專利名稱：D－葡糖酸內(nèi)酯氧化酶基因以及生產(chǎn)重組d－葡糖酸內(nèi)酯氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼葡糖酸內(nèi)酯氧化酶的新型核酸分子，所述酶可用于生產(chǎn)異抗壞血酸及相關(guān)鹽的方法。
異抗壞血酸是抗壞血酸的C-5表異構(gòu)物，具有基本相同的化學(xué)特性，如抗氧化劑活性。然而，與抗壞血酸的維生素C活性相比，異抗壞血酸的維生素C活性非常低，因此在實際應(yīng)用中人們并不認為異抗壞血酸是維生素。異抗壞血酸屬于GRAS情況，在許多食品和其它應(yīng)用中用作抗氧化劑。目前用于生產(chǎn)異抗壞血酸的化學(xué)方法以下面所述反應(yīng)為基礎(chǔ)酯化2-酮葡糖酸，然后堿催化該酯環(huán)化產(chǎn)生異抗壞血酸鈉。
自六十年代起，人們就知道某些屬于青霉屬(Penicillium)的野生型真菌當(dāng)在葡萄糖上培養(yǎng)時產(chǎn)生少量異抗壞血酸[Yagi J.等.Agric.Biol.Chem.31(3)340-345(1967)]。通過廣泛化學(xué)誘變/選擇程序，已經(jīng)分離出能夠轉(zhuǎn)化葡萄糖為異抗壞血酸的產(chǎn)率達40％的特異青霉(Penicillium notatum)菌株[Shimizu K.等，Agric.Biol.Chem 31(3)346-352(1967)]。然而，需要完成所述轉(zhuǎn)化的發(fā)酵時間非常長(1-2周)，這使該生產(chǎn)方法不能工業(yè)化。
隨后對青霉屬中從葡萄糖到異抗壞血酸途徑的酶學(xué)研究確定該途徑由兩個反應(yīng)組成[Takahashi T.Biotechnology and Bioengineering11，1157-1171(1969)]。第一個反應(yīng)是眾所周知的，由葡萄糖氧化酶將葡萄糖氧化為葡糖酸內(nèi)酯。該途徑的第二個反應(yīng)是分子氧將D-葡糖酸內(nèi)酯氧化，形成異抗壞血酸和過氧化氫。該反應(yīng)由D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶(D-GLO)催化，該酶僅在幾種真菌中檢測到。Takahashi及其合作者[Takahashi T.等，Agric.Biol.Chem.40，121-129(1976)]已經(jīng)闡明了一種藍棕青霉(Penicillium cyaneofulvum)(隨后重新分類為Penicillium griseoroseum ATCC 1043)菌株的D-GLO基本酶學(xué)特性。
以經(jīng)濟上可接受的速率使葡萄糖直接轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸的有關(guān)難題仍然沒有得到解決。本發(fā)明提供編碼D-GLO的分離核酸，其中所述D-GLO可用于生產(chǎn)異抗壞血酸及其鹽的生物技術(shù)方法。
本發(fā)明涉及分離和鑒定編碼用于生產(chǎn)異抗壞血酸及相關(guān)鹽的D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶(D-GLO)的核酸分子。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及SEQ ID NO1(cDNA)、SEQ ID NO2(編碼)和SEQ ID NO3(成熟)定義的新分離的核酸分子。本發(fā)明還考慮了在嚴格條件下與SEQ.ID.NOS.1-3中的任一種雜交的核酸分子。
在本發(fā)明的另一實施方案中，還提供包含本文鑒定的任何一種核酸分子的載體以及用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明還考慮了使用所鑒定的核酸分子產(chǎn)生D-GLO的重組方法。
本發(fā)明的再一實施方案涉及由本文鑒定的核酸分子所編碼的D-GLO蛋白，其中包括SEQ ID NO4表示的蛋白和與SEQ ID NO4具有至少70％序列同一性的蛋白。
在本發(fā)明的又一實施方案中，還提供使用本發(fā)明的D-GLO轉(zhuǎn)化葡萄糖和/或D-葡糖酸內(nèi)酯生產(chǎn)異抗壞血酸和相關(guān)鹽的方法。


圖1圖解說明編碼P.Griseoroseum GLO的MFα1前原肽(prepropepetide)和成熟部分的質(zhì)粒pGTY(GLO)。
圖2圖解說明未轉(zhuǎn)化的啤酒酵母(S.cerevisiae)和pGTY(GLO)轉(zhuǎn)化的啤酒酵母的細胞密度和GLO活性。
圖3圖解說明利用葡萄糖氧化酶和D-GLO使葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸。
圖4圖解說明利用葡萄糖脫氫酶和D-GLO使葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸。
圖5圖解說明包含巴斯德畢赤酵母啟動子控制下的D-GLO基因完整編碼區(qū)的質(zhì)粒pPIC3.5K(GLO)。
本發(fā)明涉及編碼真菌來源的D-GLO的分離的核酸分子。所述真菌最好屬于青霉屬，如Penicillium griseoroseum、特異青霉、藍青霉(Penicillium cyaneum)和斜臥青霉(Penicillium decumbens)。本文所用的術(shù)語“D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶”(D-GLO)是指并且包括任何天然或人造的真菌D-GLO變異體。例如，編碼真菌D-GLO的本發(fā)明核酸分子可以具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列；或者具有這樣的序列在嚴格條件下與具有SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的分離的核酸分子雜交的序列；或者具有編碼這樣的蛋白的序列所述蛋白當(dāng)與SEQ ID NO4氨基酸序列比較時，具有約70％或更高的序列同一性。約70％或更高的氨基酸同一性可以定義為根據(jù)在國際互聯(lián)網(wǎng)站點http//www.ncbi.n/m.nih.gov/egi-bin/BLAST/上執(zhí)行的BLASTP算法，使用該程序的默認參數(shù)(矩陣(Matrix)＝Blosum 62；缺口罰分(Gap existence cost)＝11；缺口延伸罰分(Gap extension cost)＝1)進行搜索的正百分率。
更具體地說，本發(fā)明的核酸分子包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的變異形式，如缺失、插入、添加和突變，其中這樣的序列編碼保持天然D-GLO的酶促活性的蛋白，即所編碼的蛋白能夠轉(zhuǎn)化D-葡糖酸內(nèi)酯成為異抗壞血酸。
包含本發(fā)明所述核酸分子的載體以及轉(zhuǎn)化宿主細胞或轉(zhuǎn)基因生物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。“載體或表達載體”是指包含用于包括但不限于在原核或真核細胞或生物中表達的調(diào)節(jié)元件或報道基因的任何核酸分子或病毒?！稗D(zhuǎn)化宿主細胞”是指其中已經(jīng)通過分子生物學(xué)技術(shù)引入編碼D-GLO的核酸的宿主細胞，其中所述核酸最好來自真菌，最優(yōu)選來自青霉屬真菌。在將所述核酸引入所述細胞后，所述核酸可以在染色體外存在或整合入宿主基因組。對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說，下列操作是常規(guī)性的構(gòu)建其中本發(fā)明的核酸分子與所需啟動子有效連接的表達載體，以便在各種宿主中表達和分泌所述核酸分子編碼的D-GLO蛋白。Sambrook，等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
可用于實施本發(fā)明的宿主細胞可以是任何適用于轉(zhuǎn)化程序的可獲得宿主細胞。例如，可以使用細菌細胞，例如屬于埃希氏菌屬(Eschericha)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌。也可以使用酵母細胞作為宿主細胞，例如屬于酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)和許旺酵母屬(Schwanniomyces)的酵母。也可以使用單細胞藻類，例如集胞藻屬(Synechosystis)、衣藻屬(Chlamydomonas)和裸藻屬(Euglena)的單細胞藻類。也可以用本發(fā)明的分離的核酸轉(zhuǎn)化高等植物細胞。用裸DNA或用包含與異源基因有效連接、在植物中起作用的啟動子的載體轉(zhuǎn)化植物細胞的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。代表性的植物包括大豆、玉米、馬鈴薯、番茄、甜菜等等。也可以使用哺乳動物細胞作為宿主細胞。表達的GLO最好靶向培養(yǎng)基或一種細胞器，例如液泡、葉綠體、微粒體、過氧化物酶體等等。
