專利名稱：Udp-n-乙酰半乳糖胺和含n-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及UDP-N-乙酰半乳糖胺和含有N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生產(chǎn)方法。某些含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物在癌細(xì)胞等中特異性表達(dá)，因而可用作抗癌治療的抗癌疫苗等。進(jìn)一步，由于腦中存在豐富的含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物，預(yù)計其可適用于提高腦功能。UDP-N-乙酰半乳糖胺可用作合成含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的底物。
背景技術(shù)：
關(guān)于UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下縮寫為UDP-GalNAc)的生產(chǎn)，已有公知的生產(chǎn)方法，其利用源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的無細(xì)胞提取物或部分純化的酶[美國專利號4,569,909；J.Biol.Chem.，234，2801(1959)；Agr.Biol.Chem.，37，1741(1973)；Appl.Environ.Microbio.，41，392(1981)；Microbiol.Immunol.，30，1085(1986)；Agr.Biol.Chem.，49，603(1985)]。然而，上述方法生產(chǎn)UDP-GalNAc的得率低，且源自枯草芽孢桿菌的UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向異構(gòu)酶(EC5.1.3.7，以下縮寫為UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶)或編碼UDP-GlcNAc4-差向異構(gòu)酶的基因尚未詳細(xì)說明。
至于源自微生物的UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶，有報道指出源自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的WbpP蛋白具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶的活性[J.Biol.Chem.，275，19060(2000)]，但尚無用蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的DNA來制備UDP-GalNAc的報道。
另一方面，至于UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.2)，已知源自倉鼠和人的酶也以UDP-GlcNAc為底物[Cell，44，749(1986)]，但尚無報道顯示源自大腸桿菌(Escherichia coli)的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶[Nucleic Acid Res.，14，7705(1986)]具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶的活性。另外，上文所提及的源自銅綠假單胞菌的WbpP蛋白與已知的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶沒有同源性。
源自下列微生物的已知蛋白質(zhì)被認(rèn)為是UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(galE)，因為其與已知的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列有較高的同源性枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)、Arabidopsis thaliana、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、空腸彎曲桿菌空腸亞種(Campylobacter jejuni)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、黏膜炎麼拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、Pisum sativum、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、Cyamopsis tetragonoloba、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Aquifexaeolicus、集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis sp.)、巴西固氮螺菌(Azospiriumbrasilense)、苜宿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、嗜熱堿甲烷桿菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、馬紅球菌(Rhodococcus equi)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)、耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritma)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、鹽桿菌屬(Halobacterium sp.)NRC-1、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和唾液鏈球菌氏熱亞種(Streptococcus thermophilus)。源自微生物如巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白質(zhì)也與已知UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列有較高的同源性，但其功能尚未闡明。然而，尚不清楚這些蛋白是否具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶的活性及用來制備UDP-GalNAc。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)因其與已知的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列有較高的同源性，但其功能尚未闡明而被認(rèn)作是UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(galE)的蛋白質(zhì)，或者與已知的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列具有較高同源性的蛋白質(zhì)，具有UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向異構(gòu)酶的活性，及發(fā)現(xiàn)該酶可用于UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的有效制備。本發(fā)明的完成基于上述發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明涉及下列(1)至(35)。
(1)制備UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下縮寫為UDP-GalNAc)的方法，其包括讓酶源和UDP-N-乙酰葡糖胺(以下縮寫為UDP-GlcNAc)共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，該轉(zhuǎn)化株能產(chǎn)生具UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向異構(gòu)酶(以下縮寫為UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶)活性的蛋白，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；
讓UDP-GalNAc在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收UDP-GalNAc。
(2)制備含N-乙酰半乳糖胺(以下縮寫為GalNAc)的碳水化合物的方法，其包括讓酶源、受體碳水化合物、GalNAC轉(zhuǎn)移酶和UDP-GlcNAc共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，該轉(zhuǎn)化株能產(chǎn)生具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；讓含GalNAc的碳水化合物在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收含GalNAc的碳水化合物。
(3)制備UDP-GalNAc的方法，其包括讓酶源、尿苷-5’-三磷酸(以下縮寫為UTP)的前體和糖共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為微生物的培養(yǎng)物，該微生物具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)，及為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，該轉(zhuǎn)化株能產(chǎn)生具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；讓UDP-GalNAc在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收UDP-GalNAc。
(4)制備含GalNAc的碳水化合物的方法，其包括讓酶源、UTP的前體、糖和受體碳水化合物共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為微生物的培養(yǎng)物，該微生物具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)，為GalNAc轉(zhuǎn)移酶，及為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，該轉(zhuǎn)化株能產(chǎn)生具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；讓含GalNAc的碳水化合物在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收含GalNAc的碳水化合物。
(5)依照(1)至(4)中任何一種所述的方法，其中培養(yǎng)物的處理物質(zhì)為濃縮的培養(yǎng)物，干燥的培養(yǎng)物，由培養(yǎng)物離心獲得的細(xì)胞，將細(xì)胞進(jìn)行干燥、冷凍干燥、表面活性劑處理、超聲波、機(jī)械摩擦、溶劑處理、酶處理、蛋白分級分離或固定而獲得的產(chǎn)物，或由細(xì)胞提取獲得的酶制劑。
(6)依照(2)或(4)所述的方法，其中的受體碳水化合物為復(fù)合碳水化合物，其包含在其非還原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、巖藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖。
(7)依照(6)所述的方法，其中在其非還原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、巖藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖為乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖(globotriose)、唾液酸乳糖、唾液酸-N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸軟骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Galβ1-3GlcNAc)或H型2(Fuc α1-2Gal β1-4GlcNAc)。
(8)依照(2)或(4)所述的方法，其中受體碳水化合物為乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸-N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸軟骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Gal β1-3GlcNAc)或H型2(Fucα1-2Gal β1-4GlcNAc)。
(9)依照(3)或(4)所述的方法，其中前體為乳清酸、乳清酸核苷、尿嘧啶、尿嘧啶核苷或尿嘧啶核苷-5’-一磷酸。
(10)依照(3)或(4)所述的方法，其中糖為葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。
(11)依照(3)或(4)所述的方法，其中具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物選自屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)和糖酵母菌屬(Saccharomyces)中的微生物。
(12)依照(11)所述的方法，其中屬于埃希氏桿菌屬中的微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)。
(13)依照(11)所述的方法，其中屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物為產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)。
(14)依照(11)所述的方法，其中屬于糖酵母菌屬(Saccharomyces)的微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
(15)依照(1)至(4)中任一項所述的方法，其中的轉(zhuǎn)化株為將重組DNA導(dǎo)入微生物所獲得的轉(zhuǎn)化株。
(16)依照(15)所述的方法，其中的微生物選自屬于埃希氏桿菌屬、棒桿菌屬和糖酵母菌屬中的微生物。
(17)依照(16)所述的方法，其中屬于埃希氏桿菌屬中的微生物為大腸桿菌。
(18)依照(16)所述的方法，其中屬于棒桿菌屬的微生物為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
(19)依照(16)所述的方法，其中屬于糖酵母菌屬的微生物為釀酒酵母。
(20)依照(1)至(4)中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白為源自屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)或奈瑟氏球菌屬(Neisseria)的微生物的具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。
(21)依照(20)所述的方法，其中屬于芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。
(22)依照(20)所述的方法，其中屬于奈瑟氏球菌屬的微生物選自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)或腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。
