專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新型重組組織型纖溶酶原激活劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型重組組織型纖溶酶原激活劑及其制備方法。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新型重組組織型纖溶酶原激活劑分子，并通過(guò)酵母菌分泌表達(dá)，分離純化，從而獲取本發(fā)明的新型重組組織型纖溶酶原激活劑，可進(jìn)一步獲取新型的溶栓藥物。
本發(fā)明利用甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母(市售)(Pichia pastoris，亦稱(chēng)畢赤酵母)基因表達(dá)體系，該體系以醇氧化酶(AOX1)為啟動(dòng)子，新型重組組織型纖溶酶原激活劑(Nr-PA)基因經(jīng)轉(zhuǎn)化穩(wěn)定地整合于酵母染色體上，該酵母可將有活性的表達(dá)產(chǎn)物直接分泌于細(xì)胞外培養(yǎng)上清中，而且自身的蛋白分泌卻很少，從而有利于下游的純化制備。
本發(fā)明采用下列技術(shù)方案和步驟(1)設(shè)計(jì)新型重組組織型纖溶酶原激活劑分子結(jié)構(gòu)，去除天然組織型纖溶酶原激活劑(human tissue type plasminogen activator，t-PA)結(jié)構(gòu)中1-173位氨基酸，保留174-527位氨基酸，即去除t-PA的指形區(qū)(F區(qū))，表皮生長(zhǎng)因子區(qū)(E區(qū))和大部分的K1三角區(qū)，保留部分K1三角區(qū)，K2三角區(qū)和輕鏈區(qū)(P區(qū))。利用PCR技術(shù)，以質(zhì)粒pcDNA3-tPA為模板，設(shè)計(jì)上游和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Nr-PA基因，然后與質(zhì)粒pUC19(市售)重組，酶解篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證是否獲得了與預(yù)先設(shè)計(jì)相符的Nr-PA基因。Nr-PA基因再與酵母表達(dá)載體pPIC9K(市售)重組，形成表達(dá)質(zhì)粒pSTPA-G，表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化酵母菌，酵母菌經(jīng)篩選獲得高表達(dá)的工程菌株。(2)發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)用酵母培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，誘導(dǎo)前用甘油溶液進(jìn)行補(bǔ)料，到達(dá)一定的菌體濃度(OD600約為200)后用甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵參數(shù)為溫度30-32℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動(dòng)。(3)以甲醇誘導(dǎo)酵母表達(dá)新型重組組織型纖溶酶原激活劑(Nr-PA)，表達(dá)產(chǎn)物以可溶的形式存在于表達(dá)上清中，工程菌發(fā)酵后離心收集上清，再通過(guò)超濾濃縮，凝膠過(guò)濾，離子交換，三步法純化獲得產(chǎn)品。(4)產(chǎn)品經(jīng)生物學(xué)活性測(cè)定，具有顯著的纖溶活性。
2.篩選高拷貝高效表達(dá)的工程菌株。
表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母菌GS115，使目的基因與酵母染色體重組，用G418篩選高效表達(dá)的工程菌株，并用PCR的方法檢測(cè)目的基因，檢定陽(yáng)性重組克隆菌，挑取上述陽(yáng)性克隆菌接種于10ml低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液BMG(含13.4g/L酵母氮源堿基(YNB)，4×10-4g/L生物素，10g/L甘油，100mmol/L磷酸鉀，pH6.0)中，30℃快速振搖250r/min，至培養(yǎng)液中光密度OD600＝2-6時(shí)，離心棄除BMG培液，無(wú)菌水洗滌1次，再加入BMM培液(含13.4g/L酵母氮源堿基(YNB)，4×10-4g/L生物素，5g/L甲醇，100mmol/L磷酸鉀，pH6.0)，稀釋至OD600＝1，每天補(bǔ)加體積百分?jǐn)?shù)為0.5％的甲醇，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，每隔12小時(shí)取樣1ml，離心棄除沉淀，取培養(yǎng)上清液10μl，加到酪蛋白板上預(yù)先打好的孔內(nèi)，測(cè)定其纖溶活性。結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有顯著的纖溶活性。
3.工程菌的發(fā)酵表達(dá)按上法篩選的高拷貝高表達(dá)的工程菌株作為工程菌，然后以5L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，在室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級(jí)潔凈度條件下劃YPD平板，30℃溫箱中培養(yǎng)2-3天，從YPD平板上挑取單菌落，同樣在100級(jí)潔凈度條件下接種于10ml BMG培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，此為一級(jí)種子液，再將一級(jí)種子液加入90mlBMG培液中，30℃培養(yǎng)直至OD600≈6，此為二級(jí)種子液，再將二級(jí)種子液，接入5L發(fā)酵罐中自然增殖，待發(fā)酵罐中OD600達(dá)到200左右，開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)，甲醇誘導(dǎo)30小時(shí)以后，停止發(fā)酵。離心沉淀菌體，收集上清進(jìn)行純化。發(fā)酵參數(shù)為溫度30-32℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動(dòng)。
4.超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清經(jīng)超濾裝置超濾濃縮且脫去無(wú)機(jī)鹽。
5.Sephadex G-75及Q-Sepharose FF柱層析超濾濃縮脫鹽后先以Sephadex G-75凝膠過(guò)濾，然后以10倍柱體積PB緩沖液平衡Q-Sepharose FF色譜柱，凝膠過(guò)濾后溶液直接上柱，Waters色譜儀控制流速和檢測(cè)蛋白峰。上樣結(jié)束后，以PB緩沖液洗至基線，0-1mol/lNaCl梯度洗脫，收集洗脫組分，SDS-PAGE法分析目的蛋白。
6.純度鑒定及分子量測(cè)定樣品進(jìn)行15％SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色后，PharmaciaImagemaster VDS掃描測(cè)定純度，分子量。目的蛋白純度＞95％，分子量約為39KD。
7.生物活性鑒定(1)酪蛋白板溶圈法取經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的酵母菌培養(yǎng)上清液10μl，直接加到酪蛋白板上孔內(nèi)，37℃濕盒過(guò)夜，觀察溶圈的大小，與標(biāo)準(zhǔn)t-PA溶圈進(jìn)行比較，測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的纖溶活性。結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶活性，培液中纖溶活性大于3000IU/ml。(2)翻轉(zhuǎn)板法SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，電泳結(jié)束以后，將凝膠分為兩半，一半進(jìn)行考馬斯亮蘭R-250染色，可見(jiàn)誘導(dǎo)后酵母菌培養(yǎng)上清在分子量約為39KD處有一濃集條帶，另一半洗去SDS后，貼在酪蛋白凝膠板上，37℃濕盒過(guò)夜后，相當(dāng)于39KD處有一明顯的透亮區(qū)，即此部位的酪蛋白已降解，表明表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶活性。