術(shù)語“核酸或核酸分子”包括RNA和DNA，其中包括cDNA、基因組DNA和合成(如化學(xué)合成或修飾)DNA。本發(fā)明的核酸分子可以是雙鏈或單鏈核酸分子。當(dāng)所述核酸是單鏈時，所述核酸可以是有義鏈或反義鏈。術(shù)語“分離的核酸”是指可以側(cè)接非天然序列的核酸，例如質(zhì)?；虿《竞怂?。因此，所述核酸可以不包括5′非編碼序列(如啟動子)、包括部分或全部緊接編碼序列的5′非編碼序列(如啟動子)。因此，該術(shù)語包括例如摻入包括自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒的載體的重組DNA，或摻入原核細胞基因組DNA或除青霉屬以外的真核細胞基因組DNA的重組DNA，或作為獨立于其它序列的單獨分子(如cDNA或通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段)存在的重組DNA。該術(shù)語還包括作為編碼額外多肽序列的雜合基因組成部分的重組DNA或RNA。此外，該術(shù)語還包括不作為片段天然存在和不見于天然狀態(tài)的核酸片段。
這些重組核酸分子還可以包括增強、調(diào)節(jié)或改進所述D-GLO編碼序列在各種重組宿主中轉(zhuǎn)錄的各種序列中的任何一種；即組成型或調(diào)節(jié)型啟動子、轉(zhuǎn)錄增強子和轉(zhuǎn)錄終止子以及其它通過各種已知機制(如轉(zhuǎn)錄阻抑物結(jié)合、減弱或抗終止作用)調(diào)節(jié)D-GLO的表達的序列。
“在嚴格條件下雜交”是指這樣的條件在人們認為嚴格而且在Sambrook等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T..第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)給出的低鹽和高溫條件下，核酸與在溶液中或在固體支持物上的SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核酸分子形成穩(wěn)定、序列特異性、非共價結(jié)合的條件。例如，可以將參考序列如SEQ ID NO1固定在硝酸纖維素膜上，而在0.2×SSC(1.75g/l NaCl，0.88g/l二水合檸檬酸鈉；pH7.0)和0.1％(w//v)十二烷基硫酸鈉存在下于68℃與所述固定參考核酸特異性非共價結(jié)合的任何其它核酸被認為是在嚴格條件下進行雜交。
從用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細胞中獲得的GLO制劑或D-GLO蛋白也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢耘囵B(yǎng)本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細胞并從所培養(yǎng)的細胞回收D-GLO。所述D-GLO可以分泌出來或表達在宿主細胞內(nèi)；完整的D-GLO編碼區(qū)或部分所述編碼區(qū)可以沒有任何其它修飾性表達，或者可以在添加各種C末端和N末端延伸物如起始密碼子或寡組氨酸序列后表達。仍然保持D-GLO活性的D-GLO與其它蛋白的融合物以及本文鑒定的所有D-GLO相關(guān)蛋白的突變形式都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些突變形式可以通過隨機誘變或定向誘變獲得。具有D-GLO活性的所述蛋白制劑可以是粗制或純化制劑，可以溶液使用或固定在本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種載體上。同樣，可以使用表達所述蛋白的重組宿主細胞在所述宿主的發(fā)酵過程中、甚至在所述宿主靜止狀態(tài)下催化D-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸。值得注意的是，本發(fā)明的死亡重組宿主細胞也可用作葡萄糖和/或D-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸中的D-葡糖酸內(nèi)酯氧化催化劑。具體來說，在葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶的存在下葡萄糖可轉(zhuǎn)化為D-葡糖酸內(nèi)酯；然后通過使所述D-葡糖酸內(nèi)酯底物與本發(fā)明的D-GLO在產(chǎn)生異抗壞血酸的充分條件下接觸一段時間，從而使所述D-葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸。D-葡糖酸內(nèi)酯作為本發(fā)明D-GLO的底物，可以通過化學(xué)轉(zhuǎn)化葡糖酸制備，或者通過葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶轉(zhuǎn)化葡萄糖制備。因此，通過使D-葡糖酸內(nèi)酯與D-GLO在足以產(chǎn)生異抗壞血酸的條件下接觸一段時間，使所述底物轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸。
全長D-GLO編碼序列可以不進行任何修飾而使用，或可以通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法進行修飾。例如，可以缺失N末端或C末端氨基酸序列，或用各種已知的改善D-GLO在合適宿主中的分泌的前肽(pre-peptide)或前原肽(信號肽)取代所述氨基酸序列?？梢詫⒄{(diào)節(jié)所述D-GLO多肽的分類和靶向的各種其它氨基酸序列與全長D-GLO或保留GLO活性的部分D-GLO編碼序列融合。
本發(fā)明的D-GLO也可以表達為融合蛋白。尤其是本發(fā)明的D-GLO可以融合到提供輔助酶活性和/或相關(guān)酶促活性例如葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶等等的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。同樣，可以將D-GLO融合到提供其它已知有用功能的結(jié)構(gòu)域，例如對特異性配體的高親合性(如鏈霉抗生物素蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、纖維素和其它多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或者改善所述融合蛋白的穩(wěn)定性和/或溶解度(如超氧化物歧化酶或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)。
可以如下產(chǎn)生異抗壞血酸使用本發(fā)明的重組D-GLO作為酶促過程中的關(guān)鍵成分，最好是在有效宿主如絲狀真菌(如屬于曲霉屬或青霉屬的真菌)、或具有高度分泌潛力的酵母物種(如屬于畢赤酵母屬或漢遜酵母屬的酵母物種)中，使葡萄糖轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸。除D-GLO外，這樣的過程至少加入兩種其它的酶，最好包括葡萄糖氧化酶(或具有重疊特異性的酶，如葡萄糖脫氫酶、己糖氧化酶或吡喃糖氧化酶)以及過氧化氫酶。圖3圖解說明了構(gòu)成所述基于葡萄糖氧化酶和GLO的過程的基礎(chǔ)的化學(xué)反應(yīng)的順序。簡要地說，分子氧將葡萄糖氧化成為D-葡糖酸-d-內(nèi)酯。該反應(yīng)由葡萄糖氧化酶(或己糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶等等)催化，產(chǎn)生副產(chǎn)物過氧化氫。D-GLO隨后催化D-葡糖酸-d-內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸。在該反應(yīng)中，同樣消耗分子氧并形成過氧化氫。已知D-葡糖酸-d-內(nèi)酯在水溶液中與葡糖酸和D-葡糖酸-γ-內(nèi)酯形成平衡。D-葡糖酸-γ-內(nèi)酯也是D-GLO的底物。這兩種D-葡糖酸內(nèi)酯都被GLO氧化形成相同產(chǎn)物異抗壞血酸。D-葡糖酸內(nèi)酯水解的自發(fā)反應(yīng)相當(dāng)慢，并且假如所述反應(yīng)混合物中存在足夠高濃度的GLO和分子氧，該水解反應(yīng)可能降低到最低程度。此外，由于該反應(yīng)的可逆性，葡糖酸最終形成可以被氧化成異抗壞血酸的內(nèi)酯。葡萄糖氧化酶催化的反應(yīng)和D-GLO催化的反應(yīng)都產(chǎn)生副產(chǎn)物過氧化氫。過氧化氫是高度活性物質(zhì)，可使參與該過程的酶失活。因此，必須不斷地從所述反應(yīng)混合物中去除過氧化氫。去除過氧化氫的優(yōu)選方法是利用過氧化氫酶。使用其它已知的去除各種活性氧的清除劑(如超氧化物酶)在實施本發(fā)明時也是有利的。
假如使用葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡糖酸內(nèi)酯，就可以將過氧化氫的去除與在葡萄糖脫氫酶催化的反應(yīng)中消耗的NAD+的再生偶聯(lián)起來。圖4圖解說明具體實施本發(fā)明的整個反應(yīng)流程。按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化葡萄糖成為異抗壞血酸的優(yōu)選方法是在單個反應(yīng)器中進行整個過程，在所述反應(yīng)器中同時進行葡萄糖氧化與葡糖酸內(nèi)酯氧化。然而，分別進行葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡糖酸內(nèi)酯以及葡糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸的實施方案也是可以接受的。使用本發(fā)明的重組D-GLO，用葡糖酸內(nèi)酯、葡糖酸或二者的混合物作為產(chǎn)生異抗壞血酸的原料也是令人滿意的。
