結(jié)直腸癌抗原肽與熱休克蛋白的復(fù)合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一類與熱休克蛋白結(jié)合的結(jié)直腸癌抗原，包括結(jié)直腸癌特異性抗原MU5AC、RNF43和T0MM34來源的肽段。本發(fā)明同時還提供了抗原與熱休克蛋白gp96和HSP78的復(fù)合物及其制備方法，復(fù)合物包括gp96和HSP78與抗原多肽以非共價鍵結(jié)合的復(fù)合體，和二者以共價鍵連接形成的融合蛋白。這種復(fù)合物可用于制備治療結(jié)直腸癌的治療性疫苗。
【專利說明】結(jié)直腸癌抗原肽與熱休克蛋白的復(fù)合物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及結(jié)直腸癌抗原多肽與熱休克蛋白gp96和 HSP78的復(fù)合物以及它們的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 熱休克蛋白（Heat Shock Protein, HSP)是一類高度保守、廣泛存在于原核及 真核生物中的蛋白質(zhì)，在熱休克、葡萄糖缺乏、細(xì)菌和病毒感染等應(yīng)激狀態(tài)下會表達(dá)升 高。gp96是熱休克蛋白HSP90家族中的重要成員，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（Endoplasmic Reticulum)，能夠阻止蛋白質(zhì)聚集，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、伸展、組裝和轉(zhuǎn)運，抑制錯折疊蛋白質(zhì) 的分泌。gp96在正常組織和腫瘤中均有廣泛表達(dá)。gp96分子除了具備分子伴侶的功能， gp96分子還具有多肽結(jié)合的能力，能結(jié)合細(xì)胞中5-25個氨基酸的多肽序列。熱休克蛋白 hsp78是細(xì)胞質(zhì)中hsp70家族中的成員，分子量約78kDa。HSP78分子也能夠和細(xì)胞中各種 短肽結(jié)合。
[0003] 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，組織提取的gp96、HSP78蛋白具有很強免疫原性，能夠有效的 激起組織特異性的免疫反應(yīng)。同時也發(fā)現(xiàn)這種抗原性由這些HSP結(jié)合的短肽所決定。HSP 將結(jié)合的短肽呈遞給I類MHC分子，激活特異性的效應(yīng)和記憶T細(xì)胞，引發(fā)長期的細(xì)胞免疫 反應(yīng)。gp96還可以活化樹突細(xì)胞（DC)促進(jìn)MHC I類和MHC II類分子以及共刺激因子的表 達(dá)，從而提商免疫反應(yīng)。
[0004] 結(jié)直腸癌是最常見惡性腫瘤之一，近年來國內(nèi)外發(fā)病率逐年上升。根據(jù)2012年最 新發(fā)表的腫瘤登記年報，結(jié)直腸癌年發(fā)病率達(dá)到29. 4/105,居常見腫瘤的第3位。盡管確診 時709Γ80%的患者可以進(jìn)行根治性手術(shù)切除，但總體的5年生存率仍只有509Γ60%。約2/3 接受過根治手術(shù)的患者會發(fā)生復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，85%的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生在術(shù)后2年半之內(nèi)，這 些復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生可能與確診時已存在微轉(zhuǎn)移灶有關(guān)，而目前的檢查手段還無法發(fā)現(xiàn)這種 微轉(zhuǎn)移。這些綜合原因?qū)е陆Y(jié)直腸癌年死亡率超過14/10 5,危害嚴(yán)重。
[0005] 臨床試驗已證實，術(shù)后輔助化療可顯著降低疾病復(fù)發(fā)率并使生存期明顯延長。但 由于化療不可能殺滅體內(nèi)全部癌細(xì)胞，癌癥是否復(fù)發(fā)最終取決于機(jī)體自身的自穩(wěn)功能和免 疫功能，同時大腸癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性差。因此化療給機(jī)體帶來的毒副作用、對機(jī)體 免疫功能的打擊遠(yuǎn)比化療殺滅部分癌細(xì)胞給機(jī)體帶來的益處要大得多。
