專利名稱：新的外切－β－1，4－葡聚糖酶/內(nèi)切－β－1，4－木聚糖酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶、編碼該酶的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術產(chǎn)生這種酶的方法。本發(fā)明還涉及含該外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的載體和宿主細胞及其在生產(chǎn)簡單糖和葡萄糖方面的用途。
背景技術：
纖維素是自然界最豐富的可再生的能源。將未經(jīng)任何化學處理的纖維素生物轉化成簡單糖或葡萄糖，作為發(fā)酵碳源生產(chǎn)酒精，是最理想和有效利用天然纖維素資源的方法之一。
通常認為，生物轉化纖維素生成葡萄糖至少需要三種不同的酶的協(xié)同作用(1)葡聚糖內(nèi)切酶(Endo-1，4-β-D-glucanase，E.C.3.2.1.4，也稱之為纖維素內(nèi)切酶)。它作用于纖維素的非結晶區(qū)，隨機水解β-1，4-糖苷鍵生成帶非還原端的較短的寡聚糖，(2)葡聚糖外切酶(Exo-1，4-β-D-glucanase，E.C.3.2.1.91)，它作用于纖維素分子的非還原末端水解β-1，4-糖苷鍵產(chǎn)生纖維二糖，(3)β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，E.C.3.2.1.21)，它將纖維二糖水解為葡萄糖。
目前，研究較為集中的是真菌和細菌的纖維素酶系。絲狀真菌中的李氏木霉(T.reesei)和綠色木霉(T.viride)以及熱纖梭菌(C.thermocellum)和cellulomonas fimi等物種的纖維素酶系較復雜，有多種亞類的內(nèi)切酶，外切酶及葡萄糖苷酶[ThomasM.Wood，Biochemical.SocietyTransactions.1992，20，46-53]，例如綠色木霉有6種亞型的內(nèi)切酶[Beldman，G.et al Eur.J.Biochem.1985，146301-308]。熱纖梭菌的纖維素酶需要同多個蛋白質形成分子量巨大的纖維體(Cellulosome)才能起催化反應[Felix C.R and L.G.Ljiungdahl，Annu.Rev.Microbiol.1993，47791-819]，顯然這樣復雜的酶系必然會給研究和應用帶來極大的困難。另一方面，純化的單一組分的內(nèi)切酶和外切酶要么不能水解未經(jīng)化學處理的天然纖維素生成簡單糖，要么水解活力極低，如李氏木霉(T.reesei)的纖維素酶系統(tǒng)中至少需14類纖維素酶的協(xié)同作用才能水解將未經(jīng)化學處理的植物纖維。
傳統(tǒng)的觀點認為動物沒有自己的纖維素酶系，需依賴共生菌的纖維素酶將纖維素水解成單糖，供生命活動需要。但是90年代末發(fā)現(xiàn)了白蟻和小龍蝦內(nèi)在的纖維素內(nèi)切酶[Hirofumi，W.Gaku，T，nathan，L Nature，1998，394330-331；Keren A.B.et al.，Gene，1999，239，317-324]。此外，在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了12種內(nèi)切酶基因[del Compillo，Curr.Top.Dev.Boil.1999，4639-61]。動物纖維素酶可能成為新的應用研究的熱點。
在地球上每年由固定CO2的光合作用就能形成100億噸以是上的干植物物質，其中這些物質的組成一半以上是由纖維素，其次是半纖維素(主要由木聚糖所構成)。如果再加上人類活動所造成的廢棄的纖維素，如稻草，麥秸等，其存在量則要以天文數(shù)字來計算。如何采用生物技術綜合利用植物干物質或廢棄的纖維素的問題上，纖維素酶和木聚糖酶(半纖維素酶)起著關鍵作用。有效地將這些天然的纖維素轉化為簡單糖是纖維素作為再生能源的關鍵。目前的纖維素酶還遠不能適應將植物纖維素轉化為簡單糖作為再生能源的需求。因此，本領域迫切需要開發(fā)不同來源的具有能高效率水解纖維素的新的纖維素酶，以及新的生產(chǎn)葡萄糖的工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶以及其片段、類似物和衍生物，及其編碼序列。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的方法以及其用途。
本發(fā)明的另一目的是提供新的生產(chǎn)簡單糖和葡萄糖的工藝。
在本發(fā)明的第一方面，提供了新穎的分離出的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該酶選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有葡聚糖外切和/或木聚糖內(nèi)切功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種具有SEQ ID NO3中77-1261位的序列；具有SEQ IDNO3中1-1293位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的制備方法，該方法包含(a)在適合表達該外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出該外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。