(23)依照(1)至(4)及(20)至(22)中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白為具有SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
(24)依照(1)至(4)及(20)至(22)中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白其組成的氨基酸序列為SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸殘基的缺失、替代、插入或加入并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
(25)依照(1)至(4)及(20)至(22)中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白其組成的氨基酸序列與SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列具有50％或以上的同源性。
(26)依照(15)所述的方法，其中重組DNA包含的DNA編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。
(27)依照(15)所述的方法，其中重組DNA包含的DNA所編碼的UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶(以下縮寫為galE蛋白)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
(28)依照(27)所述的方法，其中g(shù)alE蛋白來自屬于芽孢桿菌屬或奈瑟氏球菌屬的微生物。
(29)依照(28)所述的方法，其中屬于芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌。
(30)依照(28)所述的方法，其中屬于奈瑟氏球菌屬的微生物為淋病奈瑟氏球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌。
(31)依照(15)所述的方法，其中重組DNA包含的DNA編碼具有SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
(32)依照(15)所述的方法，其中重組DNA包含的DNA所編碼的蛋白，其組成的氨基酸序列為SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸殘基的缺失、替代、插入或加入并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
(33)依照(15)所述的方法，其中重組DNA包含的DNA所編碼的蛋白，其組成的氨基酸序列與SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列具有50％或以上的同源性并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
(34)依照(15)所述的方法，其中重組DNA包含的DNA具有SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列。
(35)依照(15)所述的方法，其中重組DNA包含的DNA與由SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且其所編碼的蛋白具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
任何具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)都可用于本發(fā)明的方法中。合適的實例如下列(1)至(6)。
(1)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的galE蛋白質(zhì)(2)因為與galE蛋白的氨基酸序列有高同源性，其應(yīng)具有g(shù)alE蛋白的功能并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)(3)其氨基酸序列與galE蛋白的氨基酸序列的同源性為50％或以上并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)(4)具有如SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(5)其組成的氨基酸序列在SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸殘基的缺失、替代、插入或加入并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)(6)其組成的氨基酸序列SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列具有50％或以上的同源性并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的galE蛋白的實例源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(GenBank登錄號X99339)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)(GenBank登錄號Z215508)。
因其與已知galE蛋白的氨基酸序列有較高同源性而被視為galE蛋白的蛋白質(zhì)實例源自Bacillus halodurans(GenBank登錄號AP001510)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(GenBank登錄號X57315)、流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)(GenBank登錄號U78089)、Arabidopsis thaliana(GenBank登錄號AL078468)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(GenBank登錄號AF083467)、解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)(GenBank登錄號X76172)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocoliticia)(GenBank登錄號Z47767)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)(GenBank登錄號CJl1168X4)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)(GenBank登錄號AF016844)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)(GenBank登錄號AE004405)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)(GenBank登錄號AF248584)、Pisum sativum(GenBank登錄號U315444)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)(GenBank登錄號X83927)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)(GenBank登錄號M33681)、Cyamopsis tetragonoloba(GenBank登錄號AJ005081)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(GenBank登錄號AE004568)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(GenBank登錄號AJ011653)、Aquifexaeolicus(GenBank登錄號AE000721)、集胞藍(lán)細(xì)菌屬種(Synechocystissp.)(GenBank登錄號D90910)、巴西固氮螺菌(Azospiriumbrasilense)(GenBank登錄號U09349)、苜宿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)(GenBank登錄號X58126)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(GenBank登錄號X96507)、嗜熱堿甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(GenBank登錄號AE000844)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)(GenBank登錄號Z49823)、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(GenBank登錄號AF221951)、馬紅球菌(Rhodococcus equi)(GenBank登錄號AF277002)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank登錄號AL359989)、淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)(GenBank登錄號M18953)、耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)(GenBank登錄號AE002053)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(GenBank登錄號AF253311)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)(GenBank登錄號AE001727)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(GenBank登錄號M94964)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(GenBank登錄號U67477)、鹽桿菌屬種(Halobacterium sp.)NRC-1(GenBank登錄號AE004975)、Pyrococcushorikoshii(GenBank登錄號AP000007)、Pyrococcus abyssi(GenBank登錄號AJ248284)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(GenBank登錄號AF0099622)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)(GenBank登錄號X86505)、耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)(GenBank登錄號AE001927)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(GenBank登錄號AE001079)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)(GenBank登錄號AF109295)和唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus thermophilus)(GenBank登錄號M38175)。
其氨基酸序列與galE蛋白的氨基酸序列的同源性為50％或以上并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的實例源自白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)(GenBank登錄號M80338)及源自如巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和無乳鏈球菌(streptococcus agalactiae)的微生物。
其氨基酸序列與galE蛋白的氨基酸序列的同源性為50％或以上的蛋白質(zhì)的實例是指那些蛋白，其組成的氨基酸序列與galE蛋白的氨基酸序列的同源性至少為50％或更高，優(yōu)選60％或高，更優(yōu)選80％或更高，進(jìn)一步優(yōu)選95％或更高。
氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可用Karlin和Altschul[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]的BLAST算法及FASTA[MethodsEnzymol.，183，63(1990)]來確定。在BLAST算法的基礎(chǔ)上，已經(jīng)開發(fā)出如BLASTN和BLASTX程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。以BLAST為基礎(chǔ)，用BLASTN分析核苷酸序列，所用參數(shù)如下，例如，分值＝100和字長＝12。以BLAST為基礎(chǔ)，用BLASTX分析氨基序列，所用參數(shù)如下，例如，分值＝50和字長＝3。當(dāng)使用BLAST和GappedBLAST程序時，用各個程序所默認(rèn)的參數(shù)。這類分析的特定技術(shù)是已知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
用于本發(fā)明方法中具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的更特定的實例是具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性源自下列微生物的蛋白質(zhì)，屬于枯草桿菌屬的如枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌(嗜熱脂肪桿菌)，以及屬于奈瑟氏球菌屬的如淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌。
由其中有一個或多個氨基酸殘基缺失、替代或加入的氨基酸序列組成并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，例如可通過下列文獻(xiàn)所述的定點誘變將突變導(dǎo)入到編碼具有SEQ ID NO1或2所示氨基酸序列的蛋白的DNA中而獲得Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版(1989)(下文簡稱Molecular Cloning，第2版)；CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997)(下文簡稱Current Protocols in Molecular Biology)；Nucleic Acids Res.，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Gene，34，315(1985)；Nucleic Acids Res.，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等。
缺失、替代、插入或加入的氨基酸殘基數(shù)目沒有特別的限制，但通過已知方法如上述定點誘變后，缺失、替代、插入或加入的數(shù)目應(yīng)在可能的范圍內(nèi)。合適的數(shù)目為1至數(shù)十個，優(yōu)選為1至20個，更優(yōu)選為1至10個，進(jìn)一步優(yōu)選為1至5個。
表述“一個或多個氨基酸殘基在具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的多肽的氨基酸序列中缺失、替代、插入或加入”意為氨基酸序列在其單個或多個任意位點上含有單個或多個氨基酸殘基的缺失、替代、插入或加入。缺失、替代、插入和加入可同時包含在一個序列中，替代、插入或加入的氨基酸殘基可以是天然的或非天然的。天然的氨基酸殘基的實例為L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸和L-半胱氨酸。
