專利名稱：添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飼料科學(xué)與飼料添加劑檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
微生態(tài)飼料添加劑因其豐富的營養(yǎng)價(jià)值和特殊的益生功效以及綠色環(huán)保特性而成為預(yù)混料領(lǐng)域人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前市場(chǎng)上的微生態(tài)飼料添加劑種類繁多，并且每年以高速度增長。盡管微生態(tài)飼料添加劑在畜牧養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用日益廣泛，但尚未形成統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和完善的管理機(jī)制，對(duì)其質(zhì)量的監(jiān)管和認(rèn)證，尤其在定性、定量檢測(cè)方面缺乏科學(xué)、合理、快速的方法，究其原因是基礎(chǔ)研究薄弱，現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)或檢測(cè)周期長、或不能區(qū)分死菌活菌、或成本高，難以建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)技術(shù)。傳統(tǒng)方法中對(duì)釀酒酵母菌的定性、定量檢測(cè)，仍采用生理生化反應(yīng)和選擇性培養(yǎng)基純培養(yǎng)分離技術(shù)的方法。傳統(tǒng)方法易受外界環(huán)境因素和培養(yǎng)性能的影響，檢測(cè)結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且耗時(shí)耗力。現(xiàn)階段急需從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，逐步建立起科學(xué)有效的、易于推廣的飼用菌種快速高效標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)技術(shù)，促進(jìn)微生態(tài)飼料添加劑行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。PCR技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR)的出現(xiàn)更是實(shí)現(xiàn)了 PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，避免了傳統(tǒng)PCR定量鑒定中交叉污染的問題。具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，成為了分子生物學(xué)和微生物領(lǐng)域定量檢測(cè)的重要方法。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性測(cè)定方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量測(cè)定方法。本發(fā)明采用釀酒種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立簡便、快速、準(zhǔn)確的添加劑預(yù)混料中釀酒酵母快速分子檢測(cè)方法，可簡化釀酒酵母的檢測(cè)程序、提高檢測(cè)效率。技術(shù)方案本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性測(cè)定方法，該方法使用釀酒酵母的DNA為模板，以釀酒酵母的^s rDNA基因序列的種屬特異性引物進(jìn)行種屬特異性PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片度長度為134bp，進(jìn)而快速定性釀酒酵母；所述的種屬特異性引物如下上游引物DZf 5 ’ -CGAGAGACCGATAGCGAACA-3 ’，下游引物 OZr5' -AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3，。
進(jìn)一步，該方法的步驟如下A.模板DNA的制備采用玻璃珠法制備飼料樣品模板DNA (1)取Ig含有釀酒酵母菌的預(yù)混料樣品于1. 5mL離心管中，加入500 μ LPBS懸浮樣品，2500 Xg離心3min ；(2)棄上清，加入適量酸洗過的玻璃珠，劇烈震蕩aiiin ；(3)加入400 μ L TE及等體積的Tris飽和酚，翻轉(zhuǎn)混勻，15000 Xg離心5min ；(4)轉(zhuǎn)移水相至一新離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇=25 24 1的混合物，顛倒混勻，15000 Xg離心5min ；(5)吸上清至一新離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc及2. 5倍體積95%冰乙醇，-20°C過夜；(6) 4"C 15000 Xg 離心 lOmin，棄上清；(7)加入 lmL70% 乙醇，15000Xg 離心 5min，棄上清；(8)37°C放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60 μ L TE中，_20°C保存?zhèn)溆茫籅. PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系25. Ομ L :12. 5μ L 2XPCR_mix、各 1 μ L 10mmol/L 上、下游引物、1 μ L 50ng/ μ L DNA模板、二次蒸餾水補(bǔ)足至25. 