在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶、其編碼序列、載體或宿主細胞的用途，它們可用于生產(chǎn)簡單糖和葡萄糖，尤其是利用如稻草等植物干物質為原料。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種新的生產(chǎn)葡萄糖的工藝，包括步驟(a)用本發(fā)明上述的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶或轉化或轉導的宿主細胞處理纖維素材料，從而產(chǎn)生簡單糖；(b)分離出所述的簡單糖。較佳地，所述的纖維素材料是未經(jīng)任何化學預處理的纖維素材料。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1是內(nèi)切-Glu C蛋白水解酶水解福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶所生成的水解肽片段的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜。
圖2顯示了轉入福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶cDNA序列的宿主細胞具有水解木聚糖的活性。
圖3顯示了氯離子對福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶[外切-β-1，4-葡聚糖酶]活性的影響。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從從福壽螺(AmpullariumCrossean)中得到能有效水解未經(jīng)過任何化學處理的稻草產(chǎn)生簡單糖的纖維素酶系，分離出了纖維素外切酶和內(nèi)切酶及β-葡萄糖苷酶。其中，一種分離的福壽螺纖維素外切酶還具有聚木糖水解酶(半纖維素酶)活力，即是一種酶具有兩種酶活力的雙功能酶，依據(jù)酶分類學的原則，該酶應屬第10糖苷水解酶家族(family 10)。因此可稱該酶為外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶(exo-β-1，4-glucanase/endo-β-1，4-xylanase)，該酶的外切酶的活力不受高濃度產(chǎn)物抑制，SDS-PAGE均一的該雙功能酶能水解稻草生成簡單糖，同時還具有高比活的半纖維素酶的活性，是目前發(fā)現(xiàn)活力最高的半纖維素酶之一。在此基礎上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術語“福壽螺纖維素外切酶”“福壽螺葡聚糖外切酶”“福壽螺外切-1，4-β-D-葡聚糖外切酶”，或“外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶”可互換使用，都指具有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。這里內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶也可稱之為半纖維素酶。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶蛋白或多肽”是指外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化該外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的帶。
本發(fā)明的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶可以是重組的、天然的、合成的，優(yōu)選是重組的。本發(fā)明的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括該外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶”指具有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術語還包括具有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的、SEQ IDNO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的可溶性片段。通常，該片段具有福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶序列的至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶或多肽的類似物。這些類似物與天然福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表A

