專利名稱：酵母細胞表達人白細胞介素10的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到人白細胞介素10的制造方法，更具體地說是關(guān)于應(yīng)用酵母細胞表達人白細胞介素10，屬于生物技術(shù)高科技研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1989年Fiorentino等發(fā)現(xiàn)鼠CD4+Th2細胞分泌一種可抑制Th1細胞產(chǎn)生細胞因子(如IFN)的物質(zhì)，稱其為細胞因子分泌抑制因子(CSIF)，后統(tǒng)一稱為白細胞介素10(IL-10)。
IL-10是正常人體的一類重要細胞因子，成熟的IL-10有160個氨基酸殘基，單體分子量為18.7KD，含有4個半胱氨酸形成的二硫鍵(12-108，62-114)。活性形式是由非共價鍵連接的分子量為39KD的同源寡二聚體。
人IL-10由多種細胞分泌，主要由Th2細胞產(chǎn)生，并對多種細胞和因子發(fā)揮免疫抑制和調(diào)節(jié)作用。IL-10可抑制T細胞、單核細胞、巨嗜細胞的活性和功能，調(diào)節(jié)B細胞、Tc、Th、肥大細胞、粒細胞、DC、角化細胞和上皮細胞的生長、分化。IL-10抑制致炎細胞因子(IL-1、IFN、TNF)、趨化因子(CC、CXC)、PGE2、NO、MHC II以及共刺激分子(IL-12、CD80/CD86)的合成、抗原提呈，下調(diào)TLR4的表達、LPS受體的信號轉(zhuǎn)導，增強CD14、CD16、CD64、CD163以及被LPS、IFN-γ和TNF下調(diào)的清除因子受體的表達，從而限制免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，最終結(jié)束炎癥反應(yīng)。
當機體處于病理狀態(tài)時，IL-10可以抑制致炎因子及其產(chǎn)生細胞的活性，保護機體免于過度的免疫病理損傷。動物實驗和人體臨床試驗證明了IL-10的抑制作用和抗炎反應(yīng)在機體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著根本的作用，提示其在器官移植和治療炎癥及自身免疫疾病方面如炎性結(jié)腸炎、克隆病(Crohns disease)、類風性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、慢性丙型肝炎具有很大的應(yīng)用潛力。IL-10在臨床治療方面表現(xiàn)出良好的安全性和生物學活性，具有極為重要的臨床應(yīng)用價值，為開發(fā)rhIL-10基因工程藥物奠定了堅實的理論基礎(chǔ)、提供了可靠的臨床依據(jù)。
隨著對IL-10在作用機理以及治療臨床疾病方面深入而廣泛的研究，一方面肯定了IL-10的生物學功能，另一方面擴展了其臨床應(yīng)用范圍；同時也表現(xiàn)出對IL-10的大量需求，所以，通過基因工程手段大規(guī)模生產(chǎn)高純度天然活性的重組hIL-10成為必然。
IL-10單體含有4個半胱氨酸形成的二硫鍵，1個N-糖基化位點，但無糖鏈，活性形式是由非共價鍵連接的同源寡二聚體。這種結(jié)構(gòu)特征決定了以分泌形式來表達rhIL-10才不會影響其天然活性的發(fā)揮。大腸桿菌是常用的基因工程菌株，在大腸桿菌中以包涵體形式表達hIL-10，是無活性的變性蛋白，經(jīng)過純化和復性，仍有部分蛋白不能形成準確的二硫鍵和適當?shù)目臻g折疊，影響了hIL-10的生物活性，而且工藝復雜，回收率低，增加了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以分泌形式來表達rhIL-10的方法，具體是應(yīng)用酵母細胞進行胞內(nèi)可溶性表達或胞外分泌性表達，這種表達提高可以有效地人白細胞介素10的空間結(jié)構(gòu)的正確折疊及其生物學活性。
本發(fā)明的方法的酵母選用His-的畢赤酵母GS115株和KM71株，整合性表達質(zhì)粒是pPIC3.5K、pPIC9K和pAO815。