熱休克蛋白gp96在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了熱休克蛋白gp96在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的熱休克蛋白gp96為a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白質(zhì)；a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a3)在a1)或a2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；a4)將序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。實驗證明，熱休克蛋白gp96對治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡和/或緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀有重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】
熱休克蛋白gp96在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及熱休克蛋白gp96在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)屬于自身免疫類疾病，常 發(fā)生于20~40歲女性。大量研究顯示遺傳、內(nèi)分泌、感染、免疫異常和一些環(huán)境因素與SLE的 發(fā)病有關(guān)，但病因至今尚未肯定。在遺傳因素、環(huán)境因素、雌激素水平等各種因素相互作用 下，SLE患者的T淋巴細胞減少，T抑制細胞功能降低，B細胞過度增生，并產(chǎn)生大量的自身抗 體。這些自身抗體可與體內(nèi)相應(yīng)的自身抗原結(jié)合形成相應(yīng)的免疫復(fù)合物，沉積在皮膚、關(guān) 節(jié)、小血管、腎小球等部位，引起急慢性炎癥及組織壞死(如狼瘡腎炎）；這些自身抗體也可 直接與組織細胞抗原作用，引起細胞破壞(如紅細胞、淋巴細胞和血小板壁的特異性抗原與 相應(yīng)的自身抗體結(jié)合，分別引起溶血性貧血、淋巴細胞減少癥和血小板減少癥），從而導致 機體的多系統(tǒng)受到損害。
[0003] 目前，SLE不論采用中醫(yī)還是西醫(yī)治療均不可能根治，只能通過藥物緩解病情，給 SLE患者及其家屬帶來巨大的經(jīng)濟和精神負擔。
[0004] 熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP)是一類在生物進化中高度保守且廣泛存 在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。HSP根據(jù)同源程度和分子量大小可分為HSPl 10、HSP90、 邯卩70、!^?60、!^?40、小分子!^?和泛素等多個亞家族。熱休克蛋白（!^3〖811〇^^口1〇丨6111， HSP)gp96屬于HSP90亞家族的成員，該蛋白是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上含量最豐富的熱休克蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了熱休克蛋白gp96在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述產(chǎn)品的功能為如下Al)至A10)中的至少一種：
[0007] Al)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡；
[0008] A2)緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀；
[0009] A3)誘導調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生；
[0010] A4)降低抗雙鏈DNA抗體滴度；
[0011] A5)降低抗核抗體滴度；
[0012] A6)降低尿蛋白濃度；
[0013] A7)延長生存時間；
[0014] A8)提尚血小板的數(shù)量；
[0015] A9)使抗核抗體和/或抗UlRNP抗體和/或抗SSA抗體和/或抗核糖體P蛋白抗體由陽 性轉(zhuǎn)為陰性；
[0016] A10)預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述Al)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)和 所述A10)中，所述熱休克蛋白gp96的劑量可為向哺乳動物注射IOOyg~500yg所述熱休克蛋 白gp96 (如I OOyg所述熱休克蛋白gp96或500yg所述熱休克蛋白gp96)。
[0018]上述應(yīng)用中，所述A8)和所述A9)中，所述熱休克蛋白gp96的劑量具體可為向哺乳 動物注射IOOyg所述熱休克蛋白gp96。
[0019] 上述應(yīng)用中，所述A4)中，所述雙鏈DNA可為Sigma Aldrich公司的小牛胸腺dsDNA 標準品。
[0020] 所述哺乳動物可為人、鼠。所述鼠具體可為雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠。
[0021 ]上述應(yīng)用中，所述熱休克蛋白gp96可為al)或a2)或a3)或a4):
[0022] al)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白質(zhì)；
[0023] a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0024] a3)在al)或a2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0025] a4)將序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序 列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。 [0026]上述應(yīng)用中，編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子可為dl)或d2)或d3)或d4):
[0027] dl)核苷酸序列是序列表中序列1自5'端起第4位至2352位所示的DNA分子；
[0028] d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0029] d3)與dl)或d2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述熱休 克蛋白gp96的DNA分子；
[0030] d4)在嚴格條件下與dl)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述熱休克蛋白 gp96的DNA分子。
[0031]上述應(yīng)用中，所述熱休克蛋白gp96的獲得方式可為Dl)或D2):
[0032] Dl)從離體哺乳動物的胎盤組織中提??；
[0033] D2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導入受體中，培養(yǎng)，純化。
[0034] 所述Dl)中，所述哺乳動物可為人、鼠。所述鼠具體可為雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小 ￡3
[0035] 所述D2)中，所述"將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導入受體中"可通過向 受體中導入重組載體實現(xiàn);所述重組載體可為將所述熱休克蛋白gp96的編碼基因插入出發(fā) 質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pFastBacl-gp96。所述重組質(zhì)粒 pFastBacl-gp96具體可為在質(zhì)粒pFastBacl的多克隆位點插入序列表中序列1所示的DNA分 子得到的重組質(zhì)粒。
[0036] 所述重組質(zhì)粒pFastBacl_gp96具體可為將質(zhì)粒pFastBacl的EcoRI和XbaI識別序 列間的片段(質(zhì)粒PFastBacl被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和XbaI切成一個大片段和一個小片 段，該DNA為該小片段)替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。
[0037]所述D2)中，所述受體可為Sf9細胞。
[0038] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)節(jié)性T細胞可為⑶4+⑶25+F0XP3+調(diào)節(jié)性T細胞。
[0039]上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品可為藥物。
