專利名稱：具有生理活性作用的新物質(zhì)、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的糖苷化合物，含有其作為有效成分的生理活性物質(zhì)，它們的制備方法和用途。更具體地說，本發(fā)明涉及含有異麥芽酚作為苷元的糖苷(葡糖苷)，含有該葡糖苷作為有效成分的生理活性物質(zhì)，其制備方法和用途。
本發(fā)明人已提交了關(guān)于用擔(dān)子菌(屬于擔(dān)子菌綱的菌)培養(yǎng)物作為人單核細(xì)胞干擾素-γ(IFN-γ)、白介素12(IL-12)等細(xì)胞因子產(chǎn)生能力恢復(fù)劑的專利申請(特愿平11-283223號)。
這種擔(dān)子菌的培養(yǎng)物中包含的生理活性已在下列文獻(xiàn)中描述“水溶性木質(zhì)素”(特公平6-88909號)、“主要包含多糖和玉米素相關(guān)物質(zhì)的細(xì)胞因子類活性物質(zhì)的復(fù)合物”(特公昭62-36009號)、“新的多糖物質(zhì)”(特開平8-259602號)等。如這些申請所示，擔(dān)子菌培養(yǎng)物包含多種類型的生理活性物質(zhì)，但是，沒有一種生理活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)能夠被確定到通過儀器分析，尤其是光譜法(包括核磁共振等)而清楚地確認(rèn)它的存在。
而且，在常規(guī)方法中，用植物組織材料使培養(yǎng)物包含多種不同類型的有機物，由于缺乏目的化合物的結(jié)構(gòu)信息，通過儀器分析，即使使用柱色譜法等分離手段也難以識別含有目的物質(zhì)的部分，因此，難以有效分離和制備具有優(yōu)良生理活性作用的成分。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于闡明本申請人長期關(guān)注的擔(dān)子菌培養(yǎng)物中所含的生理活性成分中的主要物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，明確有效制備該物質(zhì)的條件，提供利用該物質(zhì)的生理活性作用的食品、藥品和飼料的用途。
也就是說，本發(fā)明涉及以下具有生理活性作用的新物質(zhì)，它們的制備方法和用途。
1.式(I)表示的包含異麥芽酚作為苷元的糖苷 式中，Sug是葡萄糖殘基或由兩個或更多個葡萄糖單元組成的糖鏈。
2.前述1所述的糖苷，其由式(II)表示 式中，n為0或1或更大的整數(shù)。
3.前述2所述的糖苷，其中，n為1-20。
4.前述1-3之任一項所述的糖苷，其中，所述的糖苷通過以下方法得到使通過培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液與米糠提取液和酶的反應(yīng)液反應(yīng)，然后通過柱色譜分離所述的糖苷。
5.前述式(II)中n為0的式(III)表示的2-乙?；?3-羥基呋喃-3-O-α-D-吡喃糖苷 6.包含前述1或2所述的糖苷作為有效成分的生理活性物質(zhì)。
7.前述6所述的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的生理活性作用是提高人細(xì)胞的細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力的作用。
8.前述7所述的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的細(xì)胞因子為腫瘤壞死因子(TNF-α)。
9.前述7所述的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的細(xì)胞因子為干擾素-γ(IFN-γ)。
10.前述7所述的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的細(xì)胞因子為白介素-2(IL-2)。
11.式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制備方法 式中的符號的意義與前述1中所述相同，所述方法包括以下步驟使通過培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液與米糠提取液和酶的反應(yīng)液反應(yīng)，然后進(jìn)行分離。
12.前述10中所述的式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制備方法，所述方法包括以下步驟使通過培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液與米糠提取液和酶的反應(yīng)液反應(yīng)；然后通過柱色譜，用表現(xiàn)出以下特征的成分作為指標(biāo)，分離所述的糖苷(1)1H-NMR譜顯示的由甲基酮的甲基氫導(dǎo)致的峰和AB系統(tǒng)特征的由2，3-二取代呋喃環(huán)的4，5-位氫導(dǎo)致的峰，(2)13C-NMR譜顯示的由吡喃葡萄糖導(dǎo)致的6個峰和由異麥芽酚導(dǎo)致的6個峰。