具體方法包括以下步驟1、按照畢赤酵母偏愛的密碼子人工合成hil-10全基因，核酸序列如下10 20 30 40 50 60ATGCATTCTT CTGCTTTGTT GTGTTGTTTG GTTTTGTTGA CTGGTGTTAG AGCTTCTCCATACGTAAGAA GACGAAACAA CACAACAAAC CAAAACAACT GACCACAATC TCGAAGAGGT70 80 90100110120GGTCAAGGTA CTCAATCTGA AAATTCTTGT ACTCATTTTC CAGGTAATTT GCCAAATATGCCAGTTCCAT GAGTTAGACT TTTAAGAACA TGAGTAAAAG GTCCATTAAA CGGTTTATAC130140150160170180TTGAGAGATT TGAGAGATGC TTTTTCTAGA GTTAAGACTT TTTTTCAAAT GAAGGATCAAAACTCTCTAA ACTCTCTACG AAAAAGATCT CAATTCTGAA AAAAAGTTTA CTTCCTAGTT190200210220230240TTGGATAATT TGTTGTTGAA GGAATCTTTG TTGGAAGATT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGTAACCTATTAA ACAACAACTT CCTTAGAAAC AACCTTCTAA AATTCCCAAT GAACCCAACA250260270280290300CAAGCTTTGT CTGAAATGAT TCAATTTTAC TTGGAAGAAG TTATGCCACA AGCTGAAAATGTTCGAAACA GACTTTACTA AGTTAAAATG AACCTTCTTC AATACGGTGT TCGACTTTTA310320330340350360CAAGATCCAG ATATTAAGGC TCATGTTAAT TCTTTGGGTG AAAATTTGAA GACTTTGAGAGTTCTAGGTC TATAATTCCG AGTACAATTA AGAAACCCAC TTTTAAACTT CTGAAACTCT370380390400410420TTGAGATTGA GAAGATGTCA TAGATTTTTG CCATGTGAAA ATAAGTCTAA GGCTGTTGAA
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2、體外構(gòu)建重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母中，進行胞外的分泌性表達和胞內(nèi)的可溶性表達2.1)體外構(gòu)建重組分泌性表達載體2.1.1)將人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10和帶有原始信號序列的hIL-10分別重組到整合型表達載體pPIC9K和pPIC3.5K的多克隆位點；2.1.2)將人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10和α-因子的融合基因以及帶有原始信號序列的hIL-10重組到載體pAO815的EcoR I位點，利用Bgl II和BamH I內(nèi)切酶在pAO815上體外構(gòu)建多拷貝表達盒；2.2)體外構(gòu)建重組胞內(nèi)可溶性表達載體2.2.1)將人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10 5’端加上起始密碼子ATG，重組到載體pPIC3.5K的多克隆位點；2.2.2)將人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10 5’端加上起始密碼子ATG，重組到載體pAO815的EcoR I位點，利用Bgl II和BamH I內(nèi)切酶在pAO815上體外構(gòu)建多拷貝表達盒；3、畢赤酵母轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Sal I或Sac I酶切成線性質(zhì)粒，通過電穿孔或原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化畢赤酵母；4、畢赤酵母表達hIL-10在畢赤酵母培養(yǎng)基中加入甲醇進行誘導表達。
真核細胞酵母中分泌表達人活性蛋白IL-10具有良好的優(yōu)勢它不僅能夠防止宿主菌對表達產(chǎn)物的降解、減輕宿主細胞代謝的負荷以及表達產(chǎn)物對宿主的毒性作用，而且能促進分泌蛋白按適當?shù)姆绞秸郫B、恢復其天然構(gòu)象和活性。尤其hIL-10的活性形式是以非共價鍵連接的同源寡二聚體，分泌表達hIL-10才有可能保持其生物學活性。利用酵母細胞進行分泌表達rhIL-10，目的蛋白將會大量分泌到培養(yǎng)液中，能夠形成準確的二硫鍵和正確的空間結(jié)構(gòu)，保持了hIL-10天然活性；由于不受宿主菌體細胞內(nèi)蛋白的影響，減少了純化工藝，提高了回收率；同時酵母細胞結(jié)構(gòu)簡單、生長快速、易于培養(yǎng)和發(fā)酵、生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高。


