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.按照權(quán)利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中，“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的編碼序列是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
5.按照權(quán)利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中，卡介苗伴侶蛋白10位于該融合蛋白的氨基端，“O”型口蹄疫病毒VP1抗原位于該融合蛋白的羧基端。
6.按照權(quán)利要求1所述的重組蛋白疫苗，它具有SEQ ID No4所示的氨基酸序列。
7.編碼權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的重組蛋白疫苗的核苷酸序列。
8.按照權(quán)利要求7所述的核苷酸序列，其具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在嚴(yán)緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
9.按照權(quán)利要求7所述的基因，它具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
10.含有權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的核苷酸序列的表達(dá)載體。
11.含有權(quán)利要求10表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
12.按照權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其為原核細(xì)胞，真核細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
13.一種制備權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的重組蛋白疫苗的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求9或10所述的宿主細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的重組蛋白在制備用于預(yù)防動物口蹄疫病毒的感染的疫苗制品中的用途。
15.一種用于預(yù)防動物口蹄疫病毒的感染的疫苗制品，含有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的重組蛋白和載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白；這種重組蛋白疫苗的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列；“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白及其全編碼區(qū)的核苷酸序列；含有卡介苗伴侶蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白的編碼核苷酸的表達(dá)載體；含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及該重組蛋白疫苗的制備方法。本發(fā)明的融合蛋白在應(yīng)用于動物后可有效地預(yù)防口蹄疫病毒的感染。
文檔編號C12N15/31GK1465402SQ0214133
公開日2004年1月7日 申請日期2002年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月5日
發(fā)明者王麗穎, 馬克威, 于永利 申請人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司