0 μ L ；PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C 30s,60°C 45s，72°C 40s，進(jìn)行；35 個(gè)循環(huán)， 72°C最終延伸7min，得到的PCR產(chǎn)物，在溫度4°C下保存；取5 μ LPCR產(chǎn)物，1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；C.結(jié)果及判斷檢測(cè)時(shí)設(shè)以目的擴(kuò)增片度的膠回收產(chǎn)物作為模板為陽性對(duì)照，以滅菌水作為模板為陰性對(duì)照；根據(jù)在134bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該預(yù)混料樣品中含有釀酒酵母，相反地則不合有釀酒酵母。本發(fā)明還提供一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的快速定量測(cè)定方法，該方法以待測(cè)樣品cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的cDNA為模板，使用定性測(cè)定方法中所述的上游引物和下游引物，以相同的體系同時(shí)進(jìn)行釀酒酵母26s rDNA D1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行預(yù)混料樣品中釀酒酵母的快速定量檢測(cè)。進(jìn)一步，該方法的步驟如下A.樣品總RNA的制備采用酶法破除釀酒酵母細(xì)胞壁，高純總RNA，快速提取試劑盒提取樣品總RNA 樣品0. 5-1. Og加入到1. 5mL離心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U Lyticase,充分混勻30°C處理30min，1500Xg離心IOmin后，棄上清，收集沉淀，提取樣品RNA，然后用 DNase I處理兩次，得到純化的RNA樣品，使用紫外分光光度儀測(cè)定濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，然后將樣本保存于-80°C ；B.反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(1)在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應(yīng)混合物1-5μ g 總 RNA、2y L Oligo (dT) 15,2 μ LdNTP (2. 5mM each)、補(bǔ) RNase_freeddH20定容至14. 5μ L ；(2)70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，快速離心反應(yīng)液后加入以下組分 4μ L 5XFirst-Strand Buffer(含有 DTT) ；0. 5μ L RNasin ；(3)加入 1 μ L (200U) TIANScript M-MLV,輕輕用移液器混勻；(4)42°〇溫浴50111士11;(5) 95°C加熱5min，終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存；(6)用RNase-free ddH20將反應(yīng)體系稀釋到50 μ L。_20°C保存?zhèn)溆?；C.熒光定量PCR反應(yīng)體系25. 0μ L :12· 5μ L 2XSuperReal PreMix(含 STOR Green I)、各 0.75 μ L ΙΟμ θΙ/L 上下游引物 DZf和 DZr，2.0yL cDNA模板、0.5yL 50 X ROXReference Dye、補(bǔ) RNase—free ddH20 M 25 μ L 體系；熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95°C預(yù)變性15min ；95°C變性10s，60°C退火32s，40個(gè)循環(huán)；4°C保存；每個(gè)樣品重復(fù)3次；D.外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制外標(biāo)準(zhǔn)品的制備利用分光光度計(jì)將過夜培養(yǎng)的釀酒酵母菌發(fā)酵液稀釋至10D， 按照上述提取總RNA步驟并通過反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得cDNA，進(jìn)行10倍系列稀釋，梯度稀釋至 107-1個(gè)酵母cDNA/ μ L的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以不同濃度的模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)得到的釀酒酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為待測(cè)樣品定量測(cè)定的參照標(biāo)準(zhǔn)；Ε.結(jié)果及判斷以待測(cè)樣品cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的cDNA為模板，用釀酒酵母菌的種特異性引物，以相同的體系同時(shí)進(jìn)行釀酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行飼料樣品中釀酒酵母菌的快速定量檢測(cè)。有益效果本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所提供的引物具有特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，可用于快速定性鑒定釀酒酵母菌。本發(fā)明利用cDNA的梯度稀釋物作為外標(biāo)準(zhǔn)品可以用于區(qū)別死活菌，更準(zhǔn)確的檢測(cè)待測(cè)樣品中的活菌數(shù)。本發(fā)明可以在不進(jìn)行釀酒酵母菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量檢測(cè)預(yù)混料樣品中的釀酒酵母菌，整個(gè)過程對(duì)預(yù)混料樣品中釀酒酵母的檢測(cè)程序簡單、檢測(cè)效率高、準(zhǔn)確性好，檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)；從而為微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展提供技術(shù)保障。