下列為能夠相互替代的氨基酸殘基實例。相同組內(nèi)的氨基酸殘基可以相互替代。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸
B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基乙二酸、2-氨基辛二酸C組天冬酰胺、谷氨酰胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸G組苯丙氨酸、酪氨酸為了用于本發(fā)明的方法中的蛋白質(zhì)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性，需要其氨基酸序列與，當(dāng)按照上文的條件用BLAST、FAST等計算時。理想的是在上述條件下利用BLAST、FASTA等進(jìn)行計算時，其氨基酸序列與SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列的同源性至少50％或更多，優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選80％或更多，甚至優(yōu)選95％或更多。
用于本發(fā)明方法中的DNA編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，其實例為編碼上文蛋白(1)至(6)的那些DNA。
特定的實例包括具有SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列的DNA，和在嚴(yán)格條件下能與上述DNA雜交并且編碼具有UDP-GlcNAc4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA。
上述能夠在嚴(yán)格條件下雜交的DNA是指通過克隆雜交、噬菌體雜交、Southern印跡雜交等利用部分或完整的編碼依照上述(1)至(6)中的任何一個蛋白的DNA作為探針而獲得的DNA。此類DNA的一個特別的實例是其被鑒定為能在65℃，存在0.7至1.0mol/l的氯化鈉，使用具克隆或噬菌體來源的DNA固定于其上的濾器來進(jìn)行雜交，然后在65℃，用0.1至2倍濃度的SSC溶液(1倍濃度的SSC溶液150mmol/l氯化鈉和15mmol/l檸檬酸鈉)洗滌濾器。按照《MolecularCloning(分子克隆)，第二版》；《Current Protocols in Molecular Biology(當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南)》；《DNA Cloning 1Core Techniques，A PralticalApproach(DNA克隆1核心技術(shù)，實驗方法)，第二版，牛津大學(xué)(1995)》等中所描述的方法進(jìn)行雜交。具體而言，可雜交的DNA包括與SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列經(jīng)BLAST或FASTA在上述條件下計算后具至少60％或更高同源性的DNA，優(yōu)選地，同源性為80％或更高，進(jìn)一步優(yōu)選地，同源性為95％或以上。
本發(fā)明方法中所使用的能夠制備具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的轉(zhuǎn)化株的獲得方法是例如，制備重組DNA，而重組DNA通過將由上文描述的方法制備的編碼蛋白的DNA按照《分子克隆，第二版》中所描述的方法連接到載體DNA上，然后按照《分子克隆，第二版》中所描述的方法用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明方法中所使用的能夠表達(dá)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的轉(zhuǎn)化株的制備描述如下。
(1)編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA的制備編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA可由源自任一具該酶活性的生物的DNA制備。合適的DNA的實例來自微生物的DNA，優(yōu)選的微生物屬于芽孢桿菌屬或奈瑟氏球菌屬，更優(yōu)選的微生物為枯草芽孢桿菌MI112(ATCC 33712)和淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)。
屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)和奈瑟氏球菌屬的微生物可通過已知的方法培養(yǎng)。培養(yǎng)后，通過已知的方法(如，當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南)分離和純化微生物的染色體DNA。
包含編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA的片段可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[PCR Protocols(PCR實驗指南)，Hamana出版社(1993)]獲得，其使用根據(jù)已知的編碼假定具有UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶(EC5.1.3.2)活性的蛋白的DNA的核苷酸序列而準(zhǔn)備的一對引物和作為模板的染色體DNA。合適的核苷酸序列的實例為來自枯草芽孢桿菌、如SEQ ID NO1所示的序列和來自淋病奈瑟氏球菌、如SEQ ID NO2所示的序列。
所需的DNA也可通過雜交獲得，其使用基于已知核苷酸序列而設(shè)計的合成DNA作為探針。
也可以人工合成編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA，其按照常規(guī)方法[PCR實驗指南，Hamana出版社(1993)]利用合成DNA通過聚合酶鏈反應(yīng)獲得。
(2)編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA的克隆及核苷酸序列的確認(rèn)按上文(1)制備的本發(fā)明方法所用的DNA，原樣或用合適的限制性內(nèi)切酶切割后，通過常規(guī)方法連接到載體上。
作為DNA所連接的載體，可使用能夠在大腸桿菌K12株中自主復(fù)制的任何噬菌體載體、質(zhì)粒載體等。合適的載體實例為ZAP Express[STRATAGENE；Strategies，5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[STRATAGENE；Nucleic Acids Res.，17，9494(1989)]、λzap II(STRATAGENE)、λgt10、λgt11[DNA Cloning，A Practical Approach，1，49(1985)]、λTripl Ex(Clontech)、λExCell(Amersham Pharmacia Biotech)和pUC18[Gene，33，103(1985)]。
作為用作重組DNA的宿主細(xì)胞的大腸桿菌，該DNA通過把(1)中制備的本發(fā)明方法中所用的DNA連接至載體而獲得，屬于大腸桿菌的任何微生物均可使用。合適的微生物實例為大腸桿菌XL1-BlueMRF’株[STRATAGENE；Strategies，5，81(1992)]、大腸桿菌C600[Genetics，39，440(1954)]、大腸桿菌Y1088[Science，222，778(1983)]、大腸桿菌Y1090[Science，222，778(1983)]、大腸桿菌NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]、大腸桿菌K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]和大腸桿菌JM105[Gene，38，275(1985)]。
重組DNA的導(dǎo)入可按導(dǎo)入DNA至上述宿主中的任何一種方法來執(zhí)行，例如，使用鈣離子方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生質(zhì)體方法[日本出版的未經(jīng)審查的專利申請?zhí)?48394/88(Japanese Published Unexamined Patent Application No.248394/88)]和電穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]。
包含在重組DNA中的本發(fā)明的DNA的核苷酸序列可通過從轉(zhuǎn)化株中提取重組DNA后測定，轉(zhuǎn)化株通過上述方式獲得。核苷酸序列的測定可使用常規(guī)的測序方法，如雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.SciUSA,74,5463(1977)]或使用核苷酸測序儀如373A DNA測序儀(Perkin-Elmer公司)。
攜帶按上述方式獲得的重組DNA的轉(zhuǎn)化株的實例為大腸桿菌NM522/pGT73，其攜帶具SEQ ID NO3所顯示的核苷酸序列的質(zhì)粒DNA，和大腸桿菌NM522/pGT24，其攜帶具SEQ ID NO4所顯示的核苷酸序列的質(zhì)粒DNA。
(3)生產(chǎn)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的轉(zhuǎn)化株的制備生產(chǎn)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的轉(zhuǎn)化株的制備可按如下方式進(jìn)行，例如，使用《分子克隆，第二版》和《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南》中所描述的方法。
即，在上述獲得的DNA的基礎(chǔ)上，按照需要來制備包含編碼蛋白區(qū)域的合適長度的DNA片段，并將該DNA片段插入到合適表達(dá)載體中的啟動子的下游以制備重組DNA。然后將重組DNA導(dǎo)入到適合表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中制備成轉(zhuǎn)化株。
作為宿主細(xì)胞，能表達(dá)所需基因的任何細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞等均可使用。
可使用的表達(dá)載體為能夠自主復(fù)制或整合到上述宿主細(xì)胞的染色體DNA中并在合適的位置包含啟動子以轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明的蛋白的DNA。
當(dāng)使用原核生物如細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時，優(yōu)選的是包含能編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA的重組DNA為載體，其能夠在原核生物中自主復(fù)制并包含啟動子、核糖體結(jié)合序列、本發(fā)明的DNA和轉(zhuǎn)錄終止序列。該載體可進(jìn)一步包含調(diào)節(jié)啟動子的基因。
合適的表達(dá)載體的實例為pHelixl(Roche Diagnostics)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech)、pSE280(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(QIAGEN)、pKYP10(日本出版的未經(jīng)審查的專利申請?zhí)?10600/83)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(STRATAGENE)、pTrs30[由大腸桿菌(Escherichia coli)JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備]、pTrs32[由大腸桿菌(Escherichia coli)JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制備]、pPAC31(WO98/12343)、pGHA2[由大腸桿菌(Escherichia coli)IGHA2(FERM B-400)制備；日本出版的未經(jīng)審查的專利申請?zhí)?21091/85]、pGKA2[由大腸桿菌(Escherichia coli)IGKA2(FERMBP-6798)制備日本出版的未經(jīng)審查的專利申請?zhí)?21091/85]、pTerm2(US4686191、US4939094和US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pGEX(AmershamPharmacia Biotech)和pET系統(tǒng)(Novagen)。
作為啟動子，任何在宿主細(xì)胞中具功能的啟動子均可使用。例如，來自大腸桿菌(Escherichia coli)或噬菌體的啟動子，如可以使用trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子和T7啟動子。也可使用人工設(shè)計和修飾的啟動子，如2個Ptrp啟動子合并串聯(lián)的啟動子(Ptrp×2)、tac啟動子、lacT7啟動子和letI啟動子等。
優(yōu)選使用的質(zhì)粒是在其中SD序列(核糖體結(jié)合序列)和起始密碼子之間的距離調(diào)整為合適的長度(如，6至18個堿基)。
在本發(fā)明的重組DNA中，轉(zhuǎn)錄終止序列對于本發(fā)明DNA的表達(dá)不是必需的，但優(yōu)選是將轉(zhuǎn)錄終止序列的位置緊接著結(jié)構(gòu)基因的下游。
合適的宿主細(xì)胞的實例為屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的微生物。特定的例子是大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-Blue、大腸桿菌(Escherichiacoli)XL2-Blue、大腸桿菌(Escherichia coli)DH1、大腸桿菌(Escherichiacoli)MC1000、大腸桿菌(Escherichia coli)KY3276、大腸桿菌(Escherichia coli)W1485、大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、大腸桿菌(Escherichia coli)HB101、大腸桿菌(Escherichia coli)No.49、大腸桿菌(Escherichia coli)W3110、大腸桿菌(Escherichia coli)NY49、大腸桿菌(Escherichia coli)GI698、大腸桿菌(Escherichia coli)TB1、無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Brevibacteriumimmariophilum ATCC 14068，解糖短桿菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC 14066、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、產(chǎn)谷氨酸短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13869、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和假單胞菌種(Pseudomonas sp.)D-0110。