圖1是構(gòu)建帶有原始信號序列的分泌性表達載體p3K/shIL圖2是構(gòu)建帶有α因子信號序列的分泌性表達載體p9K/nshIL圖3是構(gòu)建單拷貝非分泌性表達載體pAO/nshIL圖4是構(gòu)建單拷貝帶有原始信號序列的分泌性表達載體pAO/shIL圖5是構(gòu)建單拷貝帶有α因子信號序列的分泌性表達載體pAO/ahIL圖6是構(gòu)建多拷貝表達載體具體實施方式
1.人工合成hIL-10全基因，核苷酸序列如下10 20 30 40 50 60ATGCATTCTT CTGCTTTGTT GTGTTGTTTG GTTTTGTTGA CTGGTGTTAG AGCTTCTCCATACGTAAGAA GACGAAACAA CACAACAAAC CAAAACAACT GACCACAATC TCGAAGAGGT70 80 90100110120GGTCAAGGTA CTCAATCTGA AAATTCTTGT ACTCATTTTC CAGGTAATTT GCCAAATATGCCAGTTCCAT GAGTTAGACT TTTAAGAACA TGAGTAAAAG GTCCATTAAA CGGTTTATAC130140150160170180TTGAGAGATT TGAGAGATGC TTTTTCTAGA GTTAAGACTT TTTTTCAAAT GAAGGATCAAAACTCTCTAA ACTCTCTACG AAAAAGATCT CAATTCTGAA AAAAAGTTTA CTTCCTAGTT190200210220230240TTGGATAATT TGTTGTTGAA GGAATCTTTG TTGGAAGATT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGTAACCTATTAA ACAACAACTT CCTTAGAAAC AACCTTCTAA AATTCCCAAT GAACCCAACA250260270280290300CAAGCTTTGT CTGAAATGAT TCAATTTTAC TTGGAAGAAG TTATGCCACA AGCTGAAAATGTTCGAAACA GACTTTACTA AGTTAAAATG AACCTTCTTC AATACGGTGT TCGACTTTTA310320330340350360CAAGATCCAG ATATTAAGGC TCATGTTAAT TCTTTGGGTG AAAATTTGAA GACTTTGAGAGTTCTAGGTC TATAATTCCG AGTACAATTA AGAAACCCAC TTTTAAACTT CTGAAACTCT370380390400410420
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2.構(gòu)建畢赤酵母整合型表達載體方式如下2.1)本發(fā)明所使用的畢赤酵母菌株GS115(HIS-)及其表達載體pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815均來自于Invitrogen公司。
2.2)構(gòu)建表達重組質(zhì)粒的方法如下2.2.1)使用引物PCR擴增人工合成的hIL-10基因，上游引物5’端含有EcoR I酶切序列，下游引物3’端含有Not I酶切序列。
PCR反應(yīng)按下列試劑調(diào)配模板1μl上游引物0.5μl下游引物0.5μl10×reaction buffer 5μlMgCl23μldNTP3μlDNA聚合酶Taq2U無菌水 up to 50μl置于DNA擴增儀上按94℃，4min；94℃，30sec，55℃，20sec，72℃，20sec，循環(huán)35次；72℃，10min。取5μl擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖電泳，90V，15min。在紫外燈下觀察并拍照。
2.2.2)上述PCR擴增的DNA片段大小與預(yù)期的大小符合時，使用OMEGA GEL EXTRACT KIT回收片段，具體操作按試劑盒說明書進行。
2.2.3)酶切PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒反應(yīng)液組成如下，PCR產(chǎn)物 質(zhì)粒(pPIC3.5K或pPIC9K)
底物50μl 50μl10×H buffer10μl 10μlBSA 10μl 10μlNot I 10U10UEcoR I 10U10U無菌水 up to 100μl up to 100μl37℃，3小時后，按照2.2.2)方法進行片段回收。
2.2.4)連接反應(yīng)酶切PCR產(chǎn)物10μl酶切質(zhì)粒 5μl10×ligase buffer 2μlT4 ligase 1μl無菌水 up to 20μl16℃，過夜。
