專利名稱：從熱休克蛋白衍生的免疫調(diào)節(jié)肽及其使用的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明是關(guān)于調(diào)節(jié)受試者免疫反應(yīng)的方法和組合物。特別地，本發(fā)明是關(guān)于包含細菌dnaJ肽，或其人同系物或非同源的人同工型肽的組合物，以及用這種組合物刺激免疫反應(yīng)或誘發(fā)對免疫源的耐受性的方法。同樣地，本發(fā)明提供了多種方法調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答，包括的方法有粘膜耐受性，DNA接種，無反應(yīng)性誘導(dǎo)，自動免疫接種。
背景技術(shù)：
很多疾病的治療策略是注重減輕疾病的癥狀，而不是解決產(chǎn)生癥狀的原因。例如，在炎性疾病中，旨在減輕炎癥的常用治療通常是使用類固醇藥或非類固醇的抗炎劑。
炎癥常常是免疫反應(yīng)的結(jié)果。雖然免疫反應(yīng)和所產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答通常對個體有利，例如，對細菌感染的反應(yīng)；但是在有些病例中，免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答產(chǎn)生有害結(jié)果。特別是，患有自身免疫性疾病的病人，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，常常遭受嚴重的組織損害，在有些病例中遭受全身性組織損害。雖然類固醇藥的使用，例如，可減輕這些病人免疫反應(yīng)的嚴重性，但是長期用這些藥會產(chǎn)生副作用，包括降低病人的生活質(zhì)量。而且，用這些藥通常降低個體啟動免疫反應(yīng)的能力，這樣，使個體容易易于被短期感染所感染，引起嚴重的后果。因此，存在對特別有用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，和相關(guān)的炎癥應(yīng)答的組合物和方法的需要。本發(fā)明滿足了這種需要并提供了其它的益處。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及從dnaJ熱休克蛋白(hsp)衍生而來的免疫原性肽和使用這些肽的方法，及用這些肽在受試者中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法。正如本文所披露的，本發(fā)明中的免疫原性肽是通過T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起作用的，包括“促炎肽”，其引起促炎細胞因子的表達增加，如干擾素γ；和“抗炎肽”，其誘發(fā)抗炎細胞因子的表達增加，如白細胞介素-10。這些肽通常也以下述兩種類型來表征“同源肽”，其具有在各種物種的dnaJ hsp間的相對保守的氨基酸序列；和“非同源肽”，其具有基本上不保守的氨基酸序列。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)的方法。如，本發(fā)明的方法的實施可以通過把一種dnaJ hsp的免疫原性肽部分用在受試者中，以調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)。這種dnaJ hsp可以是原核的或者真核的dnaJ hsp，如細菌dnaJ hsp，比如大腸桿菌dnaJ hsp；無脊椎動物dnaJhsp，比如酵母菌dnaJ hsp；或脊椎動物dnaJ hsp，比如哺乳動物的dnaJhsp，包括人dnaJ hsp，如人HSJ1、HDJ1或HDJ2。
免疫原性肽可以是dnaJ hsp的任何免疫原性部分，包括這種肽的糖基化形式，常常是一種可以和II類主要組織相容性抗原復(fù)合物受體或T細胞受體結(jié)合的肽，其提供了基本上對dnaJ多肽有特異性的抗原決定簇。如，這個肽可以是大腸桿菌dnaJ hsp的免疫原性肽部分，這些肽具有這樣的氨基酸序列QDYYEILGVSKTAEE(SEQ ID NO1)，RKAYKRLAMKYHPDR(SEQ ID NO2)，QKRAAYDQYGHAAFEQ(SEQ ID NO3)，QGFFAVQQTCPHCQG(SEQ ID NO4)，SKTLSVKIPGAVDTG(SEQ ID NO5)，GDLYVQVQVKQHPIF(SEQ ID NO6)，YCEVPINFAMAALGG(SEQ ID NO7)，或PINFAMAALGGEIEV(SEQ ID NO8)；或人的HSJ1，HDJ1或HDJ2 dnaJ hsp的免疫原性肽部分，這些肽具有這樣的氨基酸序列ASYYEILDVPRSASA(SEQ ID NO9)，KDYYQTLGLARGASD(SEQ ID NO10)，TTYYDVLGVKPNATQ(SEQ ID NO11)，KKAYRRKALQWHPDK(SEQ ID NO12)，KRAYRRQALRYHPDK(SEQ ID NO13)，KKAYRKLALKYHPDK(SEQ ID NO14)，F(xiàn)RSVSISTFVQGRR(SEQ ID NO15)，PGMVQQIQSVCMECQ(SEEQ ID NO16)，或GRRITTRRMENGQE(SEQ ID NO17)，或一個肽，具有氨基酸序列QAYEVLSDAKKRELYD(SEQ ID NO18)，EAYEVLSDKHKREIYD(SEQ ID NO19)，SGPFFTFSSSFPGHS(SEQ ID NO20)，DGQLKSVTINGVPDD(SEQ ID NO21)，DLQLAMAYSLSEMEA(SEQ ID NO22)，EDLFMCMDIQLVEAL(SEQ ID NO23)，LCGFQKPISTLDNRT(SEQ ID NO24)，RTIVITSHPGQIVKH(SEQ ID NO25)，或GRLIIEFKVNFPENG(SEQ ID NO26)。
本發(fā)明的方法可以是通過增加或減少與免疫反應(yīng)有關(guān)的炎癥應(yīng)答的來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法提供了一些手段，用于增加或誘導(dǎo)受試者的炎癥應(yīng)答。一方面，增加或誘導(dǎo)受試者的炎癥應(yīng)答的方法是通過對免疫狀態(tài)下的受試者用有促炎活性的肽，也就是促炎肽而實施的。另一方面，這個方法是通過對耐受狀態(tài)下的受試者用抗炎肽而實施。該方法還有另一方面，免疫原性肽的聯(lián)合使用，例如，使用兩種或更多種免疫狀況下的促炎肽，或使用兩種或更多種在耐受狀況下的抗炎肽，或者使用至少一種免疫狀態(tài)下的促炎肽和至少一種耐受狀態(tài)下的抗炎肽。這樣的增加或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答的方法導(dǎo)致了受試者的促炎細胞因子水平的增加，象伽馬干擾素(IFNγ)，阿耳法腫瘤壞死因子(TNFα)，白細胞介素-1(IL-1)，IL-6，IL-12，或IL-23，或者導(dǎo)致受試者的抗炎細胞因子水平的降低，象IL-4，IL-10，或貝塔生長轉(zhuǎn)化因子(TGFβ)，或者這兩種情況同時發(fā)生。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明的方法提供了在受試者中減輕或抑制炎癥應(yīng)答的手段。一方面是，在免疫狀態(tài)下，在受試者中用有抗炎活性的肽進行減少或抑制炎癥應(yīng)答的方法。而另一方面，這方法是通過對耐受狀態(tài)下的受試者用促炎肽。還有另一方面，免疫原性肽的結(jié)合使用，比如，在耐受狀態(tài)下，兩種或更多種的促炎肽，或免疫狀態(tài)下，兩種或更多種的抗炎肽，或耐受狀態(tài)下的至少一種促炎肽和免疫狀態(tài)下的至少一種抗炎肽。這樣的一種減少或抑制炎癥應(yīng)答的方法導(dǎo)致受試者的抗炎細胞因子水平的增加，例如IL-4，IL-10，或TGFβ，或者是促炎細胞因子水平的降低，如IFNγ，TNFα，IL-1，IL-6，IL-12，或IL-23，或者兩者同時存在。
正如此處所公開的，一種danJ hsp的免疫原性肽片段或其組合都可用，例如，包括SEQ ID NOS1-26例舉的免疫原性肽的一種或隨意的組合，正如從此處公開內(nèi)容將會清楚的，本發(fā)明中的肽被用于免疫條件或耐受條件下的受試者是依據(jù)肽是否是促炎肽或抗炎肽，是否肽用于增強或誘發(fā)炎癥應(yīng)答，或降低或抑制炎癥應(yīng)答。根據(jù)肽的免疫原性量，可以在免疫條件下使用肽，如皮內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)，并且如需要，是在含有免疫佐劑，像福氏完全佐劑或不完全佐劑的組合物中使用。根據(jù)肽的致耐受量，肽可以在耐受免疫條件下使用，如粘膜，或皮內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)。
本發(fā)明的方法可在有關(guān)受試者中實踐，該受試者有或者是易感或可疑于任何需要調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的狀況，包括患有免疫性疾病或者可疑或易感免疫性疾病的受試者。這些受試者通常屬于脊椎動物，特別是哺乳類，包括家養(yǎng)動物，如貓，狗，馬；飼養(yǎng)動物如綿羊，牛，豬類或人類。免疫性疾病可以是免疫系統(tǒng)的病。如自身免疫性疾病，如關(guān)節(jié)炎，象特發(fā)性幼稚型關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎，或者是免疫缺陷病，如獲得性免疫缺陷病(AIDS)。另一種情況其是需要調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，這種情況的受試者沒有發(fā)育完善的免疫反應(yīng)，如對感染性疾病或癌的反應(yīng)?；蛘呤鞘茉囌叩那闆r是免疫反應(yīng)太高，如受試者患有除了自身免疫性疾病以外的腸道炎癥或者細菌性壞死。
本發(fā)明也涉及到調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細胞的反應(yīng)性的方法。通過把danJhsp的肽片段給受試者，接觸免疫效應(yīng)細胞，這種方法就可以進行。從其中可以衍生肽的dnaJ hsp可以是任何dnaJ hsp，如在此公開的或其他該領(lǐng)域已知的，包括原核或真核生物的dnaJ hsp。肽可以配制在組合物中，但不是必須的，如果需要，其中也可以含有免疫佐劑或其他免疫調(diào)節(jié)劑，如，一種或多種細胞因子。免疫效應(yīng)細胞可以是T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)的任何細胞，特別是T細胞，可以通過把肽用于受試者，在體內(nèi)與該肽接觸，或在體外接觸。
當(dāng)免疫效應(yīng)細胞在體外被接觸時(或離體)，該方法可進一步包括將接觸過的免疫效應(yīng)細胞施用給受試者。因此，免疫效應(yīng)細胞相對于受試者可以是自體的，也就是，從患者自身取出的細胞，與該肽離體接觸，然后施用給受試者，如果需要，是在培養(yǎng)使細胞擴張之后予以施用。免疫效應(yīng)細胞相對于受試者可以是同種異體的，例如，細胞與受試者的細胞比較，至少是部分單倍體。相應(yīng)地，這種方法通過增加或誘導(dǎo)受試者的炎癥應(yīng)答，或降低或抑制受試者的炎癥應(yīng)答，提供了調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的手段。
本發(fā)明也涉及具有促炎或抗炎活性的dnaJ hsp的免疫原性肽片段。本發(fā)明的免疫原性肽是以在SEQ ID NO1--26中表示的肽為例證的。另外，本發(fā)明涉及一種嵌合多肽，其包括本發(fā)明的一個肽與至少一個異源多肽有效連接。提供了至少含有一個本發(fā)明中的肽的組合物，例如，其含有表示在SEQ ID NO1--26中的肽中的任何一個肽，和一個含有由這些肽任意組合的組合物，特別地，含有促炎肽的組合的組合物和含有抗炎肽的組合的組合物。本發(fā)明的組合物通常在生理適宜溶液里配制，如需要，可再加入一種或更多種的免疫佐劑，如，一種或更多種的細胞因子，完全福氏佐劑，不完全福氏佐劑，明礬，或者類似物。一般來說，當(dāng)組合物包括一種或多種細胞因子時，細胞因子具有炎性活性，其與本發(fā)明的肽的炎性活性可相同或者補充其炎性活性。
本發(fā)明進一步涉及到編碼本發(fā)明中免疫原性肽的多核苷酸。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，并且可以是核糖核酸分子(RNA)，脫氧核糖核酸分子(DNA)，或它們的雜交分子。也可以提供重組核酸分子，其含有本發(fā)明的多核苷酸與至少一個異源核苷酸序列的有效連接。異源核苷酸序列可以是任何核苷酸序列，在自然狀態(tài)下，正常情況下，沒發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列與本發(fā)明的多核苷酸相鄰連接。例如，異源核苷酸序列可以是一個表達控制序列，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件或翻譯調(diào)節(jié)元件，或是其組合；或可以是編碼多肽，如細胞因子、或其他免疫調(diào)節(jié)因子，肽標(biāo)記物，細胞定位結(jié)構(gòu)域，或類似物。還提供含本發(fā)明的多核苷酸的載體，如表達載體，以及含本發(fā)明的多核苷酸或載體的細胞。
根據(jù)本發(fā)明，調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)的方法是基于下述發(fā)現(xiàn)通過對潛在的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，免疫反應(yīng)自身的調(diào)節(jié)，而不僅僅注意于所導(dǎo)致的炎癥，可以實現(xiàn)改善免疫相關(guān)疾病的炎癥相關(guān)癥狀，例如關(guān)節(jié)炎，的有效治療策略。這一策略可用于調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答，及用于需要免疫調(diào)節(jié)的多種情況下，例如，包括粘膜耐受性，DNA接種，無反應(yīng)性誘導(dǎo)，自動免疫接種，抗原特異T細胞的離體調(diào)節(jié)。
在多種實施方案中，調(diào)節(jié)可以包含促炎細胞因子水平增加，如受試者的IFNγ水平或TNFα水平；刺激單核細胞增殖；或增加抗炎細胞因子的水平，如受試者的IL-10，IL-4或TGFβ的水平。在其他實施方案中，調(diào)節(jié)可以降低或抑制受試者的的細胞因子水平。因此，本發(fā)明的組合物或方法提供了一種手段，用于加強促炎反應(yīng)或耐受反應(yīng)，這與欲接受這種治療的受試者的情況相適合。