13.含有前述6-10之任一項所述的具有生理活性作用的物質(zhì)的食品。
14.含有前述6-10之任一項所述的具有生理活性作用的物質(zhì)的藥品。
15.含有前述6-10之任一項所述的具有生理活性作用的物質(zhì)的飼料。
圖2顯示給予本發(fā)明的物質(zhì)A(通式(III)的化合物)、本發(fā)明的物質(zhì)B(通式(I)的化合物)和本發(fā)明的粗產(chǎn)物(CR)后，脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-α濃度的測定結(jié)果。
圖3顯示給予本發(fā)明的物質(zhì)A(通式(III)的化合物)、本發(fā)明的物質(zhì)B(通式(I)的化合物)和本發(fā)明的粗產(chǎn)物(CR)后，脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-2濃度測定結(jié)果。
圖4顯示給予本發(fā)明的物質(zhì)A(通式(III)的化合物)、本發(fā)明的物質(zhì)B(通式(I)的化合物)和本發(fā)明的粗產(chǎn)物(CR)后，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α濃度的測定結(jié)果。
圖5顯示給予本發(fā)明的物質(zhì)A(通式(III)的化合物)、本發(fā)明的物質(zhì)B(通式(I)的化合物)和本發(fā)明的粗產(chǎn)物(CR)后，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ濃度的測定結(jié)果。
發(fā)明詳述以下詳細(xì)說明本發(fā)明。(A)糖苷化合物本發(fā)明的糖苷化合物是式(I)表示的含有異麥芽酚作為苷元的新的糖苷 所述糖苷化合物通過以下方法得到使通過培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液與米糠提取液和酶的反應(yīng)液(下文簡稱為米糠提取液·酶反應(yīng)液)反應(yīng)，然后通過柱色譜法進(jìn)行分離(后文將詳細(xì)描述)。上式中，Sug是葡萄糖殘基或由兩個或更多個葡萄糖單元組成的糖鏈。
異麥芽酚是下式表示的用作香料成分的物質(zhì) 已有以異麥芽酚作為苷元的糖苷，其例子是半乳糖苷(糖部分為半乳糖的糖苷)(J.Bartulin等，J.Heterocycle Chem.，29，1017(1992)，“Syntheses of 2-Acetyl-3-hydroxy-1-n-propylpyrrole from isomaltoland 1-n-alkyl-3-hydroxy-2-methyl-4-pyridones from maltol”(由異麥芽酚合成2-乙酰基-3-羥基-1-正丙基吡咯和由麥芽酚合成1-正烷基-3-羥基-2-甲基-4-吡啶酮))，但是，還沒有含有異麥芽酚葡糖苷(糖部分由葡萄糖單元組成的糖苷)的報道，也不知道其功能。
在Sug包含兩個或更多個葡萄糖單元的情況下，對糖鏈的長度沒有特別的限制。根據(jù)本發(fā)明的方法，n為1-20的葡萄糖單元的混合物占反應(yīng)生成的固體成分的約10％。糖鏈(Sug)含α(1→6)鍵或含一部分其它鍵，其可以包含部分支鏈，但是，它是主要通過α(1→4)鍵連接的直鏈的糖鏈。
新的糖苷化合物的典型的結(jié)構(gòu)如式(II)所示 式中，n為0或1或更大的整數(shù)。
例如，前述式(II)中n為0的式(III)表示的含有一個葡萄糖單元的化合物，新的2-乙?；?3-羥基呋喃-3-O-α-D-吡喃葡糖苷可以由本發(fā)明的方法分離或通過化學(xué)合成制備 (B)生理活性物質(zhì)上述本發(fā)明的新的糖苷化合物具有優(yōu)良的生理活性作用。
這些生理活性作用例如免疫增強/活化、巨噬細(xì)胞活化等性質(zhì)，特別是提高人細(xì)胞的細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力。
由本發(fā)明的生理活性物質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的實例是腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)等，但是，其并不限于這些。