[0006] 臨床試驗已證實，術(shù)后輔助化療可顯著降低疾病復(fù)發(fā)率并使生存期明顯延長，但 II期結(jié)腸癌的術(shù)后輔助化療仍存在許多爭議，通常建議對存在高危因素的患者進(jìn)行術(shù)后輔 助化療。
[0007] 另一方面，分子靶向藥物聯(lián)合化療的療效仍不明確，但卻顯示毒性增加，且靶向藥 物聯(lián)合化療費用昂貴。因此，如何個體化治療顯得益為重要。
[0008] 國外對29名肝轉(zhuǎn)移的直腸癌患者進(jìn)行g(shù)p96免疫治療結(jié)果顯示，手術(shù)2年后患者 總生存率OS和無病生存率DFS分別為79%和32%，有顯著改進(jìn)；同時沒有觀察到明顯的毒 副作用，為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。
[0009] 然而作為消化系統(tǒng)中嚴(yán)重的惡性腫瘤，結(jié)直腸癌從總體上仍然不能治愈。新的化 療藥物、靶向藥物的進(jìn)展緩慢。即便目前最具希望的自體gp96免疫治療由于需要的足夠大 的腫瘤組織來制備疫苗，同時自體疫苗制備的一次性，影響了該方法的療效和受眾。
[0010] 目前已證實gp96和HSP78分子能結(jié)合泡狀口炎病毒抗原區(qū)肽、鼠H-2Kb限制的卵 清蛋白抗原表位肽、La限制的白血病抗原肽、乙肝病毒抗原肽等抗原多肽。但目前為止未 見從結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中分離鑒定與HSP結(jié)合的抗原多肽。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是篩選結(jié)直腸癌特異性的肽段?？朔[瘤細(xì)胞免 疫編輯導(dǎo)致的低免疫原性，能夠在結(jié)直腸癌患者或者健康個體中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞（殺傷性T細(xì)胞，CTL)，而且CTL具有強大的抗結(jié)直腸癌作用，對正常細(xì)胞及組 織無破壞作用。
[0012] 本發(fā)明的一個目的是提供一種與gp96和HSP78結(jié)合的結(jié)直腸癌抗原的復(fù)合物。 所述的結(jié)直腸癌抗原可以分別是結(jié)直腸癌腫瘤抗原MU5AC蛋白上第466-474位的氨基酸 序列，其序列可以是SLDGAQTVV，或其變異序列；結(jié)直腸癌抗原可以分別是結(jié)直腸癌腫瘤抗 原MU5AC蛋白上第721-729位的氨基酸序列，其序列可以是FLDDTGKCV，或其變異序列；結(jié) 直腸癌抗原可以分別是結(jié)直腸癌腫瘤抗原MU5AC蛋白上第305-314位的氨基酸序列，其序 列可以是KMYATIPEL，或其變異序列，結(jié)直腸癌抗原可以分別是結(jié)直腸癌腫瘤抗原RNF43蛋 白上第631-639位的氨基酸序列，其序列可以是SICPSTSSL，或其變異序列，結(jié)直腸癌抗原 可以分別是結(jié)直腸癌腫瘤抗原RNF43蛋白上第201-209位的氨基酸序列，其序列可以是 ILMTVVGTI，或其變異序列，結(jié)直腸癌抗原可以分別是結(jié)直腸癌腫瘤抗原T0MM34蛋白上第 30-38位的氨基酸序列，其序列可以是ALYGRALRV，或其變異序列，結(jié)直腸癌抗原可以分別 是結(jié)直腸癌腫瘤抗原T0MM34蛋白上第77-85位的氨基酸序列，其序列可以是ALALVPFSI，或 其變異序列。
[0013] 本發(fā)明的復(fù)合物既包括熱休克蛋白以非共價鍵與多肽結(jié)合，又包括熱休克蛋白以 共價鍵與多肽結(jié)合。本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的如上所述抗原多肽與熱休克蛋白gp96和 HSP78的復(fù)合物的方法。
[0014] 本發(fā)明所訴的表位肽可以單獨或以熱休克蛋白復(fù)合物形式在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠 中誘導(dǎo)形成特異性的CTL。
[0015] 本發(fā)明所訴的表位肽可以在體外單獨或以熱休克蛋白復(fù)合物形式刺激HLA-A2陽 性結(jié)直腸癌患者PBMC分泌IFN- γ，且這種作用在自體gp96復(fù)合物免疫后顯著增強。
[0016] 本發(fā)明所訴的表位肽可以單獨或以熱休克蛋白復(fù)合物形式提高HLA-A2陽性結(jié)直 腸癌患者特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
[0017] 本發(fā)明所述的特異性CTL的誘導(dǎo)可以被Treg細(xì)胞的抑制劑增強。