本發(fā)明的方法用于治療患免疫反應(yīng)相關(guān)或介導(dǎo)的病的受試者，如自身免疫病，感染性疾病，或癌癥。按照本發(fā)明的方法，可以治療的自身免疫性疾病的實例有關(guān)節(jié)炎，特別是特發(fā)性幼稚關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎(oligoarticular juvenile idiopathic arthritis)(oJIA)，糖尿病和多發(fā)性硬化癥。本發(fā)明的組合物或方法也可用于藥物綜合治療的一部分，如，作為癌癥治療的佐劑，或在針對感染源的治療中接用。
附圖簡述

圖1A-1C。圖1A顯示了健康受試者(“CTRL”)和特發(fā)性幼稚關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎(″oJIA″)患者用重組大腸桿菌hsp dnaJ刺激96小時，外周血(PBMC)和滑液單核細胞(SFMC)的增殖反應(yīng)。結(jié)果以刺激指數(shù)表達，以均值+SD表示。
圖1B提供的是健康受試者(CTRL)和oJLA患者用重組大腸桿菌hsp dnaJ培養(yǎng)72小時后，對CD69+T細胞的估值。結(jié)果以％CD3+CD69+細胞的百分數(shù)表達，以均值+SD表示。
圖1C提供的是用破傷風(fēng)類毒素(TT)或重組大腸桿菌hsp dnaJ(dnaJ)刺激oJIA患者96小時的PBMC-SFMC配對樣本的刺激指數(shù)(SI)比率的估值。
圖2顯示了健康的受試者(CTRL)或oJLA患者用重組大腸桿菌hspdnaJ刺激72小時，PBMC或SFMC的培養(yǎng)物上清液中細胞因子的產(chǎn)量(以IFNγ，TNFα，IL-10，和IL-4所指示)。結(jié)果以pg/ml表達，表示為均值+SD。
圖3A和3B顯示了oJIA患者(圖3A)或HLA B27+患者(圖3B)的SFMC增殖反應(yīng)，是用重組大腸桿菌hsp dnaJ肽培養(yǎng)72小時，再用有或無相關(guān)對照肽(OVA)存在下的自身輻射的飼養(yǎng)細胞或大腸桿菌hsp衍生肽刺激，(如圖中所指明的)。結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表達，表示為均值+SD。
圖4顯示了oJIA患者SFMC培養(yǎng)物上清液中IL-10的產(chǎn)量，是用大腸桿菌hsp dnaJ肽刺激72小時，自身輻射飼養(yǎng)細胞再刺激，該細胞遞呈與細菌肽同源或不同源的人肽。結(jié)果以pg/ml表達，表示為均值+SD。
圖5顯示了oJIA患者SFMC培養(yǎng)物上清液中的IL-10的產(chǎn)量，是用大腸桿菌hsp dnaJ刺激72小時，自身輻射飼養(yǎng)細胞再刺激，該細胞遞呈同源或不同源的人肽(如圖中指明的)。結(jié)果以pg/ml表達，表示為均值+SD。
圖6顯示了非同源的人肽50，51，134，197，254，256，270，283和318(分別為SEQ ID NO18-26)的SI。
圖7-9分別顯示了對如圖6所示肽進行反應(yīng)的IFNγ，TNFα，和IL-10水平。
圖10顯示了對細菌dnaJ 4(SEQ ID NO1)和它的人類源物，2(SEQID NO9；HSJ1)，3(SEQ ID NO10；HDJ1)和5(SEQ ID NO11；HDJ2)反應(yīng)的SI。
圖11-13分別顯示了對如圖10所示的肽進行反應(yīng)的TNFα，IFNγ，和IL-10水平。
圖14顯示了對細菌肽dnaJ 4，22，61，174，209，242，264，和268(分別為SEQ ID NO1-8)反應(yīng)的SI。
圖15-18分別顯示了對細菌肽dnaJ 174(SEQ ID NO4)和它的人同源物，164(SEQ ID NO15；HSJ1)，167(SEQ ID NO16；HDJ2)和176(SEQ ID NO17；HSJ1)進行反應(yīng)的IFNγ，TNFα，和IL-10水平。
圖19-22分別顯示了對細菌dnaJ 22和它的人同源物，20(HSJ1)，21(HDJ)，和23(HSJ1)進行反應(yīng)的SI，TNFα，IFNγ和IL-10水平。
圖23顯示了oJIA(″oligo″)患者與除oJLA以外的其他形式JIA患者(″syst/poly″)相比較針對各種肽的增殖反應(yīng)。結(jié)果以SI(條線表示SD)表達。pandr和dnaJpv是對照肽。
圖24A顯示了對肽174和134刺激反應(yīng)的CTLA4/CD25陽性細胞百分率。TC表示沒有刺激的組織培養(yǎng)物。條線代表SD。
圖24B顯示了用肽174和134刺激oJIA患者的SFMC產(chǎn)生的IL-10生成量，表達為pg/ml。
圖25A-25C顯示了用如圖所示的各種肽刺激oJIA患者SFMC的增殖反應(yīng)(SI；圖25A)和IFNγ圖25B)或IL-10(圖25C)的生成量。
圖26A-26E顯示了T細胞對dnaJP1的誘導(dǎo)治療調(diào)節(jié)結(jié)果。圖26A顯示了用10μg/ml dnaJP1肽(SEQ ID NO3)刺激5天，PBMC的T細胞增殖反應(yīng)。評估以月間隔進行。對照是植物血凝素(PHA)，為一種常規(guī)促細胞分裂原，和dnaJpv(SEQ ID NO28)。用FACS以月間隔評估篩選時有反應(yīng)的病人的PBMC的細胞內(nèi)細胞因子生成量(促炎癥-圖26B，C，和D；致耐受-圖26E)。結(jié)果以dnaJP1刺激的/未刺激的培養(yǎng)物中的CD3+細胞的百分數(shù)表示。
發(fā)明祥述本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)的方法。如此文所公開的，通過對根本的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，而不僅僅是注重引發(fā)的炎癥，可改善免疫相關(guān)疾病的與炎癥有關(guān)的癥狀，如關(guān)節(jié)炎，是一種有效的治療策略。這一策略可被用來調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答，并且在多種需要免疫調(diào)節(jié)的情況下可以應(yīng)用，例如，粘膜耐受性，DNA接種，無反應(yīng)性誘導(dǎo)，自動免疫接種，抗原特異T細胞的離體調(diào)節(jié)。
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的肽，本發(fā)明的肽是免疫原性肽，選擇其能與最普通的II類人白細胞抗原的等位基因結(jié)合。如此文所述，免疫原性肽可以是dnaJ hsp任何免疫原性部分，通常是與II類組織相容性抗原復(fù)合物受體或者是T細胞受體結(jié)合的肽，并且其為dnaJ多肽提供了基本上特異性的抗原決定簇。
此文所述的例證性的免疫原性肽是從微生物和哺乳動物熱休克蛋白(hsp)衍生的，包括大腸桿菌hsp dnaJ(見GenBank Acc.No.NP-308042和人dnaJ蛋白同源物如HSJ1(GenBank Acc.No.XP-010863)，HDJ1(GenBank Acc.No.P25685)和HDJ2 Genbank Acc.No.P31689)。然而，將會認識到同源于大腸桿菌dnaJ的蛋白或人dnaJ同源物，也可作為本發(fā)明獲得免疫原性肽的來源。在這個領(lǐng)域中，對dnaJ同源物已很了解，如包括那些通過從各種原核或真核生物克隆的核酸分子編碼，例如有鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)(GenBank Acc，No.CAC89325)，釀酒酵母(GenBank Acc.No.NP-013884)，zebrafish(GenBank Acc.No.B1846679)，雞(GenBank Acc.No.B1391025)，小鼠(GenBank Acc.No.NP-064662)。將認識到，其他生物的別的dnaJ hsp可被鑒定和得到，方法是通過用術(shù)語象″dnaJ″，″HSJ1″，或類似術(shù)語和一種此處公開的檢索方法和檢索參數(shù)對核酸分子或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索，例如，如此文所述，國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫。
如此文所述，細菌hsp dnaJ蛋白和人HSJ1，HDJ1和HDJ2的hsp的肽片段，包括與細菌hsp dnaJ肽序列同源的肽(“同源人肽”)和與細菌hsp dnaJ肽序列非同源的肽(“非同源人肽”)，可以調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)。典型的細菌hsp dnaJ肽和同源及非同源人肽包括細菌dnaJ肽dnaJ4QDYYEILGVSKTAEE(SEQ ID NO1)，dnaJ22 RKAYKRLAMKYHPDR(SEQ ID NO2)，dnaJ61 QKRAAYDQYGHAAFEQ(SEQ ID NO3)，dnaJ174 QGFFAVQQTCPHCQG(SEQ ID NO4)，dnaJ209 SKTLSVKIPGAVDTG(SEQ ID NO5)，dnaJ242 GDLYVQVQVKQHPIF(SEQ ID NO6)，dnaJ264 YCEVPINFAMAALGG(SEQ ID NO7)，dnaJ268 PINFAMAALGGEIEV(SEQ ID NO8)；同源人肽2(HSJ1) ASYYEILDVPRSASA(細菌dnaJ肽4的同源物；SEQ IDNO9)3(HDJ1) KDYYQTLGLARGASD(細菌dnaJ肽4的同源物；SEQID NO10)5(HDJ2) TTYYDVLGVKPNATQ(細菌dnaJ肽4的同源物；SEQID NO11)
20(HSJ1) KKAYRRKALQWHPDK(細菌dnaJ肽22的同源物；SEQ ID NO12)21(HDJ1) KRAYRRQALRYHPDK(細菌dnaJ肽22的同源物；SEQID NO13)23(HDJ2) KKAYRKLALKYHPDK(細菌dnaJ肽22的同源物；SEQ ID NO14)164(HSJ1) FRSVSTSTTFVQGRR(細菌dnaJ肽174的同源物；SEQ ID NO15)167(HDJ2) PGMVQQIQSVCMECQ(細菌dnaJ肽174的同源物；SEEQ ID NO16)176(HSJ1) GRRITTRRIMENGQE(細菌dnaJ肽174的同源物；SEQ ID NO17)非同源人肽50(HDJ2)QAYEVLSDAKKRELYD(SEQ ID NO18)51(HSJ1)EAYEVLSDKHKREIYD(SEQ ID NO19)134(HSJ1)SGPFFTFSSSFPGHS(SEQ ID NO20)197(HSJ1)DGQLKSVTINGVPDD(SEQ ID NO21)254(HSJ1)DLQLAMAYSLSEMEA(SEQ ID NO22)256(HDJ2)EDLFMCMDIQLVEAL(SEQ ID NO23)270(HDJ2)LCGFQKPISTLDNRT(SEQ ID NO24)283(HDJ2)RTIVITSHPGQIVKH(SEQ ID NO25)318(HDJ2)GRLIIEFKVNFPENG(SEQ ID NO26)。
本發(fā)明的免疫原性肽包括“促炎肽”，其引起促炎細胞因子表達增加，如γ干擾素，也包括“抗炎肽”，其引起抗炎細胞因子的表達增加，如白細胞介素-10。本發(fā)明的肽是否有促炎活性或抗炎活性，便利地可采用此文所述(見實施例1和實施例2)的體外試驗或可用該領(lǐng)域常規(guī)使用的任何方法來決定，例如肽與免疫效應(yīng)細胞接觸而表達的細胞因子的鑒定和數(shù)量。如此處所用，術(shù)語“免疫效應(yīng)細胞”是指直接涉及產(chǎn)生或完成免疫反應(yīng)的細胞。這些細胞在該領(lǐng)域是眾所周知，包括B淋巴細胞(B細胞)；抗原呈遞細胞，如樹突狀細胞，單核巨細胞，巨噬細胞，包括郎格罕細胞(Langerhans cells)，和在人類中，靜脈內(nèi)皮細胞(和B細胞)；特別是T細胞，例如，T輔助細胞，T抑制細胞，細胞毒性T細胞。
本發(fā)明的免疫原性肽按特點可以被歸納為兩大類，包括含有在不同物種的dnaJ hsp中相對保守的氨基酸序列的肽(“同源肽”)；和含有在dnaJhsp中基本上不保守的氨基酸序列的肽(“非同源肽”)。如此文所用，術(shù)語“同源性”是用以表達，當(dāng)通過比較窗或設(shè)定區(qū)域，用數(shù)種任何序列比較算法或通過手工排列和肉眼觀察，比較和對齊獲得最大對應(yīng)時，氨基酸序列或核苷酸序列至少有大約占序列的百分之五十與參考序列具有一致性。為達到判定序列同一性的目的，保守氨基酸的替換，如類似這樣的氨基酸替換，其有疏水脂肪側(cè)鏈的氨基酸(如，丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸)，或有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如，天冬氨酸，谷氨酸)，或有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如，精氨酸，賴氨酸)或類似情況，被認為是相同的。另外，決定同源性，可以允許一個或幾個插入或缺失，優(yōu)選地為一個或兩個插入和缺失，前提是只要這種插入或者缺失被認為是一個氨基酸，它們在比較效果中沒有不同。因此，同源肽在長短上可以有一個，兩個或幾個氨基酸的不同，只要序列同一性的最低數(shù)量得以保持。
如此文所述，在與參考肽或多核苷酸分別比較時，本發(fā)明的同源肽或多核苷酸分別為具有至少有大約50％序列同一性，通常是至少大約60％序列同一性，可以是至少大約70％序列同一性或80％序列同一性或更高的序列同一性。例如，細菌dnaJ肽4(SEQ ID NO1)，其含有15個氨基酸，與人HSJ1肽2(SEQ ID NO9)同源，其含有15個氨基酸，相對于SEQ ID NO1(9/15；60％)，包括7個相同的氨基酸和兩個保守性替換；與人HDJ1肽3(SEQ ID NO10)同源，其含15個氨基酸，相對于SEQ ID NO1(9/15；60％)，包括6個相同的氨基酸和三個保守性替換；與人HDJ2肽5同源(SEQ ID NO11，相對于SEQ IDNO1(8/15；53.3％)，含有八個相同的氨基酸。本發(fā)明的非同源肽是不同源的肽，但是卻具有本發(fā)明免疫原性肽的特點。
決定肽或多核苷酸是否與本發(fā)明所述用途同源，可以通過肉眼比較兩個或幾個序列得到，或者用計算機輔助法得到，其可以用于從蛋白質(zhì)或核酸分子數(shù)據(jù)庫中所包含的許多序列中確定同源序列。例如同源性或同一性的測算可以用序列分析軟件，例如遺傳學(xué)計算機組的序列分析軟件(Wisconsin大學(xué)生物技術(shù)中心，1710 University Avenue，Madison，WI53705)。這樣的軟件是通過對各種缺失、替換及其他修飾賦予同源性程度對比相似序列。當(dāng)使用一個序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機，如果需要設(shè)定子序列坐標(biāo)，然后設(shè)定序列算法程序參數(shù)。也可以使用缺省程序參數(shù)，或可以設(shè)定替代參數(shù)?；诔绦騾?shù)，然后用序列比較算法計算與參考序列相關(guān)的測試序列的同一性百分比。