也可以在已經(jīng)能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為葡糖酸內(nèi)酯的宿主內(nèi)表達本發(fā)明的D-GLO核酸。許多這樣的微生物宿主是本領(lǐng)域已知的。通常這樣的微生物使用葡萄糖氧化酶(如許多屬于曲霉屬和青霉屬的真菌物種)或葡萄糖脫氫酶將葡萄糖氧化為葡糖酸內(nèi)酯。許多屬于產(chǎn)生膜結(jié)合葡萄糖脫氫酶的細菌屬的細菌物種是合適的。選擇還表達足夠高水平過氧化氫酶的宿主是有利的。當(dāng)在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵這樣的表達GLO的重組宿主時，可以從葡萄糖直接獲得異抗壞血酸。
此外，本發(fā)明的表達D-GLO的重組宿主可以與表達葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶和/或過氧化氫酶的不同宿主共同培養(yǎng)。在本實施方案中，可以在一步混合發(fā)酵中產(chǎn)生異抗壞血酸。
有兩種重組宿主對于直接發(fā)酵葡萄糖生成異抗壞血酸特別合適，即酵母和絲狀真菌。
在這一方面，實施例9證實，可以在酵母如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中有效表達D-GLO基因。也可以使用任何其它已知支持異源蛋白有效分泌的酵母宿主，例如多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)或馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)。實施例9中使用的表達系統(tǒng)基于葡萄糖阻遏型啟動子，因此不適于構(gòu)建發(fā)酵葡萄糖生成異抗壞血酸的重組宿主。然而，已知有基于不受葡萄糖阻遏的強啟動子的用于巴斯德畢赤酵母的同樣有效的表達系統(tǒng)，例如基于Stratagene的表達pGAPZ載體系列的表達系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以用于構(gòu)建這樣的宿主。也可以使用其它糖酵解基因啟動子。
除表達所述GLO基因外，在該發(fā)酵過程中使用的重組酵母宿主還應(yīng)當(dāng)表達葡萄糖氧化酶，如已知黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶能夠在酵母中有效表達(De Baetselier A.等Fermentation of ayeast producing A.niger glucose oxidate...Bio/Technology 9，559-561(1991).)。此外，過量表達優(yōu)選分泌型過氧化氫酶基因是發(fā)酵葡萄糖生成異抗壞血酸的酵母宿主的非常有用的附加遺傳性狀。
與酵母宿主不同，許多野生型絲狀真菌表達高水平的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶。因此，不象酵母宿主時必需遺傳工程化過量表達編碼這兩種酶的基因。對于(過量)表達D-GLO，高度表達糖酵解基因的啟動子是合適的。也可以使用在葡萄糖中培養(yǎng)時保持高活性的其它啟動子，例如真菌TEF1啟動子。
與酵母不同，許多絲狀真菌產(chǎn)生葡糖酸內(nèi)酯酶。例如，在高通氣條件下培養(yǎng)的黑曲霉中，葡糖酸內(nèi)酯酶的水平極高(Whtteveen C.F.B.等，對黑曲霉葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和內(nèi)酯酶的誘導(dǎo)，Curr.Genetics 24，408-416(1993))。葡糖酸內(nèi)酯酶與GLO競爭共同的底物葡糖酸-δ-內(nèi)酯，并因此干擾葡萄糖轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸。因此，最好應(yīng)當(dāng)使葡糖酸內(nèi)酯酶失活?；蛘咄ㄟ^對葡糖酸內(nèi)酯酶基因進行突變的遺傳方法，或者通過選擇選擇性抑制葡糖酸內(nèi)酯酶而不抑制GLO的發(fā)酵條件，可以完成所述失活。完成失活的一個優(yōu)選方法是在發(fā)酵液中加入葡糖酸內(nèi)酯酶的選擇性抑制劑。
在本發(fā)明的另一實施方案中，通過用表達足夠高水平重組D-GLO的微生物宿主發(fā)酵葡糖酸內(nèi)酯、葡糖酸或這兩種底物的混合物，由所述底物產(chǎn)生異抗壞血酸。
本發(fā)明將在下面的實施例中進一步舉例說明，但本發(fā)明不受下面的實施例的限制。
實施例1Glo活性使用葡糖酸-δ-內(nèi)酯、葡糖酸-γ-內(nèi)酯(D-葡糖酸內(nèi)酯)和葡糖酸的平衡混合物作為底物，測量GLO的活性。如下制備所述混合物將晶體葡糖酸-δ-內(nèi)酯以50％(w/v)的濃度溶于水中，并使該溶液在50℃靜置幾天。所述反應(yīng)在含有2mM羥基喹啉、12μM 2，6-二氯酚靛酚和70mM底物的50mM苯二甲酸氫鉀緩沖液，pH5.6中進行。2，6-二氯酚靛酚和底物都是緊接在測量前以貯液形式加入所述反應(yīng)混合物中。此外，在所述實驗中使用的等份底物溶液在快速調(diào)整到pH5.8后立即使用。通過記錄由于異抗壞血酸還原2，6-二氯酚靛酚引起的在600nm處光吸收時程，跟蹤所述酶促反應(yīng)。還包括一個對照，對照與所述反應(yīng)混合物的唯一不同之處是在所述測定前煮沸酶溶液2分鐘。使用通過在所述反應(yīng)混合物中加入已知量異抗壞血酸而獲得的校準曲線，計算在所述反應(yīng)中產(chǎn)生的異抗壞血酸的量。活性表示為在上述條件下、在30℃下每分鐘產(chǎn)生的異抗壞血酸微摩爾數(shù)。
實施例2從P.griseoroseum純化均一GLO使用與較早前Takahashi T等Agric.Biol.Chem.40，121-129(1976)公開的方法相似的程序，從P.griseoroseum菌株ATCC 10431純化GLO至均一。
用在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂(Difco)平板上培養(yǎng)一周的2ml P.griseoroseum孢子懸浮液接種在數(shù)個2升錐形瓶中的200ml YEPD培養(yǎng)基(2％細菌培養(yǎng)用蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中。所述培養(yǎng)物在30℃，180rpm下在旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)2天，然后用0.5 l所述培養(yǎng)物接種在15 l發(fā)酵罐中的10 l誘導(dǎo)培養(yǎng)基(8％葡萄糖，0.2％KH2PO4，0.1％(NH4)2SO4，0.1％(NH4)2CO，0.1％ NaNO3，0.1％MgSO4.7H2O，1％ MnSO4.7H2O，0.001％ ZnSO4.7H2O，0.5％ CaCO3，pH5.5)中。在一些發(fā)酵過程中使用氯霉素(2.5mg/l)和四環(huán)素(3mg/l)以避免細菌污染的危險。發(fā)酵在30℃進行60小時(通氣-5 l/min，攪拌-300rpm)。
通過在燒結(jié)的玻璃濾器上過濾而收集菌絲體，用水和緩沖液A(10mM磷酸緩沖液，pH6.5，含有0.1mM EDTA)進行洗滌。在含有1mM苯甲基磺酰氟的同樣緩沖液中，使用玻璃珠磨破碎細胞。循環(huán)進行所述破碎過程，并在所述循環(huán)之間和循環(huán)期間用冰水冷卻。調(diào)整每個循環(huán)的長度，使得所述懸浮液的溫度處于4℃-22℃的范圍內(nèi)，并調(diào)整循環(huán)的次數(shù)，達到至少90％的細胞破碎(在顯微鏡下評估)。將所述勻漿在19000xg離心30分鐘，并使用上清液來純化所述酶。
在每升細胞提取物中加入約80ml DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)，并在溫和攪拌下使所述懸浮液在4℃溫育過夜。通過過濾除去樹脂，并在相同條件下用新鮮DEAE-Sepharose處理所述濾出液。該處理除去了大部分渣滓蛋白，同時僅少量GLO吸附到樹脂上。用硫酸銨(60-100％飽和)從所述濾出液沉淀出GLO。幾次更換緩沖液A，透析所述硫酸銨沉淀物。透析后的酶溶液用足量緩沖液A稀釋，將該溶液的電導(dǎo)率降到1.25mS，然后將該溶液加樣到用同樣緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF柱(約5ml柱床體積/ml樣品)。用緩沖液A以0.15柱床體積/小時洗脫該柱，直到在280nm處的吸收降到背景值，然后用線性梯度NaCl的緩沖液A(0-100mM NaCl，總梯度體積＝2倍柱床體積)洗脫該柱。合并活性峰流分，用Amicon超濾裝置和XM50膜濃縮，然后加樣到200cm的用緩沖液A平衡的Sephacryl S-300 HR柱(Pharmacia)。以0.5cm/min的線性速率洗脫該柱。收集所述凝膠過濾柱的活性流分，將其加樣到用緩沖液A平衡的羥磷灰石柱(Bio-Gel HT，Bio-Rad)的頂端。柱床體積是所述樣品體積的0.13倍，洗脫速率是每分鐘0.1倍柱床體積。用線性梯度硫酸銨(0-75％)的緩沖液A從所述柱上洗脫GLO。梯度的總體積是約36倍柱床體積。合并最高GLO活性的流分，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析所述合并物。觀察到對應(yīng)于表觀分子量68-80kDa的單條強分散帶(diffuse band)以及約34kDa處一條非常弱的帶。表1概述了典型純化實驗結(jié)果。