[0040] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。
[0041] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，其活性成分為熱休克蛋白gP96;所述產(chǎn)品的功能為如下Al) 至A10)中的至少一種：
[0042] Al)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡；
[0043] A2)緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀；
[0044] A3)誘導調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生；
[0045] A4)降低抗雙鏈DNA抗體滴度；
[0046] A5)降低抗核抗體滴度；
[0047] A6)降低尿蛋白濃度；
[0048] A7)延長生存時間；
[0049] A8)提高血小板的數(shù)量；
[0050] A9)使抗核抗體和/或抗UlRNP抗體和/或抗SSA抗體和/或抗核糖體P蛋白抗體由陽 性轉(zhuǎn)為陰性；
[00511 A10)預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
[0052] 上述產(chǎn)品中，所述Al)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)和 所述A10)中，所述熱休克蛋白gp96的劑量可為向哺乳動物注射IOOyg~500yg所述熱休克蛋 白gp96 (如I OOyg所述熱休克蛋白gp96或500yg所述熱休克蛋白gp96)。
[0053]上述產(chǎn)品中，所述A8)和所述A9)中，所述熱休克蛋白gp96的劑量具體可為向哺乳 動物注射IOOyg所述熱休克蛋白gp96。
[0054] 上述產(chǎn)品中，所述A4)中，所述雙鏈DNA可為Sigma Aldrich公司的小牛胸腺dsDNA 標準品。
[0055] 所述哺乳動物可為人、鼠。所述鼠具體可為雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠。
[0056]上述產(chǎn)品中，所述熱休克蛋白gp96可為al)或a2)或a3)或a4):
[0057] al)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白質(zhì)；
[0058] a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0059] a3)在al)或a2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0060] a4)將序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序 列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。 [0061 ]上述產(chǎn)品中，編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子可為dl)或d2)或d3)或d4): [0062] dl)核苷酸序列是序列表中序列1自5'端起第4位至2352位所示的DNA分子；
[0063] d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0064] d3)與dl)或d2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述熱休 克蛋白gp96的DNA分子；
[0065] d4)在嚴格條件下與dl)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述熱休克蛋白 gp96的DNA分子。
[0066]上述產(chǎn)品中，所述熱休克蛋白gp96的獲得方式可為Dl)或D2):
[0067] Dl)從離體哺乳動物的胎盤組織中提?。?br>[0068] D2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導入受體中，培養(yǎng)，純化。
[0069] 所述D1)中，所述哺乳動物可為人、鼠。所述鼠具體可為雌性MRL/Mp J-Fas I pr/J小 ￡3
[0070]所述D2)中，所述"將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導入受體中"可通過向 受體中導入重組載體實現(xiàn);所述重組載體可為將所述熱休克蛋白gp96的編碼基因插入出發(fā) 質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。
[0071 ] 所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pFastBacl_gp96。所述重組質(zhì)粒pFastBacl_gp96 具體可為在質(zhì)粒pFastBacl的多克隆位點插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重組質(zhì) 粒。
[0072] 所述重組質(zhì)粒pFastBacl_gp96具體可為將質(zhì)粒pFastBacl的EcoRI和XbaI識別序 列間的片段(質(zhì)粒PFastBacl被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和XbaI切成一個大片段和一個小片 段，該DNA為該小片段)替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。
[0073]所述D2)中，所述受體可為Sf9細胞。
[0074] 上述產(chǎn)品中，所述調(diào)節(jié)性T細胞可為⑶4+⑶25+F0XP3+調(diào)節(jié)性T細胞。
[0075]上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品可為藥物。
[0076]實驗證明，所述熱休克蛋白gp96具有治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡 的癥狀、誘導調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生、降低抗雙鏈DNA抗體滴度、降低抗核抗體滴度、降低尿蛋 白濃度、延長生存時間、提高血小板的數(shù)量、使抗核抗體和/或抗UlRNP抗體和/或抗SSA抗體 和/或抗核糖體P蛋白抗體由陽性轉(zhuǎn)為陰性和預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡的功能。因此，熱休克蛋 白gp96對治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡和/或緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀具有重要的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0077] 圖 1 為pgp96的Western blot鑒定結(jié)果。
[0078] 圖2為rgp96的SDS-PAGE和Western Blot的鑒定結(jié)果。
[0079] 圖3為用pgp96或rgp96免疫的小鼠的脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+F0XP3+調(diào)節(jié)性T細 胞的頻率。
[0080]圖4為用pgp96或rgp96免疫小鼠的抗雙鏈DNA抗體滴度的檢測結(jié)果。
[0081 ]圖5為用pgp96或rgp96免疫小鼠的抗核抗體滴度的檢測結(jié)果。
[0082]圖6為用pgp96或rgp96免疫小鼠的尿蛋白濃度的檢測結(jié)果。
[0083]圖7為用pgp96或rgp96免疫小鼠的生存率統(tǒng)計結(jié)果。
【具體實施方式】
[0084]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0085] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0086] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0087] 以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0088]雌性MRL/MpJ-Faslpr/J小鼠為上海斯萊克實驗動物有限責任公司產(chǎn)品；雌性MRL/ Mp J-Fas lpr/J小鼠在下文中簡稱小鼠。
[0089] 獲取小鼠脾臟淋巴細胞的具體方法參考如下文獻:Zhen Liu，Xinghui Li，Lipeng Qiu，et al.Treg suppress CTL responses upon immunization with HSP gp96.Eur·J.mmunol，2009,39(11):3110-3120.