腫瘤壞死因子TNF-α是具有殺傷腫瘤細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)，其是對感染、創(chuàng)傷或免疫誘導(dǎo)反應(yīng)而全身或局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子。干擾素(IFN)是在受到病毒或核酸刺激時產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的抗病毒蛋白質(zhì)，已知其不僅顯示抗病毒作用，還顯示抗腫瘤作用和活化免疫系統(tǒng)等多種活性。IFN-γ是由T細(xì)胞等產(chǎn)生的。白介素-2(IL-2)具有使腫瘤縮小或消失的效果。(C)制備和分離方法上述的式(I)表示的具有生理活性作用的化合物是從來未報道過的新物質(zhì)，本發(fā)明人已確認(rèn)，它們不存在于擔(dān)子菌培養(yǎng)液或米糠提取液·酶反應(yīng)液中，且在最初將米糠加到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)也沒有生成，它們僅在擔(dān)子菌培養(yǎng)液與米糠提取液·酶反應(yīng)液反應(yīng)液中生成。
以前，在含有植物組織材料的培養(yǎng)基中進(jìn)行擔(dān)子菌的培養(yǎng)，但是意外的是，通過使培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液反應(yīng)，得到了具有高生理活性作用的物質(zhì)。(C-1)擔(dān)子菌培養(yǎng)液在本發(fā)明的生理活性物質(zhì)的制備方法中使用的擔(dān)子菌培養(yǎng)液是通過在適于擔(dān)子菌生長的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液。
液體培養(yǎng)基的碳源的實例包括葡萄糖、蔗糖(sucrose)、麥芽糖、蔗糖(saccharose)、高級白糖、黑糖、糖蜜、廢糖蜜、麥芽提取液等。
氮源的實例包括肉提取液、蛋白胨、面筋粉、大豆粉、干酵母、酵母提取液、硫酸銨、酒石酸銨、尿素等。此外，如果需要，可以添加鈉鹽、鎂鹽、錳鹽、鐵鹽、鈣鹽和磷酸酸等無機鹽類，肌醇、維生素B1鹽酸鹽、L-天冬酰胺和生物素等維生素類。
優(yōu)選的液體培養(yǎng)基的組成可以根據(jù)擔(dān)子菌的菌株而變，例如是含有麥芽提取液(1-5％)、酵母提取液(0.1-0.5％)和酒石酸銨(0.1-0.4％)。
用于本發(fā)明的擔(dān)子菌的實例包括埃杜香菇(Lentinum edodes)、雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)、多葉奇果菌(Grifola frondosa)、Phoriotanameko、糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)、冬菇(Flammulinavelutipes)、透明靈芝(Ganoderma lucidum)、木耳(Auriculariaauricura)、平蓋靈芝(Ganoderma applanalum)、透明革蓋菌(Corioluslucidum)、Grifola umbellate、Shizophyllum commune、草菇小包腳菇(Volvariella volvaceae)等，特別優(yōu)選埃杜香菇(Lentinum edodes)和多葉奇果菌(Grifola frondosa)。
根據(jù)通常的中溫菌的通氣培養(yǎng)，在pH2-6和10-45℃，優(yōu)選15-30℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間取決于菌的量和培養(yǎng)基的種類，通常進(jìn)行4-20天，優(yōu)選6-12天。
培養(yǎng)后，進(jìn)行固液分離并將液體成分用于接著與米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)。(C-2)米糠提取液·酶反應(yīng)液米糠提取液是通過在等量或更多(例如2-10倍)的熱水中攪拌處理米糠而提出的水溶液。此時，優(yōu)選使用105-130℃的加壓熱水。然后，加入酶試劑使米糠反應(yīng)后，通過潷析器等進(jìn)行固液分離，得到米糠提取液·酶反應(yīng)液。
作為酶試劑，可以單獨或組合其中兩種或多種使用α-淀粉酶、纖維酶、果膠酶等碳水化合物水解酶?？梢圆⒂玫鞍酌傅鹊鞍姿饷浮Ａ硗?，酶反應(yīng)在不損失酶活性的條件下進(jìn)行，即在40℃-90℃，優(yōu)選在40-70℃下進(jìn)行1-24小時，優(yōu)選進(jìn)行3-12小時。(C-3)擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)優(yōu)選在40-90℃，更優(yōu)選40-70℃的溫度下進(jìn)行。通常，將二者混合，反應(yīng)8-24小時。然后，在加壓下，在例如120℃或更高溫度下，通過加熱全部液體使液體中的酶等失活，如需要，進(jìn)行分離純化。
