專利名稱：增強(qiáng)的2-酮-l-古洛糖酸的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及增強(qiáng)2-KL的工業(yè)生產(chǎn)，特別地涉及編碼將2，5-二酮戊二酸從細(xì)胞的周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)區(qū)的蛋白質(zhì)的基因組的超表達(dá)。本發(fā)明提供用于在微生物中增強(qiáng)2-KLG生產(chǎn)的表達(dá)載體、方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)可用Reichstein方法很容易地經(jīng)一步化學(xué)法而被轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-抗壞血酸(維生素c)通常是眾所周知的(Reichstein，T.等人，Helv.Chim.Acta，1934，17，311-328；Reichstein，T.等人，Helv.Chim.Acta，1933，16，561，1019)。有可表達(dá)異源酶以將開(kāi)始的底物轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的重組微生物。重組DNA技術(shù)已被用于在草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)中以單個(gè)發(fā)酵的步驟將D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG(Anderson，S.等人Science 230，144-149(1985))。然而，本研究針對(duì)的是增加2，5DKG還原酶或其他合成產(chǎn)物的表達(dá)而沒(méi)有認(rèn)識(shí)到在終產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)中底物轉(zhuǎn)運(yùn)的重要性。事實(shí)上，發(fā)明者的研究揭示了因還原酶超表達(dá)引起的2-KLG生產(chǎn)增加最小。因而需要一種方法來(lái)通過(guò)利用重組微生物的生物合成途徑以增加2-KLG的工業(yè)生產(chǎn)，這用到除增加細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以外的方法。
生物膜的脂雙層通常對(duì)離子和極性分子是非通透性的。這些生物膜構(gòu)成了細(xì)胞的區(qū)室，使細(xì)胞的不同部分相互隔開(kāi)。因而被細(xì)胞利用以合成各種產(chǎn)物的底物以及被細(xì)胞利用以生成能量或生長(zhǎng)的代謝物可與利用它們的合成和/或代謝反應(yīng)分隔開(kāi)。至于產(chǎn)物的合成，不同的合成途徑或其部分可發(fā)現(xiàn)于在細(xì)胞的不同部分。一些氧化反應(yīng)可發(fā)生在細(xì)胞溶膠的外面。例如，膜結(jié)合蛋白質(zhì)可用于將碳源氧化為其他中間物。腔內(nèi)(Cystolic)反應(yīng)或途徑例如一些還原或脫氫作用也可用來(lái)將底物或中間物轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N產(chǎn)物。當(dāng)?shù)孜锖秃铣裳b置位于膜的相反側(cè)時(shí)，期望的產(chǎn)物的生產(chǎn)需要底物轉(zhuǎn)位到合成反應(yīng)的位置以使其能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榻K產(chǎn)物。換句話說(shuō)，在細(xì)胞膜內(nèi)部生成的終產(chǎn)物需要從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位。由于細(xì)胞隔開(kāi)的部分可能具有不同的環(huán)境參數(shù)例如溶質(zhì)、離子、終產(chǎn)物等，濃度或者需要穿過(guò)通常非通透性的膜障礙物轉(zhuǎn)運(yùn)，所以需要一些形式的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。
針對(duì)這些問(wèn)題，出現(xiàn)了關(guān)于增加材料跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究。已用溶劑或裂解試劑來(lái)使膜破裂，以使得材料能夠跨過(guò)膜。然而，這樣的方法具有不利于宿主細(xì)胞生存力的作用。如果合成或代謝途徑依賴于宿主細(xì)胞自身的代謝或分解代謝途徑或由其提供能量，例如需要如NADH或NADPH的輔因子，那么破壞細(xì)胞的生存力即停止了宿主細(xì)胞進(jìn)一步的或連續(xù)的合成生產(chǎn)。另外，雖然已在增加細(xì)胞生長(zhǎng)方面探索了葡萄糖或其他糖類轉(zhuǎn)運(yùn)的增加(Parker，C.等人，Mol.Microbiol 15(5)795-802(1995))，但尚未認(rèn)識(shí)到通過(guò)利用重組微生物的生物合成途徑而改變細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以增加化學(xué)終產(chǎn)物或中間物的工業(yè)生產(chǎn)。
Cornish(J.of Gen.Microbiol.，134；3111-3122(1988))討論了放射土壤桿菌(Agrobacteriym radiobacter)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和琥珀酰聚糖(succinoglucan)外聚糖(exopolysaccharide)生產(chǎn)之間的關(guān)系。Cornish提出葡萄糖的攝入是琥珀酰聚糖生產(chǎn)的主要?jiǎng)恿W(xué)控制點(diǎn)，并且應(yīng)該可能通過(guò)利用重組DNA方法獲得更高的琥珀酰聚糖生產(chǎn)速率。然而Cornish的生產(chǎn)速率不符合工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模需要。此外，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中的高水平能量消耗和復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制阻礙了而不是促使該轉(zhuǎn)運(yùn)的使用。
Volschenk，H.等人(Nat.Biotechnol.15253(March1997))描述了將蘋(píng)果酸降解途徑引入到釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)中，這是通過(guò)克隆和表達(dá)編碼所述途徑的異源DNA而耗盡酒中蘋(píng)果酸水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Volschenk主要關(guān)注從周?chē)囵B(yǎng)基中去除蘋(píng)果酸，而并非任何期望的終產(chǎn)物的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
此外，有關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)涉及其中的起碼知識(shí)很難保證能實(shí)現(xiàn)期望的終產(chǎn)物或中間物的增強(qiáng)生產(chǎn)。合成裝置可能已經(jīng)飽和，因而增加的底物的存在不一定導(dǎo)致期望的終產(chǎn)物增加的生產(chǎn)。另外，增加對(duì)除作為生產(chǎn)底物用途之外還被直接或間接用作代謝物的底物的轉(zhuǎn)運(yùn)可能不導(dǎo)致期望的增加的生產(chǎn)。
僅僅增加將底物轉(zhuǎn)變?yōu)槠谕慕K產(chǎn)物的酶的表達(dá)水平可能并不導(dǎo)致利用重組微生物的化學(xué)化合物增加的生產(chǎn)。需要有一種方法，能夠利用重組微生物通過(guò)除增加細(xì)胞內(nèi)底物表達(dá)水平之外的其它方法增加化學(xué)化合物的生產(chǎn)。
也需要一種方法，能夠通過(guò)除增加細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)還原酶的表達(dá)水平之外的方式，提高利用重組微生物的生物合成途徑工業(yè)生產(chǎn)2-KLG的水平。
發(fā)明概述微生物的2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)能力可成為期望的2-KLG生產(chǎn)的一個(gè)限制因子或瓶頸，特別是由于2-KLG生產(chǎn)是在細(xì)胞溶膠中分區(qū)室的并要求2，5-DKG從其生產(chǎn)、細(xì)胞外膜結(jié)合途徑的位置進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明提供了減輕所說(shuō)的瓶頸的方法。
本發(fā)明提供了檸檬泛菌(P.citrea)PE1、PE6、YiaX2、PermA和PermB分離的核酸和氨基酸序列。檸檬泛菌PE1、PE6、YiaX2、PermA和PermB的氨基酸序列和核酸序列如

圖1A-1E SEQ ID NO1和2所示。
本發(fā)明也提供了增強(qiáng)宿主細(xì)胞自2，5-DKG生物合成2-KLG的生產(chǎn)的改進(jìn)方法。因此，提供了一種增強(qiáng)宿主細(xì)胞2-KLG生物合成的方法，該方法包含選擇一種具有將2，5-DKG轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的合成途徑的宿主細(xì)胞；在維持宿主細(xì)胞的完整性時(shí)增加該2，5-DKG向所說(shuō)的宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)；培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生產(chǎn)該2-KLG；以及生產(chǎn)2-KLG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加該2，5-DKG向所說(shuō)的宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)步驟包括將DNA轉(zhuǎn)化入該宿主細(xì)胞的步驟，其中所述DNA編碼一種或多種使該2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)到所說(shuō)的宿主細(xì)胞的細(xì)胞溶膠材料中的蛋白質(zhì)。所說(shuō)的一種或多種蛋白質(zhì)選自YiaX2、PE1、PE6、PrmA和PrmB。編碼DNA也可在選自yiaX2、pe1、pe6、prmA和prmB的基因組中表達(dá)。這一種或多種蛋白質(zhì)能夠與SEQ ID NO_雜交。該蛋白質(zhì)與SEQ IDNO或SEQ ID NO_具有至少50％或90％的一致性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)包括一個(gè)包含至少31個(gè)殘基的序列，該殘基包括與PermA的甘氨酸119相應(yīng)的甘氨酸殘基或任選的與PermA的W136相應(yīng)的色氨酸殘基或任選的選自位于與PermA的G138相應(yīng)位置的苯丙氨酸、位于與PermA的E141相應(yīng)位置的谷氨酸和位于與PermA的R142相應(yīng)位置的精氨酸的至少一個(gè)額外的殘基。
本發(fā)明也提供了增強(qiáng)2，5DKG跨過(guò)內(nèi)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞溶膠中的方法，該方法包含選擇一種宿主細(xì)胞；將編碼一種或多種使2，5DKG轉(zhuǎn)運(yùn)到該宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化入該宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌和酵母。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞選自大腸桿菌(E.coli)、泛菌屬(Pantoea)和克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)。
本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)2，5-DKG跨過(guò)內(nèi)細(xì)胞膜向細(xì)胞溶膠中的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，包括選擇一種宿主細(xì)胞和將編碼一種或多種使2，5DKG轉(zhuǎn)運(yùn)到該宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化入該宿主細(xì)胞的步驟。
附圖簡(jiǎn)述圖1表示產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(Klebsiella oxytoca)YiaX2的DNA和氨基酸序列；PE1(環(huán)境通透酶)；PE6(環(huán)境通透酶)；檸檬泛菌(Pantoea citrea)的PermA；檸檬泛菌的PermB；檸檬泛菌的YiaX2。
圖2是一個(gè)表示從葡萄糖生產(chǎn)抗壞血酸前體2-KLG的合成途徑的流程圖。
圖3是一個(gè)表示抗壞血酸前體2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)的合成途徑的示意圖。
圖4是一個(gè)表示可由葡萄糖得到2-KLG的各種合成途徑的流程圖。Boudrant，J.，Enzym Microb.Tech.，1990，12，322-329。
圖4A是一個(gè)表示D-山梨糖醇到2-KLG的合成途徑的示意圖，顯示了該途徑中反應(yīng)相對(duì)于其他反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)定位和底物跨過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。Saito，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.58(2/3)305-315(1998)。
圖5表示D-葡萄糖(G)到2，5-DKG再到2-KLG的合成途徑，顯示了該途徑中反應(yīng)相對(duì)于其他反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)定位和各自的底物跨過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。