[0090] HepG2細胞（人肝癌細胞）為ATCC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為HB-8065T'Sf9細胞為 Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為IMge-OlSc3Cellfectin II reagent為Life technologies公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為10362-100。質(zhì)粒pFastBac?l為Invitrogen公司產(chǎn) 品，產(chǎn)品目錄號為10359-016#ρ96單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為sc-56399。辣根過氧化物酶標記的山 羊抗大鼠的單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公 司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為ZB-2307。HiTrap-Q Sepharose離子交換層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品 目錄號為17-5053-01 Auperdex 200 10/300GL分子篩層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 17517501。大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號 為CL108-01 AITC-anti-CDS、PE-anti-CD4、Percp-Cy5 · 5-anti-CD25、固定/破膜劑和 APC-anti-Foxp3均為eBioscience公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號分別為 11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和n-STTS-SOdnsect-XPRESS? Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine為LONZA公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為12-730Q。
[0091] 溶液4:溶質(zhì)及其濃度為卩1^1禮、他!1〇)3 301111;溶劑為蒸餾水;？!1值為7.4。
[0092] 溶液B:溶質(zhì)及其濃度為2mM MnCl2、2mM CaCl2、500mM NaCUPMSF ImM;溶劑為 pH7.4、20mM Tris-HCl緩沖液。
[0093] 溶液C:溶質(zhì)及其濃度為10 % (質(zhì)量體積比）a-D_吡喃葡萄糖、500mM NaCl、ImM PMSF;溶劑為pH7·4、20mM Tris-HCl緩沖液。
[0094] 清洗液:用蒸餾水將溶液B稀釋至10倍體積。
[0095] ConA瓊脂糖凝膠柱為GE公司公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為17-0440-01，該柱的規(guī)格為 1.6X2.5cm，填充介質(zhì)為Con A-Sepharose ABc3Hitrap Q陰離子交換柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品 目錄號為17 -115 3 -01，該柱的的規(guī)格為0.7 X 2.5 cm。HRP標記的I gG抗體為SER0TEC公司產(chǎn) 品，產(chǎn)品目錄號為STARinP13I X洗滌液為含0.1% (體積百分比）Triton-X100的pH7.4、 0.01 mol/L PBS緩沖液。小牛胸腺dsDNA標準品為Sigma Aldrich公司產(chǎn)品。96孔酶標板為美 國Nunc公司產(chǎn)品?？筪sDNA抗體標準品為美國Chemicon International公司產(chǎn)品。牛血清白 蛋白為Invitrogen公司產(chǎn)品。IXTMB ELISA Substrate Solution為eBioscience公司產(chǎn) 品，產(chǎn)品目錄號為00-4201-56。細胞核抗體ELISA檢測試劑盒為ADI公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 5210。尿蛋白檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，貨號為C035-2。超濾管為Merck MiIlipore公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為UFC905096。
[0096]實施例l、pgp96的提取
[0097] 組織中熱休克蛋白gp96(以下簡稱pgp96)的提取步驟如下：
[0098] (1)分離分娩前的小鼠的胎盤組織，得到小鼠離體胎盤組織。取小鼠離體胎盤組織 或人離體胎盤組織，剪碎，按質(zhì)量體積比Ig: 4mL加入溶液A，然后用玻璃勻漿器磨碎。
[0099] (2)完成步驟（1)后，16500g離心lh，得到上清液甲。
[0100] (3)完成步驟(2)后，取上清液甲，16500g離心50min，得到上清液乙。
[0101] (4)完成步驟(3)后，取上清液乙，按體積比9:1加入溶液B，混勻后得到上樣液。
[0102] (5)完成步驟(4)后，將上樣液上樣至ConA瓊脂糖凝膠柱。
[0103] (6)完成步驟(5)后，用清洗液洗脫所述ConA瓊脂糖凝膠柱，洗脫過程中實時監(jiān)測 紫外吸收值，檢測波長為280nm，直至洗脫產(chǎn)物的紫外吸收值低于0.01。