實施例3GLO的氨基酸序列分析利用赫爾辛基生物技術(shù)學(xué)會蛋白分析實驗室(Protein AnalysisLaboratory.of the Institute of Biotechnology，Helsinki)的商業(yè)化服務(wù)完成所述分析。根據(jù)N-末端序列分析發(fā)現(xiàn)實施例2純化的GLO制備物是均一的。發(fā)現(xiàn)下面的N-末端序列Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln PheGlu Val Thr Nnn Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn GluHis...(SEQ ID NO.5)(“Nnn”指在該位置沒有發(fā)現(xiàn)可解釋的信號，對此最可能的解釋是存在非衍生化(underivatized)半胱氨酸殘基或糖基化氨基酸殘基)。所述蛋白進一步用4-乙烯吡啶烷基化、用Lys-C-蛋白酶消化，然后用反相HPLC從消化物中分離出幾個肽。用質(zhì)譜測得下面的肽序列肽1-Glu His Asp Arg Met Thr Val Cys Gly Pro His Phe Asp TyrAsn Ala Lys(SEQ ID NO6)；肽2-Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala Ser CysSer Pro Gln Gly Val Val(SEQ ID NO7)；肽3-Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu Gln Leu Gly IleThr Arg(SEQ ID NO8)。
實施例4分離P.griseoroseum染色體DNA如實施例2所述在YEPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)P.griseoroseum。用水和緩沖液A(實施例2)洗滌菌絲體并將其凍干。在液氮中用研缽研磨約50mg所述干菌絲體。將磨細的菌絲體懸浮于500μl提取緩沖液(250mM NaCl，25mM EDTA，200mM Tris HCl，pH8.5，0.5％ SDS)中，加入350μl苯酚，并振蕩該混合物至形成均一懸浮液。在所述懸浮液中加入150μl氯仿，然后高速離心一小時(13500rpm，臺式微型離心機)。將水相轉(zhuǎn)移到新的試管中，加入10μl 10％核糖核酸酶A溶液。將所述混合物在37℃溫育1小時。在所述溶液中加入1/10倍溫育體積的5M乙酸鈉緩沖液(pH5.4)后，加入0.6倍體積的異丙醇。通過離心回收DNA(10分鐘，13500rpm)，用70％乙醇洗2次，真空干燥并溶解于100μl水中。
實施例5克隆編碼GLO的染色體DNA片段根據(jù)GLO SEQ ID NO5-SEQ ID NO8的部分氨基酸序列，合成多種不同的寡核苷酸，并在使用P.griseoroseum染色體DNA(實施例4)作為模板的PCR中，將所述寡核苷酸作為引物進行測試。
在一臺PTC-255 DNA Engine儀器(MJ Research Inc.，MA，USA)中，使用以下程序進行PCR94℃2分鐘；10個循環(huán)的(94℃30秒；50℃45秒；72℃3分鐘)，然后是30個循環(huán)的(94℃30秒；60℃45秒；72℃3分鐘)。每個反應(yīng)在包含以下成分的15μl溶液中進行約25ng模板DNA，0.75單位Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)，每種寡核苷酸引物各0.75μM，四種脫氧核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)各200μM，1.5μl的10X濃縮緩沖液(由Taq聚合酶生產(chǎn)廠家提供)。使用常規(guī)技術(shù)，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。[Maniatis，T.等(1982)Molecular cloning.Cold Spring Harbor Laboratory]。
一對寡核苷酸引物獲得最佳結(jié)果有義寡核苷酸TAYCGITGGTTYAAYTGGCA(SEQ ID NO9)以及反義寡核苷酸CCIARYTGYTCIACIARRAAYTCRTTIACRAAYTGRCA (SEQ IDNO10)。在兩個序列中，“I”代表肌苷磷酸殘基，R-腺苷磷酸殘基和鳥苷磷酸殘基的混合物，而Y是胸苷磷酸殘基和胞苷磷酸殘基的混合物。通過瓊脂糖凝膠電泳純化用這對寡核苷酸獲得的PCR產(chǎn)物(約1.2kb)，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將所述PCR產(chǎn)物克隆進由同一生產(chǎn)廠家提供的pCR2.1-TOPO載體，得到質(zhì)粒pCR(GLO)。
實施例6構(gòu)建P.griseoroseum cDNA文庫從在誘導(dǎo)GLO產(chǎn)生的條件(實施例2)下在礦物質(zhì)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的P.griseoroseum菌絲體分離總RNA。在液氮下將所述菌絲體(在-70℃凍存)在研缽中研磨。在劇烈攪拌下，將3g磨細的菌絲體懸浮在10ml冰冷的RNA提取緩沖液(4M硫氰酸胍，0.5％月桂基肌氨酸鈉，25mM檸檬酸鈉，100mM β-巰基乙醇)中。將所述混合物在4℃下于10000rpm(SS-34轉(zhuǎn)子，Sorvall)離心6分鐘。將10ml上清液轉(zhuǎn)移到一支新試管并在其中加入4g CsCl。在隨后步驟中使用的所有溶液都用焦碳酸二乙酯處理水以及玻璃器皿制備。將所述包含RNA的溶液加到1.2ml 5.7M CsCl，0.1M EDTA，pH7的上層，并在15℃于33000rpm離心約20小時。所述沉淀用少量水快速清洗，并溶解于100μl水中。使用Oligotex Midi試劑盒(Qiagen)，按照生產(chǎn)廠家的指導(dǎo)，從該制備物分離mRNA。使用Stratagen的cDNA合成試劑盒和λZAP-eDNA Gipapack III Gold Cloning試劑盒，按照隨同這些試劑盒提供的指導(dǎo)，由P.griseoroseum mRNA制備cDNA文庫。
實施例7從P.griseoroseum cDNA文庫分離全長GLO cDNA通過EcoRI限制性消化和制備性瓊脂糖凝膠電泳從質(zhì)粒pCR(GLO)(實施例5)分離包含部分染色體GLO基因的1.2kb DNA片段。使用標準遺傳工程技術(shù)進行限制酶消化、質(zhì)粒DNA和DNA片段分離等[Maniatis，T.等(1982)Molecular cloning.Cold Spring HarborLaboratory]。使用Random Primed DNA標記試劑盒(BoehringerMannheim)和[αP32]-dCTP放射性標記所述片段。
將實施例6的λ噬菌體文庫接種到平板上，并使用所述標記的1.2kb片段，按照隨同λZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning試劑盒由Stratagene提供的手冊，通過DNA雜交篩選所述λ噬菌體文庫。按照相同手冊的方法，鑒定出許多陽性噬菌斑，從其中二十個噬菌斑中純化出重組噬菌體，并將所述重組噬菌體轉(zhuǎn)化成為質(zhì)粒形式。通過用EcoRI和XhoI限制性消化分析這二十個質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)這二十個質(zhì)粒含有不同大小的插入片段。有一個小DNA片段在所有質(zhì)粒中都存在，暗示所有這些cDNA克隆都來自同一個基因。最大的質(zhì)粒(稱為pGLO 1.8)含有約1.8kb大小的插入片段。利用Eurogentec Bel.S.A.(Belgium)的商業(yè)化服務(wù)對所述整個插入片段進行測序。序列分析揭示質(zhì)粒pGLO 1.8的所述插入片段包含GLO cDNA的完整編碼區(qū)(1443bp，包括終止密碼子)、70bp的5′-非翻譯序列和261bp的3′-非翻譯序列(SEQ ID NO1)。所述序列編碼480個氨基酸殘基的蛋白(SEQ ID NO4)。
使用由GenBank在互聯(lián)網(wǎng)上提供的BLAST服務(wù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast？Jform＝0)，將P.griseoroseum GLO的推導(dǎo)氨基酸序列與已知的蛋白氨基酸序列相比較。鑒定出許多同源蛋白序列。假如只考慮具有確定功能的蛋白，則在其它內(nèi)酯氧化酶觀察到最高的同源性，所述內(nèi)酯氧化酶例如白假絲酵母(Candida albicans)的D-阿拉伯糖酸內(nèi)酯氧化酶和大鼠的L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶。