2.2.5)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α大腸桿菌感受態(tài)制備按常規(guī)方法進行。取上述連接產(chǎn)物10μl與感受態(tài)細菌100μl小心混合，4℃，30min，42℃，2min，然后加入500μl LB培養(yǎng)液，37℃，30min，6000rpm，室溫離心1min，其上清550μl，剩余溶液懸浮細菌沉淀，全部菌液涂Amp-LB平板，37℃培養(yǎng)14小時。
2.2.6)酶切鑒定隨機挑取4個單菌落接種到5ml Amp-LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)12小時，使用OMEGA MINIPREP PLASIMAD KIT抽提質(zhì)粒，按試劑盒說明書操作。酶切體系組成如下重組質(zhì)粒 10μl10×H buffer 2μlBSA10μlNot I 10U無菌水 up to 20μl2.3)帶有原信號序列的shIL-10與整合型表達載體pPIC3.5K的重組(如圖1示)引物擴增shIL-10基因(全長537bp)，并在5端和3端分別加上EcoR I和Not I的酶切序列，用EcoR I和Not I分別雙酶切shIL-10和表達載體pPIC3.5K，將shIL-10插入到pPlC3.5K上，獲得p3K/shIL重組質(zhì)粒。
2.4)無信號序列的nshIL-10與pPIC9K重組質(zhì)粒的構(gòu)建(如圖2示)
引物擴增nshIL-10基因(全長480bp)，并在5端和3端分別加上EcoR I和Not I的酶切序列，用EcoR 1和Not I分別雙酶切nshIL-10和表達載體pPIC9K，將nshIL-10處插入到pPIC9K上，獲得p9K/nshIL重組質(zhì)粒。
2.5)體外構(gòu)建多拷貝hIL-10表達盒2.5.1)構(gòu)建方法帶有EcoR I酶切序列的引物分別PCR擴增基因nshIL-10、shIL-10、αhIL-10，回收PCR產(chǎn)物并用EcoR I酶切。同時用EcoR I酶切pA0815質(zhì)粒，37℃，2小時；加入等體積的酚/氯仿，振蕩，13200rpm離心5min；取上清再加入等體積的氯仿，振蕩，13200rpm離心5min；取上清，加入1/10 3M NaAc，2倍體積的無水乙醇，-30℃ 30min；4℃，13200rpm離心10min，其上清，沉淀用70％冷乙醇漂洗兩次，室溫干燥；加入pH8.0的無菌水懸浮沉淀。
EcoR I酶切pAO815質(zhì)粒的去磷酸化pAO815/EcoR I 20μl10×CIAP buffer 5μlCIAP3μl無菌水 up to 50μl37℃，30min。用酚/氯仿抽提后，與EcoR I酶切的nshIL-10、shIL-10、αhIL-10連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，涂平板培養(yǎng)，挑單菌落接種Amp-LB液振蕩培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，EcoR I酶切鑒定目的基因是否重組到pAO815質(zhì)粒上(方法同上)；然后再用HindIII和BamH I鑒定重組質(zhì)粒的目的基因正反方向重組質(zhì)粒(pAO/nshIL、 10μlpAO/shIL、pAO/ahIL)10×K buffer2μlBamH I 5UHindIII 5U無菌水 up to 20μl37℃，3小時，取10μl進行1％瓊脂糖電泳，在紫外燈下觀察并拍照。如果除了有約7.7kb之外，還有640bp的片段，說明目的片段在pAO815載體上是正向，若沒有640bp條帶，是其他條帶則為反向。
2.5.2)無信號序列的nshIL-10 5’端加上起始密碼子ATG，再在5’端和3’端加上EcoRI的酶切序列；EcoR I酶切后將其連接到經(jīng)過EcoR I酶切和堿性磷酸酶去磷酸化的質(zhì)粒pAO815上，篩選正向重組質(zhì)粒pAO/nhIL(如圖3示)。
2.5.3)帶有原始信號序列的shIL-10在5’端和3’端加上EcoR I的酶切序列；EcoR I酶切后將其連接到經(jīng)過EcoR I酶切和堿性磷酸酶去磷酸化的質(zhì)粒pAO815上，篩選正向重組質(zhì)粒pAO/shIL(如圖4示)。
2.5.4)將酵母的分泌信號序列α-factor連接在hIL-10的5’端，形成融合基因αhIL-10，再在該融合基因的5’端和3’端加上EcoR I的酶切序列；EcoR I酶切后將其連接到經(jīng)過EcoRI酶切和堿性磷酸酶去磷酸化的質(zhì)粒pAO815上，篩選正向重組質(zhì)粒pAO/ahIL(如圖5示)。