[0104] (7)完成步驟(6)后，用溶液C洗脫所述ConA瓊脂糖凝膠柱，棄去首先流出的過柱后 溶液0.5個柱體積，然后收集之后流出的過柱后溶液1個柱體積;將所述ConA瓊脂糖凝膠柱 孵育50min后，再收集過柱后溶液1.5個柱體積。將兩次收集的過柱后溶液合并，即為ConA洗 脫液。
[0105] (8)完成步驟(7)后，將ConA洗脫液上樣至Hitrap Q陰離子交換柱。
[0106] (9)完成步驟(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS緩沖液進行線性梯度洗脫，流速 為lmL/min。梯度洗脫程序：在pH7.4 12mM的PBS緩沖液中使NaCl含量由300mM勻速增至 800mM，線性梯度洗脫20個柱體積。收集合并NaCl含量為400~450mM的洗脫液，即為洗脫液 甲。
[0107] (10)完成步驟(9)后，取洗脫液甲，用超濾管甲進行超濾濃縮，得到pgp96的溶液。 pgp96的溶液中，pgp96濃度為5mg/mL。
[0108] 將pgp96的溶液進行SDS-PAGE電泳分析和Western blot(以gp96單克隆抗體作為 一抗，HRP標記的IgG抗體作為二抗），實驗結(jié)果見圖1 (箭頭為pgp96)。結(jié)果表明，pgp96的溶 液顯不單一分子量條帶，對應(yīng)的分子量為96kDa。
[0109] 實施例2、重組熱休克蛋白gp96的制備 [0110] 一、重組質(zhì)粒 pFastBac?l_gp96 的構(gòu)建
[0111] 1、采用Trizol法提取HepG2細胞的RNA，然后進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0112] 2、根據(jù)人gp96基因（GenBank號為AY040226.1)的序列，人工合成引物Fl:5'_ GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3 '（下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRI識別序列）和R1: 5 ' -GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3 '（下劃線為限制性內(nèi)切酶XbaI識別序列）。
[0113] 3、完成步驟1和2后，以步驟1獲得的cDNA為模板，以步驟2合成的Fl和Rl為引物進 行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0114] 4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0115] 5、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切質(zhì)粒pFastBac?l，回收約4700bp的載體骨架。
[0116] 6、將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。
[0117] 7、將步驟6獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，得到重組大腸桿 菌，然后提取該重組大腸桿菌的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pFastBacl_gp96。
[0118] 根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pFastBacl_gp96進行結(jié)構(gòu)描述如下:將質(zhì)粒pFastBacl 的EcoRI和XbaI識別序列間的片段(質(zhì)粒pFastBacl被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和XbaI切成 一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段）替換為序列表中序列1所不的雙鏈DNA分子。 重組質(zhì)粒pFastBac l-gp96表達重組熱休克蛋白gp96(以下簡稱rgp96)，rgp96的氨基酸序 列如序列表中序列2所示。
[0119]二、rgp96 的表達
[0120] 1、將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBacl-gp96共轉(zhuǎn)染Sf9細胞(每1乂106個3€9細胞 約轉(zhuǎn)染4yg重組質(zhì)粒pFastBacl-gp96;共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為Cellfectin II reagent， 培養(yǎng)基為Insect-XPRESS? Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine，27°C 孵育72h，離心，上清液即為Pl代病毒。
[0121] 2、將Sf9細胞懸浮液1 (含I X IO8個Sf9細胞)27°C培養(yǎng)8~IOh，得到培養(yǎng)細胞;然后 向所述培養(yǎng)細胞中加入Pl代病毒(劑量為0.05~0.1M0I)，27°C孵育72h，4000rpm離心5min， 上清液即為P2代病毒。
[0122] 3、向Sf9細胞懸浮液2(含1.6X108個Sf9細胞）中加入P2代病毒（劑量為0.05~ O · IMOI)，27°C、100~120rpm培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，上清液即為P3代病毒。
[0123] 以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為 二抗，對P3代病毒進行western雜交，western雜交具體步驟參考如下文獻:張悅鳴，段躍強， 羅德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL_5a受體在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達及其鑒 定[J ].中國生物制品學雜志，2013，26:5.
