專利名稱：胚胎干細(xì)胞體外定向分化藥效篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種藥效篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，尤其是關(guān)于藥物誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)體外定向分化藥效篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，可高效率地對新化合物、天然藥物活性進(jìn)行快速初步篩選與評價(jià)。
研究ES細(xì)胞體外定向分化為單一類型細(xì)胞(心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)起始于90年代，主要用于(1)發(fā)育學(xué)研究；(2)組織工程學(xué)研究。ES細(xì)胞具有體外不分化的無限增殖能力，當(dāng)處于合適的培養(yǎng)條件下，可定向分化形成多種單一類型的細(xì)胞。國外約在幾年前起步對ES細(xì)胞體外定向分化研究，已有在合適的營養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)條件下，ES細(xì)胞可定向分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的報(bào)道(用于發(fā)育學(xué)、組織工程學(xué)研究)，但所獲結(jié)果ES細(xì)胞的分化成功率遠(yuǎn)低于藥物誘導(dǎo)的分化成功率(參見附

圖1)。迄今未見ES細(xì)胞體外定向分化用于藥效篩選用途。
本發(fā)明的目的是利用ES細(xì)胞在特定條件下，可分化為單一類型細(xì)胞的特性，在藥物誘導(dǎo)下，使ES細(xì)胞在體外定向分化為特定單一類型細(xì)胞，構(gòu)建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進(jìn)行藥物藥效初步篩選與評價(jià)。本發(fā)明主要分以下幾個(gè)步驟1.利用已有的ES細(xì)胞支持培養(yǎng)；2.藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)；3.利用該模型進(jìn)行藥效初步篩選與評價(jià)。
本發(fā)明利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)，主要是選用已有的小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì)胞株(ES-D3細(xì)胞株)，在培養(yǎng)基中接種于滋養(yǎng)層細(xì)胞上，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
本發(fā)明進(jìn)行的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，這類細(xì)胞包含心肌細(xì)胞，是用培養(yǎng)基將ES-D3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，再懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，擬胚體再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；加入供試藥物共培養(yǎng)，當(dāng)擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)特定指征時(shí)，則以此作為定向分化成功的指標(biāo)。對誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，則以擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)有節(jié)律性地搏動為定向分化成心肌細(xì)胞成功的指標(biāo)。根據(jù)藥物誘導(dǎo)擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)特定指征，及該藥物誘導(dǎo)分化的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以此作為藥效評價(jià)指標(biāo)。供試藥物可以是丹參、黃芪、淫羊藿苷、葛根素、銀杏黃酮等中藥活性物質(zhì)，或其它化學(xué)類藥物。
本發(fā)明所用的培養(yǎng)基是含DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清。
用本發(fā)明方法可構(gòu)建用于心肌細(xì)胞定向分化模型、神經(jīng)元定向分化模型、血管發(fā)生定向分化模型等多種單一類型細(xì)胞模型，用于相關(guān)藥物的藥效初步篩選與評價(jià)。
利用本發(fā)明方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，還可進(jìn)行心肌發(fā)育依賴性特殊基因表達(dá)的研究、心肌結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究和離子通道形成研究。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.應(yīng)用面非常廣ES細(xì)胞具有體外不分化的無限增殖能力，構(gòu)建藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化形成單一類型細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)的藥效篩選模型，可初步評價(jià)以心臟、神經(jīng)、血管等為作用靶點(diǎn)的多種創(chuàng)新藥物的藥效。藥物在誘導(dǎo)過程中，可能通過干預(yù)多個(gè)環(huán)節(jié)使ES細(xì)胞定向分化為某種單一類型細(xì)胞，因此在該模型的應(yīng)用中，只要藥物具有干預(yù)其中某個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的作用，就可初步評價(jià)藥物的藥效。
2.生物信息量大、特異性強(qiáng)ES細(xì)胞體外定向分化體系由于能夠基本模擬乃至重現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜的發(fā)育及組織器官生成過程，具備能人工控制、干預(yù)的特點(diǎn)；并且可特殊地通過ES細(xì)胞在定向分化過程中，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因狀況、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面高度模擬藥物在整體動物的作用，重現(xiàn)藥物對生物大分子調(diào)控的生命現(xiàn)象本質(zhì)，為新藥研制提供了簡單有效的體外藥效評價(jià)模型。