2.5.5)上述方法構(gòu)建的重組質(zhì)粒pAO/nshIL、phO/shIL、pAO/ahIL分別用Bgl I和BamH I雙切，回收約2200bp的片段，即為單拷貝表達盒，純化液加入T4連接酶及其緩沖液，共20μl，16℃進行過夜連接反應(yīng)；然后加入Bgl II 2U、BamH I 2U、10×K buffer 10μl、無菌水至100μl，37℃ 2小時，目的在于酶切消除頭-頭、尾-尾連接的表達盒；酶切產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提和乙醇沉淀(方法同上)后與其對應(yīng)的并經(jīng)BamH I酶切及去磷酸化處理的重組質(zhì)粒(含對應(yīng)的單拷貝表達盒)連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑單菌落，抽提質(zhì)粒，再用Bgl II和BamH I進行酶切鑒定和篩選，電泳觀察除了有4028bp和2393bp之外，還有2039bp(pAO/ahIL)或1829bp(pAO/shIL)或1769bp(pAO/hIL)，4076(2×2039)bp(pAO/ahIL)或3658(2×1829)bp(pAO/shIL)或3538(2×1769)bp(pAO/hIL)，6117(3×2039)bp(pAO/ahIL)或5487(3×1829)bp(pAO/shIL)或5307(3×1769)bp(pAO/hIL)……，則表示是1、2、3……等多拷貝表達盒的條帶及質(zhì)粒條帶，挑選含最多拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒進一步轉(zhuǎn)化畢赤酵母(如圖6示)。
3.重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母及體內(nèi)篩選多拷貝表達盒的酵母轉(zhuǎn)化子3.1)由上述方式構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I酶切線性化后，應(yīng)用電穿孔法或原生質(zhì)體法將重組質(zhì)粒整合到畢赤酵母染色體上。
3.1.1)電穿孔法接種His-畢赤酵母GS115單菌落于500ml YPD培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)，至OD600約為1.3-1.5。4℃，3000rpm，離心5min，收集細胞，250ml冰凍的無菌水懸浮沉淀；按此法用冰凍無菌水再洗一次，冰凍1M山梨醇洗兩次后，將酵母細胞懸浮于1ml山梨醇中。取5-20μg經(jīng)Sal I酶切線性化的DNA，與80μl電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞混合于冰凍的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰上孵育5分鐘。
應(yīng)用電轉(zhuǎn)儀BIO-PAD Gene Pulse XcellTMElectroporation System，以電壓2000V、電容25μF、電阻200Ω進行電穿孔，然后加入1ml冰凍的1M山梨醇，取200-600μl溶液涂MD平板。30℃培養(yǎng)，挑選單菌落。
3.1.2)原生質(zhì)體法His-畢赤酵母GS115經(jīng)培養(yǎng)至OD600為0.2-0.3，3000rpm，室溫離心5min，收集細胞，依次用20ml無菌水、20mlSED、20ml 1M山梨醇、20mlSCE洗滌，最后重懸于1mlSCE液中。加入1μl 1mg/ml的Lyticase(Sigma產(chǎn)品)，30℃消化細胞壁約15min，2500rpm離心5min，獲得原生質(zhì)體，再用20ml 1M山梨醇、20ml CaS各洗1次，最后懸浮于0.6ml的CaS中。取原生質(zhì)體100μl，加入10μg經(jīng)Sal I酶切線性化的重組質(zhì)粒室溫孵育10min，再加入1mlPEG/CaT室溫孵育10min，經(jīng)2000rpm室溫離心10min，沉淀用150μlSOS液懸浮，室溫放置20min后與850μl 1M山梨醇緩慢混合，取100μl與2ml RD軟瓊脂上層培養(yǎng)基混合后涂布RD平板，30℃培養(yǎng)6天。挑選單菌落。