[0018] 首次從五例結(jié)直腸癌腫瘤組織中與熱休克蛋白gp96結(jié)合的多肽中分離出一特 異9肽，經(jīng)氨基酸序列分析為"SLDGAQTVV"，經(jīng)查詢發(fā)現(xiàn)該序列位于結(jié)直腸癌特異性抗原 MU5AC的466-474位，人工合成該序列并與體外表達(dá)的gp96蛋白組裝，體外合成gp96-9肽 復(fù)合物，將9肽與gp96-9肽復(fù)合物免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，均能刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞 毒性T細(xì)胞（CTL)，且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制劑的預(yù)處理可以增強gp96-9肽復(fù)合物的免疫效果 2倍以上。實驗結(jié)果表明gp96-9肽復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型結(jié)直腸癌的治療性藥物。
[0019] 附圖簡要說明 圖1.小鼠（BALB/Chla-A2+)的特異性CTL反應(yīng)。以gp96-9肽復(fù)合物按0、1、3周的周期 免疫小鼠，最后一次免疫3天后檢測特異性細(xì)胞裂解率。效應(yīng)細(xì)胞CTL對特異性靶細(xì)胞的 裂解百分率以4小時標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放法測定，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比分別是10、25、50和100， 圖中裂解率為10只小鼠的平均值。
[0020] 圖2 PC-9荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線。裸鼠皮下接種人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116,荷瘤 7天后轉(zhuǎn)輸不同來源的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。肽段1組（n=20)的接受經(jīng)過gp96-肽段1復(fù)合 物免疫的BALB/c (HLA-A2+)小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞；無關(guān)肽組（n=20)接受經(jīng)過gp96-無關(guān)肽 (HBcAg82-90)復(fù)合物免疫的BALB/c(HLA-A2 +)小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞。
[0021] 圖3結(jié)直腸癌患者免疫自體腫瘤gp96復(fù)合物后9肽特異性T細(xì)胞的變化。以 IFN- γ的ELISP0T方法檢測患者外周血中9肽特異性T細(xì)胞。無關(guān)肽HBcAg82_9(l肽為陰性 對照。
[0022]

【具體實施方式】： 下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023] 實施例1.從結(jié)直腸組織中純化gp96蛋白 將五份結(jié)直腸癌組織和一份正常腸組織勻漿后離心，用30%/70%飽和度（NH4)2SO 3沉 淀，沉淀溶解后采用ConA Sepharose (GE公司）進(jìn)行親和層析，用8%的α -甲基葡萄糖苷 洗脫結(jié)合的蛋白，糖苷洗脫液以Hitrap-Q (GE公司）進(jìn)行陰離子層析，經(jīng)過這三步純化獲 得>95%純度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94單克隆抗體（Santa Cruz公司）進(jìn)行 Western鑒定。其純度用SDS-PAGE、銀染和反相HPLC鑒定。
[0024] 實施例2.從gp96蛋白釋放非共價結(jié)合的多肽 將純化的gp96蛋白加入三氟乙酸（TFA)使其終濃度達(dá)到0. 2% (pH約2. 0)，然后用超 濾法（分子截留為30kDa，Millipore公司）分離多肽，將多肽混合物進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜 (ABI 4700)分析，多肽分子量大多在600-1100 Da之間。