重組DNA的導(dǎo)入可由導(dǎo)入DNA至上述宿主中的任何一種方法來進(jìn)行，例如，使用鈣離子方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生質(zhì)體方法(日本出版的未經(jīng)審查的專利申請?zhí)?48394/88)和下列文獻(xiàn)中所描述的方法，Gene，17，107(1982)和Mol.Gen.Genet.，168，111(1979)。
使用酵母為宿主細(xì)胞時，可使用YEP13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)、pHS19、pHS15等作為表達(dá)載體。
作為啟動子，在酵母中具功能的任何啟動子均可使用。合適的啟動子包括糖分解基因的啟動子如己糖激酶、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10啟動子、熱激多肽啟動子、MF α1啟動子和CUP 1啟動子。
合適的宿主細(xì)胞實例為屬于糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和假絲酵母屬(Candida)的微生物，具體是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸許旺酵母(Schwanniomyces alluvius)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)。
重組DNA的導(dǎo)入可由導(dǎo)入DNA至酵母中的任何一種方法來進(jìn)行，例如，電穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生質(zhì)球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)]、醋酸鋰法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]和文獻(xiàn)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)中所描述的方法。
上述制備的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)可按培養(yǎng)宿主的常規(guī)方法來執(zhí)行，該轉(zhuǎn)化株用于制備UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物。
用原核生物如大腸桿菌(Escherichia coli)或真核生物如酵母作為宿主來制備用于本發(fā)明方法中的轉(zhuǎn)化株時，任何自然和合成培養(yǎng)基可用作培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)基，只要其為適合轉(zhuǎn)化株有效培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其包含能被轉(zhuǎn)化株吸收的碳源、氮源、無機(jī)鹽等。
作為碳源，能被轉(zhuǎn)化株吸收的任何碳源均可使用。合適的碳源的實例包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、包括上述糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物；有機(jī)酸如乙酸、丙酸；及醇類如乙醇和丙醇。
作為氮源，氨、有機(jī)或無機(jī)酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨和磷酸銨，和其他含氮化合物，以及蛋白胨、肉膏、酵母膏、玉米浸漬液、干酪素水解物、豆餅、豆餅水解物和各種發(fā)酵過的微生物細(xì)胞及其消化產(chǎn)物均可使用。
無機(jī)鹽的實例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣。
培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行，例如，振蕩培養(yǎng)或通氣下的液下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，通常在15至40℃下培養(yǎng)16小時至7天。優(yōu)選的pH為在培養(yǎng)期間維持在3.0至9.0。通過使用有機(jī)酸或無機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等來調(diào)節(jié)pH。
如果需要，可在培養(yǎng)期間向培養(yǎng)基中加入抗生素如氨芐青霉素、四環(huán)素和氯霉素。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有包含可誘導(dǎo)的啟動子的重組DNA的微生物時，如果需要，可在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑。例如，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有包含lac啟動子的重組DNA的微生物時，可在培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷或類似物；及在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有包含trp啟動子的重組DNA的微生物時，可在培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸或類似物。
如此所獲得的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物及其各種處理物質(zhì)可用作在水介質(zhì)中生產(chǎn)UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的酶源。
培養(yǎng)物的處理物質(zhì)包括濃縮的培養(yǎng)物，干燥的培養(yǎng)物，離心培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞，利用各種方式如干燥、冷凍干燥、表面活性劑處理、超聲波、機(jī)械摩擦、溶劑處理、酶處理、蛋白分級分離和固定化處理細(xì)胞所得的產(chǎn)物，提取細(xì)胞所獲得的酶制劑等。
在生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物時，使用的酶源濃度為0.1mU/l至10,000U/l，優(yōu)選為1mU/l至1,000U/l，1個單位(U)定義為在37℃下1分鐘內(nèi)生成1μmol的UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的活性。
用于生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的液體培養(yǎng)基包括水、緩沖液如磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液和Tris緩沖液，醇類如甲醇和乙醇，酯類如乙酸乙酯，酮類如丙酮，酰胺化合物如乙酰胺等。用作酶源的微生物的培養(yǎng)物也可用作水介質(zhì)。
如果需要，在生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物體系中可加入表面活性劑或有機(jī)溶劑。任何促進(jìn)含GalNAc的碳水化合物形成的表面活性劑均可使用。合適的表面活性劑包括非離子表面活性劑如聚氧乙烯十八胺(如，Nymeen S-215，NOF公司)，陽離子表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨和烷基二甲基芐基氯化銨(如，CationF2-40E，NOF公司)，陰離子表面活性劑如月桂酰肌氨酸酯，和叔胺如烷基二甲基胺(如，叔胺FB，NOF公司)，這些表面活性劑可以單獨或聯(lián)合使用。
表面活性劑通常使用的濃度為0.1至50g/l。作為有機(jī)溶劑，二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、乙酸乙酯等通?？墒褂玫臐舛葹?.1至50ml/l。
用于生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的UDP-GacNAc包括可商購的UDP-GacNAc、利用微生物或類似物活性形成的反應(yīng)溶液及由反應(yīng)溶液純化所得的UDP-GacNAc。合適的微生物實例為屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)和糖酵母屬(Saccharomuces)的微生物，具體為大腸桿菌(Escherichiacoli)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)和釀酒酵母(Saccharomuces cerevisiae)。這些微生物可單獨或聯(lián)合使用。糖核苷酸底物的使用濃度為0.1至500mmol/l。
UDP-GalNAc的制備方法是讓上述的酶源、具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物的培養(yǎng)物，或上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)為附加的酶源、UTP的前體和糖共存于水介質(zhì)中，讓UDP-GalNAc在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收UDP-GalNAc。
用于本發(fā)明方法中UTP前體的實例包括乳清酸、乳清酸核苷、尿嘧啶核苷、尿嘧啶和尿嘧啶核苷-5’-一磷酸。該前體可以為純化的產(chǎn)物、前體的鹽類或由微生物生產(chǎn)的包含該前體的培養(yǎng)物或由培養(yǎng)物獲得的部分純化的產(chǎn)物，只要其中的污染成分在不抑制反應(yīng)。該類前體的使用濃度為0.1mmol/l至1.0mol/l，優(yōu)選為0.01至0.5mol/l。
用于本發(fā)明方法中的糖的實例包括葡糖胺和N-乙酰葡糖胺。糖可以是純化的產(chǎn)物，或任何含有糖的產(chǎn)物，只要其中的污染成分在不抑制反應(yīng)。糖可以在每次反應(yīng)開始時加入，或部分或連續(xù)地在反應(yīng)期間加入，其所用的濃度為0.1mol/l至2.0mol/l。
含GalNAc的碳水化合物的制備方法是讓酶源、具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物的培養(yǎng)物或上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)及GalNAc轉(zhuǎn)移酶作為附加酶源、UTP的前體、糖和受體碳水化合物共存于水介質(zhì)中，讓含GalNAc的碳水化合物在水介質(zhì)中形成和積聚，及從水介質(zhì)中回收含GalNAc的碳水化合物。
用于形成含GalNAc的碳水化合物中的受體碳水化合物可以是能作為GalNAc轉(zhuǎn)移酶的底物的任一受體碳水化合物。合適的受體碳水化合物的的實例為包含寡糖的受體碳水化合物，所述寡糖在非還原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、巖藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。在其非還原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、巖藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖的實例為乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸軟骨素、デルタマン硫酸、H1型(Fuc α1-2Gal β1-3 GlcNAc)和H2型(Fuc α1-2Galβ1-4GlcNAc)。優(yōu)選的受體碳水化合物為乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸軟骨素、デルタマン硫酸、H1型(Fucα1-2Gal β1-3 GlcNAc)和H2型(Fuc α1-2Gal β1-4 GlcNAc)。
受體碳水化合物所用的濃度為0.1至500mmol/l。
如果需要，可在上述形成UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的反應(yīng)中加入無機(jī)鹽如MnCl2，β-巰基乙醇及類似物。
形成UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的反應(yīng)在水介質(zhì)中執(zhí)行，其pH為5至10，優(yōu)選為6至8，在20至50℃下反應(yīng)1至96小時。
在水介質(zhì)中形成的UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的測定依照已知的方法進(jìn)行[Microbiol.Immunol.，30，1085(1986)；Kagaku toKogyo(Chemistry and chemical Industry)，43，953(1990)]。
在反應(yīng)混合物中形成的UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的回收按照常規(guī)方法進(jìn)行，其使用活性碳、離子交換樹脂等。例如，可按Agr.Biol.Chem.37，1741(1973)中描述的方法回收UDP-GalNAc，及按J.Org.Chem.，47，5416(1982)中所描述的方法回收含GalNAc的碳水化合物。
附圖簡述

圖1顯示構(gòu)建質(zhì)粒pGT73的步驟，該質(zhì)粒表達(dá)能編碼具UDP-GacNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的基因，其來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
圖2顯示構(gòu)建質(zhì)粒pGT24的步驟，該質(zhì)粒表達(dá)能編碼具UDP-GacNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的基因，其來自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)。
圖3顯示構(gòu)建質(zhì)粒pGT87的步驟，該質(zhì)粒表達(dá)β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因，其來自空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)。
圖4顯示構(gòu)建質(zhì)粒pCJ2的步驟，該質(zhì)粒表達(dá)α1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因，其來自空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)。
圖1-4中的符號參照如下。
PLPL啟動子cI857cI857阻遏基因Ampr氨芐青霉素抗性基因galE(B.subtilis)來自枯草桿菌的能編碼具UDP-GalNAc4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因galE(N.gonorrhoeae)來自淋病奈瑟氏球菌的能編碼具UDP-GalNAc4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因β1，4-GalNAc轉(zhuǎn)移酶來自空腸彎曲桿菌的β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因α1，4-GalNac轉(zhuǎn)移酶來自空腸彎曲桿菌的α1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因?qū)嵤┍景l(fā)明的最佳方式本發(fā)明的實施例顯示如下。這些實施例不能解釋為本發(fā)明僅限于此范圍內(nèi)。