[0124] western雜交實驗結(jié)果表明，rgp96在Sf9細胞中表達。
[0125] 三、rgp96的純化
[0126] 1、向300ml的Sf 9細胞懸浮液3 (含4.5 X IO8個Sf9細胞）中加入P3代病毒（劑量為 5M0I)，27°C、100~120rpm培養(yǎng)72h，得到懸浮液。
[0127] 2、取所述懸浮液，7000rpm離心20min，獲得上清液1。
[0128] 3、取所述上清液1，經(jīng)0.22mm濾膜過濾，獲得上樣液。
[0129] 4、將所述上樣液上樣于HiTrap-Q Sepharose離子交換層析柱(流速為lmL/min)， 然后先用5mL的pH7.5、200mM的I3BS緩沖液沖洗(流速為lmL/min);再用IOmL的pH7.5、300mM 的PBS緩沖液沖洗(流速為lmL/min);最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS緩沖液沖洗(流速為 lmL/min)，收集過柱后溶液并采用截留分子量為50KD的超濾管進行超濾濃縮，得到ImL左右 的濃縮液。所述濃縮液即含有rgp96。
[0130] 5、將步驟4得到的濃縮液上樣于Superdex 200 10/300GL分子篩層析柱（流速為 0 · 25mL/min)，然后用pH7 · 5、150mM的PBS緩沖液洗滌（流速為0 · 25mL/min)，收集為9~12mL 處的穿透液，進一步采用截留分子量為50KD的超濾管進行超濾濃縮，得到rgp96的溶液。采 用BCA法測定rgp96的溶液中的蛋白濃度，最后分裝，IC存于-80°C。
[0131] 將步驟5得到的rgp96的溶液進行SDS-PAGE電泳分析，實驗結(jié)果見圖2中左圖（泳道 1為高分子量標準蛋白質(zhì)，泳道2為rgp96,箭頭為rgp96)。將步驟5得到的重組熱休克蛋白 gp96的溶液進行Western blot(以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標記的山羊抗 大鼠的單克隆抗體作為二抗），實驗結(jié)果見圖2中右圖。結(jié)果表明，rgp96的溶液顯示單一分 子量條帶，對應(yīng)的分子量與預(yù)期一致。
[0132] 實施例3、pgp96或rgp96在活化調(diào)節(jié)性T細胞中劑量的確定
[0133] -、小鼠分組免疫
[0134] 將90只九周齡體重為18~22g的小鼠隨機分成pgp96處理組l、pgp96處理組2、 pgp96處理組3、pgp96處理組4、rgp96處理組I、rgp96處理組2、rgp96處理組3、rgp96處理組4 和對照組(每組10只），分別進行如下處理：
[0135] PgP96處理組1:實驗第1天，腹腔注射實施例1制備的pgp96的溶液;實驗第8天，再 次腹腔注射實施例1制備的pgp96的溶液;實驗第22天，再次腹腔注射實施例1制備的pgp96 的溶液。每次注射劑量均為l〇yg pgp96/只。
[0136] pgp96處理組2:按照pgp96處理組1的操作步驟進行，僅將注射劑量IOyg pgp96/只 替換為50yg pgp96/只。
[0137] pgp96處理組3:按照pgp96處理組1的操作步驟進行，僅將注射劑量IOyg pgp96/只 替換為IOOyg pgp96/只。
[0138] pgp96處理組4:按照pgp96處理組1的操作步驟進行，僅將注射劑量IOyg pgp96/只 替換為IOOyg pgp96/只。
[0139] rgP96處理組1:實驗第1天，腹腔注射實施例2制備的rgp96的溶液;實驗第8天，再 次腹腔注射實施例2制備的rgp96的溶液;實驗第22天，再次腹腔注射實施例2制備的rgp96 的溶液。每次注射劑量均為l〇yg pgp96/只。
[0140] rgp96處理組2:按照rgp96處理組1的操作步驟進行，僅將注射劑量10ygrgp96/只 替換為50ygrgp96/只。
[0141 ] rgp96處理組3:按照rgp96處理組1的操作步驟進行，僅將注射劑量10ygrgp96/只 替換為100ygrgp96/只。
[0142] rgp96處理組4:按照rgp96處理組1的操作步驟進行，僅將注射劑量10ygrgp96/只 替換為500ygrgp96/只。
[0143] 對照組:實驗第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液，實驗第8天，再次腹腔 注射pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖液;實驗第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖 液。每次注射劑量均為IOOyL/只。
[0144] 二、小鼠淋巴細胞分離
[0145]取完成步驟一后第8天的小鼠，獲取小鼠脾臟淋巴細胞(每只小鼠取3 X IO6個脾臟 淋巴細胞）。
[0146] 三、pgp96或rgp96在活化調(diào)節(jié)性T細胞中劑量的確定
[0147] 1、取步驟二獲取的小鼠脾臟淋巴細胞（少于IX IO6個），1000 rpm離心10min，收集 小鼠脾臟淋巴細胞。
[0148] 2、完成步驟1后，取所述小鼠脾臟淋巴細胞，加入IOOyL含5% (質(zhì)量體積比）BSA的 pH7·4、0·Olmol/L PBS緩沖液重懸，4°C封閉20min;然后1000 rpm離心10min，用IOOyL上清液 重懸沉淀，得到混合液甲。
[0149] 3、完成步驟2后，取所述混合液甲，加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25,4°C 避光孵育 20min。
[0150] 4、完成步驟3后，取所述混合液甲，加入ImL pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖液，震蕩混 勻，1000 rpm離心10min，收集小鼠脾臟淋巴細胞，然后用400yL pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖 液重懸，得到混合液乙。
[0151] 5、完成步驟4后，取所述混合液乙，加入600yL固定/破膜劑，4°C破膜30min(實際操 作過程中不超過Ih即可）；然后1000 rpm離心10min，收集沉淀，得到沉淀1。