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)+非編碼序列。
術語“編碼福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的多核苷酸”可以是包括僅編碼福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽具有外切-β-1，4-葡聚糖酶活性和內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的多聚核苷酸。
本發(fā)明的福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用按常規(guī)方法所制備的福壽螺cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶編碼序列轉化的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、以及新霉素抗性，或用于大腸桿菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞。較佳地是大腸桿菌。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發(fā)明的酶還包括固定在固相載體上的固定化酶。本領域熟知的各種固定化酶技術都可用于制備本發(fā)明的固定化的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。
此外，本發(fā)明提供了外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶、其編碼序列、載體或宿主細胞的用途，它們被用于生產(chǎn)簡單糖，尤其是葡萄糖的工藝。所述的簡單糖包括纖維二糖、簡單戊糖、葡萄糖及其混合物。
本發(fā)明的生產(chǎn)簡單糖的工藝包括步驟(a)用本發(fā)明上述的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶或轉化或轉導的宿主細胞處理纖維素材料，從而產(chǎn)生簡單糖；(b)分離出所述的簡單糖。本發(fā)明酶可直接產(chǎn)生纖維二糖、簡單戊糖等簡單糖。優(yōu)選的工藝還包括加入其他酶，例如β-葡萄糖苷酶(可將纖維二糖水解為葡萄糖)，這樣就可直接產(chǎn)生葡萄糖。
一種代表性的工藝包括步驟(a)將用機械鉸碎稻草與含0.1M氯化鈉的0.05M pH5.2醋酸緩沖液按20-30％混合(按重量/體積)在45℃預熱10-15分鐘。(b)然后加入0.05-0.2％外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，緩慢攪動，在45℃水浴反應12-24小時，收集自然沉降的90％上清部分。蒸干得到葡萄糖粗品。(C)沉淀部分補加含0.1M氯化鈉的0.05M pH5.2醋酸緩沖液至原體積，緩慢攪動在45℃水浴反應24小時，收集自然沉降的90％上清部分。蒸干得到葡萄糖粗品。
本發(fā)明葡聚糖外切酶的主要優(yōu)點在于(1)活性高。本發(fā)明的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶具有最高活力的纖維素外切酶(水解微晶纖維素)和半纖維素酶之一(兩種酶的比活力為每毫克蛋白37和1300國際單位)。
(2)單一的該酶就能水解未經(jīng)任何化學處理的稻草生成簡單糖，這種性質則是已報道的纖維素酶所不具備的，該性質在水解天然纖維素上極具商業(yè)開發(fā)價值。
(3)在氯離子存在時，具有水解纖維素或半纖維素的雙重活力；在沒有氯離子存在時，只水解半纖維素。即氯離子對該纖維素酶對底物的催化反應的選擇性可進行開關式調節(jié)。這有助于擴大其應用范圍。
(4)外切酶水解纖維素的活力不受產(chǎn)物(纖維二糖)抑制，這對提高天然纖維素成糖的轉化率，降低成本都是極為有利的。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶純化福壽螺廣泛分布在中國福建、廣東，廣西，浙江，江蘇等省，福壽螺是20年前作為食用從南美引進的，其喜食秧苗，即使水質不佳，福壽螺也能成倍繁殖生長，成了河道及水稻田里的一大禍害。將市場上購得的福壽螺作為實驗材料。
(1)抽取福壽螺胃液，以0.5飽和度硫酸銨沉淀。
(2)收集沉淀，以10mM磷酸緩沖液(含0.1M氯化鈉及1mMEDTA)溶解，透析。
(3)上DEAE-Sephadex A-50柱層析純化，收集穿出峰。
(4)上Bio-gel P-100柱層析純化，收集pNPC(p-Nitrophenyl β-D-cellobioside)水解活力峰。
(5)經(jīng)苯基-Sepharose CL-4B柱層析純化，收集合并pNPC水解活力峰，即得到福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶純酶制劑。
按以上步驟，可得到SDS-PAGE均一的福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。