圖6是一個(gè)比較DKG轉(zhuǎn)運(yùn)速度與KLG生產(chǎn)速率的線圖，顯示了2，5-DKG的攝入量隨時(shí)間的變化(nmoles/OD 600)(-◆-＝果糖飼料139-2a，0.0486x+0.67；-▲-＝葡萄糖飼料139-2a，y＝0.0497+0,5877；-●-＝種子燒瓶(seed flask)139-2a，y＝0.0075x+0.0569)。
圖7是一個(gè)產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌中抗壞血酸分解代謝的yia操縱子的示意圖。
圖8是一個(gè)表示由硅酮油轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定測(cè)量的產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌的2，5-DKG攝入量(nmol)圖(-◆-＝實(shí)驗(yàn)者+異丙基-β-D-硫代半乳糖苷[IPTG]；-▲-＝ΔyiaaX2+IPTG； ＝實(shí)驗(yàn)者-IPTG)圖9是一個(gè)表示對(duì)來(lái)自檸檬泛菌、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌和環(huán)境來(lái)源的通透酶的選擇設(shè)計(jì)的示意圖。
圖10是一個(gè)表示產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌菌株中2，5-DKG攝入活性的條線圖(YiaX2、pcp1、pcp10、pcp32、pK1、環(huán)境來(lái)源#1和環(huán)境來(lái)源#6)。
圖11是一個(gè)表示具有各種DKG通透酶(139-2A、139-2A+PCP32、139-2A+PCP10、139-2A+PK1、139-2A+PCP1)和在相同質(zhì)粒構(gòu)建體(pBCL 1920)中的139-2A+PE6的搖瓶的2，5-DKG攝入測(cè)定的條線圖，在28℃測(cè)量了DKG攝入速率(g/l/hr)。
圖12是一個(gè)表示由于超表達(dá)的DKG通透酶的比生產(chǎn)力增加/比9A-9B。生產(chǎn)速率(g/L/hr)的線圖(-◆-＝野生型；-x-＝WT、prmA)圖13是一個(gè)膜表面PermA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的示意圖。推定的跨膜結(jié)構(gòu)域編號(hào)為I-XI。保守殘基的位置以粗體顯示。N是氨基端，C是羧基端。推定的檸檬泛菌通透酶A(SEQ ID_)跨膜結(jié)構(gòu)域是用從http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframeO.html上可得到的工具推斷的。
圖14是一個(gè)相應(yīng)于殘基G119s到142的保守的氨基酸序列。
詳述定義轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定義細(xì)菌通道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白指那些通常為T(mén)C分類#1.A的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Saier，M.等人，1998，微生物生理學(xué)進(jìn)展(Advances inMicrobial Physiology(Poole，R.K.，d.)pp.81-136，AcademicPress，SanDiego，CA.)。(“TC”代表“Transport Council”，即一種考慮到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育方面的分類系統(tǒng)。)這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常通過(guò)一種非能量依賴性易化擴(kuò)散機(jī)制用一種跨膜孔道來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)底物、離子或其他材料。
初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白指那些通常為T(mén)C分類TC#3.A的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Saier，M.等人，1998)，即那些利用化學(xué)能完成底物的主動(dòng)攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)排出的，一般以ATP水解形式作為能量偶聯(lián)方式。
基團(tuán)轉(zhuǎn)位系統(tǒng)指TC分類為T(mén)C#4.A中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Saier，M.等人，1998)，即伴隨轉(zhuǎn)運(yùn)而磷酸化其底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這類的成員通常是細(xì)菌特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的部分，且其特征在于與磷酸烯醇丙酮酸(PEP)利用的氧化相偶聯(lián)。
次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白指那些通常為T(mén)C分類#2.A的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Saier，M.等人，1998)，即那些通常利用化學(xué)滲透能例如以質(zhì)子梯度的形式提供能量以跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)底物、離子或終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
主要易化物超家族(major facilitator superfamily，MFS)指通常為T(mén)C分類#2的次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Saier，M.等人，1998)。
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白指任何允許化學(xué)化合物跨膜轉(zhuǎn)位而從一個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室進(jìn)或出的大分子。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已知為或被稱為通透酶。雖然不限于一個(gè)特定的理論，但認(rèn)為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種與膜相互作用的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的部分從膜的外表面伸出、穿過(guò)膜且從膜的內(nèi)表面伸出。
主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)指與能量消耗例如腺苷三磷酸(ATP)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的水解偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
陰離子/陽(yáng)離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(symporter)指利用化學(xué)滲透梯度來(lái)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TC類14)。它們也指底物/H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
TMS指跨膜結(jié)構(gòu)域。
途徑定義“胞質(zhì)的”指位于內(nèi)細(xì)胞膜內(nèi)。
“外源底物”指在合成反應(yīng)的隔膜相反面發(fā)現(xiàn)的材料，例如當(dāng)?shù)孜飳⒈患?xì)胞內(nèi)合成途徑或合成途徑的細(xì)胞內(nèi)部分轉(zhuǎn)變?yōu)槠谕慕K產(chǎn)物或中間物時(shí)，指內(nèi)細(xì)胞膜外面。
“細(xì)胞外”或“內(nèi)細(xì)胞膜外面”指位于與胞質(zhì)相反的膜一側(cè)的細(xì)胞位置，包括但不局限于周質(zhì)。
“內(nèi)細(xì)胞膜”指將胞質(zhì)與周質(zhì)分隔開(kāi)的障礙物。
“膜”指對(duì)底物有內(nèi)在非通透性的脂雙層。
“細(xì)胞內(nèi)”指位于最靠近或作為細(xì)胞溶膠的膜一面的細(xì)胞部分。細(xì)胞內(nèi)也包括胞質(zhì)。
“細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)”指位于胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞材料即包含在內(nèi)細(xì)胞膜內(nèi)的材料的合成反應(yīng)或生物轉(zhuǎn)變。
“限速步驟”指2-KLG生物合成途徑的步驟，其中該步驟轉(zhuǎn)變的增加可導(dǎo)致2-KLG生產(chǎn)的增加。
“增強(qiáng)生產(chǎn)”指期望的合成反應(yīng)中間物、終產(chǎn)物或前體的增加的效價(jià)(總量)，通常以反應(yīng)過(guò)程中獲得的gm/l/hour的增加來(lái)測(cè)量。它也可指期望產(chǎn)物生產(chǎn)速度的增加，通常以g/l每單位時(shí)間的重組產(chǎn)物來(lái)測(cè)量，其中生產(chǎn)的終產(chǎn)物、中間物或前體作為DNA轉(zhuǎn)化的結(jié)果而增加，該DNA編碼至少一種在超表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在時(shí)增加底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)。
“底物”指由合成反應(yīng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)變的2，5-DKG，胞質(zhì)反應(yīng)位置與底物是由膜分隔的。
“合成反應(yīng)”指底物到中間物或終產(chǎn)物的重組生物轉(zhuǎn)變。
2，5-DKG還原酶指能夠立體選擇性地催化2，5-DKG到2-KLG的轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)。
2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白指能夠?qū)?，5-DKG跨過(guò)內(nèi)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)以由2，5-KLG還原酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的蛋白質(zhì)。
表達(dá)定義啟動(dòng)子指引導(dǎo)RNA聚合酶在適當(dāng)位點(diǎn)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄以生成信使RNA的DNA元件，該信使RNA一旦被細(xì)胞的翻譯裝置翻譯則能夠形成多肽。
“上游激活序列”是正作用性DNA結(jié)合調(diào)節(jié)物的結(jié)合位點(diǎn)。如其名字所顯示的，上游激活序列在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游且是核酸。
調(diào)節(jié)區(qū)指DNA上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的區(qū)域。這種修飾的一種機(jī)制是一些調(diào)節(jié)區(qū)充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)(也已知為阻抑物)的結(jié)合位點(diǎn)。一旦結(jié)合，阻抑物可妨礙RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄基因的能力。
表達(dá)系統(tǒng)包括一種或多種蛋白質(zhì)和/或核酸，當(dāng)它們一起作用時(shí)可以增加宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)。表達(dá)系統(tǒng)可在一種或多種質(zhì)粒中編碼，且可與編碼目的蛋白質(zhì)的基因在或不在相同的質(zhì)粒上。
短語(yǔ)“功能性連接的”或“功能性偶聯(lián)的”表示調(diào)節(jié)元件(DNA或蛋白質(zhì))為了發(fā)揮其功能而物理地相互作用。這可以是蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)的、DNA/蛋白質(zhì)的或DNA/DNA的相互作用。例如，DNA結(jié)合調(diào)節(jié)物與啟動(dòng)子相互作用，但是編碼它們的基因可位于染色體上的不同位點(diǎn)。同樣地，編碼元件的基因相互間和與編碼目的蛋白質(zhì)的基因間可位于不同的質(zhì)粒上而仍然一起發(fā)揮作用來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。
一般地，當(dāng)描述蛋白質(zhì)和編碼它們的基因時(shí)，基因的術(shù)語(yǔ)不是大寫(xiě)的而是斜體的，也就是permA。蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)通常為正常文字，且首字母大寫(xiě)，也就是PermA。
生物體定義“細(xì)菌”包括裂殖菌綱(Schizomycetes)的微生物。細(xì)菌可為革蘭氏陰性的或革蘭氏陽(yáng)性的。革蘭氏陰性細(xì)菌包括屬大腸桿菌屬(Escherichia)、嗜血桿菌屬(Hemophilus)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋桿菌屬(Acetobacter)、耶爾森氏菌屬(Yersenia)、志賀菌屬(Shigella)、弧菌屬(Vibrio)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、泛菌屬(Pantoea)和沙雷氏菌屬(Serratia)的成員。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括屬芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)的成員。