[0152] 6、完成步驟5后，取所述沉淀1，加入ImL I X洗滌液重懸，1000 rpm離心10min，得到 沉淀2和上清液丙。取IOOyL上清液丙重懸沉淀2，得到混合液丙；向混合液丙中加入APC-anti-Foxp3,4°C 避光孵育 30min。
[0153] 7、完成步驟6后，取所述混合液丙，加入ImL I X洗滌液重懸，1000 rpm離心10min， 收集沉淀，得到沉淀3。取400yL含4 % (質(zhì)量體積比）多聚甲醛的pH7.4、0.01 moI/L PBS緩沖 液重懸沉淀3,然后用流式細胞儀分析小鼠脾臟淋巴細胞中⑶4+⑶25+F0XP3+調(diào)節(jié)性T細胞的 頻率。
[0154] 實驗結(jié)果見圖3(小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+F0XP3 +調(diào)節(jié)性T細胞的頻率即 F0XP3+細胞在CD4+細胞中比例）。結(jié)果表明，pgp96處理組l、pgp96處理組2、pgp96處理組3、 pgp96處理組4、rgp96處理組I、rgp96處理組2、rgp96處理組3和rgp96處理組4中小鼠的脾臟 淋巴細胞中CD4+CD25+F0XP3+調(diào)節(jié)性T細胞的頻率均高于對照組，尤其是pgp96處理組3、 pgp96處理組4、rgp96處理組3和rgp96處理組4中小鼠的脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+F0XP3+調(diào) 節(jié)性T細胞的頻率均顯著高于對照組。因此，100ygrgp96、500ygrgp96、100ygpgp96或500yg pgp96均可以顯著誘導⑶4+⑶25+F0XP3+調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生。
[0155] 實施例4、pgp96或rgp96在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用
[0156] -、小鼠分組免疫
[0157] 1、發(fā)病小鼠的獲得
[0158] 取九周齡體重為18~22g的小鼠，挑選淋巴結(jié)腫大的小鼠，即為發(fā)病小鼠。
[0159] 2、小鼠分組免疫
[0160] 按照步驟1的方法，選取將50只九周齡的體重為18~22g的發(fā)病小鼠，隨機分成 pgp96處理組5、pgp96處理組6、rgp96處理組5、rgp96處理組6和對照組(每組10只），分別進 行如下處理：
[0161] pgp96處理組5:實驗第1天，腹腔注射實施例1制備的pgp96的溶液;實驗第8天，再 次腹腔注射實施例1制備的pgp96的溶液;實驗第22天，再次腹腔注射實施例1制備的pgp96 的溶液。每次注射劑量均為l〇〇yg pgp96/只。
[0162] pgp96處理組6:按照pgp96處理組5的操作步驟進行，僅將注射劑量IOOyg pgp96/ 只替換為500yg pgp96/只。
[0163] rgP96處理組5:實驗第1天，腹腔注射實施例2制備的rgp96的溶液;實驗第8天，再 次腹腔注射實施例2制備的rgp96的溶液;實驗第22天，再次腹腔注射實施例2制備的rgp96 的溶液。每次注射劑量均為l〇〇yg pgp96/只。
[0164] rgp96處理組6:按照rgp96處理組5的操作步驟進行，僅將注射劑量IOOyg pgp96/ 只替換為500yg pgp96/只。
[0165] 對照組:實驗第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS緩沖液，實驗第8天，再次腹腔 注射pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖液;實驗第22天，再次腹腔注射pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖 液。每次注射劑量均為IOOyL/只。
[0166] 二、抗雙鏈DNA抗體滴度的分析
[0167] 小鼠血清中抗雙鏈DNA抗體滴度采用酶聯(lián)免疫吸附方法測定，具體步驟如下：
[0168] 1、取完成步驟一中2后第22天的小鼠，通過眼眶取血200yL，然后室溫靜置30min， 3000rpm離心20min，取上清液并用pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖液稀釋至50倍體積，得到上清 稀釋液。
[0169] 2、取96孔酶標板，每孔加入IOOyL濃度為2.5yg/mL的小牛胸腺dsDNA標準品，4°C包 被過夜。
[0170] 3、完成步驟2后，取所述96孔酶標板，每孔加入IOOyL 2%牛血清白蛋白，37°C孵育 60min〇
[0171] 4、完成步驟3后，取所述96孔酶標板，每孔加入50yL步驟1制備的上清稀釋液或不 同濃度的抗dsDNA抗體標準品溶液（用pH7.4、0.01m 〇l/L PBS緩沖液稀釋，濃度分別為2000μ g/mL、1000yg/mL、500yg/mL、250yg/mL、125yg/mL、62 · 5yg/mL和0yg/mL)，37 °C 解育60min。
[0172] 5、完成步驟4后，取所述96孔酶標板，棄上清，每孔加入200yL的I X洗滌液，靜置 30s，甩干，重復(fù)洗滌5次;最后在吸水紙上拍干。
[0173] 6、完成步驟5后，取所述96孔酶標板，每孔加入50yL的辣根過氧化物酶標記的山羊 抗大鼠的單克隆抗體稀釋液（用pH7.4、0.Olmol/L PBS緩沖液將辣根過氧化物酶標記的山 羊抗大鼠的單克隆抗體稀釋至5000倍體積），37 °C孵育60min。
[0174] 7、重復(fù)步驟5-次。
[0175] 8、完成步驟7后，取所述96孔酶標板，每孔加入IOOyL的IXTMB ELISA Substrate Solution，37 °C 孵育 15min。
[0176] 9、完成步驟8后，取所述96孔酶標板，每孔加入50yL的2M H2SO4水溶液，混勻，于 15min內(nèi)在酶標儀測量在450nm波長下的吸光值。以抗dsDNA抗體標準品溶液的濃度為橫坐 標，相應(yīng)的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。