實施例2外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶氨基酸序列測定2.1主要試劑與儀器PVDF膜購自Millipore公司。內(nèi)切-Glu C蛋白酶購自Promega公司。DTT購自Boehringer公司。碘乙酸(ICH2COOH)購自Sigma公司。電轉膜系統(tǒng)選用LKB公司2117-250 NOVABLOT Electrophoretic Transfer Kit。
2.2外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶天然N-末端氨基酸序列測定外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶純酶制劑上樣進行SDS-PAGE，其中濃縮膠5％，分離膠10％，每孔上樣70ug，電泳電壓70V 30分鐘，再125V 90分鐘。
電泳結束后，將分離膠以半干法轉膜。轉膜結束后以0.2％麗春紅S(溶于3％三氯乙酸)染色PVDF膜1分鐘，以雙蒸水脫色，剪下外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶蛋白條帶。委托上海生化所進行蛋白氨基酸序列測定。
測得外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶天然N-末端氨基酸序列為NH2-Ala-Ala-Gly-Ala-Gly-Val-Thr-Ser-Glu-Ile(SEQ ID NO3)2.3含有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶N-末端氨基酸序列的蛋白酶水解片段測定內(nèi)切-Glu C蛋白酶水解外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶，SDS-PAGE電泳分離蛋白酶解產(chǎn)物(圖1)，電泳結束后，將分離膠以半干法轉膜。以0.2mA/cm2電流轉移12小時。轉膜結束后以0.2％麗春紅S(溶于3％三氯乙酸)染色PVDF膜1分鐘，以雙蒸水脫色，剪下圖1箭頭所示組分I，進行蛋白氨基酸序列測定(委托上海生化所)。
測得組分IN-末端氨基酸序列為NH2-Leu-Phe-Arg-I1e-Ala-His-Ala-Ala-Asp-Pro(SEQ ID NO4)實施例3外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的cDNA克隆3.1儀器PCR儀選用美國Ericomp公司SingleBlockTMsystem。
3.2 RNA抽提及反轉錄取新鮮的福壽螺的胃組織以Trizol抽提總RNA，并以oligo(dT)18為引物反轉錄生成cDNA作為PCR模板。
3.3第一步PCR根據(jù)蛋白測序所得的兩段氨基酸序列，合成以下PCR兼并引物Primer 1A5′-GCA(T/G/C) GCA(T/G/C) GGA(T/G/C) GCA(T/G/C) GGA(T/G/C)GTA(T/G/C) AC-3′(SEQ ID NO5)Primer 1B5′-GG A(G)TC A(T/G/C)GC A(T/G/C)GC A(G)TG A(T/G/C)GCA(G)AT-3′(SEQ ID NO6)以反轉錄所得cDNA為模板，進行DNA擴增反應，得到一條約600bp長度的DNA產(chǎn)物。將該DNA產(chǎn)物裝入pBluescript II SK(+)T-vector，克隆并測序，得到該基因的中部片段。
3.4第二步PCR
根據(jù)已得的基因片段，設計合成巢式PCR引物，Primer 2(外引物)5′-ACC AGC ATC AAC TGA ATG-3′(SEQ ID NO7)Primer 3(內(nèi)引物)5′-ATG ACA ATG GCT ACA AC-3′(SEQ ID NO8)巢式PCR第一步以外引物Primer 2和oligo(dT)18為引物對，第二步以內(nèi)引物Primer 3和oligo(dT)18為引物對，最后可得到一個約900bp的DNA片段。將該DNA產(chǎn)物裝入pBluescript II SK(+)T-vector，克隆并測序，得到該基因的3′端片段。
3.5第三步PCR根據(jù)已得的基因片段設計合成以下5′-RACE反轉錄引物及巢式PCR引物GSP15′-ACA TCC CAG TGC T-3′(SEQ ID NO9)GSP25′-GAG CCT TGA CCC AGT TCT G-3′(SEQ ID NO10)GSP35′-ACC GCC CAG TTG TAG TGC TGG T-3′(SEQ ID NO11)Anchor5′-GGC CTG CAG TCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTT TTT T-3′(SEQ IDNO12)UAP5′-GGC CTG CAG TCG ACT AGT AC-3′(SEQ ID NO13)以GSP1為引物反轉錄福壽螺胃組織總RNA，生成cDNA模板，經(jīng)RNaseH水解、cDNA3′端加poly(dA)尾后，以此cDNA為模板進行巢式PCR擴增，得到目的DNA片段，將該DNA片段裝入pBluescript II SK(+)T-vector，克隆并測序。該目的DNA片段即外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因的5′端片段。