革蘭氏陰性細(xì)菌可為泛菌(pantoeans)，是泛菌屬成員的菌株。優(yōu)選的細(xì)菌是檸檬泛菌。檸檬泛菌有時(shí)也被稱為草生歐氏桿菌(Erwinia herbicola)或Acetobacter ceremius。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”或“純化的”指除去至少一種與其天然聯(lián)合的成分的核酸或氨基酸。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是用包括編碼表達(dá)系統(tǒng)的核酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用包括編碼一種或多種增加底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。宿主細(xì)胞是本發(fā)明的質(zhì)粒能夠通過(guò)如轉(zhuǎn)化而被插入的細(xì)胞。宿主細(xì)胞優(yōu)選地為細(xì)菌，更優(yōu)選地為泛菌屬、大腸桿菌屬、克雷伯氏桿菌屬或芽孢桿菌屬。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果包括了調(diào)節(jié)元件，那么這樣的表達(dá)系統(tǒng)的元件來(lái)自大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞優(yōu)選地為革蘭氏陰性細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是泛菌屬。相同的宿主細(xì)胞可用另外一個(gè)包括編碼一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為編碼的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，更優(yōu)選地為陰離子/陽(yáng)離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?？勺鳛榉独霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括那些檸檬泛菌或產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌和異源來(lái)源的yiaX2、permA、permB、pe6、pe1編碼或表達(dá)的蛋白。
本發(fā)明提供了增強(qiáng)宿主細(xì)胞2-KLG的生物合成生產(chǎn)的新方法，這是通過(guò)增加2，5-DKG的轉(zhuǎn)運(yùn)以改進(jìn)目的終產(chǎn)物的合成途徑和生產(chǎn)的瓶頸而實(shí)現(xiàn)的，特別是當(dāng)將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白重組地引入宿主細(xì)胞并超表達(dá)時(shí)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是用包括編碼表達(dá)系統(tǒng)的核酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞是本發(fā)明的質(zhì)粒能夠通過(guò)如轉(zhuǎn)化而被插入的細(xì)胞。宿主細(xì)胞優(yōu)選地為細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞優(yōu)選地為革蘭氏陰性細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是泛菌(pantoen)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是檸檬泛菌，且如果包括了調(diào)節(jié)元件，則這樣的表達(dá)系統(tǒng)的元件來(lái)自泛菌屬。相同的宿主細(xì)胞可用另外一個(gè)包括編碼一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為來(lái)自檸檬泛菌的yiaX2、permA、permB、pe6、pe1編碼和表達(dá)的。
合成反應(yīng)本發(fā)明提供了增加的2，5-DKG跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以增強(qiáng)2，5-DKG自2-KLG的生產(chǎn)。增加的轉(zhuǎn)運(yùn)提供了2，5-DKG跨過(guò)將2，5-DKG與還原反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)位置分隔的膜的轉(zhuǎn)位(圖2和3)。
本發(fā)明與抗壞血酸中間物合成一起是特別有用的，例如2，5-DKG向2-KLG的轉(zhuǎn)變；山梨糖或山梨糖醇經(jīng)山梨糖酮(sorbosone)向2-KLG的轉(zhuǎn)變；5-酮-D-葡糖酸(5-KDG)到L-艾杜糖酸的還原；以及5-酮-D-葡糖酸到L-葡糖酸的還原。這些途徑的每一個(gè)特征都在于合成途徑的一部分即合成反應(yīng)位于胞質(zhì)內(nèi)，例如，2，5-DKG被2，5DKG還原酶的還原；L-山梨糖酮被山梨糖酮脫氫酶向2-KLG的還原；5-酮-D-葡糖酸(5-KDG)被5-KDG脫氫酶向L-艾杜糖酸的還原；以及5-酮-D-葡糖酸被5-KDG還原酶向L-葡糖酸的還原。這些途徑特征也在于必須跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)底物如2，5-DKG、L-山梨糖酮等以被位于胞質(zhì)內(nèi)的合成反應(yīng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)變。
底物是通常在沒(méi)有一些主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制時(shí)不能有效地通過(guò)膜的物質(zhì)。優(yōu)選地，這些底物包括但不局限于抗壞血酸中間物(2，5-DKG、山梨糖酮)。另外，底物是一種在工業(yè)規(guī)模上轉(zhuǎn)運(yùn)以用作合成用途而通常不被宿主細(xì)胞用作代謝用途的物質(zhì)。工業(yè)規(guī)模指效價(jià)和容量的生產(chǎn)力大于1gm/升/小時(shí)，優(yōu)選地大于2g/l/h，更優(yōu)選地大于3g/l/h，并且更加優(yōu)選地大于5g/l/h。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)力效價(jià)在2到14gm/l/小時(shí)之間，優(yōu)選地為3到12g/l/h之間，更加優(yōu)選地為5到10g/l/h之間，為一個(gè)經(jīng)濟(jì)上可行的工業(yè)生產(chǎn)方法。尤其優(yōu)選地底物包括2，5-DKG和山梨糖酮。本發(fā)明的發(fā)明方面在這些實(shí)施方案中尤其有用。
在本發(fā)明的實(shí)踐中尤其有用的一個(gè)反應(yīng)是2，5-DKG的跨內(nèi)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)以被胞質(zhì)內(nèi)脫氫酶2，5-DKG還原酶將其進(jìn)行胞質(zhì)還原而生成2-KLG。(Boudrant，J.(1990)Enzyme Microb.Technol.1990322-329)。2，5-DKG是由2-酮-D-葡糖酸(2-KDG)被膜結(jié)合的2-酮葡糖酸脫氫酶轉(zhuǎn)變而來(lái)的。2-KDG是從葡萄糖經(jīng)過(guò)D-葡糖酸(GA)的氧化作用轉(zhuǎn)變而來(lái)的。發(fā)明者認(rèn)識(shí)到2，5-DKG跨內(nèi)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)還原為2-KLG的位點(diǎn)可通過(guò)DNA編碼的2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的實(shí)踐中的尤其有用的另一個(gè)反應(yīng)是山梨糖酮即經(jīng)由山梨糖、山梨糖醇生產(chǎn)2-KLG的一個(gè)中間物的轉(zhuǎn)運(yùn)(Saito，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.58(2/3)309-315(19987))。從山梨糖醇和/或山梨糖向山梨糖酮的轉(zhuǎn)變是由山梨糖醇或山梨糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的途徑中的一個(gè)步驟(Boudrant，J.，1990；Saito(1997))。下面是對(duì)根據(jù)本發(fā)明的山梨糖酮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白工程化的討論。
如Saito所描述的，D-山梨糖到2-KLG的途徑包括L-山梨糖脫氫酶(SDH)將L-山梨糖氧化為L(zhǎng)-山梨糖酮，隨后是L-山梨糖酮脫氫酶將L-山梨糖酮氧化2KLG。已描述了一個(gè)由膜結(jié)合的脫氫酶將D-山梨糖醇轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-山梨糖酮的重組宿主細(xì)胞(Saito，Y.等人(1997))。然后L-山梨糖酮被從細(xì)胞周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以被胞質(zhì)內(nèi)的L-山梨糖酮脫氫酶還原。已認(rèn)識(shí)到將山梨糖酮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超表達(dá)而促進(jìn)將山梨糖酮中間物轉(zhuǎn)運(yùn)到2-KLG轉(zhuǎn)化途徑中具有有利作用。
D-葡萄糖到2-KLG的一個(gè)可選擇的途徑包括將D-葡糖酸氧化為5-酮-D-葡糖酸(5KDG)，后者再被還原為L(zhǎng)-艾杜糖酸(IA)或L-葡糖酸以氧化為2KLG。(Boudrant，J.，(1990))。也可通過(guò)5KDG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的超表達(dá)促進(jìn)5-酮-D-葡糖酸到細(xì)胞溶膠的轉(zhuǎn)運(yùn)，以便由酮還原酶還原。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，合成反應(yīng)可為胞質(zhì)外的或相對(duì)于底物位于膜的外面。第一個(gè)反應(yīng)的終產(chǎn)物可為中間底物，用于位于膜的相反面的第二個(gè)反應(yīng)中。例如，在來(lái)自Japanese persimmon的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)T-100(FERM BP-4188)中自D-山梨糖醇合成2-KLG時(shí)，D-山梨糖醇被胞質(zhì)內(nèi)L-山梨糖醇脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-山梨糖可產(chǎn)生一種中間物，該中間物跨過(guò)細(xì)胞膜被轉(zhuǎn)運(yùn)出胞質(zhì)，以被膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-山梨糖酮。因而，發(fā)明者預(yù)期可增加將胞質(zhì)中間物即一種底物從內(nèi)膜的胞質(zhì)側(cè)跨膜到膜外的轉(zhuǎn)運(yùn)以進(jìn)行隨后的轉(zhuǎn)變。Saito，Y.，(1997)雖然一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括位于單一的生物體里的合成反應(yīng)或途徑，但位于不同的生物體內(nèi)的不同反應(yīng)也是本發(fā)明者所預(yù)期的。例如，在從葡萄糖生產(chǎn)2-KLG的混合的培養(yǎng)系統(tǒng)中，葡萄糖到中間物2，5-DKG的轉(zhuǎn)變可發(fā)生在一種生物體中(醋單孢桿菌屬(Acetomonas)、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、歐氏桿菌屬)，而該中間物向目的抗壞血酸中間物2-KLG的轉(zhuǎn)變發(fā)生在第二個(gè)生物體中(短桿菌屬(Brevibacterium)或棒狀桿菌屬(Corynebacterium))。參見(jiàn)授予Sonoyama(1976)的美國(guó)專利第3,963,574號(hào)。也參見(jiàn)Hoshino，美國(guó)專利第5,312,741號(hào)。
因此，合成反應(yīng)可生成一種自身可在由細(xì)胞膜分隔的另一個(gè)細(xì)胞位置被轉(zhuǎn)變的中間物。在這個(gè)實(shí)施方案中，終產(chǎn)物可為隨后的反應(yīng)的中間底物。
確定限速步驟的方法在生產(chǎn)2-KLG中增加2，5-DKG跨過(guò)內(nèi)細(xì)胞膜到胞質(zhì)細(xì)胞位置的轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)原因是因?yàn)楸景l(fā)明者認(rèn)識(shí)到它是2，5DKG向2-KLG轉(zhuǎn)變的限速步驟。確定這樣一個(gè)步驟是否限速步驟是通過(guò)分析該途徑、估定每一步驟的生產(chǎn)以及改變可被該途徑用于轉(zhuǎn)變的2，5-DKG的量以確定是否這種增加2，5-DKG可導(dǎo)致該途徑總產(chǎn)量的增加來(lái)完成的。在確定了2，5-DKG的增加可增強(qiáng)2-KLG的生產(chǎn)時(shí)，增加底物的轉(zhuǎn)運(yùn)將增強(qiáng)2-KLG的生產(chǎn)。
限速步驟的確定可通過(guò)比較微生物的生產(chǎn)力來(lái)進(jìn)行。確定途徑部分的限速狀態(tài)的一個(gè)方法是在該途徑的各個(gè)點(diǎn)比較增加了一種特殊化學(xué)化合物的存在之前或之后中間物的生產(chǎn)力。通過(guò)編碼2，5-DKG還原酶的DNA的超表達(dá)增加還原酶的存在并不導(dǎo)致2-KLG生產(chǎn)的增加。圖_。然而，增加在細(xì)胞溶膠存在的2，5-DKG的量導(dǎo)致了2-KLG生產(chǎn)的增加。因而本發(fā)明者認(rèn)識(shí)到增加2，5-DKG的量是2-KLG生產(chǎn)中的一個(gè)限速步驟。