術(shù)語“比較窗”在本文以廣義使用，是指一個包括相鄰位置的任意數(shù)目的片段，例如約9-50個氨基酸位置，或約20-200個核苷酸位置，其中在兩個序列被最佳地排列后，其中一個序列可以與一個具有相同數(shù)目相鄰位置的參考序列進行比較。序列比較的排列方法是眾所周知的，例如包括，Smith和Watermen(Adv.Appl.Math.2482，1981)的局部同源性計算方法，Needleman and Nunsch(J.Mol.Biol.48443，1970)的同源性排列計算方法，Person and Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444，1988)的搜索相似性的方法，此處將它們的每一個均引入，以供參考；通過實施這些計算方法的計算機化的執(zhí)行程序(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，WI)；或通過人工排列和肉眼檢查。判斷同源性或同一性的另外的計算方法，如，還有BLAST程序(國家生物信息中心Basic Local Aligment Search Tool(基礎(chǔ)局部排列搜索工具)，ALIGN，AMAS(多排列序列分析)，AMPS(蛋白多序列排列)，ASSET(排列段統(tǒng)計評估工具)，BANDS，BESTSCOR，BIOSCAN(生物序列比較分析結(jié)點)，BLIMPS(BLocks IMProved Searcher)，F(xiàn)ASTA，間隔和點(Intervals&Points)，BMB，CLUSTAL V，CLUSTAL W，CONSENSUS，LCONSENSUS，WCONSENSUS，Smith-Waterman算法，DARWIN，Las Vegas算法，F(xiàn)NAT(強制多核苷酸排列工具(ForcedNucleotide Alignment Tool)，F(xiàn)ramealign，F(xiàn)ramesearch，DYNAMIC，F(xiàn)ILTER，F(xiàn)SAP(FristensKy序列分析包)，GAP(綜合排列程序)，GENAL，GIBBS，GenQuest，ISSC(敏感性序列比較)，LALIGN(局部序列排列)，LCP(局部目錄程序)，MACAW(多排列結(jié)構(gòu)及分析平臺)，MAP(多排列程序)，MBLKP，MBLKN，PIMA(誘發(fā)型多序列排列)，SAGA(遺傳算法序列排列)和WHAT-IF。這些排列程序也可用于篩選基因組數(shù)據(jù)庫，以鑒定具有基本上相同的序列的多核苷酸序列。
一種有用算法的實例是BLAST和BLAST2.0算法，是由Altschul等闡述的。(Nucleic Acids Rses.253389-3402，1977；J.Mol.Biol.215403-410，1990，將其每一個引用于此供參考)。完成BLAST分析的軟件可以從國家生物技術(shù)中心公開得到。(全球信息網(wǎng)中的網(wǎng)址是ncbi.nlm.nih.gov)。該算法首先通過在查詢序列中識別長度為W的短字詞，識別出高得分序列對，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫中序列一樣長的字詞對齊時，其或者匹配或者滿足一些T記分閾值正值。T是指鄰字詞得分閾值(Altschul et al.，supra，1977，1990)。這些初始的鄰字詞命中作為啟動搜索的籽晶(seed)，以便找到包括他們的更長的得分序列對。這種字詞命中沿著每一個序列的兩個方向擴展，只要累積排列得分可以增加。累積排列得分是計算所得，對核苷酸序列，是用參數(shù)M+(一對匹配殘基的獎勵得分；總是＞0)。對氨基酸序列，用記分矩陣計算累積得分。字詞命中在每個方向的擴展在下述情況下停止，累積排列得分在X量獲得最大極限值時下降；由于一或多個負積分殘基排列的累計，類積得分達到0或更低；或是達到其中一種序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W，T和X決定了排列的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)以字長(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，和雙鏈比較作為缺省。對氨基酸序列，BLASTP程序以字長為3，期望值(E)為10和BLOSUM62記分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 8910915，1989)排列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，，和雙鏈比較作為缺省。
BLAST算法也進行兩個序列的相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(見Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 905873，1933，在此將其引用供參考)。BLAST算法提供的一個相似性的量度標(biāo)準(zhǔn)是最小總計概率(P(N))，對偶然會發(fā)生的核苷酸和氨基酸之間的配對，其提供了概率指標(biāo)。例如，比較中的試驗核酸與參考核酸相比，如果最小總計概率小于0.2，則認為該核酸與參考核酸相似，更優(yōu)選最小總計概率小于大約0.01，最優(yōu)選小于大約0.001。
在一個實施方案中，用基本局部排列搜索工具(″BLAST″)評估蛋白質(zhì)和核酸序列的同源性。尤其是，5個特異的BLAST程序用于完成了下列工作(1)BLASTP和BLAST3將一個氨基酸查詢序列與一個蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較；(2)BLASTN將一個核苷酸查詢序列與一個核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行比較；(3)BLASTX將一個查詢核苷酸序列(兩個鏈)的6-框概念區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與一個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比較；(4)TBLASTN將一個查詢蛋白質(zhì)序列與一個全部以六個閱讀框的形式翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行比較；(5)TBLASTX將一個核苷酸查詢序列的6-框翻譯與一個核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的6-框翻譯進行比較。
BLAST程序確定同源序列是通過辨別相似片段進行的，在這里將其稱為查詢氨基酸或核酸序列與測試序列間的“高得分片斷對”，其中測試序列優(yōu)選來自蛋白質(zhì)或核酸序列數(shù)據(jù)庫。高得分片斷對優(yōu)選用記分矩陣確定(即，排列的)，其中許多記分矩陣在本領(lǐng)域是已知的。優(yōu)選地，使用的記分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet等人，Science2561443-1445，1992；Henikoff，和Henikoff，Proterns 1749-61，1993，此處將其每一個引入供參考)。次優(yōu)選地，PAM或PAM250矩陣也可以用(Schwartz和Dayhoff，編著，“探索距離關(guān)系的矩陣蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜”(華盛頓，國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會1978))。BLAST程序通過美國國家醫(yī)學(xué)圖書館可進入，如，在全球信息網(wǎng)中以網(wǎng)址ncbi.nlm.nih.gov進入。用于上述算法的參數(shù)可根據(jù)序列長度和所研究的同源性程度進行修改。在一些實施方案中，由于用戶沒有給出指令，這些參數(shù)可以是算法中所用的缺省參數(shù)。這些搜索方法也可以用于從數(shù)據(jù)庫中鑒定dnaJ hsp。
本發(fā)明的肽可以用化學(xué)的肽合成方法制備，可以由編碼的多核苷酸表達，或dnaJ hsp裂解后進行分離。純化、合成或制備重組形式的肽的技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是容易的，也是眾所共知的，適宜用于制備足夠純度的免疫原性肽用于本發(fā)明的方法中。在這個方面，術(shù)語“分離”或“基本純化”意指基本上不含有在體內(nèi)通常與其結(jié)合在一起的其他化合物的多肽或者多核苷酸。在本發(fā)明的方法中，術(shù)語基本純化是指基本上是同質(zhì)的肽或多核苷酸，其中同質(zhì)性是通過參考該領(lǐng)域已知的純度標(biāo)準(zhǔn)確定的，這樣的純度足以容許得到該蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列。優(yōu)選地，該肽或多核苷酸是充分分離的，以便它可以施用給受試者。所以，這種分離的肽或多苷酸一般地在含肽樣本中占至少約50％，通常是至少約75％，特別地至少約90％，優(yōu)選地約95％-99％或更多。應(yīng)該認識到，這種純度度量標(biāo)準(zhǔn)僅僅是指該肽，或者作為原材料，例如，將其配制成一種組合物，在這種情況下本發(fā)明的分離肽可以是該組合物的一個成分，該組合物可以進一步含有此處公開的其他成分，包括本發(fā)明的其他分離肽。
基本上純dnaJ蛋白質(zhì)和肽可以通過微生物表達從完整的微生物中獲得，特別是細菌；用化學(xué)或生物合成方法，或用該領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)純化方法，包括，如親合層析法?？衫眠@種技術(shù)獲得dnaJ hsp的免疫原性肽片段。例如，用于本發(fā)明疫苗組合物的蛋白質(zhì)或肽可以化學(xué)合成，用涉及α氨基的tBOC或FMOC保護的方法。兩種方法涉及逐步合成，都依靠從肽的羧基末端開始每一步加入一個氨基酸，(如，見Coligant等人(Current Protocols in Immunology)現(xiàn)代免疫學(xué)方法，Wiley Interscience，1991，第9單元)。本發(fā)明的肽也可以用周知的固相肽合成法合成。(如，見Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，82149，1962；Stewart和Young，固相肽合成(Solid Phase Peptides Synthesis)(Freeman，SanFrancisco，1969)，見27-62頁)，使用到一種共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，其中，每克聚合物含大約0.1-1.mmol胺。在完成化學(xué)合成后，通過用液態(tài)含氟化氫10％的茴香醚在0℃處理15分鐘到1小時，使肽脫保護，并從聚合物上脫離下來。在反應(yīng)物蒸發(fā)后，用1％的醋酸溶液從聚合物中提取肽，然后，冷凍干燥得到粗物質(zhì)，可以用諸如凝膠過濾層析法等方法純化，例如在SEPHADEX.RTM G-15親和柱或SEPHAROSE.RTM親和柱上進行純化，使用5％的醋酸作為溶劑。過柱的適當(dāng)組分的冷凍干燥得到基本上同質(zhì)的肽或肽的衍生物，這些物質(zhì)可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)定性，如氨基酸分析、薄層層析、高效液相層析、紫外吸收分光法、摩爾旋光、或溶解度，還可以測序，如用固相埃德曼降解法測序。
如果需要，本發(fā)明的免疫原性肽可被修飾，如，為了增加該肽作為免疫原或耐受原的能力，增加肽在受試者或其他介質(zhì)中的穩(wěn)定性，或為需要的其他任何目的進行修飾。如該肽可以通過糖基化修飾，這可以通過連接糖部分于該肽的氨基酸的活性側(cè)鏈上而實現(xiàn)，或者通過在該肽的N端或C端引入一個或幾個附加的氨基酸，并連接糖部分于這些附加的氨基酸上。這種連接可以是在糖蛋白上常見的任何連接方式。如，N-連接或O-連接糖分別與天冬酰胺殘基或絲氨酸殘基結(jié)合，或可以是任何其他方便地實現(xiàn)的連接方式。
本發(fā)明的免疫原性肽可以通過有效地連接在一個或更多其他肽或多肽上而被修改。因為這樣，本發(fā)明也提供了一種嵌合多肽，其包括與至少一個異源多肽有效連接的本發(fā)明的肽。在此所用，術(shù)語″有效連接″表示兩個或更多個肽(或兩個或更多個多核苷酸)連接在一起，以便被連接的肽(或多核苷酸)的功能被保留，以便該嵌合多肽(或重組核酸分子)表現(xiàn)出每一個元件肽(或多核苷酸)的功能。例如，本發(fā)明的嵌合多肽可包括與肽標(biāo)記物有效連接的本發(fā)明的肽，如肽標(biāo)記物多聚組氨酸，以便該肽可以在樣品中被鑒定或通過使用鎳螯合劑將其從混合物中分離出來。例如，本發(fā)明的肽也可與細胞區(qū)室化功能域連接，該功能域促進細胞的肽區(qū)室定位，例如，在編碼嵌合多肽重組核苷酸用于受試者后再行表達的肽。細胞區(qū)室化功能域可以促進該肽定位于細胞質(zhì)，細胞核，質(zhì)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)側(cè)高爾基體外側(cè)潴泡，或溶酶體或內(nèi)含體；或可以是膜轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運肽，其可促進免疫原性肽通過細胞膜的轉(zhuǎn)運；或是分泌肽，其可促使該肽分泌到細胞外。(例如，參見Hancock等人，EMBO J，104033-4039，1991；Buss等人，Mol.Cell.Boil.83960-3963，1988；美國專利5,776,689，將其每一個引用于此供參考)。
本發(fā)明也提供編碼的本發(fā)明的免疫原性肽的多核苷酸。該多核苷酸可以是單鏈或雙鏈，可以是核糖核酸分子(RNA)，脫氧核糖核酸分子(DNA)，或其雜交分子。另外，本發(fā)明還提供了重組核酸分子，該分子含有與至少一個異源核苷酸序列有效連接的本發(fā)明的多核苷酸。這種異源核苷酸序列可以是任何核苷酸序列，其在自然界與本發(fā)明的多核苷酸鄰接通常是找不到的。例如異源核苷酸序列可以是表達控制序列，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或翻譯調(diào)控元件，或其組合；或可以是編碼一個多肽的序列，例如細胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)因子，肽標(biāo)記物，細胞定位結(jié)構(gòu)域，或類似物。其中重組核酸分子編碼本發(fā)明的一個肽和一個第二種(或更多種)的功能多肽，如本發(fā)明的一個或多個另外的肽，或一個或多個細胞因子，或類似物，該重組核酸分子可以進一步編碼一個位于編碼的每一個肽之間的蛋白水解酶識別位點，這樣一旦表達，編碼的肽中的每一個就會以與其他編碼的肽或多肽分離開的形式釋放出來。