3.6第四步PCR根據(jù)已得的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因的5′端片段和3′端片段，合成以下引物Primer 4A5′-CAG GCT GAC CAG AAT CCA CTA-3′(SEQ ID NO14)Primer 4B5′-TTC AAC TTT ATT GCC CTC TG-3′(SEQ ID NO1 5)以oligo(dT)18為引物反轉錄福壽螺胃組織總RNA，生成cDNA模板，選取Primer 4A和Primer 4B為引物擴增得到該基因全長片段，將該DNA片段裝入pBluescript II SK(+)T-vector，克隆并測序。所得片段全長1293bp(SEQID NO1)，其中包含開放閱讀框1188bp，5′非翻譯區(qū)77bp以及3′非翻譯區(qū)30bp，編碼含395個氨基酸殘基的葡聚糖外切酶(SEQ ID NO2)。
序列比對表明，福壽螺的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的cDNA和由此推導出的氨基酸順序與好氧菌cellulomonas fimi中的纖維素外切酶/木聚糖酶(exo-glucanase/xylanase)都有很大差異。
實施例4福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶cDNA在甲醇酵母中的表達4.1構建甲醇酵母表達菌株將實施例3中獲得的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因，經(jīng)EcoRI和NotI酶切后，裝入同樣酶切的甲醇酵母分泌型表達質粒pPIC9K中，并轉化大腸桿菌E.coli DH12S，得到含分泌型重組表達質粒pPIC9K-EGX的單克隆菌株。
抽提分泌型重組表達質粒pPIC9K-EGX，并取5μg以限制性內(nèi)切酶Bpu1102I單切線性化。
取5ug線性化質粒pPIC9K-EGX電轉化甲醇酵母GS115細胞，電轉化細胞在MD平板上篩選His+克隆。
挑取20-30個His+克隆，抽提DNA，并以PCR方法確證含有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因的克隆。
將含有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因的克隆在MM平板上篩選Mut+表型。
4.2.甲醇酵母表達菌株在液體培養(yǎng)基中的表達將含有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因的克隆接種于1ml BMG培養(yǎng)基中，30℃ 220rpm培養(yǎng)24小時。
將MG培養(yǎng)菌液以1∶200比例分別接種到5ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃ 220rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6，將菌體轉移到BMMY培養(yǎng)基中，使菌液濃度達OD600＝1.0，30℃ 220rpm培養(yǎng)7天，每24小時補加甲醇至0.5％。
離心收集菌體，測定細胞內(nèi)和細胞外的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活性。
4.3.甲醇酵母表達菌株在固體培養(yǎng)基中的表達將含有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因的克隆接種于1ml MG培養(yǎng)基(1.34％酵母基本氮源、0.1％甘油、0.1M pH6.0磷酸緩沖液、20mM氯化鈉、生物素4×10-5％)中，30℃220rpm培養(yǎng)24小時。
將MG培養(yǎng)菌液以1∶200比例分別接種到5ml BMGY培養(yǎng)基(1.34％酵母基本氮源、0.1％甘油、0.1M pH6.0磷酸緩沖液、20mM氯化鈉、生物素4×10-5％)中，30℃ 220rpm培養(yǎng)至OD600＝2-6，各取0.5μgl培養(yǎng)物點于BMMY平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7天，每24小時補加100μl甲醇于培養(yǎng)皿的上蓋。
雙蒸水沖洗去BMMY平板培養(yǎng)基(1.34％酵母基本氮源、0.1M pH6.0磷酸緩沖液、20mM氯化鈉、0.1％可溶性木聚糖、2％瓊脂粉、生物素4×10-5％、甲醇0.5％)表面的甲醇酵母菌落，加10ml 0.1％剛果紅染色40分鐘，再加1N氯化鈉溶液脫色，所顯金黃色水解斑即表明有外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶水解活力產(chǎn)生。
結果如圖2所示，大斑點為含有纖維素酶的甲醇酵母表達菌株，它生長過程釋放纖維素酶到細胞外，使固體培養(yǎng)基中的纖維素被水解成簡單糖。未轉入福壽螺葡聚糖外切酶基因的對照菌無明顯的斑點產(chǎn)生。
4.4.重組葡聚糖外切酶的分離純化1)4.2.發(fā)酵7天的培養(yǎng)液離心上清部分，用0.5飽和度硫酸銨沉淀，其沉淀即是該重組酶的粗制品。