確定途徑部分的限速狀態(tài)的一個(gè)方法是在途徑的各個(gè)點(diǎn)比較增加了一種特殊的生物轉(zhuǎn)化物的存在之前或之后中間物的生產(chǎn)力。如果盡管增加了中間物或超表達(dá)了轉(zhuǎn)變途徑，而終產(chǎn)物的生產(chǎn)并沒(méi)有增加，那么該步驟不是限速性的，因而影響該合成反應(yīng)的具體酶的超表達(dá)可能不導(dǎo)致生產(chǎn)增加。個(gè)別中間物的量可由各種直接或間接方法確定。間接方法包括用線內(nèi)(in-line)測(cè)量法如氣體分壓來(lái)測(cè)量呼吸參量的消耗或產(chǎn)生，如二氧化碳生產(chǎn)、氧氣消耗。中間物的直接測(cè)量可通過(guò)各種本領(lǐng)域公知的分析技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，它們描述于Lazarus，Analyt.Biochem 157，360-366(1986)及其中引用的參考文獻(xiàn)描述(在此處引用作為參考)，包括但不局限于紙、氣相、液相和薄層層析以及化學(xué)和酶促測(cè)定。高效液相層析方法學(xué)，尤其如Lazarus，1986提出的，是尤其有用的。本發(fā)明者所使用的一種方法包括Waters 2690 HPLC和Waters 410差示折光計(jì)(differentialrefractermeter)，設(shè)置用流速為1ml/分的50mM乙酸鹽緩沖液作為洗脫介質(zhì)和Dyonex lonpac AS-10離子交換柱(4×250mm)來(lái)分離并確定存在的化學(xué)化合物的量。
由本發(fā)明者使用的另一種確定在肉湯中生產(chǎn)的2-klg的純度的方法是通過(guò)總碳分析的。
因而在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)的活性可通過(guò)測(cè)量在細(xì)胞外底物存在時(shí)產(chǎn)物的生產(chǎn)而在底物可被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的任何細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)量。例如，在天然地或重組地表達(dá)2，5-DKG還原酶的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)2，5-DKG被轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG。當(dāng)提供細(xì)胞外2，5-DKG時(shí)，在有2，5-DKG通透酶的表達(dá)時(shí)細(xì)菌細(xì)胞生產(chǎn)2-KLG的能力是表達(dá)的通透酶將2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的能力的量度標(biāo)準(zhǔn)，因而也是其2，5-DKG通透酶活性的量度標(biāo)準(zhǔn)。例如，細(xì)胞內(nèi)2-KLG可用HPLC或本領(lǐng)域公知的其他靈敏檢測(cè)方法檢測(cè)。2，5-DKG的其他代謝產(chǎn)物也可經(jīng)類似的方法檢測(cè)。
2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基于轉(zhuǎn)運(yùn)模式和能量偶聯(lián)機(jī)制，有四種不同類型的功能性特征化的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。第一種是細(xì)菌通道蛋白質(zhì)(TC#1.A)，其通過(guò)一種能量非依賴性易化擴(kuò)散機(jī)制利用跨膜孔道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。第二種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)即易化物(faciliators)和/或次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(secondarytransporter)(第二類，TC#2.A)代表了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的最大種類。第三類ATP驅(qū)動(dòng)的初級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用ATP水解作為溶質(zhì)主動(dòng)攝入和/或排出的能量偶聯(lián)模式。最后一類由在轉(zhuǎn)運(yùn)中使其底物磷酸化的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成(TC#4.A)。
在第二個(gè)家族中，類型II家族中最大的是主要易化物超家族(MFS)和氨基酸多胺膽堿(amino acid polyamine choline，APC)家族(Reizer等人)。這些第二轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族可進(jìn)一步分為三類(1)質(zhì)子動(dòng)力(proton motive form，pmf)驅(qū)動(dòng)的，(2)鈉動(dòng)力(sodium motive force，smf)驅(qū)動(dòng)的，和(3)其他離子或溶質(zhì)驅(qū)動(dòng)的交換劑。這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)催化溶質(zhì)的單向轉(zhuǎn)運(yùn)、反向轉(zhuǎn)運(yùn)和/或同向轉(zhuǎn)運(yùn)。次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已在大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、生殖道枝原體(M.genitalium)、集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)、詹氏甲烷球菌(M.Jannaschii)中鑒定(Paulsen等人1998 J.Mol.Biol.277573-592)。這個(gè)種類的所有成員均為細(xì)菌特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferasesystem，PTS)的部分。次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一般是多中心(polytopic)膜蛋白質(zhì)，通常大多數(shù)初級(jí)載體有12TMS，即一種驅(qū)動(dòng)基團(tuán)轉(zhuǎn)位的能量的化學(xué)形式，是ATP-依賴性系統(tǒng)，如同大多數(shù)ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族成員一樣，或是用PEP作為糖類攝入和磷酸化的磷酰基供體的PTS。次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)區(qū)別在初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用ATP，利用細(xì)胞的能量。另外，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的使用需要一種更加復(fù)雜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，即包含兩個(gè)疏水的膜內(nèi)在結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)ATP-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Hosie等人Molecul.Microbiol(2001)40(6)，1449-1459)。那些負(fù)責(zé)溶質(zhì)攝入的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也需要溶質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)(solute-bindingprotein，SBP)的存在。因而改進(jìn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因工程需要比次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白性質(zhì)更復(fù)雜的表達(dá)和轉(zhuǎn)化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼至少一種可增加底物跨內(nèi)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)的DNA選自醋桿菌屬、假單胞桿菌屬、桿菌屬(Bacterium)、藍(lán)球菌屬(Cyanococcus)、微球菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、醋單孢菌屬、葡糖桿菌屬和歐氏桿菌屬。優(yōu)選的生物體選自大腸桿菌、泛菌屬和克雷伯氏桿菌屬。泛菌屬是用作宿主細(xì)胞的最優(yōu)選的生物體。
尤其有用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括那些由yiaX2(來(lái)自產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌屬)、pe1和pe6(來(lái)自環(huán)境來(lái)源)以及來(lái)自檸檬泛菌的yiaX2、permA和permB。yiaX2、permA和permB基因可被發(fā)現(xiàn)于各種細(xì)菌中，如歐氏桿菌屬、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、大腸桿菌、Agrobactor、耶爾森氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞桿菌屬、芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。物種包括如鼠疫耶爾森氏菌(Yersenia pestis)、假結(jié)核耶爾森氏菌(Yerseniapseudotuberculosis)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)、銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)。
本發(fā)明提供了可被用作編碼所述至少一種可增加底物在宿主細(xì)胞中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的酶的DNA的YiaX2多核苷酸、PermA多核苷酸、PermB多核苷酸、Pe1多核苷酸和Pe6多核苷酸。YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的多核苷酸序列可由圖13和14確定，該圖表示檸檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6與克雷伯氏桿菌屬YiaX2氨基酸的序列對(duì)比。
本發(fā)明包含分別編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物，由一種或多種與檸檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6分別具有至少65％、70％、80％或至少90％或至少95％的一致性的核苷酸序列編碼，只要該同系物編碼一種能夠通過(guò)調(diào)節(jié)微生物中底物的轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)即可，優(yōu)選地為增加轉(zhuǎn)運(yùn)。如可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多種多核苷酸即YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸變體可編碼檸檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本發(fā)明包含所有這樣的多核苷酸。
檸檬泛菌、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌和環(huán)境分離物YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的微生物多核苷酸同系物可通過(guò)基因組或cDNA來(lái)源的微生物核酸的核酸雜交來(lái)鑒定。多核苷酸同系物的序列可由利用編碼所述至少一種將2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì)材料中的多核苷酸的探針、部分或片段的DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物的方法，包括使核酸樣品與來(lái)自YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核酸序列的部分或全部進(jìn)行雜交。
也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是能夠在中等到最大的嚴(yán)格性的條件下與圖1所示YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核苷酸序列的部分或整體雜交的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸序列。雜交條件是基于核酸結(jié)合復(fù)合物的解鏈溫度(Tm)的，如Berger和Kimmel(1987，分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法(Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)，Vol152，Academic Press，San DiegoCALIF。)所講授的，此處引用作為參考，并且雜交條件確定了如下所解釋的定義的“嚴(yán)格性”。
“最大嚴(yán)格性”一般發(fā)生在約Tm-5℃(比探針的Tm低5℃)；“高嚴(yán)格性”約為比Tm低5℃到10℃；“中間嚴(yán)格性”約為比Tm低10℃到20℃以及“低嚴(yán)格性”約為比Tm低20℃到25℃。如可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，最大嚴(yán)格性雜交可被用于鑒定或檢測(cè)相同的核苷酸序列，而中等的或低嚴(yán)格性的雜交可被用于鑒定或檢測(cè)多核苷酸序列同系物。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“雜交”應(yīng)包括“核酸的一條鏈通過(guò)堿基配對(duì)而與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過(guò)程”(Coombs J(1994)生物技術(shù)詞典(Dictionary of Biotechnology)，Stockton Press，New York N.Y.)。