本發(fā)明也提供了含有本發(fā)明的多核苷酸的載體，還提供含有本發(fā)明的多核苷酸或者載體的細胞。載體可以是克隆載體，其可以用于產(chǎn)生大量包含于其中的本發(fā)明的多核苷酸或重組核酸分子，或可以是表達載體，如果該多核苷酸用于細胞或受試者，其可以用于表達編碼肽的目的。這樣的載體在本領(lǐng)域是周知的，例如質(zhì)粒載體和病毒載體，包括衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘病毒、或類似病毒的載體。
有效編碼外源結(jié)構(gòu)基因插入物的一種常用質(zhì)粒載體是pBR322質(zhì)粒。
pBR322含有一個賦予氨芐青霉素抗性的基因，作為標(biāo)記基因；但是，用于人時，這種氨芐青霉素抗性基因應(yīng)該去除。用于基因免疫程序、但是沒有氨芐青霉素抗性的修飾載體已有描述，例如，在1996年1月30日提出的申請的美國序列號08/593,554中已有描述，此處將其引入供參考。
在本發(fā)明中所用的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒或諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA病毒。優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠類或鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。其中可以插入單個外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實例，包括，但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)，Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuS-V)，鼠類乳腺腫瘤病毒(MuMTV)，和勞斯肉瘤病毒(RSV)。許多其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以并入多個基因。所有這些載體可以轉(zhuǎn)移或并入一個基因作為選擇標(biāo)記，以便轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞可以被鑒定和增殖。
因為重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒有缺陷，它們需要幫助以便生產(chǎn)感染性載體顆粒。例如，這種幫助可以通過使用輔助細胞系獲得，該細胞系含有在長末端重復(fù)序列(LTR)內(nèi)的調(diào)控序列控制下的編碼該逆轉(zhuǎn)錄病毒的所有結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒缺少一種能夠使包裝機制識別用于包衣殼作用的一種RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列。輔助細胞系發(fā)生包裝信號的缺失，例如，包括，但不限于Ψ2，PA317和PA12。由于沒有包入基因組，這些細胞系產(chǎn)生空心病毒體。如果逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被導(dǎo)入這樣的輔助細胞中，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的包裝信號是完好的、但是結(jié)構(gòu)基因卻被其他有關(guān)基因替代，則該載體可以被包裝，產(chǎn)生載體病毒體。
施用編碼本發(fā)明的一種肽的多核苷酸作為疫苗以代替施用肽作為傳統(tǒng)疫苗可以獲得某些優(yōu)勢，包括，例如，潛在毒性危險可以基本上被消除，例如與蛋白質(zhì)疫苗相關(guān)的過敏性休克。在與細胞接觸或給予受試者時，本發(fā)明的多核苷酸或重組核酸分子，或含有該多核苷酸的載體可以以“裸”DNA的形式施用，或者配制進輸送載體中，例如脂質(zhì)體或膠體顆粒中，這可以促進多核苷酸的吸收，減少細胞吸收前多核苷酸降解的可能性。
本發(fā)明也提供了一種組合物，其中包括至少一個本發(fā)明的肽，以及本發(fā)明可以提供包括多種本發(fā)明的免疫原性肽的組合物，例如，一種含有SEQ ID NOS1-26闡明的肽中的任一肽的組合物，或是一種含有這些肽的任意組合的組合物，特別是一種含有促炎肽的組合的組合物，和一種含有抗炎肽的組合的組合物。一般來說，本發(fā)明的組合物是配制在生理學(xué)上接受的溶液內(nèi)，并且，如果需要，可以進一步含有一種或多種免疫佐劑，例如，一種或多種細胞因子，福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑，明礬，或類似物。一般地說，該組合物含有一種或多種細胞因子，這些細胞因子與本發(fā)明的肽具有相同的炎癥活性或能補充本發(fā)明的肽的炎癥活性。這種組合物也可含有任何免疫佐劑，包括免疫刺激物，或者，如果需要，可以是免疫抑制劑，其可以調(diào)節(jié)個體的全身性免疫反應(yīng)。有這種活性的適宜物質(zhì)在本技術(shù)領(lǐng)域是周知的，包括IL-6，其可以刺激抑制性或細胞毒性T細胞，以及環(huán)孢菌素A和抗-CD4抗體，其可以抑制免疫反應(yīng)。這些化合物可以分開施用或與本發(fā)明的疫苗作為混合物施用。
此文廣泛使用的術(shù)語“細胞因子”指一種可溶性糖蛋白，它是由免疫系統(tǒng)的細胞釋放的、以非酶作用通過特異性受體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。所以，如此文所用，術(shù)語“細胞因子”包括趨化因子，白細胞介素，淋巴因子，單核因子，干擾素，集落刺激因子，血小板活化因子，腫瘤壞死因子-α，受體相關(guān)蛋白，及其功能片段。如此文所用，術(shù)語“功能片段”是指具有天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能或活性特征的某種蛋白質(zhì)的肽或多肽部分。IL-10或IL-4的功能片段，例如分別與天然存在或重組產(chǎn)生的IL-10或IL-4具有基本上相同的抗炎活性，而IFNγ或TNFα的功能片段，例如分別與天然存在或重組產(chǎn)生的IFNγ或TNFα具有基本上相同的促炎活性。
細胞因子在本領(lǐng)域是周知的，包括，例如，內(nèi)皮單核激活性多肽II(EMAP-II，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細胞集落刺激因子(粒細胞-CSF)(G-CSF)，巨噬細胞-CSF(M-CSF)，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IL-13，等，干擾素，包括IFNα、IFNβ、IFNγ、和TNF-α，它們中的每一個都與細胞或細胞機制的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)或表型改變有關(guān)。趨化因子的例證進一步說明如下CXC(或α)趨化因子亞家族的成員，其在前兩個保守性的半胱氨酸的中有一個間插的氨基酸；CC(或β)亞家族的成員，其沒有這種間插的氨基酸殘基；以及C(或γ)趨化因子，其缺乏第一和第三半胱氨酸殘基。總地來說，α趨化因子成員在噬中性細胞和T淋巴細胞(T細胞)中有活性，β趨化因子在單核細胞、巨噬細胞和T細胞中有活性。α和β亞家族趨化因子的幾個成員也在樹突狀細胞上有活性，樹突狀細胞是游走細胞，它們表現(xiàn)出強大抗原遞呈性能、被認為參與很多炎癥疾病的病理學(xué)過程。(Xu等人，J.Leuk.Biol.，60365-71，1996和Sozzani等人，J.Immunol.，1591993-2000，1997)。第四型人類CX3C型趨化因子，fractalkine，也已被描述(Bazan等人，Nature，385640-4，1997；Imai等人，Cell，91521-30，1997；Mackay，Curr.Biol.7R384-6，1977)。不象其他趨化因子，fractalkine存在于膜上，且可以以可溶形式存在。對單核細胞和T細胞而言，這種可溶性形式是一種有力的化學(xué)吸引劑。這種趨化因子的細胞表面受體被命名為CX3CR1。
α趨化因子(也稱之為IL-8)是以下述為例證的粒細胞趨化蛋白質(zhì)-2(GCP-2)；生長相關(guān)性致癌性α(GRO-α)，GRO-β，GRO-γ；上皮細胞衍生嗜中性細胞激活肽-78(ENA-78)；血小板堿性蛋白(PBP)；結(jié)締組織激活肽III(CTAP III)；嗜中性細胞激活肽-2(NAP-2)；低親和性血小板因子(LAPF-4)；γ干擾素(IFNγ)誘導(dǎo)性單核因子(MIG)；血小板因子4(PF4)；干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)；基質(zhì)源因子SDF-1α，SDF-1β，和SDF-2。β趨化因子是以下述為例證的單核細胞趨化蛋白MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4和MCP-5；巨噬細胞抑制蛋白質(zhì)MIP-1α，MIP-1β，MIP-1γ，MIP-2，MIP-2α，MIP-2β，MIP-3 α，MIP-3β，MIP-4和MIP-5；巨噬細胞衍生趨化因子(MDC)；人趨化因子1(HCC-1)；LD78β；RANTES；eotaxin 1；eotaxin 2；胸腺和激活作用調(diào)節(jié)性趨化因子(TARC)；SCYA17；和I-309；樹突狀細胞趨化因子-1(DC-CK-1)。γ趨化因子是以lymphotactin為例證的。
通過將免疫原性肽或多種免疫原性肽與生理學(xué)上可以接受的載體混合可以制備施用于受試者的本發(fā)明組合物。在以所用的劑量和濃度使用時，這些載體對接受試者無毒。通常地，這種組合物的制備必須將特定疫苗抗原與下述物質(zhì)結(jié)合鹽水，緩沖液，抗氧化劑如抗壞血酸，低分子量(少于約10個殘基)多肽，蛋白質(zhì)，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖或葡聚糖，或螯合劑如EDTA，谷胱甘肽，和其他穩(wěn)定劑和賦形劑。這些組合物可以是懸浮液、乳劑或冷凍干燥態(tài)，并且在是與制備和批準(zhǔn)用于需要應(yīng)用方面的條件下進行配制。
生理上可接受的載體可以是任何物質(zhì)，只要當(dāng)與本發(fā)明的免疫原性肽或多肽結(jié)合時，其能夠使該成分保持生物活性并且沒有不合需要地破壞受試者免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。實例包括，但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)的生理上可接受載體，例如磷酸緩沖鹽溶液，水，乳劑如油/水乳劑，及各種類型的潤濕劑。對霧化或腸道外施用，優(yōu)選使用的稀釋劑是磷酸緩沖鹽溶液或生理鹽水(0.9％)。包括這些載體的組合物的配制是已知的常規(guī)方法(例如，參見Remington’s Phamaceutical Sciences，第43章，14th版，Mach Publishing Co.，Easton PA 18042，USA)。
為了施用于受試者，肽或編碼的多核苷酸常配制成組合物。相應(yīng)的，本發(fā)明提供一種組合物，其中除了本發(fā)明的肽或多核苷酸以外，通常含有一種載體，通過將肽或多核苷酸方便地配制到載體中用于施用。例如，載體可以是水溶液，比如生理緩沖鹽水或其他溶劑或媒介物，如二元醇，甘油，油如橄欖油，或可注射的有機酯類。載體也可以包括一種生理上可以接受的化合物，例如，其有穩(wěn)定肽或編碼多核苷酸或增加其吸收的作用。生理上可以接受的化合物，包括，例如，碳水化合物如葡萄糖，蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質(zhì)，或其他穩(wěn)定劑或賦形劑。類似地，為了實踐本發(fā)明方法的目的，被處理過的培養(yǎng)細胞，例如，滑膜液單核細胞，樹突狀細胞，或類似細胞，也可以配制在組合物中，將細胞施用給受試者。
有技術(shù)的臨床人員應(yīng)該認識到載體的選擇，包括生理上可以接受的化合物的選擇，取決于，例如，肽或編碼多核苷酸在施用時的方式，以及組合物的施用途徑。當(dāng)該組合物是在免疫狀態(tài)下施用時，即用作疫苗，一般是肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或皮下施用，但也可以是腸道外施用如靜脈注射，也可以通過注射、插管、或其他本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法。當(dāng)對免疫系統(tǒng)的期望調(diào)節(jié)是耐受性時，該組合物優(yōu)選是口服，或可用上述方法施用。
本發(fā)明的組合物還可以含有第二種試劑，如診斷試劑，營養(yǎng)物質(zhì)，毒素，或治療劑，例如，癌癥化學(xué)治療劑。優(yōu)選地，第二種試劑是一種免疫調(diào)節(jié)劑，例如，一種免疫刺激物如細胞因子或B7分子。另外，當(dāng)需要刺激免疫反應(yīng)時，該組合物可以含佐劑，如明礬，DETOX佐劑(RibiImmunochem Research，Inc.；Hamilton MT)，或福氏完全或不完全佐劑。佐劑的添加可以加強本發(fā)明肽的免疫原性，這樣就減少了刺激免疫反應(yīng)所需要的抗原量。佐劑增強免疫反應(yīng)可以通過延長抗原持久性，加強共刺激信號作用，減少肉芽腫的形成，刺激淋巴細胞非特異性增殖，或改善T細胞和抗原呈遞細胞(APC)的對合。
包括本發(fā)明的肽或多核苷酸的組合物也可以摻入到包囊材料中，如油水乳液，微乳劑，微膠粒，混合微膠粒，脂質(zhì)體，微球顆粒，或其他聚合物基質(zhì)(如見Gregoriadis，Liposome Technoloy，第1卷(CRCPress，Boca Raton，F(xiàn)L 1984)；Fraley等人，Trends Biochem Sci.，677，1981，將它們中的每一個引用與此供參考)。例如脂質(zhì)體由磷脂或其他脂類構(gòu)成，是無毒的、生理上能接受的并可代謝的載體，其制備和施用相對簡單。“Stealth”脂質(zhì)體(例如參見U.S.專利5,882,679；5,395,619；和5,225,212,將將它們中的每一個引用與此供參考)是這類包囊材料的實例。陽離子脂質(zhì)體，例如，也可以用特異性受體或配體修飾(Morishita等人，J.Clin.Invest.，912580-2585，1993，將其引入此處供參考)。另外，多核苷酸制劑可以被導(dǎo)入細胞，例如，使用腺病毒-聚賴氨酸DNA復(fù)合物(例如，參見Michael等人，J.Biol.Chem.2686866-6869，1993，將其引入此處供參考)。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)受試者免疫反應(yīng)的方法，是通過對受試者施用dnaJ hsp的免疫原性肽片段或編碼這樣的肽的多核苷酸。正如此文所述，dnaJ hsp可以是原核或真核生物的dnaJ hsp，包括，例如，細菌dnaJ hsp比如大腸桿菌dnaJ hsp；無脊椎動物dnaJ hsp比如酵母菌dnaJ hsp；或脊椎動物dnaJ hsp比如哺乳動物dnaJ hsp，包括人類dnaJ hsp比如人HSJ1，HDJ1或HDJ2。按照這樣的描述，本發(fā)明的肽，其可以組成本發(fā)明的組合物的一個成分，能作為藥劑使用，包括治療人類受試者和用于獸醫(yī)學(xué)目的。