[0177] 根據(jù)步驟9制備的標準曲線，計算完成步驟一中2后第22天的小鼠血清中抗雙鏈 DNA抗體的滴度。
[0178]三、抗核抗體(ANA)滴度的分析
[0179] 采用細胞核抗體ELI SA檢測試劑盒測定小鼠血清中抗核抗體滴度，酶標板、抗核抗 體標準品和酶結(jié)合物均為該試劑盒中組分。具體步驟如下：
[0180] 1、將細胞核抗體ELISA檢測試劑盒平衡至室溫。
[0181] 2、完成步驟1后，取所述細胞核抗體ELISA檢測試劑盒中的酶標板，每孔加入50yL 步驟二中1制備的上清稀釋液或不同濃度的抗核抗體標準品溶液（用pH7.4、0.Olmol/L PBS 緩沖液稀釋，濃度分別為 2000yg/mL、1000yg/mL、500yg/mL、250yg/mL、125yg/mL、62.5yg/mL 或0yg/mL)，37°C孵育60min。
[0182] 3、完成步驟2后，取所述酶標板，每孔加入50yL酶結(jié)合物，充分混勻，封板，置于37 °C 孵育 30min。
[0183] 4、完成步驟3后，取所述酶標板，棄上清，每孔加入200yL的I X洗滌液，靜置30s，甩 干，重復(fù)洗滌5次;最后在吸水紙上拍干。
[0184] 5、完成步驟4后，取所述酶標板，每孔加入IOOyL的I XTMB ELISA Substrate Solution，37 °C 孵育 15min。
[0185] 6、完成步驟5后，取所述酶標板，每孔加入50yL的2M H2SO4水溶液，混勻，于15min內(nèi) 在酶標儀測量在450nm波長下的吸收值。以抗核抗體標準品溶液的濃度為橫坐標，相應(yīng)的吸 光值為縱坐標，繪制標準曲線。
[0186] 根據(jù)標準曲線，計算完成步驟一中2后第22天的小鼠血清中抗核抗體滴度。
[0187] 四、尿蛋白濃度的檢測
[0188] 采用尿蛋白檢測試劑盒檢測尿蛋白，操作步驟按照尿蛋白檢測試劑盒的說明書進 行，CBB試劑為尿蛋白檢測試劑盒中的組件。具體步驟如下：
[0189] 取三個EP管，依次標記為空白管、標準管和測定管:空白管中加入雙蒸水0.05mL和 CBB試劑3. OmL;標準管中加入濃度為563mg//L的蛋白標準液0.05mL和CBB試劑3. OmL;測定管 中加入完成步驟一中2后第22天的小鼠尿液0.05mL和CBB試劑3. OmL。各管充分混勻后放置 5min，然后使用分光光度計檢測在595nm處各管的吸光度，按照下述公式計算步驟一中2后 第22天的小鼠尿液中的尿蛋白濃度：
[0190] 尿蛋白濃度(mg/L)=測定管的OD值一空白管的OD值/標準管的OD值一空白管的OD 值 X 563mg/L。
[0191] 五、小鼠生存率的統(tǒng)計
[0192] 完成上述步驟一后，統(tǒng)計各組的小鼠的生存率和小鼠的死亡時間。
[0193] 小鼠的抗雙鏈DNA抗體滴度的檢測結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，pgp96處理組5、pgp96處 理組6、rgp96處理組5和rgp96處理組6中小鼠血清中抗雙鏈DNA抗體滴度顯著小于對照組(P 〈0.01) Agpge處理組5和rgp96處理組5中小鼠血清中抗雙鏈DNA抗體滴度無顯著差異。 pgp96處理組6和rgp96處理組6中小鼠血清中抗雙鏈DNA抗體滴度無顯著差異。pgp96處理組 5和rgp96處理組5中小鼠血清中抗雙鏈DNA抗體滴度均小于pgp96處理組6和rgp96處理組6， 因此，最佳免疫劑量為IOOyg pgp96/只或100ygrgp96/只。
[0194] 小鼠的抗核抗體滴度的檢測結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，pgp96處理組5、pgp96處理組6、 rgp96處理組5和rgp96處理組6中小鼠血清中抗核抗體滴度顯著小于對照組（P〈0.01)。 pgp96處理組5和rgp96處理組5中小鼠血清中抗核抗體滴度無顯著差異。pgp96處理組6和 rgp96處理組6中小鼠血清中抗核抗體滴度無顯著差異。pgp96處理組5和rgp96處理組5中小 鼠血清中抗核抗體滴度均小于pgp96處理組6和rgp96處理組6,因此，最佳免疫劑量為IOOyg pgp96/只或 100ygrgp96/只。
[0195] 小鼠尿液中的尿蛋白濃度的檢測結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，pgp96處理組5、pgp96處理 組6、rgp96處理組5和rgp96處理組6中小鼠尿液中尿蛋白濃度顯著小于對照組(P〈0.01)。 pgp96處理組5和rgp96處理組5中小鼠尿液中尿蛋白濃度無顯著差異。pgp96處理組6和 rgp96處理組6中小鼠尿液中尿蛋白濃度無顯著差異。pgp96處理組5和rgp96處理組5中小鼠 尿液中尿蛋白濃度均小于pgp96處理組6和rgp96處理組6，因此，最佳免疫劑量為IOOyg pgp96/只或 100ygrgp96/只。
[0196] 小鼠的生存率統(tǒng)計結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，pgp96處理組5、pgp96處理組6、rgp96處 理組5和rgp96處理組6中的小鼠開始死亡的時間為30周齡;對照組中的小鼠開始死亡的時 間為20周齡。因此，經(jīng)過pgp96或rgp96處理后，小鼠的生存時間顯著延長。而且pgp96處理組 5和rgp96處理組5中小鼠的生存期均高于pgp96處理組6和rgp96處理組6,因此，最佳免疫劑 量為IOOyg pgp96/只或 100ygrgp96/只。
[0197] 上述結(jié)果表明，用pgp96或rgp96免疫發(fā)病小鼠，能夠有效的治療或減輕SLE癥狀， 同時發(fā)病小鼠的生存時間延長。
[0198] 實施例5、pgp96對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的影響