對分離純化的方法沒有特別的限制，可以使用各種分離方法，但從經(jīng)濟的角度考慮，柱色譜是優(yōu)選的。
在來自擔(dān)子菌的常規(guī)生理活性物質(zhì)中，由于缺乏有關(guān)目的化合物的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，柱的構(gòu)成和洗脫劑的選擇以試驗-和-誤差(trial-and-error)的方式，通過可能有多種解釋的呈色反應(yīng)或需要很長時間進(jìn)行判斷的生物學(xué)檢查確定，然而，在本發(fā)明中，由于目的生理活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)已被闡明，可以在其結(jié)構(gòu)式的基礎(chǔ)上根據(jù)親水性、分子量和其它性質(zhì)而容易地選擇柱的構(gòu)成和洗脫劑。而且，可以通過使用以下光譜特征作為指標(biāo)而快速識別目的部分。
(1)1H-NMR光譜顯示由甲基酮的甲基氫導(dǎo)致的峰和由2，3-二取代呋喃環(huán)的4，5-位的氫導(dǎo)致的AB系統(tǒng)的峰。
(2)13C-NMR顯示的由吡喃葡萄糖導(dǎo)致的6個峰和由異麥芽酚導(dǎo)致的6個峰。
甲基酮的甲基氫導(dǎo)致的峰出現(xiàn)在δ2.48(3H，s)附近。確認(rèn)2，3-二取代呋喃環(huán)的4，5-位的氫導(dǎo)致的峰為δ6.78和7.67附近的AB系統(tǒng)(兩者的值均為在氘代甲醇中的值)。
此外，可以參照3000-3700cm-1(羥基)、1660cm-1(共軛羰基)和1584cm-1(雙鍵)的紅外吸收等。(E)用途本發(fā)明的生理活性物質(zhì)使用過去提供作為食用的安全原料(米糠提取液和食用菌的擔(dān)子菌培養(yǎng)液)，其混有有毒性的副產(chǎn)品的可能性及低。因此，其本身可以廣泛地用作保健品、藥品或強化食品添加劑、飼料等。
為了這些用途，例如用作保健品，根據(jù)目的濃縮、純化前述(C-3)的過程得到的生理活性物質(zhì)。本發(fā)明的生理活性物質(zhì)對熱相對穩(wěn)定，但是，優(yōu)選使用冷凍干燥進(jìn)行濃縮和干燥。如果必要，可以使用食品添加劑、賦形劑進(jìn)行配方。
藥品包括人用和動物用的藥物。在將本發(fā)明的產(chǎn)品作為藥物給予的情況下，可以使用上式(I)的生理活性物質(zhì)本身或者添加有藥學(xué)可接受的無毒、惰性載體而得到的藥物組合物。作為載體，可以使用固體、半固體或液體稀釋劑、填充劑和其它配方的助劑。
這些藥品可以靜脈內(nèi)給藥、口服給藥、組織內(nèi)給藥、局部給藥(經(jīng)皮給藥等)或經(jīng)直腸給藥。劑型是適于其給藥方法的形狀。
作為飼料，可以列舉牛、豬、雞、羊等家畜和家禽的飼料，魚或甲殼類等的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)用的飼料，狗、貓和其它寵物用的飼料。
可以預(yù)期在減輕近年來在畜產(chǎn)業(yè)中成為問題的使用大量抗生素的問題的效果。以上生理活性物質(zhì)可以單獨口服給予，但優(yōu)選與各種糖苷、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、纖維、維生素類、礦物質(zhì)等一起用作散劑或丸狀的飼料。對脂質(zhì)和纖維的種類沒有特別的限制，可以使用任何可以用作魚、肉骨粉、大豆粉、苜蓿粉和糠等飼料的物質(zhì)。
通過強制口服給予6周齡雄性C57/BL6小鼠1周的1g/kg樣品進(jìn)行生理活性試驗，之后處死動物，收集脾細(xì)胞和腹膜滲出細(xì)胞(PEC)，分別進(jìn)行培養(yǎng)并測定TNF-α、IFN-γ和IL-2。a)脾細(xì)胞的培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中均化所收集的小鼠的脾，接著在4℃離心分離(1000rpm，5分鐘)，向其中加入ACK溶解緩沖液并保溫(37℃，3分鐘)以除去紅細(xì)胞，然后離心分離(1000rpm，5分鐘)。向這樣收集的脾細(xì)胞中加入終濃度為10μg/ml的ConA并在微量培養(yǎng)板中培養(yǎng)，15小時后，收集培養(yǎng)上清，測定TNF-α、IFN-γ和IL-2。b)PEC培養(yǎng)用生理鹽水從小鼠腹腔收集PEC(腹膜滲出細(xì)胞)，通過離心分離(1000rpm，10分鐘)收集細(xì)胞，此細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞，向其中加入終濃度為100ng/ml的LPS(脂多糖)并進(jìn)行培養(yǎng)，4小時后，測定培養(yǎng)上清中的TNF-α、IFN-γ和IL-2。