3.對有誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為某種單一類型細(xì)胞的創(chuàng)新藥物，該篩選模型由于可呈現(xiàn)分化的全過程，尚可提供藥物作用特異性靶點(diǎn)研究，并存在發(fā)現(xiàn)一些有治療功能基因的可能。
4.觀察與評價(jià)指標(biāo)直觀、明了，能直觀地反映藥物的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系，用于客觀評價(jià)藥效。如ES細(xì)胞與具有治療心臟疾病藥效的創(chuàng)新藥物共培養(yǎng)后，以ES細(xì)胞形成的擬胚體是否具有自發(fā)的節(jié)律性搏動為評價(jià)終點(diǎn)，如獲得的時(shí)效關(guān)系及量效關(guān)系資料與對照組有顯著性差異，即可明確其對ES細(xì)胞定向分化有誘導(dǎo)作用。
5.該藥效篩選模型仍保持常規(guī)的細(xì)胞層面篩選藥物活性的一般特點(diǎn)，如所需供試品用量少、節(jié)時(shí)省錢、效率高等，但由于在定向分化過程中富含發(fā)育依賴性生物信息，能提供更多的靶點(diǎn)供藥效評價(jià)用，因此是一個(gè)高效率、高仿真兼顧，藥效與機(jī)制研究并存的藥效篩選模型，在創(chuàng)新藥物研制、中藥活性物質(zhì)藥效評價(jià)領(lǐng)域應(yīng)用前景十分廣闊。
實(shí)施例一中藥單體淫羊藿苷誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的研究1.ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)ES-D3細(xì)胞在條件培養(yǎng)基(含DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清)中，按2×107-5×107個(gè)/ml的密度接種于滋養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞或STO細(xì)胞株)上，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
2.藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)①ES-D3細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，按20-30μL接種于培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)表面上，培養(yǎng)皿內(nèi)加入10ml D-Hanks液，將蓋子翻轉(zhuǎn)形成懸滴，置培養(yǎng)箱中懸滴培養(yǎng)2天。此后將懸滴轉(zhuǎn)入盛有10mlES細(xì)胞分化培養(yǎng)基(含DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清)的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行ES細(xì)胞集落懸浮培養(yǎng)3天，形成ES細(xì)胞擬胚體。
②附著ES細(xì)胞的分化培養(yǎng)在顯微鏡下用吸管將擬胚體轉(zhuǎn)移到24孔板內(nèi)，孵育4-5小時(shí)，使其吸附后，每孔中緩慢加入1ml ES分化培養(yǎng)基，加入中藥單體淫羊藿苷與ES細(xì)胞擬胚體共孵育。此時(shí)開始用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞，以捕捉心肌細(xì)胞開始跳動的最初時(shí)間。
3.用該模型進(jìn)行藥效評價(jià)若擬胚體細(xì)胞團(tuán)能有節(jié)律性地搏動，則以此作為定向分化成心肌細(xì)胞的指標(biāo)，作出藥物淫羊藿苷對ES-D3細(xì)胞誘導(dǎo)分化的時(shí)效關(guān)系曲線和量效關(guān)系曲線，結(jié)果見附圖1，以此作為藥效評價(jià)的指標(biāo)。附圖1中，淫羊藿苷終濃度分別為0，10-8，10-7mol·L-1.*P＜0.05，**P＜0.01***P＜0.001 vs 0mol·L-1，每個(gè)濃度n＝400擬胚體，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)做了6次。
本課題組已分別對6種心臟疾病療效明確的藥物(如丹參、黃芪、淫羊藿苷、葛根素、銀杏黃酮等)進(jìn)行誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。結(jié)果其中有3種藥物分別在與ES-D3細(xì)胞共培養(yǎng)5-7天時(shí)，就有90％以上的細(xì)胞克隆出現(xiàn)節(jié)律性搏動，并有心臟胚芽纖維蛋白表達(dá)上調(diào)。另有2種藥物與ES-D3細(xì)胞共培養(yǎng)9-11天時(shí)，均有80％以上的細(xì)胞克隆出現(xiàn)節(jié)律性搏動，同時(shí)可見心肌發(fā)育依賴性基因上調(diào)。其中以中藥單體淫羊藿苷的誘導(dǎo)作用最明顯，且具有很好的量效關(guān)系。
實(shí)施例二心肌發(fā)育依賴性特殊基因表達(dá)的研究若藥物能誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，則分別在藥物共培養(yǎng)前，藥物共培養(yǎng)后擬胚體形成時(shí)，擬胚體搏動時(shí)，進(jìn)行如下研究(1)DNA文庫克隆→培養(yǎng)后提取噬菌體DNA作模板PCR反應(yīng)擴(kuò)增→擴(kuò)增產(chǎn)物測序；(2)半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)鑒定→對一些基因進(jìn)行功能推測研究；(3)對差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR半定量鑒定→對某些基因進(jìn)行功能推測研究。
實(shí)施例三心肌結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究(1)電鏡顯示心肌結(jié)構(gòu)蛋白特征性圖譜，并以出現(xiàn)與否及其成熟程度來顯示藥物作用。
(2)蛋白電泳，western blot，評價(jià)是否有表達(dá)差異，及表達(dá)后修飾等。必要時(shí)進(jìn)行搏動擬胚體電信號采集與分析。
用本發(fā)明的藥效篩選模型能高效快速地初步評價(jià)具有改善心肌功能、抗心律失常、改善心肌供血、抗老年性癡呆、抗帕金森病、抗腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移，治療心腦血管疾病、治療糖尿病、抗肝病等藥效的創(chuàng)新藥物。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。
本發(fā)明所參考的文獻(xiàn)有1、都同功，陳系古，劉蘭英，等.小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng).中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，1999，7(1)1-4.