[0025] 實施例3.反相HPLC分析多肽 多肽混合物凍干后溶于溶液A (0.065% TFA，2%乙腈)，上樣于反相C18層析柱 (S印hasilp印tideC18;5um粒度；4·6 X 250 mm，GE公司），從0至65%溶液B(0·05% TFA，100%乙腈）進(jìn)行梯度洗脫，流速為I mL/min，用214nm波長檢測。比較腫瘤組織和正 常組織HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)一個五份結(jié)直腸癌組織共有而正常腸組織中沒有的肽峰。
[0026] 實施例4.多肽微量測序與序列分析 收集該特異肽峰用MALDI-T0F質(zhì)譜（PE公司Voyager-DE系統(tǒng)）鑒定其純度，只發(fā)現(xiàn)分 子量為889 Da的單一峰。對該肽微量測序（Procise 491.蛋白測序儀，ABI公司），其氨基 酸序列為"SLDGAQTVV"，5份腫瘤組織得到的序列一致。將該序列在網(wǎng)上蛋白數(shù)據(jù)庫（NCBI) 查詢，發(fā)現(xiàn)它位于MU5AC蛋白的466-474位。
[0027] 實施例5. gp96蛋白與人工合成的多肽體外快速組裝 人工合成9肽"SLDGAQTVV"（委托吉爾生化有限公司合成），將gp96蛋白與多肽進(jìn)行 體外組裝，體外結(jié)合反應(yīng)體系： 2.7 mmol/L KC1,1.47 mmol/L KH2PO4,8. I mmol/L Na2HPO4,138mmol/L NaCl, 10%(V/ V)甘油，3. 0 mmol/L 9肽，0. 421 mmol/L gp96蛋白，60°C反應(yīng)10分鐘，超濾法（分子截留 30 kDa，Millipore公司）去除未結(jié)合的多肽。
[0028] 實施例6表達(dá)結(jié)直腸癌抗原肽1和熱休克蛋白gp96的融合蛋白 本實例提供了結(jié)直腸癌抗原肽I (SLDGAQTVV)與熱休克蛋白gp96以共價鍵形成的融 合蛋白的方法。我們?nèi)斯ず铣蓪?yīng)于該肽的核酸序列（AGT TTA GAT GGT GCT CAA ACT GTT GTT)，引入限制性酶切位點Bgl II將該9肽的核酸序列與gp96基因5'端用T4連接酶 連接，連接產(chǎn)物的5'和3'端引入2個限制性酶切位點EcoR I和Xho I，連接到表達(dá)載體 pPICZ a A中在畢赤酵母中分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物是gp96與該9肽的融合蛋白。
[0029] 實施例7.免疫小鼠 選用生長8-10周的HLA-A2轉(zhuǎn)基因的BALB/c小鼠（HLA-A2+)用于本實驗。
[0030] 免疫方式采用將樣品溶于IOOuL的PBS中頸背皮下注射。皮下注射操作相對簡單， 要求免疫劑量適中，故采用該種免疫方式。同時在每次免疫前1天腹腔注射0.4 mg的環(huán)磷 酰胺。低劑量環(huán)磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg細(xì)胞從而能增強免疫效 果。
[0031] gp96蛋白-9肽復(fù)合物的最適免疫劑量為0. I nmol。
[0032] 免疫時間為0、1、3周進(jìn)行三次的強化免疫，優(yōu)于免疫一次或二次的效果。
[0033] 因此采用皮下注射免疫，將9肽溶于緩沖液（90% PBS 10% DMSO 0. 1% TFA) gp96-9肽復(fù)合物溶于PBS中，注射前劇烈振蕩1分鐘，每只小鼠免疫劑量9肽分別為0. 2 nmol，2 nmol和20 nmol，將肽與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠。gp96-9肽復(fù)合物免疫劑量分 別是0. 01 nmol, 0. 05 nmol, 0. 10 nmol和0. 50 nmol,米用頸背皮下注射，第一次免疫1周 后進(jìn)行第二次免疫，2周后加強免疫，3天后進(jìn)行細(xì)胞毒性分析。每一處理使用10只小鼠。
[0034] 實施例8.細(xì)胞毒性（CTL)分析 小鼠加強免疫3天后，從每只小鼠收獲得約3 X IO7脾細(xì)胞懸于含有10 mM HEPES緩沖 液，抗生素和10% (V/V) FCS培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)瓶中與經(jīng)幅射（4500 Rad)的T2細(xì)胞（3:1) 和lug/mL肽在完全培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)。6天后收集脾細(xì)胞進(jìn)行4小時標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放實驗 (具體方法見Kuhrober, A, et al. 1997. Internationallmmunology, 9(8):1203-1212) 測定細(xì)胞毒性活性。簡而言之，靶細(xì)胞用10ug/mL目標(biāo)肽或者無關(guān)肽于37°C致敏30分鐘后 加入不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞，反應(yīng)體系為100 uL的完全培養(yǎng)基。37°C共培養(yǎng)4小時后收集上 清測定特異裂解率。