(2)將粗制品用10mM磷酸緩沖液(含0.1M氯化鈉及1mMEDTA)溶解，透析。
(3)上DEAE-Sephadex A-50柱層析純化，收集穿出峰。
(4)上Bio-gel P-100柱層析純化，收集pNPC(p-Nitrophenyl β-D-cellobioside)水解活力峰。
(5)經(jīng)苯基-Sepharose CL-4B柱層析純化，收集合并pNPC水解活力峰，即得到福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶純酶制劑。
按以上步驟，可得到SDS-PAGE均一的福壽螺外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。
實施例5外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活力測定5.1對硝基酚纖維二糖苷(pNPC)水解活力(纖維素外切酶)測定450μl 1mg/ml pNPC(溶解于含0.1M氯化鈉的0.1M pH5.2醋酸緩沖液中)+50μl 10mg/ml D-Gluconi Acid Lactone(溶解于0.1M pH5.2醋酸緩沖液中)→45℃水浴5分鐘→加入適量酶液→45℃水浴反應8分鐘→加入525μl 2％Na2CO3終止反應，并顯色→讀取410nm處光吸收值。消光系數(shù)為1.76×10-5pM-1pNPC水解活力定義為在上述條件下，每分鐘水解生成1pmol對硝基酚(pNP)所需的酶量為1個單位(unit)。
5.2微晶纖維素(Sigmacell)水解活力測定500μl 1％ Sigamcell(懸浮于含0.1M氯化鈉的0.1M pH5.2醋酸緩沖液中)→45℃水浴預熱5分鐘→加入適量酶液，45℃水浴反應8分鐘→加入含40μg/ml葡萄糖的DNS試劑0.5ml→沸水浴5分鐘，冷水冷卻，補入0.5ml雙蒸水→讀取540nm處光吸收值。
微晶纖維素(Sigmacell)水解活力定義為在上述條件下，每分鐘水解生成1μmol葡萄糖還原當量所需的酶量為1個單位(unit)。
5.3木聚糖水解活力測定木聚糖水解活力測定采用可溶性木聚糖為底物。取木聚糖加水攪拌充分后，得到木聚糖的懸濁液，將該懸濁液離心，取上清冷凍干燥，即得到可溶性木聚糖。
500μl 1％可溶性木聚糖(溶解于含0.1M氯化鈉的0.1M pH5.2醋酸緩沖液中)？45℃水浴預熱5分鐘→加入適量酶液，45℃水浴反應8分鐘→加入含40μg/ml葡萄糖的DNS試劑0.5ml→沸水浴5分鐘，冷水冷卻，補入0.5ml雙蒸水→讀取540nm處光吸收值。
木聚糖水解活力定義為在上述條件下，每分鐘水解生成1μmol葡萄糖還原當量所需的酶量為1個單位(unit)。
5.4內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶水解活力測定200μl 1％羧甲基纖維素鈉(溶解于含0.1M氯化鈉的0.05M pH5.2醋酸緩沖液中)→45℃水浴預熱5分鐘→加入適量酶液，45℃水浴反應8分鐘→加入含40μg/ml葡萄糖的DNS試劑0.5ml→沸水浴5分鐘，冷水冷卻，補入0.5ml雙蒸水→讀取540nm處光吸收值。
5.5水解干稻草活力測定500μl干稻草懸浮液(含干稻草150mg，懸浮于含0.1M氯化鈉的0.05MpH5.2醋酸緩沖液中)→45℃水浴預熱5分鐘→加入18μg外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶，45℃水浴反應40分鐘→加入含40μg/ml葡萄糖的DNS試劑0.5ml→沸水浴5分鐘，冷水冷卻，補入0.5ml雙蒸水讀取540nm處光吸收值。然后計算還原糖生成量。
在以上條件下，以稻草為底物該酶的比活力為3.18國際單位。
測試結果總結于表1。
表1福壽螺纖維素外切酶與文獻報道的外切酶的活力比較


##Sigmacell和Avicel都是Sigma公司的微晶纖維素商品名。98年后的商品目錄已不再出現(xiàn)Avicel，只有Sigmacell#定義每分鐘水解微晶纖維素(Sigmacell)或聚木糖(birchwood)產(chǎn)生1μmol簡單糖為1個U。
實施例6氯離子對外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活力的影響在含有不同濃度氯離子的反應體系中測定外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活力，研究氯離子對外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活力的影響。