圖1 經(jīng)釀酒酵母菌的種屬特異性引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。圖2 以DNA為模板的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)釀酒酵母的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3 以cDNA為模板的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)釀酒酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 預(yù)混料樣品中釀酒酵母的快速定性檢測(cè)該實(shí)施例使用目的擴(kuò)增片段的膠回收產(chǎn)物作為陽性對(duì)照；無菌水作陰性對(duì)照 ’另外使用從市場(chǎng)收集的兩份飼料樣品1#和姊、糞腸球菌、畢赤酵母菌作為樣品進(jìn)行。A.模板DNA的制備采用玻璃珠法制備飼料樣品模板DNA，具體步驟如下(1)取Ig含有釀酒酵母菌的飼料樣品于1. 5mL離心管中，加入500 μ LPBS懸浮樣品，2500 Xg 離心 3min ；(2)棄上清，加入適量酸洗過的玻璃珠，劇烈震蕩aiiin ；(3)加入400 μ L TE及等體積的Tris飽和酚，翻轉(zhuǎn)混勻，15000 Xg離心5min ；(4)轉(zhuǎn)移水相至一新離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇05 24 1)，顛倒混勻，15000 Xg 離心 5min ；(5)吸上清至一新離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc及2. 5倍體積95%冰乙醇，-20°C過夜；(6) 4"C 15000 X g 離心 IOmin,棄上清；(7)加入 1!1^70%乙醇，15000\8離心51^11，棄上清；(8)37°C放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60 μ L TE中，_20°C保存?zhèn)溆谩. PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系25. 0μ L :12. 5μ L 2XPCR_mix、各 1 μ L 10mmol/L 上下游弓| 物、 1 μ L50ng/ μ L DNA模板、二次蒸餾水補(bǔ)足至25. 0 μ L ；PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C 30s,60°C 45s，72°C 40s，進(jìn)行；35 個(gè)循環(huán)， 72°C最終延伸7min，得到的PCR產(chǎn)物，在溫度4°C下保存；取5 μ LPCR產(chǎn)物使用1 %瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓電泳20-30min，EB染色， 紫外拍照。C.目的片段的膠回收純化采用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行切膠、回收、純化，獲得純化的目的片段。D.結(jié)果及判斷經(jīng)釀酒酵母菌的種屬特異性引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。泳道 1以目的片段的純化PCR產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，泳道2以滅菌水作為陰性對(duì)照。一般認(rèn)為陽性特征在134bp處出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶，說明此樣本中含有釀酒酵母菌；陰性對(duì)照無特征條帶。 泳道3-4為從市場(chǎng)中收集到的飼料樣品，結(jié)果為陽性性說明這2份飼料樣品中含有活的釀酒酵母菌。泳道5-6為釀酒酵母菌外的畢赤酵母和糞腸球菌，結(jié)果為陰性，說明引物特異性好，與預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)施例2 預(yù)混料樣品中釀酒酵母的定量測(cè)定對(duì)實(shí)施例1中提到的不同樣品進(jìn)行釀酒酵母菌的定量測(cè)定。其測(cè)定步驟如下A.樣品總DNA的制備采用酶法破除酵母細(xì)胞壁高純總DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取樣品總DNA 樣品0. 5-1. Og加Λ到1. 5mL離心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U Lyticase,充分混勻30°C處理30min，1500Xg離心IOmin后，棄上清，收集沉淀，按高純總DNA快速提取試劑盒說明書提取樣品DNA，使用紫外分光光度儀測(cè)定濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，然后將樣本保存于-20°C。B.熒光定量PCR反應(yīng)體系25. 0μ L :12· 5μ L 2XSuperReal PreMix(含 STOR Green I)、各 0.75 μ L ΙΟμ θΙ/L 上下游引物 DZf 和 DZr，2.0yL DNA 模板、0.5yL 50 X ROXReference Dye、補(bǔ) RNase—free ddH20 M 25 μ L 體系。熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95°C預(yù)變性15min ；95°C變性10s，60°C退火32s，40個(gè)循環(huán)；在溫度4°C保存；每個(gè)樣品重復(fù)3次。D.外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制外標(biāo)準(zhǔn)品的制備利用分光光度計(jì)將過夜培養(yǎng)的釀酒酵母菌發(fā)酵液稀釋至 IOD (約IO7ceIls)，按照上述步驟提取總DNA，進(jìn)行10倍系列稀釋，梯度稀釋至IO7-I個(gè)酵母DNA/ μ L的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以不同濃度的模板為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)得到的釀酒酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見附圖2。Ε.結(jié)果及判斷由圖2可見，Ct值和不同梯度稀釋的模板濃度呈較好的線性關(guān)系，以不同濃度的模板為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制出的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Υ =-1. 802Χ+26. 115 (Y代表Ct值，X代表模板初始DNA濃度)，模板初始DNA的濃度與Ct值之間線性相關(guān)系數(shù)為0. 994，斜率為-1. 802，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合Real-Time PCR定量的要求。以待測(cè)樣品的DNA和標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，用實(shí)施例1描述的釀酒酵母菌的種特異性引物，以相同的體系同時(shí)進(jìn)行釀酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段熒光定量PCR擴(kuò)增。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和采用ABI公司的7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的計(jì)算機(jī)軟件software v2. 0. 1進(jìn)行飼料樣品中釀酒酵母菌的快速定量檢測(cè)。這些樣品的測(cè)定結(jié)果與分析誤差結(jié)果一并列于下表1中。表1樣品的Real-time測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性測(cè)定方法，其特征在于使用釀酒酵母的DNA為模板，以釀酒酵母的^s rDNA基因序列的種屬特異性引物進(jìn)行種屬特異性PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片度長度為134bp，進(jìn)而快速定性釀酒酵母； 所述的種屬特異性引物如下上游引物DZf5’ -CGAGAGACCGATAGCGAACA-3’，下游引物DZ r 5， -AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3，。
2.如權(quán)1所述的快速定性測(cè)定方法，其特征在于該方法的步驟如下A.模板DNA的制備采用玻璃珠法制備飼料樣品模板DNA (1)取Ig含有釀酒酵母菌的預(yù)混料樣品于1.5mL離心管中，加入500 μ L磷酸鹽緩沖液懸浮樣品，2500 Xg離心3min ；(2)棄上清，加入適量酸洗過的玻璃珠，劇烈震蕩aiiin；(3)加入400μ L TE緩沖液及等體積的Tris飽和酚，翻轉(zhuǎn)混勻，15000 Xg離心5min ；(4)轉(zhuǎn)移水相至一新離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇=25 24 1的混合物， 顛倒混勻，15000 Xg離心5min ；(5)吸上清至一新離心管，加入1/10體積3mol/L醋酸鈉及2.5倍體積95 %冰乙醇，_20°C過夜；(6)40C 15000 Xg 離心 lOmin，棄上清；(7)加入lmL70%乙醇，15000Xg離心5min，棄上清；(8)37°C放置15!1^11干燥沉淀，沉淀溶于6(^1^TE緩沖液中，_20°C保存?zhèn)溆?；B.PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 25. 0μ L :12. 5μ L 2XPCR-mix,# 1 μ L 10mmol/L 上、下游引物、1 μ L 50ng/ μ L DNA模板、二次蒸餾水補(bǔ)足至25. 0 μ L ；PCR 反應(yīng)條件941預(yù)變性51^11，941 30s, 60°C 45s, 72°C 40s，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，72°C最終延伸7min，得到的PCR產(chǎn)物，在溫度4°C下保存；取5 μ LPCR產(chǎn)物，1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；C.結(jié)果及判斷檢測(cè)時(shí)設(shè)以目的擴(kuò)增片度的膠回收產(chǎn)物作為模板為陽性對(duì)照，以滅菌水作為模板為陰性對(duì)照；根據(jù)在134bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該預(yù)混料樣品中含有釀酒酵母，相反地則不含有釀酒酵母。