2、娟娟，杜冠華.藥物篩選模型研究進(jìn)展.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2001，21(4)302-304.
3、郭曉霞，賀福初.胚胎干細(xì)胞的研究與利用.科學(xué)通報(bào)，2000，45(5)467-474.
4、杜忠偉，叢笑倩.胚胎干細(xì)胞體外分化的研究進(jìn)展.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1998，20(3)102-106.
5、薛慶善主編.《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》.科學(xué)出版社.
6、Robbins J，Doctschman T，Jones WK，et al.Embryonic stem cell asa model for cardiogenesis.Trends Cardiovasc Med，1992，244-50.
7、Joseph MM，Linda CS，Elizabeth MR，et al.Embryonic stem cellcardiogenesis application for cardiovascular research.TCM，1997，7(2)63-68.
權(quán)利要求
1.一種胚胎干細(xì)胞體外定向分化藥效篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，其特征是在藥物誘導(dǎo)下，使胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)定向分化為特定單一類型細(xì)胞，構(gòu)建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進(jìn)行創(chuàng)新藥物藥效初步篩選與評價(jià)，本發(fā)明主要分以下幾個(gè)步驟(1)利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)；(2)藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)；(3)利用該模型進(jìn)行藥效初步篩選與評價(jià)。
2.如權(quán)利要求1所述的利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)，其特征是選用小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì)胞株(ES-D3細(xì)胞株)，接種于滋養(yǎng)層細(xì)胞上，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是當(dāng)誘導(dǎo)定向分化為單一類型細(xì)胞時(shí)，這類細(xì)胞包含心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)基將ES-D3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，再懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，加入供試藥物共培養(yǎng)，以擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)特定指征，作為定向分化成功的指標(biāo)。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是當(dāng)誘導(dǎo)定向分化為心肌細(xì)胞時(shí)，擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的特定指征是有節(jié)律性地搏動。
5.如權(quán)利要求3所述的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是本發(fā)明所用的培養(yǎng)基是含DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清。
6.如權(quán)利要求3所述的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是供試藥物可以是丹參、黃芪、淫羊藿苷、葛根素、銀杏黃酮等中藥活性物質(zhì)，也可以是化學(xué)類藥物。
7.如權(quán)利要求1所述的利用該模型進(jìn)行藥效評價(jià)，其特征是當(dāng)誘導(dǎo)定向分化為單一類型細(xì)胞時(shí)，這類細(xì)胞包含心肌細(xì)胞，根據(jù)藥物誘導(dǎo)擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)有節(jié)律性地搏動，該誘導(dǎo)分化的時(shí)效關(guān)系曲線和量效關(guān)系曲線差異應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，作為藥效評價(jià)指標(biāo)。
8.如權(quán)利要求1所述的模型的應(yīng)用，其特征是利用本發(fā)明方法構(gòu)建的模型，誘導(dǎo)定向分化為心肌細(xì)胞，可進(jìn)行心肌發(fā)育依賴性特殊基因表達(dá)的研究、心肌結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究和離子通道形成研究。
9.如權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞體外定向分化藥效篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，其特征是利用該方法，可構(gòu)建心肌細(xì)胞定向分化模型、神經(jīng)元定向分化模型、血管發(fā)生定向分化模型以及其它多種單一類型細(xì)胞模型，用于藥效初步篩選與評價(jià)。
全文摘要
一種胚胎干細(xì)胞體外定向分化藥效篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，是在藥物誘導(dǎo)下，使胚胎干細(xì)胞定向分化為特定單一類型細(xì)胞，構(gòu)建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進(jìn)行藥物藥效初步篩選與評價(jià)。本模型應(yīng)用只要藥物具有干預(yù)定向分化的某個(gè)或若干個(gè)作用環(huán)節(jié)，就可初步評價(jià)藥物的藥效。該模型是一種高效率藥效篩選模型，評價(jià)指標(biāo)直觀、明了。可對許多創(chuàng)新化合物、天然藥物的藥理作用進(jìn)行快速初步評價(jià)，為新藥研制提供了簡單有效的體外藥效評價(jià)模型，且該藥效篩選模型所需供試品用量少、節(jié)時(shí)省錢，富含發(fā)育依賴性生物信息，是一個(gè)高效率與高仿真兼顧，藥效與機(jī)制研究并存的藥效篩選模型。
文檔編號C12Q1/18GK1403586SQ0213729
公開日2003年3月19日 申請日期2002年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者樓宜嘉, 朱丹雁, 王志強(qiáng) 申請人:浙江大學(xué)