結果如圖3所示，氯離子對酶的內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶活力無明顯影響，而對外切-β-1，4-葡聚糖酶活力有明顯的激活作用，且為外切-β-1，4-葡聚糖酶活力所必需。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院生物化學與細胞生物學研究所<120>新的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶及其應用<130>023315<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1293<212>DNA<213>福壽螺(Ampullarium Crossean)<220><221>CDS<222>(77)..(1261)<223><400>1caggctgacc agaatccact accaaggacc agaggagggc atcagttttg tcgtcgacga 60cgcttcagtc aagcgc atg ccc tct ggt gct gct ggt gct ggg gtg acc agc112Met Pro Ser Gly Ala Ala Gly Ala Gly Val Thr Ser1 5 10gag atc gac aga ctg aga aga agc gac ata acg gtt cac gtg aat gtt 160Glu Ile Asp Arg Leu Arg Arg Ser Asp Ile Thr Val His Val Asn Val15 20 25ggt ggt aac atc aac cac ggt caa gtg agc att cga gtg tta caa aag 208Gly Gly Asn Ile Asn His Gly Gln Val Ser Ile Arg Val Leu Gln Lys30 35 40aga aag gca ttc ccg ttc ggg aca tgt gtg gcc gcc tgg gcc tac aac 256Arg Lys Ala Phe Pro Phe Gly Thr Cys Val Ala Ala Trp Ala Tyr Asn45 50 55 60gat ggg tcc aaa gga gca tac cgg gat ttc atc cac cag cac tac aac 304Asp Gly Ser Lys Gly Ala Tyr Arg Asp Phe Ile His Gln His Tyr Asn65 70 75tgg gcg gtg cca gaa aac tca ctc aag tgg gct agc 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權利要求
1.一種分離的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶，其特征在于，該酶選自下組(a)具有SEQ ID N02氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有葡聚糖外切和/或木聚糖內(nèi)切功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(a)編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸；(b)具有SEQ ID NO3中77-1261位的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-1293位的核苷酸序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
6.一種轉化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
7.一種外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶。
8.如權利要求1所述的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶或權利要求6所述的宿主細胞的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)簡單糖或葡萄糖的工藝。
9.一種生產(chǎn)簡單糖的方法，其特征在于，包括步驟(a)用權利要求1所述的外切-β-1，4-葡聚糖酶/內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶或權利要求6所述的宿主細胞處理纖維素材料，從而產(chǎn)生簡單糖；(b)將分離出所述的葡萄糖。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纖維素材料是未經(jīng)任何化學預處理的纖維素材料，所述的簡單糖包括纖維二糖、簡單戊糖、葡萄糖及其混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的外切－β－1，4－葡聚糖酶/內(nèi)切－β－1，4－木聚糖酶、編碼該酶的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術產(chǎn)生這種酶的方法。本發(fā)明還公開了含該外切－β－1，4－葡聚糖酶/內(nèi)切－β－1，4－木聚糖酶的載體和宿主細胞，及其在生產(chǎn)簡單糖和葡萄糖方面的用途。
文檔編號C12P19/00GK1485426SQ0213728
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月29日 優(yōu)先權日2002年9月29日
發(fā)明者趙輔昆, 王驥, 許根俊, 李燕紅, 陳清西 申請人:中國科學院生物化學與細胞生物學研究所, 中國科學院生物化學與細胞生物學研究