實施例1生產(chǎn)來自枯草芽孢桿菌的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建將枯草芽孢桿菌MI112(ATCC 33712)接種于300-ml培養(yǎng)瓶中的20ml LB培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌用胰蛋白胨、10g/l酵母膏和5g/l氯化鈉)上，在37℃下培養(yǎng)16小時。然后，按照《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南》中所描述的方法制備微生物的染色體DNA。
以galE基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，該基因假定為來自枯草芽孢桿菌、編碼具UDP-GalNAc4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)[Microbiology，142，3113(1996)]，用DNA合成儀(8905型，PerSeptive Biosystems)合成具SEQ ID NO5和6所顯示的核苷酸序列的DNA。按下列方式進(jìn)行PCR反應(yīng)，用合成DNA作為一組引物，枯草芽孢桿菌MI112的染色體DNA作為模板。即，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃反應(yīng)1分鐘、37℃反應(yīng)2分鐘、72℃反應(yīng)3分鐘，反應(yīng)混合物的體積為40μl，其包括0.1μg染色體DNA、0.5μmol/l各個引物、2.5單位的PfuDNA聚合酶(STRATAGENE)、4μl的PfuDNA聚合酶緩沖液(10X)(STRATAGENE)和200μmol/l的每種dNTP，結(jié)果獲得大約1.0kb的PCR產(chǎn)物。
用反應(yīng)后的混合物的十分之一進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)擴(kuò)增了所需的片段。然后將剩余的反應(yīng)混合物與等體積的經(jīng)TE飽和的酚/氯仿混合。
所得的混合物進(jìn)行離心，獲得的上層液與2倍體積的冷乙醇混合并置于-80℃下30分鐘。使所得的混合物離心獲得DNA沉淀。
將DNA沉淀溶解于20μl的TE[10mmol/l Tris-HCl、1mmol/lEDTA(pH8.0)]溶液中，取5μl的溶液用限制性酶ClaI和BamHI進(jìn)行反應(yīng)切割DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒(Funakoshi)回收包含UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶基因的1.0kb的DNA片段。
用限制性酶ClaI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用同樣方式回收5.5kb的DNA片段。
將上述獲得的1.0kb和5.5kb的DNA片段用連接試劑盒(TakaraShuzo有限公司)在16℃進(jìn)行16小時的連接反應(yīng)。
依照上述描述的已知方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522，在含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，于30℃培養(yǎng)過夜。
依照上述描述的已知方法從生長在培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化株克隆中提取質(zhì)粒，獲得表達(dá)質(zhì)粒pGT73。通過限制性酶消解來確認(rèn)獲得的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)(圖1)。
實施例2生產(chǎn)來自淋病奈瑟氏球菌的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建依照已知的方法(美國專利號5,545,553)培養(yǎng)淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)。然后，按照《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南》中所描述的方法制備該微生物的染色體DNA。
以galE基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，該基因假定為來自淋病奈瑟氏球菌、編碼具UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)[Mol.Microbiol.，8，891(1993)]，用DNA合成儀(8905型，PerSeptiveBiosystems)合成具SEQ ID NO7和8所顯示的核苷酸序列的DNA。按下列方式進(jìn)行PCR反應(yīng)，用合成DNA作為一組引物，淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色體DNA作為模板，PCR反應(yīng)條件與上述描述的相同，結(jié)果獲得大約1.0kb的PCR產(chǎn)物。
用反應(yīng)后的混合物的十分之一進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)擴(kuò)增了所需的片段。然后將剩余的反應(yīng)混合物與等量的經(jīng)TE飽和的酚/氯仿混合。
將所得的混合物進(jìn)行離心，獲得的上層液與2倍體積的冷乙醇混合并置于-80℃下30分鐘。所得的混合物離心獲得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶ClaI和BamHI進(jìn)行反應(yīng)切割DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，并用Gene Clean II試劑盒回收含有UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶基因的1.0kb的DNA片段。
用限制性酶ClaI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用同樣方式回收5.5kb的DNA片段。
將上述獲得的1.0kb和5.5kb的DNA片段用連接試劑盒在16℃進(jìn)行16小時的連接反應(yīng)。
依照上述描述的已知方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，于30℃培養(yǎng)過夜。
依照上述描述的已知方法從生長在培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化株克隆中提取質(zhì)粒，獲得表達(dá)質(zhì)粒pGT24。通過限制性酶消解來確認(rèn)獲得的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)(圖2)。
實施例3生產(chǎn)來自空腸彎曲桿菌的β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建依照已知的方法[Microbiology，144，2049(1998)]培養(yǎng)空腸彎曲桿菌(ATCC 43446)。然后，按照《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南》中所描述的方法制備該微生物的染色體DNA。
以來自空腸彎曲桿菌(ATCC 43446)、編碼β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)[J.Biol.Chem.，275，3896(2000)]，用DNA合成儀(8905型，PerSeptive Biosystems)合成具SEQ ID NO9和10所顯示的核苷酸序列的DNA。按下列方式進(jìn)行PCR反應(yīng)，用合成DNA作為一組引物，空腸彎曲桿菌(ATCC 43446)的染色體DNA作為模板，PCR反應(yīng)條件與上述描述的相同，結(jié)果獲得大約1.0kb PCR產(chǎn)物。
用反應(yīng)后的混合物的十分之一進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)擴(kuò)增了所需的片段。然后將剩余的反應(yīng)混合物與等量的經(jīng)TE飽和的酚/氯仿混合。
將所得的混合物進(jìn)行離心，獲得的上層液與2倍體積的冷乙醇混合并置于-80℃下30分鐘。所得的混合物離心獲得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶Xho和BamHI進(jìn)行反應(yīng)切割DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，并用Gene Clean II試劑盒(Funakoshi)回收β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的1.0kb的DNA片段。
另外，以具SEQ ID NO11和12所顯示的核苷酸序列的DNA作為一組引物，以pPAC31為模板，在上述描述的相同條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。
用反應(yīng)后的混合物的十分之一進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)擴(kuò)增了所需的片段。然后將剩余的反應(yīng)混合物與等量的經(jīng)TE飽和的酚/氯仿混合。
將所得的混合物進(jìn)行離心，獲得的上層液與2倍體積的冷乙醇混合并置于-80℃下30分鐘。所得的混合物離心獲得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶XhoI和EcoRI進(jìn)行反應(yīng)切割DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，并用Gene Clean II試劑盒(Funakoshi)回收含有PL啟動子的0.3kb的DNA片段。
用限制性酶EcoRI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，并用同樣方式回收5.2kb的DNA片段。
將上述獲得的1.0kb、0.3kb和5.2kb的DNA片段用連接試劑盒在16℃進(jìn)行16小時的連接反應(yīng)。
依照上述描述的已知方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，于30℃培養(yǎng)過夜。
依照上述描述的已知方法從生長在培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化株克隆中提取質(zhì)粒，獲得表達(dá)質(zhì)粒pGT87。通過限制性酶消解來確認(rèn)獲得的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)(圖3)。
實施例4生產(chǎn)來自空腸彎曲桿菌的α1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建以來自空腸彎曲桿菌(ATCC 43446)、編碼β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)[Microbiology，144，2049(1988)]，用DNA合成儀(8905型，PerSeptive Biosystems)合成具SEQ ID NO13和14所顯示的核苷酸序列的DNA。按下列方式進(jìn)行PCR反應(yīng)，用合成DNA作為一組引物，空腸彎曲桿菌(ATCC 43446)的染色體DNA作為模板，PCR反應(yīng)條件與實施例3相同，結(jié)果獲得大約1.0kb的PCR產(chǎn)物。
用反應(yīng)后的混合物的十分之一進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)擴(kuò)增了所需的片段。然后將剩余的反應(yīng)混合物與等量的經(jīng)TE飽和的酚/氯仿混合。
將所得的混合物進(jìn)行離心，獲得的上層液與2倍體積的冷乙醇混合并置于-80℃下30分鐘。所得的混合物離心獲得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶ClaI和BamHI進(jìn)行反應(yīng)切割DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，并用Gene Clean II試劑盒回收α1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的1.0kb的DNA片段。
用限制性酶ClaI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，并用同樣方式回收5.5kb的DNA片段。
將上述獲得的1.0kb和5.5kb的DNA片段用連接試劑盒在16℃進(jìn)行16小時的連接反應(yīng)。
依照上述描述的已知方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，于30℃培養(yǎng)過夜。
依照上述描述的已知方法從生長在培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化株克隆中提取質(zhì)粒，獲得表達(dá)質(zhì)粒pCJ2。通過限制性酶消解來確認(rèn)獲得的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)(圖4)。
實施例5UDP-GalNAc的生產(chǎn)(1)將實施例1中獲得的大腸桿菌NM522/pGT73菌株和生產(chǎn)半乳糖激酶及半乳糖-1-磷酸尿苷?；D(zhuǎn)移酶的大腸桿菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株接種到1升的配有擋板的Erlenmeyer型培養(yǎng)瓶中的125ml的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中含有50μg/ml的氨芐青霉素，在28℃下，220rpm培養(yǎng)17小時。將所獲得的培養(yǎng)物(125ml)接種到5升發(fā)酵罐中的2.5升的TB培養(yǎng)基上[10g/l葡萄糖、12g/l細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco)、12g/l酵母膏(Difco)、2.3g/l KH2PO4和12.5g/l K2HPO4(未調(diào)節(jié)pH)]，其中含有50μg/ml的氨芐青霉素，在30℃下，600rpm通氣(2.5升/分)培養(yǎng)4小時，然后繼續(xù)在40℃下培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)期間，用28％的氨水調(diào)節(jié)使培養(yǎng)物維持在pH7.0，根據(jù)需要向其中加入葡萄糖。培養(yǎng)物離心獲得濕細(xì)胞。將濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆?，解凍后即可使用?br> 將產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170接種到配有擋板的300-ml Erlenmeyer型培養(yǎng)瓶的25ml的液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含50g/l葡萄糖、10g/l聚蛋白胨(Nihon制藥有限公司)、10g/l酵母膏(Oriental Yeast有限公司)、5g/l尿素、5g/l(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、3g/l K2HPO4、1g/l MgSO4·7H2O、0.1g/l CaCl2·2H2O、10mg/l FeSO4·7H2O、l0mg/l ZnSO4·7H2O、20mg/l MnSO4·4-6H2O、20mg/l L-半胱氨酸、10mg/l D-泛酸鈣、5mg/l維生素B1、5mg/l尼克酸和30mg/l生物素(用10mol/l NaOH調(diào)節(jié)pH為7.2)，于28℃下220rpm培養(yǎng)24小時。