使用由P.griseoroseum純化的GLO測定的N-末端氨基酸序列(實施例3，SEQ ID NO5)與從氨基酸殘基21開始的GLO推導(dǎo)序列(SEQID NO4)相同。這項觀察結(jié)果以及在翻譯GLO編碼序列1-20區(qū)域中疏水氨基酸殘基占優(yōu)勢有力說明P.griseoroseum GLO包含N-末端信號肽。GLO中存在信號肽是未曾預(yù)料到的，因為其它內(nèi)酯氧化酶沒有信號肽，并且已知是不分泌的。此外，P.griseoroseum GLO的推導(dǎo)序列包含8個推測性連接的糖基化位點。分離的GLO在聚丙烯酰胺凝膠電泳上表現(xiàn)為一條分散帶，提示它確實是一種糖蛋白。然而，我們已經(jīng)從P.griseoroseum的細胞提取物中分離了GLO?？梢酝茰yGLO在其天然宿主中或者從高爾基體導(dǎo)向其中一種細胞內(nèi)細胞器，或者分泌但仍保持與細胞結(jié)合。
實施例8P.griseoroseum GLO基因在異源宿主中表達由于GLO推導(dǎo)序列顯示出分泌蛋白的許多特征，因此看起來酵母分泌表達最適于測試所克隆的GLO cDNA的功能性。用于表達GLO的表達載體基于眾所周知的酵母-大腸桿菌穿梭載體pJDB207[Beggs.J.D-，見Wiliamson R.(編著)Genetic Engineering 2，Academic Press(1981)]。分兩個階段完成所述表達載體的構(gòu)建。首先，通過同時連接三個DNA片段構(gòu)建pAC109(1)得自啤酒酵母PHO5基因啟動子區(qū)的0.45kb BamHI-Eco47III片段；(2)得自啤酒酵母MFα1基因的0.38kb HaeIII-HindIII片段，所述片段包含MFα1基因的116bp的3′-非編碼區(qū)域以及對應(yīng)于酵母α因子前體蛋白的前原肽(MFα1-前原肽)序列的編碼區(qū)部分；(3)通過BamHI和HindIII限制性消化獲得的約6.5kb pJDB207片段。第二步，在pAC109的HindIII位點插入合成多接頭。
所述多接頭包括兩個寡核苷酸上面的核苷酸鏈AGCTCTCGAGATCTCCCGGGA(SEQ ID NO11)和下面的核苷酸鏈AGCTTCCCGGGAGATCTCGAG(SEQ ID NO12)。選出所述多接頭插入的取向使得所述HindIII位點位于所述Mfα1前原肽區(qū)附近的質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒命名為pGTY。
如下將所克隆的GLO基因的DNA序列修飾成為適于與Mfα1前原肽構(gòu)建融合體的形式使用質(zhì)粒pGLO 1.8作為模板，并使用兩個在所述GLO基因下游載體上退火的寡核苷酸引物進行PCR，其中“有義”引物是GAAGAAGCTTACCGGTGGTTCAATTGGCAGTTTTTGGT(SEQ IDNO13)和“反義”引物是CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG(SEQ ID NO14)。在該步驟中，在所述GLO基因中引入修飾。缺失所有5′-非編碼序列以及相當(dāng)于推定GLO編碼序列的氨基酸殘基1-20的序列，并在允許所述Mfα1-前原肽與成熟GLO按讀框融合的位置引入HindIII位點。該PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用HindIII和XhoI消化，并與用同一對限制酶消化的pGTY連接。
所得到的質(zhì)粒pGTY(GLO)(
圖1)編碼融合蛋白，所述融合蛋白由MFα1前原肽以及P.griseoroseum GLO的推定成熟部分(SEQ IDNO15)組成。
使用“鋰”轉(zhuǎn)化法[Sherman F.等，Laboratory Course Manual forMethods in Yeast Genetics，第121-122頁，Cold Spring HarborLaboratory(1986)]，將啤酒酵母菌株GRF18(ATCC 64667，基因型MATα，leu2-3，leu2-112，his3-11，his3-15)轉(zhuǎn)化為亮氨酸原養(yǎng)型。
在0.3 l SC-his培養(yǎng)基(0.67％ Yeast Nitrogen Base w/o氨基酸(Difco)，2％葡萄糖，100mg/l組氨酸；對于未轉(zhuǎn)化的對照菌株，另外以100mg/l加入亮氨酸)中，培養(yǎng)其中一種轉(zhuǎn)化克隆以及用作對照的接受體菌株直到早期靜止期(旋轉(zhuǎn)式搖床，180rpm，30℃)。使用來自這些培養(yǎng)物的酵母細胞接種兩個相同的15 l發(fā)酵罐，每個發(fā)酵罐內(nèi)含有10 l低磷酸(PEP)培養(yǎng)基。為了制備PEP培養(yǎng)基，8％的細菌培養(yǎng)用蛋白胨(Difco)用CaCl2(加至0.4M濃度)在pH11、100℃下處理5分鐘。使所述蛋白胨溶液冷卻到室溫，調(diào)整到pH5.5，通過紙和0.4μm孔徑濾膜過濾，以用作脫磷酸蛋白胨的貯液。PEP培養(yǎng)基含有2％脫磷酸蛋白胨和5％葡萄糖。發(fā)酵條件如下攪拌-300rpm，通氣-5 l/min，加入4M NaOH維持pH-5.5。以合適間隔取培養(yǎng)物樣品。通過在600nm處測定吸光度，確定細胞密度。離心去除細胞，用Centriplus膜(Amicon)濃縮培養(yǎng)基樣品約500倍，用一次性EconoPack 10 DG微型柱(BioRad)通過凝膠過濾去除所述發(fā)酵培養(yǎng)基的低分子量成分后，測定GLO活性。在發(fā)酵約60-70小時后檢測到GLO的峰水平(約2.4mU/ml)。在所述未轉(zhuǎn)化接受體菌株的對照發(fā)酵中未檢測到GLO活性。
本實驗的結(jié)果確鑿證實質(zhì)粒pGLO 1.8中的GLO基因的cDNA克隆確實是有功能的。已知啤酒酵母是分泌異源蛋白相對無效的宿主。因此，當(dāng)將所述GLO基因引入其它真菌菌種(絲狀真菌或其它具有更高分泌潛力的酵母)中時，預(yù)期重組GLO表達水平會高得多。
實施例9GLO基因在甲基營養(yǎng)酵母中的表達使用下列寡核苷酸引物通過PCR擴增所述GLO基因的編碼區(qū)CAAAGCTTCTAGAGCCTCAGACCACTCATATCACATC (SEQ IDNO14)和CCAACAATTGATGCTGAGCCCTAAGCCGGCTTTCCTGC(SEQ ID NO16)。得到的DNA片段用限制性內(nèi)切核酸酶XbaI和MfeI消化，并與用Avr II和EcoRI消化的質(zhì)粒pPIC3.5K(Multi-Copy PichiaExpression Kit，Invitrogen Corp.)連接。得到的質(zhì)粒PPIC3.5K(GLO 51-3)包含處于巴斯德畢赤酵母AOXI啟動子控制下的所述GLO基因的完整編碼區(qū)(圖5)。
使用Invitrogen推薦的方法，用PPIC3.5K(GLO 51-3)轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株GS115。
在BMGY(酵母提取物-1％蛋白胨-2％磷酸鉀緩沖液，pH6.0-100mM，1％甘油，1.34％ Yeast Nitrogen Base(Difco)，0.4mg/l生物素)中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)數(shù)個獨立獲得的轉(zhuǎn)化克隆(30℃，200rpm)。在達到早期靜止期后，通過低速(4000rpm)離心收集細胞，重懸浮并在等體積的BMMY中培養(yǎng)過夜，BMMY與BMGY相同，只是用0.5％甲醇取代了甘油。
這些實驗中在培養(yǎng)物上清中檢測到的最高GLO表達水平是約0.4-0.5U/ml。該值是啤酒酵母中的GLO表達水平的約200倍。
實施例10純化巴斯德畢赤酵母產(chǎn)生的重組GLO為了制備性分離重組GLO，使用基本如(K.Sreckrishna等Biochemistry，1989，28，4117-4125)中所述的分批模式，在10 l發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組巴斯德畢赤酵母菌株GS115∷pPIC3.5(GLO 51-3)。
培養(yǎng)完成后，離心分離細胞，將澄清后的培養(yǎng)基的pH調(diào)到6.5，并加入500ml DEAE Sepharose FF。所述懸浮液在4℃下攪拌過夜，然后通過沉降收集DEAE Sepharose，將所述懸浮液加載到柱子上，用0-0.2M NaCl梯度的含有1mM EDTA的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)進行洗脫。
匯集含有最高GLO活性的流分，在實施例2所述的條件下進行羥磷灰石層析。通過丙烯酰胺凝膠電泳分析含有最高GLO活性的流分，發(fā)現(xiàn)其含有近乎均一的GLO制備物(根據(jù)考馬斯亮藍G250染色的強度判斷，約80-90％純度)。
該制備物的比活是約24U/mg蛋白，即比從藍棕青霉純化的均一GLO比活高約四倍。
實施例11固定重組GLO將1ml N-羥基琥珀酰亞胺活化的Sepharose 4 FF(Pharmacia)與0.5ml 0.35mg/ml依照實施例10純化的GLO溶液溫育，并調(diào)整到pH8.0。按照樹脂生產(chǎn)廠家的說明書進行偶聯(lián)反應(yīng)和隨后的處理。
使用輕微改變的我們的標準測定(實施例1)，測定固定GLO的活性。1ml GLO-Sepharose與10ml底物溶液(實施例1)溫和攪拌30分鐘，通過沉降分離樹脂，并在使用2，6-二氯酚靛酚的反應(yīng)中測量形成的異抗壞血酸的量。
發(fā)現(xiàn)GLO活性即固定GLO的活性(約2.5U/ml樹脂)與殘余的未結(jié)合GLO活性大致(5.5U)與在所述反應(yīng)中使用的酶量相當(dāng)。因此，在GLO固定在N-羥基琥珀酰亞胺活化的Sepharose上后，GLO保持大部分酶活。因此，固定GLO可以用于從葡糖酸內(nèi)酯生產(chǎn)異抗壞血酸。