[0035] 從51Cr釋放實驗可以看出gp96_9肽復(fù)合物可刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì) 胞，每只小鼠免疫〇. I nmol (約IOug)的gp96-9肽復(fù)合物即能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強烈的細(xì)胞免 疫反應(yīng)，細(xì)胞毒性測定靶細(xì)胞的裂解率在40%以上，通過注射環(huán)磷酰胺的預(yù)處理可以明顯 的提高gp96-9肽復(fù)合物的免疫效果，且這種細(xì)胞毒效應(yīng)是表位肽特異性的（圖1)。實驗結(jié) 果表明gp96-9肽復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型結(jié)直腸癌的治療藥物。
[0036] 實施例9.細(xì)胞轉(zhuǎn)輸體內(nèi)抑瘤實驗 用HLA-A2陽性人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116皮下注射裸鼠。7天后轉(zhuǎn)輸從gp96-結(jié)直腸 癌抗原9肽1復(fù)合物免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的脾臟淋巴細(xì)胞（n=20)、gp96-無關(guān)肽復(fù) 合物免疫小鼠淋巴細(xì)胞（n=20)，每周轉(zhuǎn)輸一次，共3周。檢測腫瘤大小可以發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)輸 gp96-肺癌抗原9肽1復(fù)合物免疫小鼠的淋巴細(xì)胞可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長（圖2)。
[0037] 實施例10結(jié)直腸癌患者免疫自體gp96復(fù)合物治療腫瘤 該研究中入組的gp96免疫治療的III、IV期結(jié)直腸癌患者術(shù)后接受gp96治療及醫(yī)生常 規(guī)治療(放化療)。一周為一個療程，每個療程注射一次。試驗組在術(shù)后8周內(nèi)在常規(guī)治療 的基礎(chǔ)上開始自體gp96免疫治療。
[0038] 操作流程 η選取計劃行手術(shù)的III、IV期的結(jié)直腸癌患者； η獲得患者自愿簽署的"知情同意書"以及"手術(shù)同意書"； η行術(shù)前全面檢查以明確根治性手術(shù)可行性； η手術(shù)切取腫瘤組織； 1將組織存放于無菌管中； 1存有腫瘤組織的無菌管在〇°C條件下于2個小時內(nèi)送至GMP制備車間。
[0039] η鑒定腫瘤組織質(zhì)量，確認(rèn)可以提取足量的熱休克蛋白gp96_多肽復(fù)合物； 熱休克蛋白gp96_多肽復(fù)合物提取及檢測； gp96治療及常規(guī)治療； 熱休克蛋白gp96-多肽復(fù)合物皮下注射流程： 第1次注射前3天內(nèi)需檢查血常規(guī)、血生化及心電圖。
[0040] 注射預(yù)處理：每次gp96注射前1-3天給患者靜脈注射環(huán)磷酰胺。
[0041] 由研究護(hù)士進(jìn)行g(shù)p96蛋白注射，根據(jù)既往國外研究資料制定劑量，加入生理鹽水 混勻后上臂及大腿左右皮下注射，每周1次。
[0042] 第1、2次免疫蛋白注射后，需留院觀察24小時，后幾次注射后需觀察1小時，無不 良反應(yīng)后方可離開。
[0043] 第2次及第8次注射后3天內(nèi)需檢查血常規(guī)、血生化及心電圖。
[0044] 免疫治療前及免疫結(jié)束后,采集IOml患者血液,進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)的測定。
[0045] 若患者治療期間疾病復(fù)發(fā)，由研究者詳實記錄患者疾病復(fù)發(fā)情況，并按照臨床診 療規(guī)范給予相應(yīng)治療； 隨訪； 術(shù)后2年內(nèi)每3月訪視1次，2年后每6月訪視1次，直至患者疾病復(fù)發(fā)或死亡，具體訪 視內(nèi)容如下： ①2年內(nèi)每3個月復(fù)查1次： a)第3、9、15、21月復(fù)查內(nèi)容： 腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA19-9、AFP); 腹、盆腔B超； 胸部X線。