將所獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物(20ml)接種到含有250ml其組成與上述相同的液體培養(yǎng)基的配有擋板的2升Erlenmeyer型培養(yǎng)瓶中，并于28℃下220rpm培養(yǎng)24小時。所獲得的培養(yǎng)物作為種子培養(yǎng)物。
將種子培養(yǎng)物(250ml)接種到接種到裝有2.25升液體培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中，該培養(yǎng)基中包含150g/l葡萄糖、5g/l肉膏(KyokutoPharmacentical Ind.有限公司)、10g/l KH2PO4、10g/l K2HPO4、10g/l MgSO4·7H2O、0.1g/l CaCl2·2H2O、20mg/l FeSO4·7H2O、10mg/l ZnSO4·7H2O、20mg/l MnSO4·4-6H2O(單獨滅菌)、15mg/l β-丙氨酸(單獨滅菌)、20mg/l L-半胱氨酸、100mg/l生物素、2g/l尿素、和5mg/l維生素B1(單獨滅菌)(用10mol/l NaOH調(diào)節(jié)pH為7.2)，于32℃下，600rpm通氣(2.5升/分)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)期間，用28％的氨水調(diào)節(jié)使培養(yǎng)物維持在pH7.0。
培養(yǎng)物離心獲得濕細(xì)胞。將濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆?，解凍后即可使用?br> 將反應(yīng)混合物(30ml)放進(jìn)200-ml的燒杯中，該反應(yīng)混合物包含50g/l大腸桿菌NM522/pNT25的濕細(xì)胞、50g/l大腸桿菌NM522/pGT73的濕細(xì)胞、150g/l產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170的濕細(xì)胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、10g/l乳清酸、25g/l KH2PO4、5g/lMgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反應(yīng)在32℃下，用磁力攪拌器以900rpm攪拌進(jìn)行27小時。反應(yīng)期間，用4mol/l NaOH調(diào)節(jié)使反應(yīng)混合物的pH維持在7.2，根據(jù)需要可向其中加入果糖、N-乙酰葡糖胺和KH2PO4。
反應(yīng)完成后，用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果確認(rèn)在反應(yīng)混合物中形成和積聚了9.6g/l的UDP-GalNAc。
實施例6UDP-GalNAc的生產(chǎn)(2)將實施例2中獲得的大腸桿菌NM522/pGT24菌株和大腸桿菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株按與實施例5相同的方式培養(yǎng)以獲得濕細(xì)胞。把濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆茫鈨龊蠹纯墒褂谩?br> 將產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170按與實施例5相同的方式培養(yǎng)以獲得濕細(xì)胞。把濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆?，解凍后即可使用?br> 將反應(yīng)混合物(30ml)放進(jìn)200-ml的燒杯中，該反應(yīng)混合物包含50g/l大腸桿菌NM522/pNT25的濕細(xì)胞、50g/l大腸桿菌NM522/pGT24的濕細(xì)胞、150g/l產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170的濕細(xì)胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、10g/l乳清酸、25g/l KH2PO4、5g/lMgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反應(yīng)在32℃下，用磁力攪拌器以900rpm攪拌進(jìn)行27小時。反應(yīng)期間，用4mol/l NaOH調(diào)節(jié)使反應(yīng)混合物的pH維持在7.2，根據(jù)需要可向其中加入果糖、N-乙酰葡糖胺和KH2PO4。
反應(yīng)完成后，用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果確認(rèn)在反應(yīng)混合物中形成和積聚了5.5g/l的UDP-GalNAc。
實施例7GM2碳水化合物鏈[GalNAc β1，4(NeuAc α2，3)Gal β1，4 Glc]的生產(chǎn)將實施例1中獲得的大腸桿菌NM522/pGT73菌株、大腸桿菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株和實施例4中獲得的大腸桿菌NM522/pGT87菌株按與實施例5相同的方式培養(yǎng)以獲得濕細(xì)胞。把濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆?，解凍后即可使用?br> 將產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170按與實施例5相同的方式培養(yǎng)以獲得濕細(xì)胞。把濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆?，解凍后即可使用?br> 將反應(yīng)混合物(30ml)放進(jìn)200-ml的燒杯中，該反應(yīng)混合物包含50g/l大腸桿菌NM522/pNT25的濕細(xì)胞、50g/l大腸桿菌NM522/pGT73的濕細(xì)胞、100g/l大腸桿菌NM522/pGT87的濕細(xì)胞、150g/l產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170的濕細(xì)胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、50g/l UDP-N-乙酰葡糖胺、33g/l 3’-唾液酸乳糖、25g/l KH2PO4、5g/l MgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反應(yīng)在32℃下，用磁力攪拌器以900rpm攪拌進(jìn)行27小時。反應(yīng)期間，用4mol/l NaOH調(diào)節(jié)使反應(yīng)混合物的pH維持在7.2，根據(jù)需要可向其中加入果糖、N-乙酰葡糖胺、3’-唾液酸乳糖和KH2PO4。
反應(yīng)完成后，用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果確認(rèn)在反應(yīng)混合物中形成和積聚了7.9g/l的GM2碳水化合物鏈。
實施例8NOS-α(GalNAc α1，4 Gal β1，4 Glc NAc β1，3Gal β1，4 Glc)的生產(chǎn)將實施例2中獲得的大腸桿菌NM522/pGT24菌株、大腸桿菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株和實施例5中獲得的大腸桿菌NM522/pCJ2菌株按與實施例5相同的方式培養(yǎng)以獲得濕細(xì)胞。把濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆茫鈨龊蠹纯墒褂谩?br> 將產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170按與實施例5相同的方式培養(yǎng)以獲得濕細(xì)胞。把濕細(xì)胞保存在-20℃?zhèn)溆?，解凍后即可使用?br> 將反應(yīng)混合物(30ml)放進(jìn)200-ml的燒杯中，該反應(yīng)混合物包含50g/l大腸桿菌NM522/pNT25的濕細(xì)胞、25g/l大腸桿菌NM522/pGT24的濕細(xì)胞、50g/l大腸桿菌NM522/pCJ2的濕細(xì)胞、150g/l產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170的濕細(xì)胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、200g/l乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)、5g/l乳清酸、25g/lKH2PO4、5g/l MgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反應(yīng)在32℃下，用磁力攪拌器以900rpm攪拌進(jìn)行35小時。反應(yīng)期間，用4mol/l NaOH調(diào)節(jié)使反應(yīng)混合物的pH維持在7.2，根據(jù)需要可向其中加入果糖和KH2PO4。
反應(yīng)完成后，用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果確認(rèn)在反應(yīng)混合物中形成和積聚了2.4g/l的NOS-α。
工業(yè)實用性依照本發(fā)明，可以有效地生產(chǎn)UDP-GalNAc和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物。
SEQ ID NO5-人工序列描述合成DNASEQ ID NO6-人工序列描述合成DNASEQ ID NO7-人工序列描述合成DNASEQ ID NO8-人工序列描述合成DNA
SEQ ID NO9-人工序列描述合成DNASEQ ID NO10-人工序列描述合成DNASEQ ID NO11-人工序列描述合成DNASEQ ID NO12-人工序列描述合成DNASEQ ID NO13-人工序列描述合成DNASEQ ID NO14-人工序列描述合成DNA
序列表序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社(KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD.)<120>UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生產(chǎn)方法(Process for the production of UDP-N-acetylgalactosamine andcarbohydrates containing N-acetylgalactosamine)<130>SCT031230-47<140><141><150>JP 2000-388992<151>2000-12-21<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>339<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>1Met Ala Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr1 5 10 15Cys Val Glu Leu Leu Asn Ser Gly Tyr Glu Ile Val Val Leu Asp Asn20 25 30Leu Ser Asn Ser Ser Ala Glu Ala Leu Asn Arg Val Lys Glu Ile Thr35 40 45Gly Lys Asp Leu Thr Phe Tyr Glu Ala Asp Leu Leu Asp Arg Glu Ala50 55 60Val Asp Ser Val Phe Ala Glu Asn Glu Ile Glu Ala Val Ile His Phe65 70 75 80Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Ile Pro Leu Lys Tyr85 90 95Tyr His Asn Asn Leu Thr Gly Thr Phe Ile Leu Cys Glu Ala Met Glu
100 105 110Lys Tyr Gly Val Lys Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr115 120 125Gly Val Pro Glu Thr Ser Pro Ile Thr Glu Asp Phe Pro Leu Gly Ala130 135 140Thr Asn Pro Tyr Gly Gln Thr Lys Leu Met Leu Glu Gln Ile Leu Arg145 150 155 160Asp Leu His Thr Ala Asp Asn Glu Trp Ser Val Ala Leu Leu Arg Tyr165 170 175Phe Asn Pro Phe Gly Ala His Pro Ser Gly Arg Ile Gly Glu Asp Pro180 185 190Asn Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Val Ala Gln Val Ala Val195 200 205Gly Lys Leu Glu Gln Leu Ser Val Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr Lys210 215 220Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Glu225 230 235 240Gly His Val Lys Ala Leu Glu Lys Val Leu Asn Ser Thr Gly Ala Asp245 250 255Ala Tyr Asn Leu Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Ser Val Leu Glu Met Val260 265 270Lys Ala Phe Glu Lys Val Ser Gly Lys Glu Val Pro Tyr Arg Phe Ala275 280 285Asp Arg Arg Pro Gly Asp Ile Ala Thr Cys Phe Ala Asp Pro Ala Lys290 295 300Ala Lys Arg Glu Leu Gly Trp Glu Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Met305 310 315 320Cys Ala Asp Ser Trp Arg Trp Gln Ser Ser Asn Val Asn Gly Tyr Lys325 330 335Ser Ala Glu339<210>2<211>338<212>PRT<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseeria gonorrhoeae)<400>2Met Thr Val Leu Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Ile Gly Ser His Thr1 5 10 15Ala Val Ser Leu Val Gln Ser Gly Tyr Asp Ala Val Ile Leu Asp Asn20 25 30Leu Cys Asn Ser Ser Ala Ala Val Leu Pro Arg Leu Arg Gln Ile Thr35 40 45Gly Arg Asn Ile Pro Phe Tyr Gln Gly Asp Ile Arg Asp Cys Gln Ile50 55 60Leu Arg Gln Ile Phe Ser Glu His Glu Ile Glu Ser Val Ile His Phe65 70 75 80Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Glu Pro Thr Lys Tyr85 90 95Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Gly Ser Leu Val Leu Ala Glu Glu Met Ala100 105 110Arg Ala Gly Val Leu Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr115 120 125Gly Asp Ala Glu Lys Val Pro Tyr Thr Glu Asp Met Arg Pro Gly Asp130 135 140Thr Ala Asn Pro Tyr Gly Ala Ser Lys Ala Met Val Glu Arg Met Leu145 150 155 160Thr Asp Ile Gln Lys Ala Asp Pro Arg Trp Ser Val Ile Leu Leu Arg165 170 175Tyr Phe Asn Pro Ile Gly Ala His Glu Ser Gly Leu Ile Gly Glu Gln180 185 190Pro Asn Gly Val Pro Asn Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Cys Gln Val Ala