本發(fā)明的方法可以通過增加與免疫反應(yīng)有關(guān)的炎癥應(yīng)答或降低與免疫反應(yīng)有關(guān)的炎癥應(yīng)答而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。所以，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法提供了一種增強或誘發(fā)受試者的炎癥應(yīng)答的手段。這樣的方法可以以如下步驟實施對免疫狀態(tài)下的受試者施用具有促炎活性的肽，即促炎肽；對耐受狀態(tài)下的受試者施用抗炎肽；或是施用這些肽的組合，例如，在免疫狀態(tài)下施用兩種或多種促炎肽，或在耐受狀態(tài)下施用兩種或多種抗炎肽，或者免疫狀態(tài)下的至少一種促炎肽和耐受狀態(tài)下的至少一種抗炎肽。增強或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答的方法可以導(dǎo)致受試者的促炎細胞因子如IFNγ，TNFα，IL-1，IL-6，IL-12，或IL-23的水平增加，或?qū)е率茉囌叩目寡准毎蜃尤鏘L-4，IL-10，或TGFβ的水平降低，或這些情況的結(jié)合。
本發(fā)明的方法也提供了減少或抑制受試者的炎癥應(yīng)答的手段，是通過對免疫狀態(tài)下的受試者施用具有抗炎活性的肽；或?qū)δ褪軤顟B(tài)下的受試者施用具有促炎活性的肽；或結(jié)合使用這些肽，例如在耐受狀態(tài)下施用兩種或多種促炎肽，或在免疫狀態(tài)下施用兩種或多種抗炎肽，或至少一種耐受狀態(tài)下的促炎肽和至少一種免疫狀態(tài)下抗炎肽。這樣的方法可以導(dǎo)致受試者的抗炎細胞因子比如IL-4，IL-10，或TGFβ水平的增加，或受試者的促炎細胞因子如IFNγ，TNFα，IL-1，IL-6，IL-12，或IL-23水平的減少，或這些情況的結(jié)合。
如此文所述，可以施用dnaJ hsp免疫原性肽片段之一種或一個組合，包括，例如，由SEQ ID NO1-26例示的免疫原性肽中的任何一個或者任何組合。鑒于本發(fā)明的公開內(nèi)容，有技術(shù)的臨床人員將會認識到本發(fā)明的肽是用于免疫狀態(tài)下的受試者或用于耐受狀態(tài)下的受試者，這要取決于該肽是促炎肽或是抗炎肽，并且要根據(jù)該肽是用于增強或誘發(fā)炎癥應(yīng)答，或者是用于降低或抑制炎癥應(yīng)答。
如此文所用，術(shù)語“在免疫狀態(tài)下”(under immunizing conditions)意思是本發(fā)明的肽與細胞接觸或用于受試者，以便它可以實現(xiàn)其免疫原活性。正因為這樣，該肽是T細胞免疫原，一般將在致免疫量下使用，典型地在激發(fā)劑量使用一段時間后，給予加強劑量一次或者多次，方式是皮內(nèi)、皮下、或肌肉注射，如果需要，可配制在組合物中，其中包括免疫佐劑，比如福氏完全或不完全佐劑。如此文所用，術(shù)語“在耐受狀態(tài)下”(under tolerizing conditions)意思是本發(fā)明的肽與細胞接觸或用于受試者，以便它可以誘發(fā)對其他免疫原活性的耐受性。結(jié)果是，例如，受試者對該肽產(chǎn)生耐受性，以致受試者認為該肽是“自身的”而不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)。可以在耐受狀態(tài)下使用的肽以該肽的耐受量施用，一般是一段時間內(nèi)的小劑量使用，施用方式是皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)，或優(yōu)選地為透粘膜，例如鼻粘膜噴霧，或口服。
本發(fā)明的方法實施時涉及到的受試者具有需要調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的狀態(tài)，或者素因性或易患病性的狀態(tài)，包括患有免疫疾病的受試者，或者對于免疫學(xué)疾病具有易患病性或素因性。一般地，受試者是脊椎動物受試者，特別是哺乳動物，包括飼養(yǎng)動物比如貓、狗、或馬；牧養(yǎng)動物比如綿羊、牛、或豬類動物；或人類。免疫學(xué)疾病可以是免疫系統(tǒng)病，比如自身免疫性疾病，例如，關(guān)節(jié)炎比如特發(fā)性幼稚關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎(oJIA)，或免疫缺陷病比如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。其他需要調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的狀況有受試者不能產(chǎn)生足夠的免疫反應(yīng)，例如對感染性疾病或癌癥的反應(yīng)；或者一種狀況是受試者的免疫反應(yīng)太強，例如，患除了自身免疫病的炎癥性腸病的受試者或患細菌性膿毒癥的受試者。
在實踐本發(fā)明的方法時，所用組合物的總量可以以一次性劑量給予受試者，在相對短的時間里用丸劑或通過輸注，以及在一段時間內(nèi)給予一次或幾次加強劑量。該用于刺激受試者免疫反應(yīng)的組合物的用量要依據(jù)各種因素決定，包括受試者的年齡和一般健康狀況，及施用途徑和施用中的處理次數(shù)。對于這些因素，有技術(shù)的臨床人員將會知道按需要調(diào)整特定劑量。通常，該組合物的配方和使用的途徑及頻率最初是用I期臨床實驗(參見實施例8)和II期臨床實驗確定的。
本發(fā)明的免疫原性肽優(yōu)選是用一種可以充分選擇性刺激受試者的胃腸道IgA生成并且誘導(dǎo)口腔耐受性的方式施用的。通過給人或動物受試者飼喂抗原誘導(dǎo)口腔耐受性的方法是眾所周知的(例如，參見Husby等人，J.Immunol.1524663-4670(1994)，將其引入此處供參考)。因此，需要耐受性時，本發(fā)明的肽可以伴隨一種IgA免疫刺激劑同時施用，其中IgA免疫刺激劑誘導(dǎo)IgM向IgA轉(zhuǎn)換；例如，TGF-β，其也可以抑制全身性T輔助細胞活性。優(yōu)選地，免疫原性肽和IgA(如果存在)通過腸道施用，使得疫苗效果局限在胃腸道。而且本發(fā)明的肽可以以免疫治療領(lǐng)域接受的任何其他方式施用，例如血管內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉、或腹膜內(nèi)。
多核苷酸可以通過任何用于免疫學(xué)程序的常規(guī)途徑使用，特別是皮內(nèi)(例如參見美國序列編號08/446,691，是于1995年6月7日提出申請的，將其引入此處供參考；又參見美國序列編號08/593,554)。根據(jù)這些公開內(nèi)容，重組基因表達載體是通過諸如注射、吸收或經(jīng)皮傳遞的方式通過宿主的皮膚或者粘膜而使用。
本發(fā)明的肽或多核苷酸的施用的方案依所用組合物的成分和病人的年齡、體重及狀況的不同而不同。但是，施用肽的一個優(yōu)選方案涉及每天口服(腸道)免疫學(xué)上有效劑量的疫苗，可以用或者不用其他形式的治療方法，如上所述，或者傳統(tǒng)的抗炎治療(例如，用類固醇或非類固醇抗炎藥和/或止痛藥)。依據(jù)給藥頻率，本發(fā)明的每一種肽疫苗的免疫有效劑量的變動范圍是大約從10μg-100mg，一般是大約100μg-100mg，通常大約是1mg-50mg，特別是大約25mg的抗原性蛋白或肽。抗原性肽的每日劑量將一般以約1mg/日的用量施用。
多核苷酸的使用劑量按照本發(fā)明的方法將是不同的，其根據(jù)宿主需要的反應(yīng)和所用載體完成的基因表達水平而定。一般地，對于通過皮內(nèi)途徑導(dǎo)入裸多核苷酸，單次劑量可以達到大約100μg--200μg的多核苷酸，而通過皮膚和粘膜施用則只用0.3μg的多核苷酸就可以誘導(dǎo)長期持續(xù)的免疫反應(yīng)。但是，為了達到本發(fā)明的目的，提供足以導(dǎo)致編碼免疫原性肽的裸基因表達載體表達的劑量是足夠的。這些劑量可以調(diào)整以獲得不同的表達水平，從而提供了免疫量或耐受量。證實表達肽的存在和數(shù)量的方法在該領(lǐng)域是周知的，包括，例如，免疫測定法比如酶聯(lián)免疫吸附測定法，PCR技術(shù)，和免疫組織學(xué)分析。根據(jù)這些檢測和定量手段提供的信息和臨床領(lǐng)域已被醫(yī)師們了解的體內(nèi)臨床癥狀，可以調(diào)節(jié)施用的多核苷酸的劑量，以便達到所需的表達水平。
常規(guī)劑量的免疫刺激劑或免疫抑制劑可以包括在含有本發(fā)明的肽或多核苷酸的組合物中，或者可以分開使用，優(yōu)先于該肽，與該肽同時，或在該肽之后，例如大約1μg/kg-100μg/kg的IL-6。這樣的劑量將是根據(jù)該領(lǐng)域已知的或用其他普通實踐過的方法可確定的信息。早期病人的治療可以持續(xù)到，貫穿，或超過觀察到終期接替癥狀時。
本發(fā)明的肽或多核苷酸施用給素因性受試者，但不是已發(fā)生的受試者，可以通過短期施用一次或多次劑量的該組合物，例如，產(chǎn)生可以檢測到的病人胃腸道或外周血管循環(huán)液體中抗dnaJ肽IgA的增加，從而治療該疾病。一般地，本發(fā)明的疫苗優(yōu)選使用于患早期疾病的病人。
隨著時間推移，本發(fā)明治療方法的效果可以通過對這些疾病具有素因性的受試者的免疫學(xué)疾病癥狀或臨床征消失予以鑒定，但在治療開始時沒有疾病的病癥或癥狀。對于診斷有免疫性疾病的病人，或在其他需要調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的狀況中，本發(fā)明的方法的功效可以通過受試者病癥或癥狀的嚴重性的減少進行衡量評估或通過疾病終期接替癥狀的發(fā)生評估。
關(guān)于免疫性疾病比如自身免疫性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)炎和該疾病的終期接替癥狀的臨床征和癥狀的常用參數(shù)是周知的，包括，例如進行關(guān)節(jié)觸痛的“里奇指數(shù)(Ritchie Index)”測量(Ritchie等人，Quart J.Med.，37393-406(1968))，測量關(guān)節(jié)腫大的數(shù)量，每天早上關(guān)節(jié)僵硬持續(xù)的時間，握力，或在直觀模擬疼痛標(biāo)出上的疼痛強度(Huskisson，lancet 21127-1131(1974))，和測量病人使用抗炎劑或止痛劑的相對水平。其他臨床常用參數(shù)可以是下面的，包括，例如，疾病持續(xù)時間，紅細胞沉降率(ESR)，C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平，活動性關(guān)節(jié)炎數(shù)量(NAA)，關(guān)節(jié)指數(shù)嚴重性(CSA)，緩和間歇，兒童健康評估調(diào)查表(CHAQ)，和對dnaJ肽治療的反應(yīng)(反應(yīng)者對無反應(yīng)者的特征)。
根據(jù)大腸桿菌提取物(Brackertz等人，J.Rheum.1619-23，1989)臨床雙盲實驗的結(jié)果，使用本發(fā)明的組合物在受試者上的所產(chǎn)生的不利副作用如果有的話，也是很少的。例如，可能發(fā)生胃腸道刺激，但預(yù)期很輕。用常規(guī)方法監(jiān)測這些組合物的毒性，比如周期性實驗評估，是通過分析這些變量進行，如血細胞比容、血紅蛋白、血小板和類風(fēng)濕因子水平和血液化學(xué)。對于其他免疫性疾病或者其他需要調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)的狀況，將監(jiān)測疾病的病征和癥狀特點。
本發(fā)明也提供了一種調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細胞反應(yīng)性的方法。這種方法可以這樣實施，例如，用dnaJ hsp的肽片段或編碼這樣的肽的多核苷酸接觸免疫效應(yīng)細胞。從其中衍生這種肽的dnaJ hsp可以是此處公開的任何dnaJ hsp或是該領(lǐng)域已知的其他dnaJ hsp，并且可以，但不必需，配制進一種組合物中，如果需要，其也可以包括免疫佐劑或其他免疫調(diào)節(jié)劑，例如一種或多種細胞因子。免疫效應(yīng)細胞，是T細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)涉及的任意細胞，包括抗原呈遞細胞比如樹突細胞，特別是T細胞，可以通過將該肽施用給受試者使免疫效應(yīng)細胞與肽在體內(nèi)接觸，或也可以在體外接觸。
免疫效應(yīng)細胞與該肽在體外接觸(或離體的)時，該方法可以進一步包括將接觸過的免疫效應(yīng)細胞施用給受試者，這樣就提供了調(diào)節(jié)受試者免疫反應(yīng)的一種手段。免疫效應(yīng)細胞可以是來自于病人的自身細胞，與該肽離體接觸，然后返回施于受試者。這種方法提供了便利，可以允許免疫效應(yīng)細胞在體外繁殖，如果需要，然后細胞擴張后的細胞群可以被用于受試者。相對于受試者，免疫效應(yīng)細胞可以是同種異體的，例如，從與受試者相關(guān)的、并與受試者分享共同單倍體的個體選擇而來的細胞，或選自已知單倍體的、并且至少有部分單倍體與受試者相配的細胞系群體的細胞。這種細胞在施用于受試者后可以調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)，是通過增強或誘導(dǎo)受試者的炎癥應(yīng)答，或通過降低或抑制受試者的炎癥應(yīng)答實現(xiàn)的。
以下的實施例是為了說明而不是為了限制本發(fā)明。
實施例1對重組大腸桿菌dnaJ的細胞免疫反應(yīng)來自10個健康受試者(“對照組”)和21個特發(fā)性幼稚關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎(“oJLA”)患者的外周血單核細胞(PBMC)對重組大腸桿菌hspdnaJ(dnaJ)的增殖反應(yīng)沒有顯著不同(圖1A)。為了評估是否dnaJ-特異性T細胞在炎性的滑膜區(qū)是增多的，所有“oJLA”患者的滑膜液單核細胞(SFMC)用dnaJ刺激了96小時。SFMC的平均刺激指數(shù)(SI)比相應(yīng)的PBMC的SI有顯著性增高(p＝0.01；圖1A)。另外，在用dnaJ刺激后，以CD3+CD69+細胞數(shù)進行評估，與PBMC相比，在SFMC中激活的T細胞百分比有顯著性增高(p＝0.0002)(圖1B)。