如在聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)中進(jìn)行的擴(kuò)增的方法由Dieffenbach CW和G S Dveksler描述(1995，PCR引物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(PCRPrimer，a Laboratory Mannul)，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.)。來(lái)自圖1A-1E的PermA核苷酸序列的至少約10個(gè)核苷酸和多達(dá)60個(gè)核苷酸，優(yōu)選地約12到30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為20-25個(gè)核苷酸的核酸序列可被用作探針或PCR引物。
氨基酸序列如圖1所示的檸檬泛菌PermA多核苷酸編碼檸檬泛菌PermA。檸檬泛菌permA基因確定了一種436個(gè)殘基且計(jì)算分子量為47801.94道爾頓的蛋白質(zhì)。平均的親水性為0.62，等電點(diǎn)為9.24。permA蛋白質(zhì)是具有11個(gè)推定的跨膜螺旋的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。這些結(jié)構(gòu)域與來(lái)自其他生物體的其他已知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯示了顯著的序列相似性，發(fā)現(xiàn)與來(lái)自假單胞桿菌屬的KDG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間有最高的相似性。如圖8B所示的31個(gè)殘基的一段顯示了高度保守的片段，其中檸檬泛菌permA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白第119位為甘氨酸(G)、第122位為谷氨酸(E)、第127位為苯丙氨酸(P)、第136位為色氨酸(W)、第138位為苯丙氨酸、第141位為谷氨酸(E)、第142位為精氨酸(R)。這個(gè)高度保守的片段與上表3和4的陰離子/陽(yáng)離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ACS)家族(Pao，S.S.，1998)的保守殘基一致。圖8顯示了對(duì)應(yīng)于PermA的殘基119到141的保守區(qū)。推定的跨膜結(jié)構(gòu)域(I-XI)以灰色陰影顯示。圖8B的跨膜結(jié)構(gòu)域是由SOUCI程序確定的。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括那些由來(lái)自檸檬泛菌、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌和環(huán)境來(lái)源的yiaX2、permA、pe1、pe6和permB所編碼的。yiaX2、permA、pe1、pe6和permB基因可發(fā)現(xiàn)于多種細(xì)菌物種，例如歐氏桿菌屬、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、大腸桿菌、Agrobacter、耶爾森氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞桿菌屬、芽孢桿菌屬。
本發(fā)明提供了YiaX2多核苷酸、PermA多核苷酸、PE1多核苷酸、PE6多核苷酸和PermB多核苷酸，它們可被用作在宿主細(xì)胞中編碼所述至少一種可增加2，5-DKG跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)的DNA。YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的多核苷酸序列可由圖確定，后者顯示了檸檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6與克雷伯氏桿菌屬YiaX2的氨基酸序列對(duì)比。
本發(fā)明包含分別編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物，它們由一種或多種與檸檬泛菌YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6分別具有至少65％、70％、80％或至少90％或至少95％一致性的核苷酸序列編碼，只要該同系物編碼一種能夠通過(guò)調(diào)節(jié)底物在微生物中的轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)即可。如可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多種多核苷酸即YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸變體可編碼檸檬泛菌的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6因子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本發(fā)明包含所有這樣的多核苷酸。
檸檬泛菌、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌和環(huán)境分離物YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的微生物多核苷酸同系物可通過(guò)基因組或cDNA來(lái)源的微生物核酸的核酸雜交來(lái)鑒定。多核苷酸同系物的序列可利用在圖中公開(kāi)的探針、部分或片段由DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸同系物的方法，包括使核酸樣品與來(lái)自YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核酸序列的全部或部分進(jìn)行雜交。
也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是能夠在中等到最大嚴(yán)格性的條件下與圖1的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6的核苷酸序列的部分或整體雜交的YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸序列。雜交條件是基于核酸結(jié)合復(fù)合物的解鏈溫度(Tm)的，如Berger和Kimmel所講授的(1987，分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法(Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)，Vol152，Academic Press，San DiegoCALIF。)，此處引用作為參考，并且雜交條件確定了如下所解釋的定義的“嚴(yán)格性”。
“最大嚴(yán)格性”一般發(fā)生在約Tm-5℃(比探針的Tm低5℃)；“高嚴(yán)格性”約為比Tm低5℃到10℃；“中間嚴(yán)格性”約為比Tm低10℃到20℃以及“低嚴(yán)格性”約為比Tm低20℃到25℃。如可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，最大嚴(yán)格性雜交可被用于鑒定或檢測(cè)相同的核苷酸序列，而中等的或低嚴(yán)格性的雜交可被用于鑒定或檢測(cè)多核苷酸序列同系物。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“雜交”應(yīng)包括“核酸的一條鏈通過(guò)堿基配對(duì)而與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過(guò)程”(Coombs J(1994)生物技術(shù)詞典(Dictionary Biotechnology)，Stockton Press，New York N.Y.)。
如在聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)中進(jìn)行的擴(kuò)增的方法由Dieffenbach CW和G S Dveksler描述(1995，PCR引物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(PCRPrimer，a Laboratory Mannul)，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.)。來(lái)自圖1的PermA核苷酸序列的至少約10個(gè)核苷酸和多達(dá)60個(gè)核苷酸，優(yōu)選地約12到30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為20-25個(gè)核苷酸的核酸序列可被用作探針或PCR引物。
II.表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明提供了在微生物包括細(xì)菌和酵母中增強(qiáng)目的異源或同源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)的表達(dá)系統(tǒng)。
a.編碼序列在本發(fā)明中，載體包含至少一個(gè)拷貝的編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，優(yōu)選地包含多拷貝。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物是泛菌屬。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物是克雷伯氏桿菌屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用包含permA基因的多核苷酸來(lái)構(gòu)建載體。這些多核苷酸區(qū)段可包含比permA更多量的殘基。例如，pcp1、pcp10和pcp32是檸檬泛菌基因組操縱子或結(jié)構(gòu)域的核苷酸片段。這些多核苷酸區(qū)段分別為約9kb、13kb和67kb。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼檸檬泛菌PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6的多核苷酸，或者其片段，或者融合蛋白質(zhì)或編碼PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6的氨基酸變體的多核苷酸同系物序列可被用來(lái)生成重組DNA，從而在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中分別指導(dǎo)PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6或者其氨基酸變體的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自醋桿菌屬、假單胞桿菌屬、桿菌屬(Bacterium)、藍(lán)球菌屬(Cyanococcus)、微球菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、醋單孢菌屬和葡糖桿菌屬。優(yōu)選的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、泛菌屬和克雷伯氏桿菌屬。檸檬泛菌和克雷伯氏桿菌屬是用作宿主細(xì)胞的最優(yōu)選的生物體。泛菌屬也已知為歐氏桿菌屬。
如可被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，生產(chǎn)具有非天然存在的密碼子的多核苷酸序列是有利的。例如，可選擇由特殊宿主細(xì)胞所偏好的密碼子(Murry E等人(1989)Nuc Acids Res 17477-508)以增加表達(dá)的速率或生產(chǎn)具有想要的性質(zhì)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物，例如比從天然存在的序列生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄物更長(zhǎng)的半衰期。
可依照本發(fā)明而被使用的改變的PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸序列包括不同核苷酸殘基的缺失、插入或替代，導(dǎo)致分別編碼相同或功能上相當(dāng)?shù)腜ermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6同系物的多核苷酸。如在此處所用的，“缺失”定義為核苷酸或氨基酸序列的改變，其中不存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。
如在此處所用的，“插入”或“添加”是與天然存在的革蘭氏陽(yáng)性PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6相比，分別導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的添加的核苷酸或氨基酸序列的改變。
如在此處所用的，“替代”分別由不同的核苷酸或氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸而產(chǎn)生。
編碼的蛋白質(zhì)也可顯示產(chǎn)生沉默改變的氨基酸殘基的缺失、插入或替代，導(dǎo)致功能上相當(dāng)?shù)母锾m氏陽(yáng)性PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6變體。細(xì)致的氨基酸替代是在殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)方面的相似性的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，只要變體保留了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)、優(yōu)選地為增加轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的極性頭部基團(tuán)和相似的親水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本發(fā)明的PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸可被操作以修飾基因產(chǎn)物的克隆、加工和/或表達(dá)。例如，可用本領(lǐng)域公知的技術(shù)引入突變，如用定點(diǎn)誘變插入新的限制酶切位點(diǎn)來(lái)改變密碼子的偏好性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可將PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸連接到異源的序列上以編碼融合蛋白質(zhì)。也可操作融合蛋白以便在PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6多核苷酸序列和異源蛋白質(zhì)序列之間包含切割位點(diǎn)，從而PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6蛋白質(zhì)可從異源部分上切割下來(lái)并純化。