195 200 205Ser Gly Arg Leu Pro Gln Leu Ser Val Phe Gly Gly Asp Tyr Pro Thr210 215 220Pro Asp Gly Thr Gly Met Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala225 230 235 240Glu Gly His Ile Ala Ala Met Lys Ala Lys Gly Gly Val Ala Gly Val245 250 255His Leu Phe Asn Leu Gly Ser Gly Arg Ala Tyr Ser Val Leu Glu Ile260 265 270Ile Arg Ala Phe Glu Ala Ala Ser Gly Leu His Ile Pro Tyr Arg Ile275 280 285Gln Pro Arg Arg Ala Gly Asp Leu Ala Cys Ser Tyr Ala Asp Pro Ser290 295 300His Thr Lys Gln Gln Thr Gly Trp Glu Thr Lys Arg Gly Leu Gln Gln305 310 315 320Met Met Glu Asp Ser Trp Arg Trp Val Ser Arg Asn Pro Gly Arg Tyr325 330 335Gly Asp338<210>3<211>1017<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>3atg gca ata ctt gtt act ggc ggt gcc ggt tac att ggc agc cac aca 48Met Ala Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr1 5 10 15tgt gtt gaa cta ttg aac agc ggc tac gag att gtt gtt ctt gat aat 96Cys Val Glu Leu Leu Asn Ser Gly Tyr Glu Ile Val Val Leu Asp Asn20 25 30ctg tcc aac agt tca gct gaa gcg ctg aac cgt gtc aag gag att aca 144Leu Ser Asn Ser Ser Ala Glu Ala Leu Asn Arg Val Lys Glu Ile Thr35 40 45gga aaa gat tta acg ttc tac gaa gcg gat tta ttg gac cgg gaa gcg 192Gly Lys Asp Leu Thr Phe Tyr Glu Ala Asp Leu Leu Asp Arg Glu Ala50 55 60gta gat tcc gtt ttt gct gaa aat gaa atc gaa gct gtg att cat ttt 240Val Asp Ser Val Phe Ala Glu Asn Glu Ile Glu Ala Val Ile His Phe65 70 75 80gca ggg tta aaa gca gtc ggc gaa tct gtg gcg att ccc ctc aaa tat 288Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Ile Pro Leu Lys Tyr85 90 95tat cat aac aat ttg aca gga acg ttt att tta tgc gag gcc atg gag 336Tyr His Asn Asn Leu Thr Gly Thr Phe Ile Leu Cys Glu Ala Met Glu100 105 110aaa tac ggc gtc aag aaa atc gta ttc agt tca tct gcg aca gta tac 384Lys Tyr Gly Val Lys Lys Ile Val Phe Ser Ser Set Ala Thr Val Tyr115 120 125ggc gtt ccg gaa aca tcg ccg att acg gaa gac ttt cca tta ggc gcg 432Gly Val Pro Glu Thr Ser Pro Ile Thr Glu Asp Phe Pro Leu Gly Ala130 135 140aca aat cct tat ggg cag acg aag ctc atg ctt gaa caa ata ttg cgt 480Thr Asn Pro Tyr Gly Gln Thr Lys Leu Met Leu Glu Gln Ile Leu Arg145 150 155 160gat ttg cat aca gcc gac aat gag tgg agc gtt gcg ctg ctt cgt tac 528Asp Leu His Thr Ala Asp Asn Glu Trp Ser Val Ala Leu Leu Arg Tyr165 170 175ttt aac ccg ttc ggc gcg cat cca agc gga cgg atc ggt gaa gac ccg 576Phe Asn Pro Phe Gly Ala His Pro Ser Gly Arg Ile Gly Glu Asp Pro180 185 190aac gga atc cca aat aac ctt atg ccg tat gtg gca cag gta gca gtc 624Asn Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Val Ala Gln Val Ala Val195 200 205ggg aag ctc gag caa tta agc gta ttc gga aat gac tat ccg aca aaa 672Gly Lys Leu Glu Gln Leu Ser Val Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr Lys210 215 220gac ggg aca ggc gta cgc gat tat att cac gtc gtt gat ctc gca gaa 720Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Glu225 230 235 240ggc cac gtc aag gcg ctg gaa aaa gta ttg aac tct aca gga gcc gat 768Gly His Val Lys Ala Leu Glu Lys Val Leu Asn Ser Thr Gly Ala Asp245 250 255gca tac aac ctt gga aca ggc aca ggc tac agc gtg ctg gaa atg gtc 816Ala Tyr Asn Leu Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Ser Val Leu Glu Met Val260 265 270aaa gcc ttt gaa aaa gtg tca ggg aaa gag gtt cca tac cgt ttt gcg 864Lys Ala Phe Glu Lys Val Ser Gly Lys Glu Val Pro Tyr Arg Phe Ala275 280 285gac cgc cgt ccg gga gac atc gcc aca tgc ttt gca gat cct gcg aaa 912Asp Arg Arg Pro Gly Asp Ile Ala Thr Cys Phe Ala Asp Pro Ala Lys290 295 300gcc aag cga gaa cta ggc tgg gaa gcg aaa cgc ggc ctt gag gaa atg 960Ala Lys Arg Glu Leu Gly Trp Glu Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Met305 310 315 320tgt gct gat tcc tgg aga tgg cag tct tct aat gtg aat ggg tat aag 1008Cys Ala Asp Ser Trp Arg Trp Gln Ser Ser Asn Val Asn Gly Tyr Lys325 330 335agt gcg gaa 1017Ser Ala Glu<210>4<211>1014<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)<400>4atg acc gtc ctg att acc ggc ggc acc ggc ttt atc ggt tcg cac acc 48Met Thr Val Leu Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Ile Gly Ser His Thr1 5 10 15gcc gtc tcg ctc gtc caa tcc ggt tac gat gcc gtg att ttg gat aat 96Ala Val Ser Leu Val Gln Ser Gly Tyr Asp Ala Val Ile Leu Asp Asn
20 25 30ctg tgc aac tcg tct gcc gcc gtc ctc cca cgc ctt cgg caa att acc 144Leu Cys Asn Ser Ser Ala Ala Val Leu Pro Arg Leu Arg Gln Ile Thr35 40 45ggc aga aac ata ccg ttt tat cag ggc gac atc cgc gac tgt cag att 192Gly Arg Asn Ile Pro Phe Tyr Gln Gly Asp Ile Arg Asp Cys Gln Ile50 55 60ttg agg cag att ttt tca gaa cat gaa atc gaa tcc gtc atc cat ttt 240Leu Arg Gln Ile Phe Ser Glu His Glu Ile Glu Ser Val Ile His Phe65 70 75 80gcc ggt ttg aag gca gtg ggg gaa agc gtt gcc gag ccg aca aaa tat 288Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Glu Pro Thr Lys Tyr85 90 95tac ggc aac aat gtt tac ggc agc ctg gtg ctg gcg gaa gaa atg gcg 336Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Gly Ser Leu Val Leu Ala Glu Glu Met Ala100 105 110cgc gcg ggc gtg ttg aaa atc gta ttc agc tcg tcg gca acc gtt tac 384Arg Ala Gly Val Leu Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr115 120 125ggc gat gcg gaa aaa gtc ccc tat acg gaa gat atg cgc ccg ggc gat 432Gly Asp Ala Glu Lys Val Pro Tyr Thr Glu Asp Met Arg Pro Gly Asp130 135 140acc gct aat cct tac ggt gcg tcc aaa gcg atg gtg gag cgg atg tta 480Thr Ala Asn Pro Tyr Gly Ala Ser Lys Ala Met Val Glu Arg Met Leu145 150 155 160acc gac atc caa aaa gcc gat ccg cgt tgg agc gtg att ttg ttg cgc 528Thr Asp Ile Gln Lys Ala Asp Pro Arg Trp Ser Val Ile Leu Leu Arg165 170 175tat ttc aac ccg atc ggc gcg cac gaa agc gga ctt atc ggc gaa cag 576Tyr Phe Asn Pro Ile Gly Ala His Glu Ser Gly Leu Ile Gly Glu Gln180 185 190ccc aac ggc gtt ccc aac aat ctt ttg ccc tat atc tgt caa gtg gct 624Pro Asn Gly Val Pro Asn Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Cys Gln Val Ala195 200 205tcg ggc agg ctg ccg caa ctg tcg gta ttc ggc ggc gac tat ccg acc 672Ser Gly Arg Leu Pro Gln Leu Ser Val Phe Gly Gly Asp Tyr Pro Thr210 215 220ccc gac ggt acg gga atg cgc gac tac atc cat gtg atg gat ttg gca 720Pro Asp Gly Thr Gly Met Arg Asp Tyr Ile His Val Met AsP Leu Ala225 230 235 240gaa ggg cat atc gcg gca atg aag gcg aaa ggc ggc gtt gcc ggc gta 768Glu Gly His Ile Ala Ala Met Lys Ala Lys Gly Gly Val Ala Gly Val245 250 255cat ttg ttc aac ttg ggt tcg gga cgc gcc tat tcc gtt ttg gaa atc 816His Leu Phe Asn Leu Gly Ser Gly Arg Ala Tyr Ser Val Leu Glu Ile260 265 270atc cgc gcc ttt gag gcc gca tcc ggt ttg cac att cct tac cga atc 864Ile Arg Ala Phe Glu Ala Ala Ser Gly Leu His Ile Pro Tyr Arg Ile275 280 285caa