實施例12葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸將120μl在100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中含有600U/ml葡萄糖氧化酶，1.2U/ml過氧化氫酶和1％葡萄糖的反應(yīng)混合物在35℃溫育1小時。這時，加入120μl鄰苯二甲酸鉀緩沖液pH5.6以及100μl含有約0.8活性單位的純化重組GLO溶液(實施例10)，并使反應(yīng)再進行1小時。通過冰凍終止反應(yīng)，并通過HPLC(使用L.W.Doner，K.Hicks，Anal.Biochem.115，225-230(1981)所述的條件)測量2，6-二氯酚靛酚的減少分析異抗壞血酸。發(fā)現(xiàn)所述反應(yīng)混合物含有約1.5mg/ml異抗壞血酸，相當(dāng)于產(chǎn)率約40％。
在另一個實驗中，在開放的試管中使1ml在0.1M磷酸鉀緩沖液中含有0.1mg/ml葡萄糖，0.06U/ml glo，24U/ml過氧化氫酶和800U/ml葡萄糖氧化酶的反應(yīng)混合物于室溫下溫育。形成約0.3mg/ml異抗壞血酸，相當(dāng)于約30％的產(chǎn)率。
值得注意的是，在這些實驗中沒有試圖優(yōu)化轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。例如，可以通過引入自動pH控制以及本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的其它方法進一步提高異抗壞血酸的產(chǎn)率。
說明書的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>丹尼斯科卡爾特美國有限公司(Danisco Cultor America，Inc.)<120>D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶基因以及生產(chǎn)重組D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶的方法<130>Andrei Miasnikov等<140><141><160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1774<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述青霉屬(Penicillium)D-萄糖酸內(nèi)酯cDNA<400>1gactattgca ggaatttatc ttgtgagacg atcttgttca tagtttgagc attcctattc 60ctatatcaaa atgctgagcc ctaagccggc tttcctgctg ttgctgctgc acgcagtgtt 120cggctcggcc taccgctggt tcaactggca gtttgaggtc acttgccagt ctgatgccta 180tattgctcct cataatgagc atgccgccgc cgagttcctc aaggaacagt accctaagag 240ctcccatatc aaagttgttg ggaatggtca tggatttggt aacctcacta cctgtgtcga 300caatgctctc actgagaagc ccacctacat cgtttctctc accaacctga agaagctcca 360tatcgataag aagaacttga ccgtcacctt tggtgccggc tgggatgtcg atgaccttat 420ccaagagctc aaggccaacg acttgtcctt cagcaatctc ggtgttgagc gtgttcagaa 480ctttgtgggt gctgcctcca caggtaccca cggttctgga tccgacctcg ggaatatcgc 540aacccagatt atcgggctgc gtgtattgga ctcacaggga ggcctgcgtg tcatcaacga 600gaagcacaat gcggaagaat tgaaggcttt ccgtatcagt 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1500tatctctgta taagatgtga tatgagtggt ctgaggcact cttttctttt cttttttgtc 1560agaggtgatg tggtcgtcaa tatgtcagtt ggcaaacacc ttttccaccg caacttttgt 1620cctaagaatt tttgagtgga atgggtcatt gaatgagctt cgtgtcggac ttggtggcac 1680ctcttggtgg gtttcctagt tatgtacata tatagtttct gagatagctt catgaccaat 1740tcatctacca ccagttaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1774<210>2<211>1443<212>DNA<213>未知生物<220><221>CDS<222>(1)..(1440)<220><223>未知生物描述青霉屬D-萄糖酸內(nèi)酯cDNA<400>2atg ctg agc cct aag ccg gct ttc ctg ctg ttg ctg ctg cac gca gtg 48Met Leu Ser Pro Lys Pro Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu His Ala Val1 5 10 15ttc ggc tcg gcc tac cgc tgg ttc aac tgg cag ttt gag gtc act tgc 96Phe Gly Ser Ala Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Cys20 25 30cag tct gat gcc tat att gct cct cat aat gag cat gcc gcc gcc gag 144Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu His Ala Ala Ala Glu35 40 45ttc ctc aag gaa cag tac cct aag agc tcc cat atc aaa gtt gtt ggg 192Phe Leu Lys Glu Gln Tyr Pro Lys Ser Ser His Ile Lys Val Val Gly50 55 60aat ggt cat gga ttt 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435 440 445Gln Leu Gly Ile Thr Arg Cys Ala Asn Tyr Ile Ser Val450 455 460<210>6<211>480<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述青霉屬D-萄糖酸內(nèi)酯蛋白<400>6Met Leu Ser Pro Lys Pro Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu His Ala Val1 5 10 15Phe Gly Ser Ala Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Cys20 25 30Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu His Ala Ala Ala Glu35 40 45Phe Leu Lys Glu Gln Tyr Pro Lys Ser Ser His Ile Lys Val Val Gly50 55 60Asn Gly His Gly Phe Gly Asn Leu Thr Thr Cys Val Asp Asn Ala Leu65 70 75 80Thr Glu Lys Pro Thr Tyr Ile Val Ser Leu Thr Asn Leu Lys Lys Leu85 90 95His Ile Asp Lys Lys Asn Leu Thr Val Thr Phe Gly Ala Gly Trp Asp100 105 110Val Asp Asp Leu Ile Gln Glu Leu Lys Ala Asn Asp Leu Ser Phe Ser