為了證明SFMC對dnaJ的增殖反應(yīng)不是繼發(fā)于SFMC反應(yīng)性的非特異性增加，研究了來自兩個部分的細胞對無關(guān)記憶抗原，破傷風(fēng)類毒素(TT)的增殖反應(yīng)。與PBMC(均值SI＝12.3)相比，針對TT的增殖反應(yīng)在SFMC(均值SI＝6.0)傾向增高。為了比較PBMC和SFMC對dnaJ和TT的反應(yīng)不同，計算了所得的兩個部分對兩種抗原中的每一種的刺激指數(shù)的比率。如圖IC所顯示，用dnaJ刺激后比用TT刺激后，SISFMC/SI PBMC的比率更顯著增高(p＝0.038)。
用健康對照組的PBMC的培養(yǎng)物上清液和來自oJLA病人的用或沒用dnaJ培養(yǎng)72小時的PBMC-SFMC配對樣本，評估了促炎細胞因子干擾素γ(IFNγ)和腫瘤壞死因子α(TNFα)，和抗炎細胞因子(IL-4)和IL-10的生成量。如圖2所顯示，病人和對照組的PBMC的細胞因子生成量沒有不同。對PBMC-SFMC配對樣本的細胞因子生成量的分析顯示用dnaJ刺激誘導(dǎo)oJLA病人的SFMC的IFNγ的生成量比PBMC的IFNγ的生成量顯著增高(P＜0.01)；，INF的生成量與疾病持續(xù)期間具有顯著的反相關(guān)(p＝-0.40，p＝0.034)。TNFα和IL-10的生產(chǎn)量是在兩個部分中比較。IL-4水平在對照組和病人組中均低于檢測限，是以PBMC和SFMC的上清液進行測定的。
表1顯示了oJLA病人的SFMC的培養(yǎng)物上清液的促炎細胞因子和抗炎細胞因子的生成量的評估結(jié)果，將SFMC在重組大腸桿菌的dnaJ蛋白培養(yǎng)72小時，然后再用在無關(guān)對照肽存在或缺乏時的自身輻射滋養(yǎng)細胞，卵清蛋白(OVA)或者大腸桿菌hsp dnaJ衍生肽再刺激。結(jié)果表示為pg/ml(均值+SD)。
表1促炎和抗炎細胞因子的生成量

這些結(jié)果說明針對dnaJ的增殖反應(yīng)和IFNγ生成量在oJLA病人的滑膜間隙中比外周血中高一些，表明大腸桿菌hsp dnaJ或其同源蛋白或肽片斷在關(guān)節(jié)的炎性過程中具有一定作用。
實施例2對重組大腸桿菌dnaJ衍生的合成肽的細胞免疫反應(yīng)為了確定細菌dnaJ蛋白可能的相關(guān)表位，oJLA病人的PBMC和SFMC用dnaJ培養(yǎng)72小時，并且，用自身供給細胞在有或沒有精選的大腸桿菌衍生的II類主要組織相容復(fù)合物結(jié)合肽的存在下再刺激92小時?？偣矞y試了8種肽，有3種(pep4，pep22，pep174)是從大腸桿菌dnaJ的N末端區(qū)衍生而來，它們與3種人dnaJ同工型(HDJ1，HDJ2，HSJ1；同源肽)中的每一個表現(xiàn)序列同源性；5種肽是從大腸桿菌dnaJ的C末端區(qū)衍生而來，它們與人的相對物(pep61，pep209，pep242 pep264，pep268；非同源肽)不存在任何同源性。
用大腸桿菌衍生的肽刺激PBMC導(dǎo)致非常低的增殖反應(yīng)(SI＜1)，并且沒檢測到促炎或抗炎細胞因子的生成。相反，SFMC對所有肽表現(xiàn)增殖反應(yīng)，雖然是不同程度，在肽22，61，174，或268(圖3)存在下的均值SI≥6。為了評估反應(yīng)的特異性，SFMC用dnaJ培養(yǎng)，然后給予不相關(guān)OVA肽再刺激。來自不患有oJLA的HLA B27+病人(n＝4)的SFMC對這些細菌肽中每一種的反應(yīng)的均值SI＜3。這個結(jié)果提示對大腸桿菌dnaJ衍生肽的高增殖反應(yīng)是疾病特異性的。針對同樣的肽的細胞因子生成量是以來自oJLA病人的SFMC培養(yǎng)物上清液進行檢測的。如表1所顯示，促炎細胞因子的生成量在與每一種大腸桿菌衍生肽接觸后而被檢測到。來自21個患有oJLA的病人中只有一個的SFMC生成了可以檢測水平的抗炎細胞因子IL-10，并且沒有一個生成可檢測水平的IL-4。
在被測試促炎的細胞因子中，IFNγ生成量與所有細菌肽的增殖反應(yīng)顯著相關(guān)，除了肽4和264(表2)。與肽22，61，174，和268的相關(guān)性強些，它們誘導(dǎo)的SI≥6，表明這些肽可能在炎性位點呈現(xiàn)了相關(guān)的靶表位。另外，對肽209、242或264刺激的反應(yīng)中的IFNγ的生成量與CRP和ESR的值顯著相關(guān)。表2顯示來自oJLA病人的SFMC的培養(yǎng)物上清液中的IFNγ的生成相關(guān)性，是用重組大腸桿菌hsp dnaJ刺激，然后用有或沒有大腸桿菌hsp dnaJ衍生肽存在下的輻射自身滋養(yǎng)細胞再刺激，并且所誘導(dǎo)的刺激指數(shù)(SI)表明了用同樣肽刺激SFMC，ESR，或CRP值。
表2.相關(guān)性(通過斯皮爾曼試驗(Spearman test))

*區(qū)分與衍生自大腸桿菌hsp dnaJ的3種人的同工物的肽表現(xiàn)出序列同源性的細菌肽。
實施例3對人HSJ1，HDJ1，或HDJ2的細胞免疫反應(yīng)與大腸桿菌hspdnaJ同源或非同源的肽為了評估是否人的同源肽可能是導(dǎo)致自身反應(yīng)的交叉識別的靶，對衍生于HSJ1，HDJ1，或HDJ2，與大腸桿菌hsp dnaJ具有序列同源性區(qū)域的人肽進行了研究。14名oJLA病人的SFMC對重組大腸桿菌hsp dnaJ呈現(xiàn)的SI比3大些，是在有或沒有下述肽存在下用自身細胞再刺激了96小時人肽2、3或5，其是細菌肽4的同源物；人肽20、21或23，其是細菌肽22的同源物；或人肽164、167或176，其是細菌肽174的同源物。從人dnaJ蛋白質(zhì)衍生的肽和同源的細菌肽的SFMC增殖反應(yīng)，促炎細胞因子生成量，和抗炎IL-4水平是全面相似的。
表3顯示oJLA病人的SFMC用重組大腸桿菌hsp dnaJ培養(yǎng)72小時，然后用自身輻射滋養(yǎng)細胞在有或沒有大腸桿菌hsp dnaJ衍生肽或人dnaJ同工型(HSJ1，HDJ1，或HDJ2)衍生的同源肽存在下再刺激。結(jié)果表現(xiàn)為SI或pg/ml(均值+SD)。
表3增殖反應(yīng)和細胞因子生成量

*p＜0.03對大腸桿菌pep4，@p＜0.05對大腸桿菌pep4觀察到僅有不同是人肽5，其誘導(dǎo)增殖反應(yīng)和IFNγ生成量顯著比與其細菌同源物的反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的那些情況高些(分別為p＜0.03和p＜0.05)。在評估衍生自HSJ1、HDJ1、或HDJ2蛋白的、與大腸桿菌hsp dnaJ沒有序列同源性的區(qū)域的9種人肽的反應(yīng)性時，也觀察到相似的結(jié)果。與用細菌肽獲得的結(jié)果比較，在用人肽刺激的SFMC培養(yǎng)物的上清液中檢測到了IL-10的生成，雖然程度不同，其中人肽與細菌是同源的或非同源的。用非同源(27.1±10.3pg/ml)人肽刺激后IL-10生成量均值比用同源(7.7±7.0pg/ml圖4)人肽高些，并且對同源人肽20、21和23是特別證實的，其相似于他們的細菌同源物(肽22)，它們沒有誘導(dǎo)IL-10(圖4)的可檢測水平的出現(xiàn)。這些表位作圖實驗顯示不同的生物效應(yīng)發(fā)生于不同的肽，并且這種效應(yīng)是疾病特異性的。
這些結(jié)果表明通過對來自與大腸桿菌dnaJ相遇而誘導(dǎo)的人dnaJ蛋白的不同同工型的肽的免疫反應(yīng)，能夠通過抗炎IL-10的生成而具有調(diào)節(jié)作用，雖然對大腸桿菌hsp dnaJ的促炎反應(yīng)用細菌肽和在肽上來自與其人的相對物同源相關(guān)表位可以使其持續(xù)。這一結(jié)果通過檢查在取樣時表現(xiàn)廣泛少關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎的3個病人的IL-10生成量而得以證實，其中用細菌或人肽刺激的培養(yǎng)物上清液顯出IL-10生成量的減少，特別是對于人肽50、254、256和283，它們與大腸桿菌hsp dnaJ衍生肽是非同源的。
實施例4對人非同源肽反應(yīng)時的增殖和細胞因子生成按照如上所述，對其他一些肽進行了實驗，包括一系列來自細菌dnaJ肽的同工型的非同源區(qū)域的人肽。圖6顯示非同源肽50，51，134，197，254，256，270，283和318的SI。IFNγ，TNFα和IL-10對這些肽的反應(yīng)中的水平分別顯示在圖7-9中。
實施例5對細菌肽和它們的人同源物反應(yīng)時的增殖和細胞因子生成在用各種細菌肽刺激反應(yīng)中檢查了增殖和細胞因子生成，并與這些細菌肽的人同源物的刺激反應(yīng)進行比較。圖10顯示對細菌dnaJ 4和人同源物肽2(HSJ1)、3(HDJ1)和5(HDJ2)反應(yīng)中的SI。圖11-13分別顯示了在對這些肽的反應(yīng)中的TNFα、IFNγ和IL-10水平。為了比較，對細菌肽dnaJ，4，22，61，174，209，242，264和268的反應(yīng)中的SI顯示在圖14。圖15-18分別顯示的對細菌dnaJ 174和同源人肽164(HSJ1)、167(HDJ2)和176(HSJ1)的反應(yīng)中的SI、TNFα、IFNγ和IL-10水平。對細菌dnaJ 22和同源人肽20(HSJ1)、21(HDJ2)和23(HSJ1)的反應(yīng)中的SI、TNFα、IFNγ和IL-10水平分別顯示在圖19-22。
實施例6體外檢驗與臨床結(jié)果之間的相關(guān)性(上述的)增殖和細胞因子的結(jié)果與臨床參數(shù)進行了比較，包括在同一病人中的疾病持續(xù)期、血細胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平、活動性關(guān)節(jié)炎計數(shù)(NAA)、關(guān)節(jié)嚴重度指數(shù)CSA)、疼痛間隙、兒童健康評價調(diào)查表(CHAQ)和用dnaJ肽治療的反應(yīng)(“反應(yīng)者對無反應(yīng)者”)。如表4-10顯示，對dnaJ肽治療的反應(yīng)的關(guān)節(jié)炎病人也顯示出良好的結(jié)果，是使用僅僅屬于人同工型中的肽(即非同源人肽)刺激他們自己的單核細胞以用于檢測體外增殖和細胞因子分析。與這些觀察結(jié)果一致，用dnaJ肽治療其關(guān)節(jié)炎已經(jīng)擴展到不僅僅是幾個關(guān)節(jié)而是廣泛受累的關(guān)節(jié)炎患者(“廣泛性少關(guān)節(jié)炎”)表明廣泛性少關(guān)節(jié)炎患者對非同源人肽反應(yīng)不好(表11)。
表4資料概述和與臨床參數(shù)的比較病人(n＝21) R P斯皮爾曼疾病持續(xù)期對CD69總數(shù)-0.52 0.02斯皮爾曼疾病持續(xù)期對TNF peph20 0.68 0.01斯皮爾曼ESR對IL-10 peph23 0.77 0.005表5病初起的C-反應(yīng)蛋白斯皮爾曼 R P病初起的CRP對SI pep4-0.67 0.004病初起的CRP對TNF pep4 -0.59 0.02病初起的CRP對SI pep209 -0.52 0.037病初起的CRP對SI pep264 -0.51 0.043病初起的CRP對IL-10 peph23 0.72 0.008病初起的CRP對IL-10 peph3同源于 pep4 0.73 0.022病初起的CRP對IL-10 peph5同源于 pep4 0.79 0.011表6活動性關(guān)節(jié)計數(shù)(NAA)斯皮爾曼 RPNAA對IL-10 peph1640.62 0.022表7關(guān)節(jié)炎嚴重指數(shù)斯皮爾曼 RPCSA對SI dnaJ 0.51 0.02CSA對SI h50非同源的 0.75 0.018CSA對TNF pep242 0.48 0.03表8反應(yīng)者對非反應(yīng)者于6個月時Mann-Whitney反應(yīng)者在6個月時對SI pep268 0.049反應(yīng)者在6個月時對SI h167同源于174 0.037＞反應(yīng)者反應(yīng)者在6個月時對IFN 1740.012＞反應(yīng)者反應(yīng)者在6個月時對SI h20同源于22 ＞反應(yīng)者反應(yīng)者在6個月時對IFN 22 ＞反應(yīng)者反應(yīng)者在6個月時對SI h270非同源的0.034＞反應(yīng)者反應(yīng)者在6個月時對IFN 4 0.034＞反應(yīng)者反應(yīng)者在6個月時對IL-10 a dnaJ 0.024＞無反應(yīng)者表9緩解間期(Rem int.)斯皮爾曼 R PRem int.對SI dnaJ0.53 0.049Rem int.對SI 174 0.60.021Rem int.對SI 209 0.61 0.02Rem int.對SI 268 0.56 0.038Rem int.對IFN 1740.68 0.019Rem int.對IFN 22 0.71 0.009表10兒童健康評價調(diào)查表(CHAO)RPCHAQ對SI dnaJ-0.49 0.037CHAQ對SI 174 -0.63 0.005CHAQ對ST 268 -0.56 0.015CHAQ對ST 209 -0.5 0.032CHAQ對SI h20 -0.54 0.043CHAQ對IFN dnaJ -0.56 0.017CHAQ對IFN 174-0.61 0.006CHAQ對IFN 268-0.59 0.009CHAQ對IFN 22 -0.6 0.0076CHAQ對IFN 61 -0.56 0.015CHAQ對IFN h167(同源于174)-0.59 0.04CHAQ對TFN 174-0.57 0.011CHAQ對TFN 22 -0.57 0.011CHAQ對IFNγ人類非同源50 -0.49 0.036CHAQ對IFNγ人類非同源51 -0.5 0.034CHAQ對IFNγ人類非同源134 -0.49 0.036CHAQ對IFNγ人類非同源197 -0.6 0.01CHAQ對IFNγ人類非同源254 -0.49 0.036CHAQ對IFNγ人類非同源256 -0.49 0.036CHAQ對IFNγ人類非同源270 -0.49 0.036CHAQ對IFNγ人類非同源283 -0.49 0.036CHAQ對IFNγ人類非同源318 -0.5 0.034表11少關(guān)節(jié)炎病人與廣泛性少關(guān)節(jié)炎病人的比較少關(guān)節(jié)炎(n＝14)廣泛性少關(guān)節(jié)炎(n＝7)Mann WhitneyIFNγ22 0.033IFNγ1740.427IFNγh164同源于174 0.037IFNγh167同源于174 0.037IFNγh176同源于174 0.037IFNγ22 0.032IFNγ2680.044