其中1標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量(λDNA/Hind III+EcoR I.)；2pSTPA-G用Not I酶切所產(chǎn)生的片段(1.0kb，9.3kb)；3pSTPA-G用EcoR I酶切所產(chǎn)生的片段(0.47kb，9.8kb)4pSTPA-G用Xhol I和Sal I酶切所產(chǎn)生的片(2.5kb+3.0kb+4.8kb)；圖4是本發(fā)明酪蛋白板溶圈法測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物纖溶活性其中1-5.t-PA標(biāo)準(zhǔn)品的纖溶活性(100IU/ml，50IU/ml，25IU/ml，12.5IU/ml，6IU/ml)6.陰性對(duì)照品7.工程菌酵母發(fā)酵誘導(dǎo)前的表達(dá)上清液8-13.工程菌發(fā)酵誘導(dǎo)后1-6天的表達(dá)上清液的纖溶活性新型重組組織型纖溶酶原激活劑序列表.txt序列表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>一種新型重組組織型纖溶酶原激活劑及其制備方法<130>無(wú)<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210>1<211>354<212>PRT<213>重組蛋白質(zhì)<220><221>CHAIN<222>(1)..(354)<223><400>1Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg1 5 10 15Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn20 25 30Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala35 40 45Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly50 55 60Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp65 70 75 80Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr85 90 95Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala
新型重組組織型纖溶酶原激活劑序列表.txt100 105 110Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro115 120 125Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile130 135 140Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu145 150 155 160Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu165 170 175Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp180 185 190Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser195 200 205Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro210 215 220Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly225 230 235 240Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys245 250 255Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His260 265 270Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr275 280 285Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp290 295 300
新型重組組織型纖溶酶原激活劑序列表.txtSer Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val305 310 315 320Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly325 330 335Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met340 345 350Arg Pro
核苷酸引物序列表.txt核苷酸序列表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>一種新型重組組織型纖溶酶原激活劑及其制備方法<130>無(wú)<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>核苷酸<400>1gcggccgcct ctgagggaaa cagt 24<210>2<211>35<212>DNA<213>核苷酸<400>2atagcggccg ctcacggtcg catgttgtca cgaat 3權(quán)利要求
1.一種新型重組組織型纖溶酶原激活劑，其特征在于去除天然t-PA多肽鏈中1-173位氨基酸，保留174-527位氨基酸，即去除天然t-PA的指形區(qū)(F區(qū))，表皮生長(zhǎng)因子區(qū)(E區(qū))和大部分的K1三角區(qū)，而保留部分K1三角區(qū)，K2三角區(qū)和輕鏈區(qū)(P區(qū))。
2.一種新型重組組織型纖溶酶原激活劑的制備方法，其特征在于采用下列步驟(1)以質(zhì)粒pcDN3-tPA為模板，設(shè)計(jì)上游和下游引物通過(guò)PCR擴(kuò)增構(gòu)建新型重組組織型纖溶酶原激活劑基因，與質(zhì)粒pUC19重組，酶解篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證；(2)新型重組組織型纖溶酶原激活劑基因與酵母菌表達(dá)質(zhì)粒載體重組，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSTPA-G，轉(zhuǎn)化酵母菌，篩選高表達(dá)的工程菌；(3)發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)用低鹽培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，菌體濃度達(dá)到OD600為200后用甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵參數(shù)為溫度30-32℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動(dòng)；(4)甲醇誘導(dǎo)酵母菌表達(dá)新型重組組織型纖溶酶原激活劑，工程菌發(fā)酵后，經(jīng)離心，收集上清，超濾濃縮，凝膠過(guò)濾和離子交換三步法純化，獲得終產(chǎn)物新型重組組織型纖溶酶原激活劑。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)PCR的方法構(gòu)建新型組織型纖溶酶原激活劑的基因,即去除編碼天然組織型纖溶酶原激活劑分子結(jié)構(gòu)中的指形區(qū),表皮生長(zhǎng)因子區(qū)和大部分的K1三角區(qū),但保留部分K
文檔編號(hào)C12N15/58GK1380416SQ0211132
公開(kāi)日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2002年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月10日
發(fā)明者宋后燕, 張業(yè)民 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)