115 120 125Asn Leu Gly Val Glu Arg Val Gln Asn Phe Val Gly Ala Ala Ser Thr130 135 140Gly Thr His Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Asn Ile Ala Thr Gln Ile145 150 155 160Ile Gly Leu Arg Val Leu Asp Ser Gln Gly Gly Leu Arg Val Ile Asn165 170 175Glu Lys His Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Arg Ile Ser Leu Gly180 185 190Ala Leu Gly Leu Ile Thr Glu Leu Thr Ile Lys Val Gln Pro Thr Gln195 200 205Leu Leu Lys Lys Thr Thr Lys Val Leu Asn Ala Thr Ser Asp Tyr Ser210 215 220Lys Met Tyr Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Glu His Asp Arg Met225 230 235 240Thr Val Trp Gly Pro His Phe Asp Trp Asn Ala Lys Ser Gln Ser Trp245 250 255Asp Leu Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Ser Tyr Trp Glu Pro Thr Asn Tyr260 265 270Thr Gly Val Arg Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Cys Ala Asn Gly Cys Gly275 280 285Asp Cys Lys Lys Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala290 295 300Ser Cys Ser Pro Gln Gly Val Cys Ser Arg Gly Phe Tyr Ala Glu Ile305 310 315 320Glu His Phe Leu Pro Ile Glu Tyr Phe Ala Glu Ala Ala Thr Asn Tyr325 330 335Thr Ile Phe Gln Gln Gly Gln Thr Ser Arg Met Lys Ala Pro Tyr Asn340 345 350Lys Gln Met Val Met Gln His Arg Ser Leu Lys Gly Asp Asp Thr Tyr355 360 365Leu Ser Pro Val Asn Thr Tyr Asn Leu Gly Pro Asp Leu Ser Gly Val370 375 380Phe Gly Val Ile Glu Ile Asp Trp Ile Gln Glu Tyr Asn Asn Phe Thr385 390 395 400Thr Leu Trp Gln Asn Gln Glu Leu Ala His Glu Phe Leu Pro Gln Phe405 410 415Gly Glu Thr Tyr Asn Ala Arg Ser His Trp Asn Lys Met Ser Ala Pro420 425 430Asn Ala Thr Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Pro Lys Leu Pro Glu Phe Leu435 440 445Ala Ile Gln Lys Arg Gln Asp Pro Lys Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe450 455 460Leu Val Glu Gln Leu Gly Ile Thr Arg Cys Ala Asn Tyr Ile Ser Val465 470 475 480<210>7<211>24<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述青霉屬D-萄糖酸內(nèi)酯肽<220><221>不確定<222>(12)<223>位置12的Xaa是半胱氨酸或任何糖基化氨基酸殘基<400>7Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Xaa Gln Ser Asp Ala1 5 10 15Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu His20<210>8<211>17<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述青霉屬D-萄糖酸內(nèi)酯肽<400>8Glu His Asp Arg Met Thr Val Cys Gly Pro His Phe Asp Tyr Asn Ala1 5 10 15Lys<210>9<211>20<212>PRT<2l3>未知生物<220><223>未知生物描述青霉屬D-萄糖酸內(nèi)酯肽<400>9Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala Ser Cys Ser Pro1 5 10 15Gln Gly Val Val20<210>10<211>16<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述青霉屬D-萄糖酸內(nèi)酯肽<400>10Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu Gln Leu Gly I1e Thr Arg1 5 10 15<210>11<211>20<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯寡核苷酸<220><221>不確定<222>(3)<223>位置3的Y是T和C的混合物<220><221>不確定<222>(12)<223>位置12的Y是T和C的混合物<220><221>不確定<222>(15)<223>位置15的Y是T和C的混合物<220><221>不確定<222>(6)<223>位置6的N是肌苷磷酸殘基<400>11taycgntggt tyaaytggca 20<210>12<211>38<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯寡核苷酸<220><221>不確定<222>(6)<223>位置6的Y是T和C的混合物<220><221>不確定<222>(9)<223>位置9的Y是T和C的混合物<220><221>不確定<222>(21)<223>位置21的Y是T和C的混合物<220><221>不確定<222>(33)<223>位置33的Y是T和C的混合物<220><221>不確定<222>(3)<223>位置3的N是肌苷磷酸殘基<220><221>不確定<222>(12)<223>位置12的N是肌苷磷酸殘基<220><221>不確定<222>(15)<223>位置15的N是肌苷磷酸殘基<220><221>不確定<222>(27)<223>位置27的N是肌苷磷酸殘基<400>12ccnarytgyt cnacnarraa ytcrttnacr aaytgrca 38<210>13<211>21<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯寡核苷酸<400>13agctctcgag atctcccggg a 21<210>14<211>21<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯寡核苷酸<400>14agcttcccgg gagatctcga g 21<210>15<211>38<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯寡核苷酸有義引物<400>15gaagaagctt accggtggtt caattggcag tttttggt 38<210>16<211>37<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯寡核苷酸反義引物<400>16caaagcttct agagcctcag accactcata tcacatc 37<210>17<211>549<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯融合蛋白<400>17Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln85 90 95Phe Leu Val Thr Cys Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu100 105 110His Ala Ala Ala Glu Phe Leu Lys Glu Gln Tyr Pro Lys Ser Ser His115 120 125Ile Lys Val Val Gly Asn Gly His Gly Phe Gly Asn Leu Thr Thr Cys130 135 140Val Asp Asn Ala Leu Thr Glu Lys Pro Thr Tyr Ile Val Ser Leu Thr145 150 155 160Asn Leu Lys Lys Leu His Ile Asp Lys Lys Asn Leu Thr Val Thr Phe165 170 175Gly Ala Gly Trp Asp Val Asp Asp Leu Ile Gln Glu Leu Lys Ala Asn180 185 190Asp Leu Ser Phe Ser Asn Leu Gly Val Glu Arg Val Gln Asn Phe Val195 200 205Gly Ala Ala Ser Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Asn210 215 220Ile Ala Thr Gln Ile Ile Gly Leu Arg Val Leu Asp Ser Gln Gly Gly225 230 235 240Leu Arg Val Ile Asn Glu Lys His Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe245 250 255Arg Ile Ser Leu Gly Ala Leu Gly Leu Ile Thr Glu Leu Thr Ile Lys260 265 270Val Gln Pro Thr Gln Leu Leu Lys Lys Thr Thr Lys Val Leu Asn Ala275 280 285Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Met Tyr Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Lys290 295 300Glu His Asp Arg Met Thr Val Trp Gly Pro His Phe Asp Trp Asn Ala305 310 315 320Lys Ser Gln Ser Trp Asp Leu Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Ser Tyr Trp325 330 335Glu Pro Thr Asn Tyr Thr Gly Val Arg Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Cys340 345 350Ala Asn Gly Cys Gly Asp Cys Lys Lys Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu355 360 365Val Thr Asp Ala Ala Ser Cys Ser Pro Gln Gly Val Cys Ser Arg Gly370 375 380Phe Tyr Ala Glu Ile Glu His Phe Leu Pro Ile Glu Tyr Phe Ala Glu385 390 395 400Ala Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Phe Gln Gln Gly Gln Thr Ser Arg Met405 410 415Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Gln Met Val Met Gln His Arg Ser Leu Lys420 425 430Gly Asp Asp Thr Tyr Leu Ser Pro Val Asn Thr Tyr Asn Leu Gly Pro435 440 445Asp Leu Ser Gly Val Phe Gly Val Ile Glu Ile Asp Trp Ile Gln Glu450 455 460Tyr Asn Asn Phe Thr Thr Leu Trp Gln Asn Gln Glu Leu Ala His Glu465 470 475 480Phe Leu Pro Gln Phe Gly Glu Thr Tyr Asn Ala Arg Ser His Trp Asn485 490 495Lys Met Ser Ala Pro Asn Ala Thr Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Pro Lys500 505510Leu Pro Glu Phe Leu Ala Ile Gln Lys Arg Gln Asp Pro Lys Cys Gln515 520 525Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu Gln Leu Gly Ile Thr Arg Cys Ala530 535 540Asn Tyr Ile Ser Val545<210>18<211>38<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述D-萄糖酸內(nèi)酯寡核苷酸<400>18ccaacaattg atgctgagcc ctaagccggc tttcctgc 38
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，該核酸分子編碼D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，所述核酸分子分離自真菌。
3.權(quán)利要求2的核酸分子，所述核酸分子分離自青霉屬(Pencicillium)真菌。
4.權(quán)利要求3的核酸分子，所述核酸分子分離自Penicilliumgriseoroseum、特異青霉(Pencillium notatum)、藍青霉(Penicilliumcyaneum)或斜臥青霉(Penicillium decumbens)。
5.權(quán)利要求4的核酸分子，所述核酸分子分離自Penicilliumgriseoroseum。
6.一種分離的核酸分子，該核酸分子包括SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3。
7.一種分離的核酸分子，當(dāng)與SEQ ID NO4的氨基酸序列比較時，所述核酸分子編碼蛋白具有至少約70％序列同一性。
8.一種分離的核酸分子，該核酸分子在嚴格條件下與權(quán)利要求6中的任一種核酸雜交。
9.一種表達載體，它包含權(quán)利要求1-8中任一項的核酸分子。
10.一種轉(zhuǎn)化宿主細胞，該宿主細胞包含權(quán)利要求9的表達載體。
11.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，它還存在至少一種添加、缺失、插入或突變，其中所述核酸分子編碼具有酶促活性的D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶。
12.一種D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶蛋白，它是由權(quán)利要求1-8和11中任一項的核酸分子編碼的D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶蛋白。
13.一種生產(chǎn)D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求10的細胞，以及從所述培養(yǎng)物回收D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶。
14.一種D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶，該氧化酶具有SEQ ID NO4。
15.一種轉(zhuǎn)化葡萄糖成為異抗壞血酸的方法，該方法包括使葡萄糖與葡萄糖氧化酶接觸形成D-葡糖酸內(nèi)酯，然后使所述D-葡糖酸內(nèi)酯與由權(quán)利要求1-8和11的核酸編碼的D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶在足以產(chǎn)生異抗壞血酸的條件下接觸一定時間。
16.一種轉(zhuǎn)化D-葡糖酸內(nèi)酯成為異抗壞血酸的方法，該方法包括使所述D-葡糖酸內(nèi)酯與權(quán)利要求1-8和11的D-葡糖酸內(nèi)酯氧化酶在足以產(chǎn)生異抗壞血酸的條件下接觸一定時間。
17.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括回收所述異抗壞血酸。
18.權(quán)利要求16的方法，所述方法還包括回收所述異抗壞血酸。
19.一種異抗壞血酸，它是使用權(quán)利要求15的方法生產(chǎn)的異抗壞血酸。
20.一種異抗壞血酸，它是使用權(quán)利要求16的方法生產(chǎn)的異抗壞血酸。
21.權(quán)利要求15的方法，其中所述葡萄糖與所述葡萄糖氧化酶在過氧化氫酶存在下接觸。
22.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述宿主細胞還包含表達葡萄糖氧化酶的基因。
23.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述宿主細胞還包含表達過氧化氫酶的基因。
24.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母。
25.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中所述宿主細胞是絲狀真菌。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于分離編碼D－葡糖酸內(nèi)酯氧化酶(D－GLO)的核酸分子,所述D－葡糖酸內(nèi)酯氧化酶用于通過轉(zhuǎn)化D－葡糖酸內(nèi)酯而生產(chǎn)異抗壞血酸。設(shè)想了對所述核酸分子的各種改進,包括保持天然D－GLO的酶促活性的編碼蛋白。優(yōu)選利用本發(fā)明核酸以合適表達載體轉(zhuǎn)化的各種宿主細胞產(chǎn)生D－葡糖酸內(nèi)酯氧化酶的重組方法。還設(shè)想了在轉(zhuǎn)化葡萄糖、尤其是轉(zhuǎn)化D－葡糖酸內(nèi)酯成為異抗壞血酸的過程中利用本發(fā)明的D－GLO的方法。
文檔編號C12P7/58GK1379822SQ00814350
公開日2002年11月13日 申請日期2000年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月20日
發(fā)明者A·米亞斯尼科夫, T·薩盧斯亞維, H·奧亞莫 申請人:丹尼斯科卡爾特美國有限公司