實施例7“oJLA”患者的滑膜液單核細胞中對細菌hsp dnaJ表位的免疫反應(yīng)T細胞對完整的大腸桿菌dnaJ熱休克蛋白反應(yīng)是以TH-1型為主并且限制在滑膜液間隙中。在oJLA患者中的SFMC的反應(yīng)與同一來源的PBMC比較時，T細胞增殖(SI)和IFN生成量顯著性升高。oJLA患者的SFMC的反應(yīng)與疾病對照組的SFMC比較時顯著性升高，有14名系統(tǒng)和多關(guān)節(jié)JIA患者，細菌hsp dnaJ來源的8個pan-DR結(jié)合肽中的4個作為T細胞抗原(圖23)進行測試。這些反應(yīng)也是具有促炎性質(zhì)，這由體外對個體肽反應(yīng)中的IFN生成量和調(diào)節(jié)細胞因子不能被檢測到而得以支持。這樣的反應(yīng)性是區(qū)室性的，也是抗原和疾病特異性的，這是因為從14個不同型JLA患者以及年齡相配的健康對照組來源的PBMC和SFMC顯示出微不足道的反應(yīng)。
對先證抗原的反應(yīng)性和對照的無關(guān)肽進行比較時發(fā)現(xiàn)了顯著性不同，這些肽包括pan-DR結(jié)合設(shè)計肽(pandr)，大腸桿菌衍生改變肽配體(dnaJpv；參見圖23)。SFMC對重組dnaJ的反應(yīng)增加不是SFMC反應(yīng)性上的非特異性增加的結(jié)果。也檢測了7名oJLA患者中，來自兩部分的細胞對破傷風(fēng)類毒素(TT)，一種無關(guān)的記憶抗原的增殖反應(yīng)。為了比較PBMC和SFMC對重組dnaJ和TT反應(yīng)不同，對兩種抗原中的每一個在兩部分中的刺激指數(shù)的比率進行了計算。用重組dnaJ刺激比起用TT刺激，比率SI SFMC/SI PBMC有顯著性(p＜0.02)增高。
這些結(jié)果展示了在oJLA患者滑膜液間隙對大腸桿菌dnaJ表位具有顯著性的反應(yīng)，表明這種反應(yīng)在發(fā)炎區(qū)有一定作用。這種作用可能與自身免疫炎癥的調(diào)節(jié)有關(guān)，它可能是基于細菌蛋白和它的人對等蛋白的不同表位間的相互作用，這些表位可以在滑膜區(qū)過量表達。所以研究了這些推定的表位的鑒定。
由于4個免疫原性細菌肽中的2個(22和174)是衍生于與人dnaJ蛋白(HSJ1、HDJ1或HDJ2)有序列同源性的大腸桿菌hsp dnaJ區(qū)域，評價了可能因交叉識別而導(dǎo)致的自身反應(yīng)性。同源人肽20、21和23(細菌肽22的同源物)和肽164、167-181和176(細菌肽174的同源物)，和非同源人肽被檢測。這些肽誘導(dǎo)出T細胞反應(yīng)，與用對應(yīng)的同源細菌肽刺激而得到的進行比較具有增殖作用和IFNγ的生成。對這些人肽的SI和IFNγ反應(yīng)是與存在細菌同源物所得到的情況高度相關(guān)的。這些結(jié)果通過交叉識別展示了T細胞對細菌肽和它們的人同源物反應(yīng)之間的相關(guān)性。與用細菌肽獲得的結(jié)果相比，用人dnaJ肽衍生的肽刺激的SFMC培養(yǎng)物上清液中檢測到達檢測水平的IL-10；沒有檢測到IL-4。這些結(jié)果進一步證實自身抗原可以引起大量不同的T細胞反應(yīng)。
在用非同源人肽134刺激oJLA長期患者的代表性SFMC之后，F(xiàn)ACS分析用于評估CTLA+/CD25/CD4陽性細胞的百分數(shù)。與維持在對照條件下的細胞比，被認為具有調(diào)節(jié)功能的CTLA+/CD25/CD4陽性細胞的百分數(shù)在肽處理過的細胞中較高些(圖24A)。在同樣培養(yǎng)條件下，對肽134反應(yīng)中調(diào)節(jié)細胞的擴張與IL-10的生成量很好地相關(guān)(圖24B)。這些結(jié)果證明人dnaJ134肽的識別作用導(dǎo)致調(diào)節(jié)細胞擴張和IL-10生成。
為了探索臨床特征與肽誘發(fā)的免疫調(diào)節(jié)之間的可能相關(guān)性，按照疾病過程將oJLA患者分組，其中包括永久性(n＝16)和中期(n＝15)o-JLA患者。與永久性o-JLA患者相比較，來自中期患者的樣本中對肽134的增殖反應(yīng)顯著降低(p＝0.05)(圖25A和25B)。另外，統(tǒng)計學(xué)顯著意義的一個臨界水平(p＝0.076)與IFN生成量相關(guān)。在考慮IL-10生成量時，發(fā)現(xiàn)了特別顯著的不同(p＝0.0012；參見圖25C)。
為了進一步分析與比較良性疾病的相關(guān)性，在關(guān)節(jié)內(nèi)使用一種可注射的類固醇，TXA之后，將所研究關(guān)節(jié)的臨床緩解間期作為衡量個體關(guān)節(jié)炎性活性程度的量度。在對非同源人肽134的反應(yīng)中的IL-10生成量與個體關(guān)節(jié)的臨床緩解間期有高度的相關(guān)性(R＝0.537，p＝0.026)。這些結(jié)果表明免疫調(diào)節(jié)自身表位的識別與減輕疾病相關(guān)。
實施例8dnaJP1肽在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中提供了一種促炎表位鑒定了一種來自hsp dnaJ蛋白的肽，它具有作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病人外周血和滑膜液細胞的T細胞增殖和促炎細胞因子生成的的觸發(fā)物的作用。這種肽，dnaJ P1(QKRAAYDQYGHAAFE；SEQ ID NO27)，與“共同表位”(shared epitope)分享序列同源性，共同表位是一個通常在RA相關(guān)HLA等位基因中共有的含有5個氨基酸的片段(Albani等人，Nat.Med.1448-52，1995，將此文引入此處供參考)。為確定在RA中HLA和dnaJ衍生肽之間的相互作用是否維持和刺激T細胞而進行研究，其中T細胞參與自身免疫炎癥。這樣的T細胞群一直是I期免疫耐受性研究的靶標(biāo)。
在I期臨床試驗中，15個RA患者用3種不同的劑量的dnaJ P1(每天4次，口服)治療6個月。參與的條件要求是疾病為臨床活動型和促炎T細胞在體外對該肽具有反應(yīng)性。如圖26所示，粘膜對dnaJ P1的耐受性誘導(dǎo)從促炎向調(diào)節(jié)型細胞因子的顯著免疫偏離。這種免疫變化是治療特異性的和治療誘導(dǎo)性的。
雖然參照上述實施例已闡述了本發(fā)明，然而要理解的是修改和變化是包括在本發(fā)明的精神和范圍之中的。相應(yīng)地，本發(fā)明唯受所附權(quán)利要求的限制。
序列表<110> 加利福尼亞大學(xué)董事會<120> 從熱休克蛋白衍生的免疫調(diào)節(jié)肽及其使用<130> UCSD1360WO<150> US 60/245,181<151> 2000-11-01<160> 27<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 1Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu1 5 10 15<210> 2<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 2Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg1 5 10 15<210> 3<211> 16<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 3Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln1 5 10 15<210> 4<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 4Gln Gly Phe Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly1 5 10 15<210> 5<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro Gly Ala Val Asp Thr Gly1 5 10 15<210> 6<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 6Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro Ile Phe1 5 10 15<210> 7<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 7Tyr Cys Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala Met Ala Ala Leu Gly Gly1 5 10 15<210> 8<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 8Pro Ile Asn Pne Ala Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu Val1 5 10 15<210> 9<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 9Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Leu Asp Val Pro Arg Ser Ala Ser Ala1 5 10 15<210> 10<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 10Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asp1 5 10 15<210> 11<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 11Thr Thr Tyr Tyr Asp Val Leu Gly Val Lys Pro Asn Ala Thr Gln1 5 10 15<210> 12<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 12Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Lys Ala Leu Gln Trp His Pro Asp Lys1 5 10 15<210> 13<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 13Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His Pro Asp Lys1 5 10 15<210> 14<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 14Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro Asp Lys1 5 10 15<210> 15<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 15Phe Arg Ser Val Ser Thr Ser Thr Thr Phe Val Gln Gly Arg Arg1 5 10 15<210> 16<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 16Pro Gly Met Val Gln Gln Ile Gln Ser Val Cys Met Glu Cys Gln1 5 10 15<210> 17<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 17Gly Arg Arg Ile Thr Thr Arg Arg Ile Met Glu Asn Gly Gln Glu1 5 10 15<210> 18<211> 16<212> PRT<213> 人類<400> 18Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Glu Leu Tyr Asp1 5 10 15<210> 19<211> 16<212> PRT<213> 人類<400> 19Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys Arg Glu Ile Tyr Asp1 5 10 15<210> 20<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 20Ser Gly Pro Phe Phe Thr Phe Ser Ser Ser Phe Pro Gly His Ser1 5 10 15<210> 21<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 21Asp Gly Gln Leu Lys Ser Val Thr Ile Ash Gly Val Pro Asp Asp1 5 10 15<210> 22<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 22Asp Leu Gln Leu Ala Met Ala Tyr Ser Leu Ser Glu Met Glu Ala1 5 10 15<210> 23<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 23Glu Asp Leu Phe Met Cys Met Asp Ile Gln Leu Val Glu Ala Leu5 10 15<210> 24<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 24Leu Cys Gly Phe Gln Lys Pro Ile Ser Thr Leu Asp Asn Arg Thr1 5 10 15<210> 25<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 25Arg Thr Ile Val Ile Thr Ser His Pro Gly Gln Ile Val Lys His1 5 10 15<210> 26<211> 15<212> PRT<213> 人類<400> 26Gly Arg Leu Ile Ile Glu Phe Lys Val Asn Phe Pro Glu Asn Gly1 5 10 15<210> 27<211> 15<212> PRT<213> 大腸桿菌<400> 27Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)受試者免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給受試者施用一種dnaJ熱休克蛋白(hsp)的免疫原性肽片段，從而調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述dnaJ hsp是細菌dnaJ hsp。