b.載體序列用于在微生物中表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)載體包含至少一種與選自PermA、YiaX2、PermB、PE1和/或PE6的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白因子相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中是有功能的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是所選擇的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的野生型啟動(dòng)子，而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而言是異源的，但在宿主中仍然是有功能的。
與編碼目的蛋白質(zhì)或多肽的異源核酸相關(guān)聯(lián)的額外的啟動(dòng)子可通過(guò)重組DNA技術(shù)而被引入。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞能夠過(guò)表達(dá)異源的蛋白質(zhì)或多肽，并重組地引入編碼一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼至少一種或多種增加底物轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)的核酸可穩(wěn)定地整合入微生物基因組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞被加工成過(guò)表達(dá)編碼一種或多種增加所說(shuō)的底物轉(zhuǎn)運(yùn)入該宿主細(xì)胞的本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，且編碼異源蛋白質(zhì)或多肽的核酸是通過(guò)重組技術(shù)引入的。本發(fā)明包含能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超表達(dá)的宿主細(xì)胞，包括但不局限于那些在表1、2或3中鑒定的或本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的或?qū)?lái)鑒定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含多克隆位點(diǎn)盒，該盒優(yōu)選地包含至少一個(gè)對(duì)載體是唯一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以使得對(duì)核酸的操作容易。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體也包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記。如在此處所用的，術(shù)語(yǔ)選擇性標(biāo)記指能夠在革蘭氏陽(yáng)性宿主中表達(dá)、從而便于對(duì)那些含有載體的宿主進(jìn)行選擇的基因。這樣的選擇性標(biāo)記的實(shí)施例包括但不局限于抗生素如紅霉素、壯觀霉素(aspectinomycin)、氯霉素和四環(huán)素。也提供了其中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由與SEQ ID NOS[_________]所示的DNA序列有至少90％的同源性的核酸編碼的實(shí)施方案。優(yōu)選地，同源性為至少95％，更優(yōu)選地為至少98％。同源性可以通過(guò)將請(qǐng)求保護(hù)的氨基酸或DNA序列與另一個(gè)序列排列起來(lái)并以總序列的百分比確定有多少氨基酸或核苷酸相匹配而確定。同源性也可用商業(yè)上可獲得的序列分析軟件程序之一來(lái)確定，例如序列分析軟件包6.0版(Sequence Analysis Software PackageVersion 6.0)中的TFastA Data Searching Program(GeneticComputer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，Madison，Wis.53705)。
可以利用如在此處所描述的雜交或利用簡(jiǎn)并引物的PCR來(lái)篩選同源序列。Chen和Suttle(1995)Biotechniques 18(4)609-610，612。
在本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案中，也提供了可在嚴(yán)格的條件下分別與FIGS.和SEQ ID NOS所示的DNA或其片段雜交的核酸。嚴(yán)格的雜交條件包括本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的嚴(yán)格的雜交和洗滌條件。雜交和適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件描述于Sambrook等人1989《分子克隆》(Molecular Cloning)2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York。
從具有編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化DNA的宿主細(xì)胞中增加重組肽生產(chǎn)的方法增加底物從一個(gè)細(xì)胞位置到另一個(gè)的轉(zhuǎn)運(yùn)的特別有力的方法涉及從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞基因組中缺失代謝轉(zhuǎn)移(metabolicdiversions)及伴隨提供可增加想要的底物的轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA。這可通過(guò)向細(xì)胞提供缺失-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白嵌合體或融合蛋白質(zhì)而方便地實(shí)現(xiàn)，其中缺失部分的代謝轉(zhuǎn)移被最小化，而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能力部分是超表達(dá)的?；瘜W(xué)地融合的多肽或基因組的改組部分是可能發(fā)生的，但是重組蛋白質(zhì)自然地是如此方式使用時(shí)最優(yōu)選的。用于這樣的嵌合體的適當(dāng)通透酶片段的鑒定已在上面此處描述。
至于這些融合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)部分，任何含有足夠的一級(jí)序列信息以賦予嵌合體以轉(zhuǎn)運(yùn)活性的通透酶衍生序列在這種情況中都是有用的。然而，經(jīng)常優(yōu)選地使用整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶，因?yàn)檫@在方法學(xué)方面是更直接的。此外，可參看在各種發(fā)表的參考書(shū)目中提供的大量的信息以助于鑒定適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其片段。
轉(zhuǎn)化本發(fā)明也涵蓋增大或增加細(xì)胞生產(chǎn)生物活性多肽的能力，這樣的多肽可增加底物從第一個(gè)細(xì)胞位置跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到第二個(gè)細(xì)胞位置。在一些情況，這可通過(guò)使與底物向另一個(gè)細(xì)胞位置轉(zhuǎn)運(yùn)以進(jìn)行進(jìn)一步生物轉(zhuǎn)變有關(guān)的蛋白質(zhì)超表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，例如次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白陰離子/陽(yáng)離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Saier，1988)，在一個(gè)實(shí)施方案中為陰離子/陽(yáng)離子H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本發(fā)明者預(yù)期的示例性同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括來(lái)自產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌和檸檬泛菌的通透酶YiaX2、PE1、PE6、prmA和prmB。
與維持宿主細(xì)胞的生存力和生產(chǎn)能力尤其是轉(zhuǎn)運(yùn)能力有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)是重要的。在所述途徑是需要NADPH或NADH的反應(yīng)的情況下，宿主細(xì)胞持續(xù)的生存力是由想要的途徑進(jìn)行成功的連續(xù)生產(chǎn)所必要的。在確定維持生物體的生存力同時(shí)可被超表達(dá)的多拷貝數(shù)或啟動(dòng)子時(shí)應(yīng)牢記某些需要考慮的事項(xiàng)和因子。通常，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞是有害的，這是因?yàn)樵谀ぶ袚饺朕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的可用空間是有限的。因此，一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的非常過(guò)度的超生產(chǎn)可減少與其他養(yǎng)分從培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膜中的摻入。加工細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)可增加或穩(wěn)定工程改造的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白性能。
細(xì)菌宿主細(xì)胞中H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的穩(wěn)定超表達(dá)適用于幾個(gè)目的。它可在維持微生物的生存力時(shí)增加轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的超表達(dá)比ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的超表達(dá)更簡(jiǎn)單，這是因?yàn)橥蜣D(zhuǎn)運(yùn)蛋白不需要ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多重成分的大量編碼。第三，通過(guò)使次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而不是ATP或PTS偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)超表達(dá)，可使宿主細(xì)胞的能量需求的轉(zhuǎn)移最小化。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸是通過(guò)能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的表達(dá)載體而引入宿主細(xì)胞的。泛菌屬的適當(dāng)?shù)膹?fù)制型質(zhì)粒描述于Sambrook等人1989《分子克隆》(Molecular Cloning)2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，在此特別地引入作為參考，這是基于泛菌屬能維持與大腸桿菌相同質(zhì)粒的復(fù)制的事實(shí)的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸被穩(wěn)定地整合到微生物基因組中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞來(lái)自泛菌屬。另一個(gè)優(yōu)選的宿主細(xì)胞是產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了幾個(gè)將DNA整合到基因組中的策略(參見(jiàn)如Balbas等人，1996，Gene 17265-69；LeBorge等人，1998，Gene 223213-219)。
檸檬泛菌的轉(zhuǎn)化可采用對(duì)于大腸桿菌發(fā)展的規(guī)程由電穿孔方法來(lái)實(shí)現(xiàn)(Potter，H.，1988，Anal.Biochem.174361-373)。
III.轉(zhuǎn)化體的鑒定將DNA引入到宿主中后，轉(zhuǎn)化體是通過(guò)在載體中編碼的抗生素抗性或通常通過(guò)選擇在質(zhì)粒中編碼的功能來(lái)選擇的。一旦轉(zhuǎn)化體已經(jīng)被與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，則可用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來(lái)證實(shí)具有完整結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒的存在(Sambrook等人，1989)。
YiaX2、PermA、PermB、PE1和PE6多核苷酸序列的存在可通過(guò)利用在圖1中公開(kāi)的多核苷酸序列的探針、部分或片段進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)。
IV.轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定利用HPLC方法學(xué)來(lái)確定抗壞血酸中間物水平的優(yōu)選方法已在上面描述。