[0199] 1位于2014年7月南京軍區(qū)南京總醫(yī)院確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者(為知情同意 的志愿者），女，44歲。自身免疫性溶血貧血3年余。自身指標如下：血小板52，抗核抗體1: 320，抗UlRNP抗體陽性，抗SSA抗體、抗核糖體P蛋白抗體陽性。將患者進行如下治療:實驗第 1天，肌肉注射實施例1制備的pgp96的溶液;實驗第8天，再次肌肉注射實施例1制備的pgp96 的溶液;實驗第22天，再次肌肉注射實施例1制備的pgp96的溶液。每次注射劑量均為I OOyg pgp96/只。完成最后一次注射后半年，檢測該患者的指標，結(jié)果如下:血小板152,抗核抗體， 抗UlRNP抗體，抗SSA抗體、抗核糖體P蛋白抗體全部轉(zhuǎn)陰性。
[0200] 上述結(jié)果表明，pgp96可治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
【主權(quán)項】
1. 熱休克蛋白g P 9 6在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能為如下A1)至A10)中的至少 一種： A1)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡； A2)緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀； A3)誘導調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生； A4)降低抗雙鏈DNA抗體滴度； A5)降低抗核抗體滴度； A6)降低尿蛋白濃度； A7)延長生存時間； A8)提尚血小板的數(shù)量； A9)使抗核抗體和/或抗U1RNP抗體和/或抗SSA抗體和/或抗核糖體P蛋白抗體由陽性轉(zhuǎn) 為陰性； A10)預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述熱休克蛋白gp96為al)或a2)或a3)或 a4)： al)氣基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所不的蛋白質(zhì)； a2)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)； a3)在al)或a2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)； a4)將序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng) 過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為D1)或D2): D1)從離體哺乳動物的胎盤組織中提取； D2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導入受體中，培養(yǎng)，純化。4. 如權(quán)利要求1至3任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述調(diào)節(jié)性T細胞為⑶4+⑶25+FOXP3+ 調(diào)節(jié)性T細胞。5. 如權(quán)利要求1至4任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述產(chǎn)品為藥物。6. -種產(chǎn)品，其活性成分為熱休克蛋白gp96;所述產(chǎn)品的功能為如下A1)至A10)中的至 少一種： A1)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡； A2)緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀； A3)誘導調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生； A4)降低抗雙鏈DNA抗體滴度； A5)降低抗核抗體滴度； A6)降低尿蛋白濃度； A7)延長生存時間； A8)提尚血小板的數(shù)量； A9)使抗核抗體和/或抗U1RNP抗體和/或抗SSA抗體和/或抗核糖體P蛋白抗體由陽性轉(zhuǎn) 為陰性； A10)預(yù)防系統(tǒng)性紅斑狼瘡。7. 如權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述熱休克蛋白gp96為al)或a2)或a3)或 a4)： al)氣基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所不的蛋白質(zhì)； a2)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)； a3)在al)或a2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)； a4)將序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng) 過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。8. 如權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于： 所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為D1)或D2): D1)從離體哺乳動物的胎盤組織中提??； D2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導入受體中，培養(yǎng)，純化。9. 如權(quán)利要求6至8任一所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述調(diào)節(jié)性T細胞為⑶4+⑶25+F0XP3+ 調(diào)節(jié)性T細胞。10. 如權(quán)利要求6至9任一所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述產(chǎn)品為藥物。
【文檔編號】A61K38/17GK105963681SQ201610301471
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】孟頌東, 李鑫, 陳密
【申請人】中國科學院微生物研究所