3.2)G418篩選多拷貝表達盒的酵母轉(zhuǎn)化子從RD平板或MD平板上挑選50個重組子接種在MD平板上，然接種在含200μl YPD培養(yǎng)液的96孔板傳代三次，使每個重組子的濃度基本一致，各取10μl接種在含不同濃度G418(0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/ml)YPD平板上，30℃培養(yǎng)。挑選抗高濃度的重組子(即含有多拷貝表達盒的轉(zhuǎn)化子)做誘導表達。
4.畢赤酵母轉(zhuǎn)化子誘導表達hIL-10蛋白將含多拷貝表達盒的轉(zhuǎn)化子單菌落接種到20ml BMGY中，30℃振蕩培養(yǎng)48小時，收集菌體并懸浮于10ml BMMY中，30℃振蕩培養(yǎng)，每隔12小時取樣1ml并每24小時補加0.5％的甲醇。分離5天取樣上清，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE和Western Blotting進行鑒定和檢測，篩選表達量高的重組子進行大量誘導培養(yǎng)。
附溶液配方1.LB培養(yǎng)基(pH至7.0)胰蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl 10gLB固體培養(yǎng)基再加入2％的瓊脂2.YPD培養(yǎng)基蛋白胨 2％酵母提取物 1％葡萄糖 2％YPD固體培養(yǎng)基再加入2％的瓊脂。
3.MD固體培養(yǎng)基酵母含氮堿基 1.34％生物素 4×10-5％葡萄糖 2％瓊脂 2％4.RD固體培養(yǎng)基酵母含氮堿基 1.34％生物素 4×10-5％葡萄糖 2％山梨醇 1M無組氨酸的混合氨基酸 0.005％上層軟瓊脂 0.8％
下層瓊脂 2％5.SCE山梨醇 1MEDTA1mM檸檬酸緩沖液(pH5.8) 10mM6.SED1ml DTT+19ml SE(1M山梨醇，25mM EDTA(pH8.0)7.CaS山梨醇 1MTris-HCl(pH7.5) 10mMCaCl210mM8.SOS山梨醇 1MYPD 0.3倍CaCl210mM9.CaTTris pH7.5 20mMCaCl220mM10.BMGY蛋白胨 2％酵母提取物 1％酵母含氮堿基1.34％生物素 4×10-5％葡萄糖 2％磷酸鉀緩沖液pH6.0 100mM甘油1％11.BMMY蛋白胨 2％酵母提取物 1％酵母含氮堿基1.34％生物素 4×10-5％葡萄糖 2％磷酸鉀緩沖液pH6.0 100mM甲醇0.5％
權(quán)利要求
1.一種制造重組人白細胞介素10的方法，其特征是應(yīng)用酵母表達人白細胞介素10。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的制造重組人白細胞介素10的方法，其特征是酵母選用His-的畢赤酵母GS115株和KM71株。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的制造重組人白細胞介素10的方法，其特征是包括以下步驟1)按照畢赤酵母偏愛的密碼子人工合成hIL-10全基因，核酸序列如下10 20 30 40 50 60ATGCATTCTT CTGCTTTGTT GTGTTGTTTG GTTTTGTTGA CTGGTGTTAG AGCTTCTCCATACGTAAGAA GACGAAACAA CACAACAAAC CAAAACAACT GACCACAATC TCGAAGAGGT70 80 90100110120GGTCAAGGTA CTCAATCTGA AAATTCTTGT ACTCATTTTC CAGGTAATTT GCCAAATATGCCAGTTCCAT GAGTTAGACT TTTAAGAACA TGAGTAAAAG GTCCATTAAA CGGTTTATAC130140150160170180TTGAGAGATT TGAGAGATGC TTTTTCTAGA GTTAAGACTT TTTTTCAAAT GAAGGATCAAAACTCTCTAA ACTCTCTACG AAAAAGATCT CAATTCTGAA AAAAAGTTTA CTTCCTAGTT190200210220230240TTGGATAATT TGTTGTTGAA GGAATCTTTG TTGGAAGATT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGTAACCTATTAA ACAACAACTT CCTTAGAAAC AACCTTCTAA AATTCCCAAT GAACCCAACA250260270280290300CAAGCTTTGT CTGAAATGAT TCAATTTTAC TTGGAAGAAG TTATGCCACA AGCTGAAAATGTTCGAAACA GACTTTACTA AGTTAAAATG AACCTTCTTC AATACGGTGT TCGACTTTTA310320330340350360CAAGATCCAG ATATTAAGGC TCATGTTAAT