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細菌dnaJ hsp是大腸桿菌dnaJhsp。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述肽是QDYYEILGVSKTAEE(SEQ ID NO1)，RKAYKRLAMKYHPDR(SEQ ID NO2)，QKRAAYDQYGHAAFEQ(SEQ ID NO3)，QGFFAVQQTCPHCQG(SEQ ID NO4)，SKTLSVKIPGAVDTG(SEQ ID NO5)，GDLYVQVQVKQHPIF(SEQ ID NO6)，YCEVPINFAMAALGG(SEQ ID NO7)，PINFAMAALGGEIEV(SEQ ID NO8)，或它們的任意組合。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述dnaJ hsp是一種真核dnaJ hsp。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述真核dnaJ hsp是一種酵母菌dnaJ hsp或一種脊椎動物dnaJ hsp。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述脊椎動物dnaJ hsp是一種人dnaJ hsp。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述人dnaJ hsp是HSJ1，HDJ1或HDJ2。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述肽是同源于細菌dnaJ hsp的肽片段。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述肽是ASYYEILDVPRSASA(SEQ ID NO9)，KDYYQTLGLARGASD(SEQ ID NO10)，TTYYDVLGVKPNATQ(SEQ ID NO11)，KKAYRRKALQWHPDK(SEQ ID NO12)，KRAYRRQALRYHPDK(SEQ ID NO13)，KKAYRKLALKYHPDK(SEQ ID NO14)，F(xiàn)RSVSTSTTFVQGRR(SEQ ID NO15)，PGMVQQIQSVCMECQ(SEEQ ID NO16)，GRRITTRRIMENGQE(SEQ ID NO17)，或它們的任意組合。
11.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述肽是細菌dnaJ hsp的肽片段的非同源物。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述肽是QAYEVLSDAKKRELYD(SEQ ID NO18)，EAYEVLSDKHKREIYD(SEQ ID NO19)，SGPFFTFSSSFPGHS(SEQ ID NO20)，DGQLKSVTINGVPDD(SEQ ID NO21)，DLQLAMAYSLSEMEA(SEQ ID NO22)，EDLFMCMDIQLVEAL(SEQ ID NO23)，LCGFQKPISTLDNRT(SEQ ID NO24)，RTIVITSHPGQIVKH(SEQ ID NO25)，GRLIIEFKVNFPENG(SEQ ID NO26)，或它們的任意組合。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括增強或誘導(dǎo)受試者的炎癥應(yīng)答。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述肽具有促炎活性，并且其中增強或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答包括在免疫狀態(tài)下施用該肽。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述肽具有抗炎活性，并且其中增強或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答包含在耐受狀態(tài)下使用肽。
16.權(quán)利要求13所述的方法，其中強化或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答包括增加受試者的伽嗎干擾素(IFNγ)、腫瘤壞死因子(TNFα)或兩者的水平。
17.權(quán)利要求13所述的方法，其中增強或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答包括增加受試者的白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-12、IL-23或它們的組合。
18.權(quán)利要求13所述的方法，其中增強或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答包括減少受試者的IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子貝塔(TGFβ)或它們的組合的水平。
19.權(quán)利要求13所述的方法，其中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括減低或抑制受試者的炎癥應(yīng)答。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述肽具有抗炎活性，并且其中減低或抑制炎癥應(yīng)答包括在免疫狀態(tài)下施用該肽。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述肽具有促炎活性，并且其中減低或抑制炎癥應(yīng)答包括在耐受狀態(tài)下施用該肽。
22.權(quán)利要求19的方法，其中減低或抑制炎癥反應(yīng)包含提高受試者IL-4，IL-10，TGFβ，或它們的組合的水平。
23.權(quán)利要求19的方法，其中減低或抑制炎癥反應(yīng)包含降低受試者IFNγ，TNFα，或兩者的水平。
24.權(quán)利要求19的方法，其中強化或誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答包含降低受試者IL-1，IL-6，IL-12，IL-23，或它們組合的水平。
25.權(quán)利要求1的方法，其中使用肽包含在免疫狀態(tài)下使用肽。
26.權(quán)利要求25的方法，其中在免疫狀態(tài)下使用肽包含在皮內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)使用肽。
27.權(quán)利要求25的方法，其中肽被配制在一種組合物里，并且其中該組合物進一步包含免疫佐劑。
28.權(quán)利要求1的方法，其中使用肽包含在耐受狀態(tài)下使用肽。
29.權(quán)利要求28的方法，其中在耐受狀態(tài)下使用肽包含肽的經(jīng)粘膜使用。
30.權(quán)利要求28的方法，其中在耐受狀態(tài)下使用肽包含肽的皮內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)使用。
31.權(quán)利要求1的方法，其中受試者有免疫性疾病。
32.權(quán)利要求31的方法，其中免疫性疾病是自身免疫性疾病。
33.權(quán)利要求32的方法，其中自身免疫性疾病是一種關(guān)節(jié)炎。
34.權(quán)利要求33的方法，其中關(guān)節(jié)炎是特發(fā)性幼稚關(guān)節(jié)型關(guān)節(jié)炎。
35.權(quán)利要求1的方法，其中受試者患感染性疾病，炎性腸道病，或癌癥。
36.一種調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細胞反應(yīng)性的方法，該方法包括將免疫效應(yīng)細胞與施用于受試者的dnaJ熱休克蛋白(hsp)的肽片段接觸。
37.權(quán)利要求36的方法，其中dnaJ hsp是細菌dnaJ hsp。
38.權(quán)利要求37的方法，其中細菌dnaJ hsp是大腸桿菌dnaJ hsp，選自QDYYEILGVSKTAEE(SEQ ID NO1)，RKAYKRLAMKYHPDR(SEQ ID NO2)，QKRAAYDQYGHAAFEQ(SEQ ID NO3)，QGFFAVQQTCPHCQG(SEQ ID NO4)，SKTLSVKIPGAVDTG(SEQ ID NO5)，GDLYVQVQVKQHPIF(SEQ ID NO6)，YCEVPINFAMAALGG(SEQ ID NO7)，PINFAMAALGGEIEV(SEQ ID NO8)，或它們的任意組合。
39.權(quán)利要求36的方法，其中dnaJ hsp是真核dnaJ hsp。
40.權(quán)利要求39的方法，其中真核dnaJ hsp是人dnaJ hsp。
41.權(quán)利要求40的方法，其中肽是同源于細菌dnaJ hsp的肽片段。
42.權(quán)利要求41的方法，其中肽是ASYYEILDVPRSASA(SEQ ID NO9)，KDYYQTLGLARGASD(SEQ ID NO10)，TTYYDVLGVKPNATQ(SEQ ID NO11)，KKAYRRKALQWHPDK(SEQ ID NO12)，KRAYRRQALRYHPDK(SEQ ID NO13)，KKAYRKLALKYHPDK(SEQ ID NO14)，F(xiàn)RSVSTSTTFVQGRR(SEQ ID NO15)，PGMVQQIQSVCMECQ(SEEQ ID NO16)，GRRITTRRIMENGQE(SEQ ID NO17)，或它們的任意組合。
43.權(quán)利要求42的方法，其中肽是非同源于細菌dnaJ hsp的肽片段。
44.權(quán)利要求43的方法，其中肽是QAYEVLSDAKKRELYD(SEQ ID NO18)，EAYEVLSDKHKREIYD(SEQ ID NO19)，SGPFFTFSSSFPGHS(SEQ ID NO20)，DGQLKSVTINGVPDD(SEQ ID NO21)，DLQLAMAYSLSEMEA(SEQ ID NO22)，EDLFMCMDIQLVEAL(SEQ ID NO23)，LCGFQKPISTLDNRT(SEQ ID NO24)，RTIVITSHPGQIVKH(SEQ ID NO25)，GRLIIEFKVNFPENG(SEQ ID NO26)，或它們的任意組合。
45.權(quán)利要求36的方法，其中接觸免疫效應(yīng)細胞包括把肽用于受試者，其中所述接觸發(fā)生在體內(nèi)。
46.權(quán)利要求36的方法，其中接觸免疫效應(yīng)細胞是在體外進行。
47.權(quán)利要求46的方法，進一步包含把免疫效應(yīng)細胞用于受試者，以此調(diào)節(jié)受試者的免疫反應(yīng)。
48.權(quán)利要求47的方法，其中免疫效應(yīng)細胞是受試者自身的。
49.權(quán)利要求47的方法，其中免疫效應(yīng)細胞是與受試者有關(guān)的同種異體的。
50.權(quán)利要求47的方法，其中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括增強或誘導(dǎo)受試者的炎癥反應(yīng)。
51.權(quán)利要求47的方法，其中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)包括降低或抑制受試者的炎癥反應(yīng)。
52.權(quán)利要求36的方法，其中免疫效應(yīng)細胞是T細胞。
53.權(quán)利要求36的方法，進一步包括免疫效應(yīng)細胞與免疫佐劑接觸。
54.權(quán)利要求53的方法，其中免疫佐劑是細胞因子。
55.權(quán)利要求54的方法，其中細胞因子是促炎細胞因子。
56.權(quán)利要求55的方法，其中細胞因子是抗炎細胞因子。
57.選自SEQ ID NOS1-26中的任意一個的肽。
58.嵌合多肽，包括與至少一種異源的多肽有效連接的權(quán)利要求57的肽。
59.組合物，包括至少一種權(quán)利要求57的肽。
60.權(quán)利要求59的組合物，包括多種所述肽。
61.權(quán)利要求60的組合物，其進一步包括生理上可接受的溶液。
62.權(quán)利要求57的組合物，其進一步包括免疫佐劑。
63.權(quán)利要求62的組合物，其中免疫佐劑是細胞因子。
64.權(quán)利要求63的組合物，其中細胞因子有促炎活性。
65.權(quán)利要求63的組合物，其中細胞因子有抗炎活性。
66.權(quán)利要求62的組合物，其中免疫佐劑包括福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑或明礬。
67.編碼權(quán)利要求57的肽的多核苷酸。
68.權(quán)利要求67的多核苷酸，其是一個雙鏈脫氧核苷酸分子。
69.重組核酸分子，包括與至少一個異源的核苷酸序列有效連接的如權(quán)利要求67所述的多核苷酸。
70.權(quán)利要求69的重組核酸分子，其中異源的核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，翻譯調(diào)節(jié)元件或者它們的組合。
71.權(quán)利要求69的重組核酸分子，其中異源的核苷酸序列編碼多肽。
72.載體，其含有權(quán)利要求67的多核苷酸。
73.細胞，其含有權(quán)利要求67的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)受者免疫反應(yīng)的方法。本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)已獲得一種改善與免疫性疾病的炎癥有關(guān)的癥狀的有效的治療策略，例如關(guān)節(jié)炎，其是通過調(diào)節(jié)潛在的免疫反應(yīng)本身，而不僅是針對所產(chǎn)生炎癥。該策略可用于調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答，并且預(yù)期應(yīng)用在多個需要免疫調(diào)節(jié)的情況中，如粘膜耐受性、DNA接種、無反應(yīng)性誘導(dǎo)、自動免疫接種和離體抗原特異性T細胞調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，該方法包括給受者施用細菌dnaJ肽或它的人同源物或非同源的人同工型肽。
文檔編號C12N1/21GK1481390SQ01820764
公開日2004年3月10日 申請日期2001年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月1日
發(fā)明者A·馬丁尼, S·阿爾瓦尼, D·A·卡森, B·J·普拉克恩, A 馬丁尼, 卡森, 吣, 普拉克恩 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會, A·馬丁尼