3.一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量測(cè)定方法，其特征在于以待測(cè)樣品cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的cDNA為模板，使用權(quán)利要求1中所述的上游引物和下游引物，以相同的體系同時(shí)進(jìn)行釀酒酵母26s rDNADl/D2的基因片段的熒光定量 PCR擴(kuò)增；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行預(yù)混料樣品中釀酒酵母的快速定量檢測(cè)。
4.如權(quán)3所述的快速定量測(cè)定方法，其特征在于該方法的步驟如下A.樣品總RNA的制備采用酶法破除釀酒酵母細(xì)胞壁，高純總RNA，快速提取試劑盒提取樣品總RNA 樣品 0. 5-1. Og加入到1. 5mL離心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U溶壁酶，充分混勻 30°C處理30min，1500Xg離心IOmin后，棄上清，收集沉淀，提取樣品RNA，然后用DNase I 處理兩次，得到純化的RNA樣品，使用紫外分光光度儀測(cè)定濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，然后將樣本保存于-80°C ；B.反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(1)在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應(yīng)混合物1-5 μ g 總 RNA、2 μ L Oligo (dT) 15、2 μ LdNTP、補(bǔ) RNase-free ddH20 定容至 14. 5 μ L ；(2)70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，快速離心反應(yīng)液后加入以下組分4yL 5 X First-Strand Buffer (含有 DTT) ；0. 5 μ L RNasin ；(3)加入1μ LTIANScript M-MLV，輕輕用移液器混勻；(4)42°〇溫浴50111士11；(5)95°C加熱5min，終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存；(6)用RNase-freeddH20將反應(yīng)體系稀釋到50 μ L。_20°C保存?zhèn)溆?；C.熒光定量PCR反應(yīng)體系 25. Ομ L :12. 5μ L 2 X SuperReal PreMix、各 0. 75 μ L lOymol/L 上下游引物 DZf 和 DZr，2.0yL cDNA 模板、0.5yL 50XROX Reference Dye、補(bǔ) RNase-free ddH20 至25 μ L體系；熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95°C預(yù)變性15min ；95°C變性10s，60°C退火32s，40個(gè)循環(huán)； 4°C保存；每個(gè)樣品重復(fù)3次；D.外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制外標(biāo)準(zhǔn)品的制備利用分光光度計(jì)將過夜培養(yǎng)的釀酒酵母菌發(fā)酵液稀釋至10D，按照上述提取總RNA步驟并通過反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得cDNA，進(jìn)行10倍系列稀釋，梯度稀釋至IO7-I 個(gè)酵母cDNA/ μ L的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以不同濃度的模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)得到的釀酒酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為待測(cè)樣品定量測(cè)定的參照標(biāo)準(zhǔn)；Ε.結(jié)果及判斷以待測(cè)樣品cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的cDNA為模板，用釀酒酵母菌的種特異性引物，以相同的體系同時(shí)進(jìn)行釀酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行飼料樣品中釀酒酵母菌的快速定量檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬于飼料科學(xué)與飼料添加劑檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種添加劑預(yù)混料樣品中釀酒酵母的快速定性、定量測(cè)定方法。本發(fā)明利用cDNA的梯度稀釋物作為外標(biāo)準(zhǔn)品可以用于區(qū)別死活菌，更準(zhǔn)確的檢測(cè)待測(cè)樣品中的活菌數(shù)。本發(fā)明可以在不進(jìn)行釀酒酵母菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量檢測(cè)預(yù)混料樣品中的釀酒酵母，整個(gè)過程對(duì)預(yù)混料樣品中釀酒酵母的檢測(cè)程序簡單、檢測(cè)效率高、準(zhǔn)確性好，檢測(cè)周期短；從而為微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展提供技術(shù)保障。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102296117SQ20111026198
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者劉瀅, 劉鵬, 周娜, 彭子欣, 王安如 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 哈爾濱大北農(nóng)牧業(yè)科技有限公司, 漳州大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司