另外，許多種標(biāo)記和綴合技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的并可被用于各種核酸和氨基酸測(cè)定。生產(chǎn)經(jīng)標(biāo)記的雜交或PCR探針用于檢測(cè)特定的多核苷酸序列的方法包括寡標(biāo)記(oligolabeling)、切口平移、末端標(biāo)記或用標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。或者，可將核苷酸序列或其任何部分克隆入載體以生產(chǎn)mRNA探針。這樣的載體是本領(lǐng)域所公知的，在商業(yè)上可得到，且可以通過(guò)添加適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶如T7、T3或SP6和標(biāo)記的核苷酸而在體外用于合成RNA探針。
許多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)、Promega(Madison Wis.)和US Biochemical Corp(ClevelandOhio)供應(yīng)用于這些程序的商業(yè)試劑盒和規(guī)程。適當(dāng)?shù)膱?bào)告分子或標(biāo)記包括那些放射性核素、酶、熒光的、化學(xué)發(fā)光的或產(chǎn)色的試劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。講授這樣的標(biāo)記的使用的專利包括美國(guó)專利號(hào)3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。同樣，重組免疫球蛋白可如美國(guó)專利號(hào)4,816,567所示而生產(chǎn)，在此處引入作為參考。同樣，重組免疫球蛋白可如美國(guó)專利號(hào)4,816,567所示而生產(chǎn)，在此引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例I材料與方法a.質(zhì)粒、細(xì)菌菌株和培養(yǎng)基質(zhì)粒pBCL1920、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌、檸檬泛菌1392A。檸檬泛菌1392A菌株是39140檸檬泛菌變型。pD92是代表含有DKG還原酶基因的載體而被描述的。美國(guó)專利號(hào)5,376,544。Murphy III培養(yǎng)基含有果糖0.5％、磷酸鹽1.6％、MgSO4.7H2O 0.2％、Soytone 0.2％、檸檬酸鹽0.01％、(NH4)2SO41％、ppm范圍的痕量鹽如Fe、Co、Mn、Zn和維生素如煙酸、葉酸和B12；M9培養(yǎng)基含有0.9％的磷酸鹽、0.1％的NaCl、0.1％的NH4Cl、MgSO4 0.0005％、CaCl2 0.025％；發(fā)酵培養(yǎng)基含有磷酸鉀(Potassium Phosphate)1％、MgSO4 0.15％、谷氨酸鹽1.5％、果糖2.5％、硫酸銨0.1％和含有生物素、硫胺素、吡哆醇、核黃素、煙酸、葉酸和B12的維生素混和物，以及含有10-100ppm水平的鐵、Zn和Mn離子的痕量金屬混合物溶液；轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定培養(yǎng)基含有100mM磷酸鉀pH6.9；抗生素壯觀霉素50μg/ml和四環(huán)素20μg/ml，IPTG 100μM。
b.DNA技術(shù)c.細(xì)胞生長(zhǎng)使以重組方法構(gòu)建的菌株以及野生型檸檬泛菌和產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌生長(zhǎng)在含有DKG作為唯一碳源的M9培養(yǎng)基或以果糖作為唯一碳源的MIII培養(yǎng)基中，或者具有混和碳源如0.1％到1％范圍內(nèi)的果糖、葡糖酸和DKG的MIII培養(yǎng)基中。使細(xì)胞在20-37℃之間生長(zhǎng)，但優(yōu)選地低于30℃。細(xì)胞優(yōu)選地生長(zhǎng)在中性pH，但是可以在pH5-8范圍內(nèi)。生長(zhǎng)在來(lái)自種子瓶的發(fā)酵罐中的檸檬泛菌細(xì)胞使用以果糖或葡萄糖飼養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基。
d.DKG攝入生化測(cè)定將含有細(xì)胞的發(fā)酵肉湯樣品從各自的生長(zhǎng)設(shè)備中取出并在冰水浴中驟冷。離心發(fā)酵肉湯并丟棄上清液。用0.95冰冷的鹽溶液洗滌細(xì)胞沉淀，隨后由DKG攝入測(cè)定緩沖液100mM冰冷的磷酸鉀pH6.9洗滌兩次。將細(xì)胞重懸于相同的測(cè)定緩沖液中至550nm的OD值為12，然后在室溫或優(yōu)選地在28℃溫育。DKG攝入測(cè)定是通過(guò)將細(xì)胞與富C-14放射性同位素標(biāo)記2，-5DKG混和而開(kāi)始。DKG攝入的時(shí)間進(jìn)程是用基于用冰冷的測(cè)定緩沖液真空/濾器驟冷來(lái)進(jìn)行的。DKG攝入測(cè)量是由細(xì)胞中放射性同位素的摻入來(lái)完成的，將所獲得的數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間繪圖得到DKG攝入速率。
也進(jìn)行了另一個(gè)用硅油對(duì)細(xì)胞DKG攝入和代謝研究的測(cè)定(Johnson，J.D.等人，J.Lab.Clin.Med.，1980，95429-439)。將100μl硅油加入到準(zhǔn)備好進(jìn)行測(cè)定的epitube中。將細(xì)胞和富14C(U)的2，5-DKG混和，然后在定期的時(shí)間間隔取出100μl的細(xì)胞/底物混和物并將其加入到含有硅油的epitube中，離心15秒，然后迅速在干冰/乙醇浴中冷凍。5分鐘后，將含有細(xì)胞沉淀的epitube的頂端直接切入閃爍小瓶中。正好在試管剩余部分的冷凍部分上面再次切割并置入另一個(gè)含有閃爍液的小瓶中。在過(guò)夜以促進(jìn)細(xì)胞沉淀從epitube頂部松散開(kāi)之后記數(shù)。頂部記數(shù)的損失和沉淀中記數(shù)的出現(xiàn)的差異歸因于細(xì)胞的代謝和釋放的CO2。在攝入測(cè)定結(jié)束時(shí)，當(dāng)細(xì)胞被透化時(shí)，低分子的細(xì)胞內(nèi)容物泄露出來(lái)并提供了關(guān)于積累的輸入底物和底物進(jìn)一步代謝變?yōu)榧?xì)胞成分的命運(yùn)的信息。
e.DKG還原酶測(cè)定收集來(lái)自每個(gè)發(fā)酵罐的細(xì)胞沉淀并在-70℃冷凍約24小時(shí)。將在15和25小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的沉淀在冰上解凍并用弗氏壓碎器在pH6.5的50mM PIPES緩沖液中壓碎。將抽提液在臺(tái)式離心機(jī)中以14K rpm旋轉(zhuǎn)2分鐘，隨后測(cè)量總蛋白質(zhì)的濃度和還原酶的活性。所有樣品是通過(guò)蛋白質(zhì)的Bradford和BCA測(cè)定法來(lái)測(cè)量的，并根據(jù)需要稀釋以進(jìn)行精確的分級(jí)測(cè)定。該測(cè)定是相對(duì)于背景等級(jí)(backgroud rate)而測(cè)量的，其中的背景等級(jí)含有除2，5-DKG之外的所有成分(低于總等級(jí)的10％)。緩沖液含有50mM PIPES pH6.5、150μM NADPH和5mM 2，5-DKG。
也進(jìn)行了利用硅油對(duì)細(xì)胞的DKG攝入和代謝分析的另一個(gè)測(cè)定(Johnson，J.D.等人，J.Lab.Clin.Med.，1980，95429-439)。將100μl硅油加入到準(zhǔn)備好進(jìn)行測(cè)定的epitube中。將細(xì)胞和富14C(U)的2，5-DKG混和，然后在定期的時(shí)間間隔(例如約每10秒鐘)取出100μl的細(xì)胞/底物混和物并將其加入到含有硅油的epitube中，離心15秒，然后迅速在干冰/乙醇浴中冷凍。5分鐘后，將含有細(xì)胞沉淀的epitube的頂端直接切入閃爍小瓶中。正好在試管剩余部分的冷凍部分上面再次切割并置入另一個(gè)含有閃爍液的小瓶中。在過(guò)夜以促進(jìn)細(xì)胞沉淀從epi頂部松散開(kāi)之后記數(shù)。頂部記數(shù)的損失和沉淀中記數(shù)的出現(xiàn)的差異歸因于細(xì)胞的代謝和釋放的CO2。在攝入測(cè)定結(jié)束時(shí)，當(dāng)細(xì)胞被透化時(shí)，低分子的細(xì)胞內(nèi)容物泄露出來(lái)并提供了關(guān)于積累的輸入底物和底物進(jìn)一步代謝變?yōu)榧?xì)胞成分的命運(yùn)的信息。
實(shí)施例II實(shí)施例II提供了底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能是全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)變的限速因子的基礎(chǔ)本實(shí)施例解說(shuō)了可被區(qū)室化為4個(gè)部分的從葡萄糖形成2KLG的關(guān)鍵步驟(圖5)。利用三種周質(zhì)酶在檸檬泛菌中以14-15g/l/hr的速率對(duì)關(guān)鍵中間物2，5-DKG進(jìn)行生產(chǎn)(Sonoyama等人，Appl.Environ.Microbiol.，1982，431064-1069)。第二部分是需要DKG在細(xì)胞的胞質(zhì)空間內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的速率。第三個(gè)是用DKG還原酶將DKG轉(zhuǎn)化為2KLG的速率(美國(guó)專利號(hào)5,032,514)。當(dāng)DKG還原酶超表達(dá)時(shí)，DKG向2KLG的轉(zhuǎn)變不是速率限制性的。在我們目前的2KLG生產(chǎn)發(fā)酵中，將誘導(dǎo)型質(zhì)粒用于增加或減少相對(duì)于我們一般的發(fā)酵(目前使用pD92)而言的還原酶比活性，其中的DKG還原酶是在組成型啟動(dòng)子trp控制下的。誘導(dǎo)型質(zhì)粒pD23是在taq啟動(dòng)子控制下的，可用IPTG誘導(dǎo)。運(yùn)行了三個(gè)發(fā)酵罐，一個(gè)用pD92，兩個(gè)用pD23且其中的一個(gè)用IPTG誘導(dǎo)。對(duì)照的pD92和誘導(dǎo)的pD23生產(chǎn)了幾乎同樣水平的2-KLG，而未誘導(dǎo)的pD23的產(chǎn)量則低得多。還原酶比活性的測(cè)定顯示相對(duì)于對(duì)照pD92而言，未誘導(dǎo)的質(zhì)粒生成的還原酶水平不到一半，而誘導(dǎo)的pD23則生成了多于兩倍。這些結(jié)果顯示，在我們生產(chǎn)2KLG的檸檬泛菌發(fā)酵中，還原酶活性的水平不是2-KLG生產(chǎn)的瓶頸。
菌株蛋白質(zhì)濃度還原酶活性比活性pD92(對(duì)照) 3.2mg/ml 25.0u/ml 7.8u/mgpD23(未誘導(dǎo)的) 3.7mg/ml 12.0u/ml 3.2u/mgpD23(誘導(dǎo)的)3.9mg/ml 73u/ml19u/mg第四部分是在細(xì)胞內(nèi)生成的并需要輸出的2KLG的轉(zhuǎn)運(yùn)。2KLG在發(fā)酵中的生產(chǎn)速率(2.2g/l/hr-2.7g/l/hr)可認(rèn)為與2KLG從細(xì)胞的輸出速率相等。這是這樣論證的，如果2KLG輸出的速率是限制性的，那么細(xì)胞將在細(xì)胞內(nèi)積累2KLG，這樣細(xì)胞將不能以其代謝潛力發(fā)揮功能并最終死亡。然而，檸檬泛菌生產(chǎn)2KLG的細(xì)胞不展示這些情形的任何一個(gè)，并且細(xì)胞內(nèi)2KLG的測(cè)量值保持在低于生產(chǎn)的2KLG最大濃度的十到二十分之一。因而可想象2KLG的輸出也不是2KLG生產(chǎn)中的限速步驟。
實(shí)施例III實(shí)施例III提供了證實(shí)底物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞以進(jìn)行生物轉(zhuǎn)變確實(shí)是限速步驟的證據(jù)將來(lái)自發(fā)酵過(guò)程的三個(gè)不同時(shí)間即種子燒瓶(seed-flask)階段、果糖飼養(yǎng)階段和葡萄糖飼養(yǎng)階段的細(xì)胞沉淀收集并如在實(shí)驗(yàn)中描述進(jìn)行加工。利用這些細(xì)胞類型的DKG攝入測(cè)定，確定出DKG攝入速率(引入DKG以轉(zhuǎn)變?yōu)镵LG)為0.5g/l/hr、2.7g/l/hr和2.75g/l/hr(圖9)。DKG輸入的速率與KLG輸出的速率相等。因而這個(gè)結(jié)果證明DKG到KLG的生物轉(zhuǎn)變的速率依賴于2，5-DKG進(jìn)入細(xì)胞的輸入速率。因而本發(fā)明將證明，通過(guò)以超表達(dá)來(lái)增加DKG攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將增強(qiáng)2，5-DKG的輸入速率，并因而將增強(qiáng)2KLG的生產(chǎn)速率。本領(lǐng)域的專家可想象利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)變方法的各種生物轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵限制因子實(shí)際上是底物進(jìn)入細(xì)胞以進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的輸入和輸入速率。
實(shí)施例IV實(shí)施例IV說(shuō)明利用DKG攝入測(cè)定發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌中2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在。WO 002170描述了來(lái)自產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌的稱為yia操縱子的鑒定和序列測(cè)定，該操縱子含有8個(gè)推定的開(kāi)放閱讀框。yia操縱子中各開(kāi)放閱讀框編碼的這些多肽的功能沒(méi)有在WO002170中描述。該操縱子的破壞去除了產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌利用抗壞血酸作為唯一碳源的能力。已知抗壞血酸是一種對(duì)氧化不穩(wěn)定的物質(zhì)，它可通過(guò)空氣氧化而分解為2，3-DKG(Kimaya，S.，Vitaminol.1961，719-26)。因而提出2，3-DKG才是生長(zhǎng)的真正底物是合理的。Yia操縱子中稱為yiaX2的一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白型跨膜蛋白質(zhì)，并因而被認(rèn)為是2，3-DKG通透酶的候選物。根據(jù)尋求2，5-DKG通透酶的并行檢索，從而認(rèn)識(shí)到2，3-DKG和2，5-DKG是類似分子，可能yiaX2可轉(zhuǎn)運(yùn)2，5-DKG和其他糖類酮酸如2KLG。