[0046] b)第 6、12、18、24 月復(fù)查內(nèi)容： 腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA19-9、AFP); 胸、腹、盆腔增強CT; 結(jié)腸鏡。
[0047] ②2年后每6個月復(fù)查1次，復(fù)查內(nèi)容： 腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA19-9、AFP); 胸、腹、盆腔增強CT ; 結(jié)腸鏡。
[0048] 若患者隨訪期間疾病復(fù)發(fā)，由研究者詳實記錄患者疾病復(fù)發(fā)情況，并按照臨床診 療規(guī)范(如NCCN指南等）給予相應(yīng)治療。
[0049] 實施例11 ELISP0T法檢測特異性T細(xì)胞 ELISP0T檢測結(jié)直腸癌患者PBMC中表位特異性CTL。按照ELISP0T試劑盒的說明書操 作.先用含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基封閉ELISP0T預(yù)包被板一小時，臨用前倒掉 封閉液，加入IOOuL含3 X 105的人的PBMCX直接用新鮮的PBMC或者將PBMC體外擴(kuò)增培 養(yǎng)7天).實驗組中加入10ug/mL的肽1、陽性對照加入4ug/mL的PHA進(jìn)行刺激，陰性對照 加入無關(guān)肽。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)26-36小時后，檢測特異性斑點的形成，并進(jìn)行統(tǒng)計分 析。我們選取HLA-A2陽性的結(jié)直腸癌患者作為研究組，選取HLA-A2陰性患者作為對照組， 通過ELISP0T方法檢測患者新鮮血液中表位特異性CTL，特異性CTL的頻率通過計數(shù)斑點 數(shù)量來確定。在3例經(jīng)自體gp96復(fù)合物免疫的HLA-A2陽性結(jié)直腸癌患者中均檢測到高頻 率的RTDE⑶NRV特異性CTL，且比免疫前有顯著的提高，同時并沒有檢測到無關(guān)肽HBcAg 82_9Q (陰性對照）特異性T細(xì)胞，說明ELISP0T結(jié)果是表位特異的（圖2)。
[0050] 實施例12其它gp96-多肽復(fù)合物的免疫活性測定 除上述抗原9肽之外，我們又選取其它6個結(jié)直腸癌抗原多肽與gp96體外組裝并測 定其免疫活性，這4個抗原多肽分別是I) MU5AC抗原多肽"FLDDTGKCV"，2 ) MU5AC抗原多肽 "KMYATIPEL"，3) RNF43 抗原多肽"SICPSTSSL"，4) RNF43 抗原多肽 "ILMTWGTI"，5) T0MM34 抗原多肽"ALYGRALRV"，6) T0MM34 抗原多肽"ALALVPFSI"。
[0051] 分別人工合成這6種多肽，采用實施例5中所述的反應(yīng)體系在體外與gp96結(jié)合， 這6種多肽與gp96均有較高的親和力，通過測定結(jié)合反應(yīng)平衡常數(shù)K，6種肽與gp96結(jié)合 反應(yīng)中K值均在4以上。采用實施例7中所述的方法用上述6種結(jié)直腸癌抗原多肽與gp96 形成的復(fù)合物，和上述gp96與6種結(jié)直腸癌抗原多肽的融合蛋白分別免疫小鼠，并采用實 施例7中所述的方法分別對這6種復(fù)合物進(jìn)行CTL分析，從 51Cr釋放實驗可以看出這4種 結(jié)直腸癌抗原多肽與gp96形成的復(fù)合物均可刺激HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性 T細(xì)胞，6種多肽與gp96形成的復(fù)合物的免疫活性比單獨多肽高100-200倍，且通過Treg 細(xì)胞抑制劑預(yù)處理可以進(jìn)一步提高免疫效果。每只小鼠免疫劑量為0.1 nmol (約IOug)時 即能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過對這6種多肽與gp96形成的復(fù)合物的細(xì)胞毒 性測定發(fā)現(xiàn)靶細(xì)胞的裂解率在40%-65%之間。