TCTTTGGGTG AAAATTTGAA GACTTTGAGAGTTCTAGGTC TATAATTCCG AGTACAATTA AGAAACCCAC TTTTAAACTT CTGAAACTCT370380390400410420TTGAGATTGA GAAGATGTCA TAGATTTTTG CCATCTGAAA ATAAGTCTAA GGCTGTTGAAAACTCTAACT CTTCTACAGT ATCTAAAAAC GGTACACTTT TATTCAGATT CCGACAACTT430440450460470480CAAGTTAAGA ATGCTTTTAA TAAGTTGCAA GAAAAGGGTA TTTACAAGGC TATGTCTGAAGTTCAATTCT TACGAAAATT ATTCAACGTT CTTTTCCCAT AAATGTTCCG ATACAGACTT490500510520530540TTTGATATTT TTATTAATTA CATTGAGGCT TACATGACTA TGAAGATTAG AAATTAA...AAACTATAAA AATAATTAAT GTAACTCCGA ATGTACTGAT ACTTCTAATC TTTAATT...2)外構(gòu)建重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母中，進行胞外的分泌性表達和胞內(nèi)的可溶性表達(1)體外構(gòu)建重組分泌性表達載體A、人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10和帶有原始信號序列的hIL-10分別重組到整合型表達載體pPIC9K和pPIC3.5K的多克隆位點；B、將人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10和α-因子連接而成的融合基因以及帶有原始信號序列的hIL-10重組到載體pAO815的EcoR I位點，利用Bgl II和BamH I內(nèi)切酶在pAO815上體外構(gòu)建多拷貝表達盒；(2)體外構(gòu)建重組胞內(nèi)可溶性表達載體A、將人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10 5’端加上起始密碼子ATG，重組到載體pPIC3.5K的多克隆位點；B、將人工合成的不帶原始信號序列的hIL-10 5’端加上起始密碼子ATG，重組到載體pA0815的EcoR I位點，利用Bgl II和BamH I內(nèi)切酶在pA0815上體外構(gòu)建多拷貝表達盒；3)畢赤酵母的轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Sal I或Sac I酶切成線性質(zhì)粒，通過電穿孔或原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化畢赤酵母；4)畢赤酵母表達hIL-10在畢赤酵母培養(yǎng)基中加入甲醇進行誘導表達hIL-10。
全文摘要
本發(fā)明是酵母細胞表達人白細胞介素10的方法，技術(shù)方案是人工合成hIL－10全基因序列，包括hIL－10的帶有其信號序列和不帶信號序列，分別記為shIL－10和nshIL－10，給其兩端加上EcorR I和Not I酶切序列或兩端都加上EcorR I酶切序列，用EcoR I和Not I分別雙酶切目的基因shIL－10、nshIL－10以及畢赤酵母的整合型表達載體pPIC3.5K、pPIC9K，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC3.5K/shIL、pPIC9K/nshIL，然后通過電穿孔、原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞，重組質(zhì)粒和目的基因整合到酵母染色體上，應(yīng)用甲醇誘導畢赤酵母進行胞內(nèi)可溶性表達或胞外分泌型表達。本發(fā)明與現(xiàn)有在大腸桿菌中表達相比，提高人白細胞介素10的空間結(jié)構(gòu)的正確折疊及其生物學活性，具有明顯的優(yōu)勢①酵母細胞表達hIL－10，不形成變性蛋白的包涵體，蛋白為可溶形式表達，直接形成活性蛋白；②可溶性活性蛋白有利于純化，純化得率高，避免包涵體復性時的損失。
文檔編號C12P21/02GK1506463SQ0212800
公開日2004年6月23日 申請日期2002年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月7日
發(fā)明者鄒全明, 井申榮 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學