為了確定yiaX2是否可轉(zhuǎn)運(yùn)2，5-DKG和2-KLG，將該基因從產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌菌株M5a1的染色體中缺失(參見(jiàn)如Streicher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.681174-1177(1971))。稱為MGK002的yiaX2缺失突變體是用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)規(guī)程來(lái)構(gòu)建的(參見(jiàn)如Hamilton等人，J.Bacterial.1714617-4622(1989))。另一種稱為T(mén)ester菌株的產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌菌株是通過(guò)將質(zhì)粒編碼的、受lac操縱子調(diào)節(jié)的yiaX2基因添加回產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌菌株MGK002而創(chuàng)建的。利用MGK002和Tester菌株在+/-IPTG誘導(dǎo)下的DKG攝入測(cè)定證實(shí)yiaX2編碼具有2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽(圖9)。
實(shí)施例V實(shí)施例V提供了從微生物中篩選2，5-DKG通透酶的選擇方法學(xué)有了yiaX2基因編碼具有2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)活性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信息，就可能設(shè)計(jì)出選擇宿主以找到檸檬泛菌和其他生物學(xué)來(lái)源的2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。構(gòu)建有yiaX2基因缺失并添加了表達(dá)參與2，5-DKG到葡糖酸的分解代謝中的酶的基因的產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌，其對(duì)于生物體的中央代謝而言是可評(píng)估的。能夠分解代謝2，5-DKG到葡糖酸的酶是由在一些革蘭氏陰性生物體中存在的tkr idnD idnO操縱子的tkr和idno基因編碼的(Bausch，C.等人，J.Bacteriol.，1998，1803704-3710)。
結(jié)果所得的產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌tester菌株是yiaX2[tkridno]，其除了不能將DKG輸入到胞質(zhì)外，含有所有以2，5-DKG作為唯一的碳源在其上生長(zhǎng)所必需的成分。因此，編碼2，5-DKG通透酶的核酸分子在tester菌株中表達(dá)后，應(yīng)可以賦予tester菌株在2，5-DKG上生長(zhǎng)的能力。這種選擇方法學(xué)如圖9所示。
用于構(gòu)建檸檬泛菌基因組文庫(kù)的克隆載體是質(zhì)粒pCI1920(Lerner等人，Nucleic Acid Res.，1994，184621)，即攜帶有壯觀霉素/鏈霉素抗性決定因子的低拷貝數(shù)表達(dá)載體。表達(dá)是由lacPO啟動(dòng)子/操縱基因區(qū)域驅(qū)動(dòng)的，當(dāng)由宿主提供了laclq基因產(chǎn)物時(shí)該區(qū)域可被該產(chǎn)物抑制。利用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程從檸檬泛菌(ATCC39140)中分離了基因組DNA并構(gòu)建了基因組文庫(kù)(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningALaboratory manual)，Coid Spring Harbor Laboratory，NewYork(1992))。將擴(kuò)增的文庫(kù)以質(zhì)粒DNA的形式貯藏以備將來(lái)用于尋找檸檬泛菌的2，5-DKG通透酶。
實(shí)施例VI實(shí)施例VI提供了通過(guò)使DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在宿主細(xì)胞中超表達(dá)可以增強(qiáng)DKG向細(xì)胞的輸入速率的證據(jù)。
將基因組文庫(kù)引入tester菌株產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌yiaX2[tkridno]菌株。用放射性標(biāo)記的14C(U)DKG對(duì)在具有2.5％的2，5-DKg和0.1mM IPTG的M9-瓊脂平板顯示能夠在2，5-DKG上生長(zhǎng)的克隆檢驗(yàn)DKG的攝入。發(fā)現(xiàn)各種克隆都比對(duì)照的tester菌株有改善的DKG攝入(圖9)。將來(lái)自這些陽(yáng)性克隆的基因組文庫(kù)DNA轉(zhuǎn)化入檸檬泛菌(139-2A)，并且進(jìn)行DKG攝入測(cè)定以測(cè)量超過(guò)檸檬泛菌139-2A菌株的DKG攝入改善。在轉(zhuǎn)化體中觀察到了3到5倍的DKG攝入速率改善，該轉(zhuǎn)化體通過(guò)基因組文庫(kù)篩選和選擇方法學(xué)而發(fā)現(xiàn)其含有編碼DKG通透酶的質(zhì)粒的額外拷貝(圖10)。
實(shí)施例VII實(shí)施例VII提供了通過(guò)使DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在宿主細(xì)胞中超表達(dá)可以改善2KLG的生產(chǎn)的證據(jù)。
當(dāng)用低拷貝的載體pBCL 1920將編碼檸檬泛菌DKG通透酶PermA的核酸分子(seq ID no2)亞克隆入適合從葡萄糖生物合成2KLG的檸檬泛菌菌株139-2A中時(shí)(美國(guó)專利號(hào)5,032514)，2KLG生產(chǎn)的生產(chǎn)速率從2.5g/l/hr提高到3.2g/l/hr，基于糖類的產(chǎn)量從45％提高到53％(圖11)。
實(shí)施例VIII實(shí)施例VIII描述了來(lái)自檸檬泛菌的2，5-DKG通透酶PermA的特征。
本實(shí)施例描述了檸檬泛菌的PermA的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。PFAM分析(Hirokawa，T.等人，Bioinformatics，1998，4(4)378)預(yù)測(cè)PermA含有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、8個(gè)初級(jí)結(jié)構(gòu)域和3個(gè)次級(jí)跨越結(jié)構(gòu)域(圖12)。氨基末端位于周質(zhì)而羧基末端位于胞質(zhì)內(nèi)。有兩個(gè)大環(huán)和兩個(gè)小環(huán)存在，且周質(zhì)和胞質(zhì)中都含有一個(gè)大環(huán)和一個(gè)小環(huán)。PermA是疏水性為0.62的膜蛋白質(zhì)，其分子量為48道爾頓?；诶鄯e比例分析，它是一種H+伴隨性2，5-DKG同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Lolkema，J.S.等人，1996，生物物理學(xué)手冊(cè)(Handbook of BiologicalPhysics)，Chapter 11，229-260)?；诠灿行蛄蟹治觯鼘儆贛FS的ACS家族(Pao，S.S.等人，Microniol.Molecular Biol.Rev.，1998，62；1-34)(圖8a)。
在本領(lǐng)域的技術(shù)人員閱讀過(guò)公開(kāi)內(nèi)容且不背離本發(fā)明的精神和范圍后，前面的描述和實(shí)施例的各種其他的實(shí)施例和修飾對(duì)他們而言都是顯然的，并且意圖將所有這樣的實(shí)施例或修飾都包括在附錄權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。此處參考的所有出版物和專利都特此整體引入。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)宿主細(xì)胞中2-KLG的生物合成生產(chǎn)的方法，該方法包含a)選擇一種能在胞質(zhì)中將2，5-DKG轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的宿主細(xì)胞；b)在維持宿主細(xì)胞的完整性時(shí)增加所說(shuō)的2，5-DKG向該宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)；c)培養(yǎng)該細(xì)胞以生產(chǎn)所說(shuō)的2-KLG；和d)生產(chǎn)2-KLG。
2.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的增加2，5-DKG向該宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)包括將DNA轉(zhuǎn)化入該宿主細(xì)胞的步驟，其中所述DNA編碼一種或多種將該2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)入所說(shuō)的宿主細(xì)胞的胞質(zhì)材料中的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的一種或多種蛋白質(zhì)選自YiaX2、PE1、PE6、prmA和prmB。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的編碼一種或多種蛋白質(zhì)的DNA是從選自YiaX2、PE1、PE6、prmA和prmB的基因組中表達(dá)的。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)能夠與SEQ ID NO[共有序列]進(jìn)行[嚴(yán)格]雜交。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO[共有通透酶序列]具有至少50％的同源性。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO[共有通透酶序列]具有至少90％的同源性。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO[整體通透酶序列]具有至少50％的同源性。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO[整體通透酶序列]具有至少90％的同源性。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)包含一個(gè)含有31個(gè)殘基的序列，所述殘基包含對(duì)應(yīng)于PermA的甘氨酸119的甘氨酸殘基。
11.權(quán)利要求11的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含對(duì)應(yīng)于PermA位置136的色氨酸殘基(W)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含至少一個(gè)選自下組的氨基酸殘基位于與PermA的G138相應(yīng)的位置處的苯丙氨酸、位于與PermA的E141相應(yīng)的位置處的谷氨酸(E)和位于與PermA的R142相應(yīng)的位置處的精氨酸(R)。
13.
14.增強(qiáng)2，5-DKG跨內(nèi)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞溶膠的方法，該方法包含選擇一種宿主細(xì)胞；和使編碼一種或多種能將2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)入所說(shuō)的宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化入該宿主細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞選自細(xì)菌和酵母。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、泛菌和克雷伯氏桿菌。
17.一種使2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超表達(dá)的方法，包含下述步驟選擇一種宿主細(xì)胞；和將編碼一種或多種2，5-DKG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA轉(zhuǎn)化入該宿主細(xì)胞。
全文摘要
描述了一種增強(qiáng)宿主細(xì)胞中2－KLG的生物合成生產(chǎn)的方法。這樣的方法包括選擇一種具有利用2，5－DKG生產(chǎn)2－KLG的細(xì)胞內(nèi)合成途徑的至少部分的宿主細(xì)胞；在維持宿主細(xì)胞的完整性時(shí)增加該2，5－DKG向所說(shuō)的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)；培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生產(chǎn)該2，5－DKG；以及生產(chǎn)2－KLG。2，5－DKG的轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)使編碼一種或多種將2，5－DKG轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi)的酶的DNA轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)而得到增加。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1527880SQ01815726
公開(kāi)日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2001年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月4日
發(fā)明者M·庫(kù)瑪, F·瓦勒, V·A·達(dá)特沃斯, J·A·赫啻, M 庫(kù)瑪, 赫啻, 達(dá)特沃斯 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司, 微基因組公司