ccc cgc cgc gcc ggc gac ttg gcg tgt tcc tat gcc gac ccg tcc 912Gln Pro Arg Arg Ala Gly Asp Leu Ala Cys Ser Tyr Ala Asp Pro Ser290 295 300cat acc aaa caa caa acc ggc tgg gaa acc aaa cgc ggc ttg cag caa 960His Thr Lys Gln Gln Thr Gly Trp Glu Thr Lys Arg Gly Leu Gln Gln305 310 315 320atg atg gaa gat tcg tgg cgt tgg gtc agc cgc aac ccc ggc aga tat 1008Met Met Glu Asp Ser Trp Arg Trp Val Ser Arg Asn Pro Gly Arg Tyr325 330 335ggg gat 1014Gly Asp<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>5tataatcgat acaggtcatt ttttaggagg gtttac 36<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>6agaaggatcc cattcttatt ccgcactctt ataccc 36<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>7cccgatcgat tctgaaagga atgtttatga 30<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>8ttgcggatcc tttgcattta atccccat28<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>9aatactcgag atgctatttc aatcatac28<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>10taaaggatcc ttaaaacaat gttaag 26<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>11caagaattct ctctcaccta ccaa24<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>12aatctcgaga tcgataccct tttttacg28<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>13aggaatcgat atgaaaataa gctttatta 29<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述合成DNA<400>14agttggatcc ataacagaaa gtttaggca 29
權(quán)利要求
1.一種制備UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下縮寫為UDP-GalNAc)的方法，其包括讓酶源和UDP-N-乙酰葡糖胺(以下縮寫為UDP-GlcNAc)共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，所述轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生具UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向異構(gòu)酶(以下縮寫為UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶)活性的蛋白，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；讓UDP-GalNAc在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收UDP-GalNAc。
2.一種制備含N-乙酰半乳糖胺(以下縮寫為GalNAc)的碳水化合物的方法，其包括讓酶源、受體碳水化合物、GalNAC轉(zhuǎn)移酶和UDP-GlcNAc共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，所述轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；讓含GalNAc的碳水化合物在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收含GalNAc的碳水化合物。
3.一種制備UDP-GalNAc的方法，其包括讓酶源、尿苷-5’-三磷酸(以下縮寫為UTP)的前體和糖共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為微生物的培養(yǎng)物，所述微生物具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)，以及為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，所述轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；讓UDP-GalNAc在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收UDP-GalNAc。
4.一種制備含GalNAc的碳水化合物的方法，其包括讓酶源、UTP的前體、糖和受體碳水化合物共存于水介質(zhì)中，所述的酶源為微生物的培養(yǎng)物，所述微生物具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)，為GalNAc轉(zhuǎn)移酶，以及為轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物，所述轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，或為上述培養(yǎng)物的處理物質(zhì)；讓含GalNAc的碳水化合物在水介質(zhì)中形成和積聚；及從水介質(zhì)中回收含GalNAc的碳水化合物。
5.依照權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中培養(yǎng)物的處理物質(zhì)為濃縮的培養(yǎng)物，干燥的培養(yǎng)物，由培養(yǎng)物離心獲得的細(xì)胞，將細(xì)胞進(jìn)行干燥、冷凍干燥、表面活性劑處理、超聲波、機(jī)械摩擦、溶劑處理、酶處理、蛋白分級分離或固定化而獲得的產(chǎn)物，或由細(xì)胞提取獲得的酶制劑。
6.依照權(quán)利要求2或4所述的方法，其中的受體碳水化合物為復(fù)合碳水化合物，其包含在其非還原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、巖藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖。
7.依照權(quán)利要求6所述的方法，其中在其非還原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、巖藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖為乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸軟骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Gal β1-3GlcNAc)或H型2(Fuc α1-2Gal β1-4GlcNAc)。
8.依照權(quán)利要求2或4所述的方法，其中受體碳水化合物為乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸軟骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Gal β1-3GlcNAc)或H型2(Fucα1-2Gal β1-4GlcNAc)。
9.依照權(quán)利要求3或4所述的方法，其中前體為乳清酸、乳清酸核苷、尿嘧啶、尿嘧啶核苷或尿嘧啶核苷-5’-一磷酸。
10.依照權(quán)利要求3或4所述的方法，其中糖為葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。
11.依照權(quán)利要求3或4所述的方法，其中具有從UTP的前體和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物是一種或多種選自屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)和糖酵母屬(Saccharomyces)中的微生物。
12.依照權(quán)利要求11所述的方法，其中屬于埃希氏桿菌屬中的微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)。
13.依照權(quán)利要求11所述的方法，其中屬于棒桿菌屬的微生物為產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
14.依照權(quán)利要求11所述的方法，其中屬于糖酵母屬的微生物為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
15.依照權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中的轉(zhuǎn)化株為將重組DNA導(dǎo)入微生物所獲得的轉(zhuǎn)化株。
16.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中的微生物選自屬于埃希氏桿菌屬、棒桿菌屬和酵母屬中的微生物。
17.依照權(quán)利要求16所述的方法，其中屬于埃希氏桿菌屬中的微生物為大腸桿菌。
18.依照權(quán)利要求16所述的方法，其中屬于棒桿菌屬的微生物為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
19.依照權(quán)利要求16所述的方法，其中屬于糖酵母屬的微生物為釀酒酵母。
20.依照權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白為源自屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)或奈瑟氏球菌屬(Neisseria)的微生物的具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。
21.依照權(quán)利要求20所述的方法，其中屬于芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。
22.依照權(quán)利要求20所述的方法，其中屬于奈瑟氏球菌屬的微生物是淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)或腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。
23.依照權(quán)利要求1至4及20至22中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白為具有SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
24.依照權(quán)利要求1至4及20至22中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白，其組成的氨基酸序列在SEQID NO1或2所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸殘基的缺失、替代、插入或加入，并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
25.依照權(quán)利要求1至4及20至22中任一項所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白其組成的氨基酸序列與SEQID NO1或2所示的氨基酸序列的同源性為50％或以上。
26.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中重組DNA包含的DNA編碼具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。
27.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中重組DNA包含的DNA所編碼的UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶(以下縮寫為galE蛋白)具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
28.依照權(quán)利要求27所述的方法，其中g(shù)alE蛋白來自屬于芽孢桿菌屬或奈瑟氏球菌屬的微生物。
29.依照權(quán)利要求28所述的方法，其中屬于芽孢桿菌屬的微生物選自枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌。
30.依照權(quán)利要求28所述的方法，其中屬于奈瑟氏球菌屬的微生物為淋病奈瑟氏球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌。
31.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中重組DNA包含的DNA編碼具有SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
32.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中重組DNA包含的DNA編碼的蛋白，其組成的氨基酸序列在SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸殘基的缺失、替代、插入或加入，并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
33.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中重組DNA包含的DNA編碼的蛋白，其組成的氨基酸序列與SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列的同源性為50％或以上，并具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
34.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中重組DNA包含的DNA具有SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列。
35.依照權(quán)利要求15所述的方法，其中重組DNA包含的DNA與由SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且其所編碼的蛋白具有UDP-GlcNAc 4-差向異構(gòu)酶活性。
全文摘要
依照本發(fā)明，利用具有UDP－N－乙酰葡糖胺4－差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)可生產(chǎn)UDP－N－乙酰半乳糖胺和含N－乙酰半乳糖胺的碳水化合物。
文檔編號C12N9/90GK1483077SQ01821109
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月21日
發(fā)明者遠(yuǎn)藤徹夫, 小泉聰司, 田畑和彥, 尾崎明夫, 司, 夫, 彥 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社