[0052] 以上實驗結(jié)果表明gp96與結(jié)直腸癌抗原多肽體外組裝合成的復(fù)合物可開發(fā)成為 一種新型結(jié)直腸癌的治療或預(yù)防藥物。由于實驗條件所限本發(fā)明專利不可能對每一種結(jié)直 腸癌抗原多肽進(jìn)行體外組裝及免疫活性測定，但我們通過選取7種有代表性的腫瘤抗原作 研究對象，在體外與gp96結(jié)合并進(jìn)行免疫活性測定，大量實驗表明gp96與這些抗原多肽形 成的復(fù)合物均能刺激小鼠產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，可開發(fā)成為一種新型治療疫苗。因此，除上 述7種抗原多肽之外，其它任何結(jié)直腸癌抗原多肽與gp96結(jié)合作為新型疫苗也應(yīng)當(dāng)在本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0053] 實施例13. HSP78-多肽免疫原性測定 將HSP78與7種多肽體外組裝形成的復(fù)合物，反應(yīng)體系同gp96 (見實施例5)，將體外 合成的復(fù)合物和HSP78與5種多肽的融合蛋白（見實施例6)免疫小鼠。小鼠免疫方式、免 疫劑量以及免疫程序同gp96(見實施例7)細(xì)胞毒性（CTL)分析方法同gp96 (見實施例 8)。從51Cr釋放實驗可以看出HSP78-9肽復(fù)合物可刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞， HSP78-9肽復(fù)合物的免疫原性為單獨9肽的150倍以上，每只小鼠免疫0. I nmol (約IOug) 即能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，細(xì)胞毒性測定靶細(xì)胞的裂解率在50%以上。實驗 表明HSP78-9肽復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型結(jié)直腸癌的治療藥物。
【權(quán)利要求】
1. 一種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽SLDGAQTVV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽FLDDTGKCV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 2 所示。
3. -種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽KMYATIPEL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 3 所示。
4. 一種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽SICPSTSSL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 4 所示。
5. -種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽ILMTVVGTI，其特征在于，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 5 所示。
6. -種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽ALYGRALRV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 6 所示。
7. -種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽ALALVPFSI，其特征在于，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID NO. 7 所示。
8. 如權(quán)利要求1-7任一項所述的表位肽與gp96或HSP78的共價或非共價連接的復(fù)合 物。
9. 如權(quán)利要求1-7任一項所述的表位肽在體外單獨或與熱休克蛋白形成如權(quán)利要求8 所述的復(fù)合物單獨或共同免疫人體誘導(dǎo)生成殺傷性T細(xì)胞中的用途。
10. 如權(quán)利要9所述的免疫誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞在預(yù)防或治療結(jié)直腸癌中的用途。
【文檔編號】A61K38/16GK104211772SQ201310693197
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】黃錫堅, 張小俊 申請人:深圳市康爾諾生物技術(shù)有限公司