對于以上a)和b)，使用用于測定細(xì)胞因子的試劑盒(和光純藥(株))。實施例1生理活性物質(zhì)的確認(rèn)在24℃下，在含有麥芽提取液(2％)、酵母提取液(0.25％)和酒石酸銨(0.2％)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)埃杜香菇(Lentinum edodes)10天以制備擔(dān)子菌培養(yǎng)液。
另外，將米糠分散在5倍(質(zhì)量)的水中，并在120℃的液體溫度下攪拌20分鐘以進(jìn)行提取，然后加入由α-淀粉酶和果膠酶組成的酶試劑，并在60℃下反應(yīng)120分鐘，然后用潷析器進(jìn)行固液分離，回收液體部分以制備米糠提取液·酶反應(yīng)液。
擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液都不顯示任何生理活性。
另一方面，將由上述操作得到的擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液混合，在60℃下攪拌20小時，進(jìn)行反應(yīng)，然后，在120℃或更高溫度下將全部液體加熱20分鐘以使液體中的酶失活，濃縮反應(yīng)液，將得到的濃縮液80ml(水分75％)通過500ml容量的DIAIONHP-20柱，用甲醇洗脫，為了在洗脫液中觀察生理活性，重復(fù)該操作兩次以得到棕色部分(5.6g)。
接著，通過各種色譜法檢測該部分中的生理活性成分，進(jìn)行硅膠色譜(Kiesel，由Merck & Co.，Inc.生產(chǎn)，125-400目，50g)，然后進(jìn)行ODS反相凝膠柱色譜(約100ml容量)，獲得白色粉末狀生理活性組分(40mg)。
所得的物質(zhì)具有以下物理性質(zhì)(i)質(zhì)譜(二級離子質(zhì)譜(SIMS))負(fù)離子化測定顯示m/z287的分子離子峰，正離子化測定顯示m/z289的分子離子峰，顯示本化合物的分子量為288。而且，結(jié)合這些離子峰的高分辨質(zhì)譜的結(jié)果，推定分子式為C12H16O8(不飽和度5)。(ii)IR光譜確認(rèn)了3000-3700cm-1處羥基導(dǎo)致的吸收、1660cm-1處共軛羰基導(dǎo)致的吸收和1584cm-1處雙鍵導(dǎo)致的吸收。(iii)1H-NMR譜(在氘代甲醇中，270MHz)觀察到由甲基酮導(dǎo)致的δ2.48(3H，s)的信號和由α-D-吡喃葡萄糖環(huán)導(dǎo)致的δ3.4-5.6的信號，以及偶合常數(shù)為1.9Hz的由AB系統(tǒng)導(dǎo)致的δ6.78和δ7.67處的峰。(iv)13C-NMR譜(在氘代甲醇中，67.5MHz，DEPT測定法)觀察到12個信號，除了由α-D-吡喃葡萄糖環(huán)導(dǎo)致的6個信號之外，還觀察到δ27.4(伯)、δ105.9和139.3(均為叔)、δ148.5、154.3和187.4(均為季)的由醇部分導(dǎo)致的6個信號。
1H-NMR中低磁場AB系統(tǒng)的特征在于偶合常數(shù)為1.9Hz下的2，3-二取代呋喃環(huán)的4，5-位氫的信號。分子式的不飽和度為5，對應(yīng)于一個吡喃糖環(huán)、兩個雙鍵、一個羰基和一個呋喃環(huán)。根據(jù)以上信息，證明所得物質(zhì)是由下式表示的新物質(zhì)(2-乙酰基-3-羥基呋喃-3-O-α-D-吡喃葡糖苷，下文簡稱為“物質(zhì)A”) 物質(zhì)A的制備過程的確認(rèn)以上述相同的方式，追蹤擔(dān)子菌培養(yǎng)液、米糠提取液·酶反應(yīng)液、二者的反應(yīng)液等中存在的物質(zhì)A的增多和減少，結(jié)果是，證明物質(zhì)A僅在擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)液中生成。在擔(dān)子菌培養(yǎng)液、米糠提取液·酶反應(yīng)液中均不存在物質(zhì)A，這表明物質(zhì)A僅通過二者的反應(yīng)開始生成。實施例2物質(zhì)A的化學(xué)合成根據(jù)J.Bartulin等，J.Heterocycle Chem.，29，1017(1992)，Syntheses of 2-acetyl-3-hydroxy-1-n-propylpyrrole from isomaltol and 1-n-alkyl-3-hydroxy-2-methyl-4-pyridones from maltol(由異麥芽酚合成2-乙酰基-3-羥基-1-正丙基吡咯和由麥芽酚合成1-正烷基-3-羥基-2-甲基-4-吡啶酮)中記載的以乳糖作為原料化學(xué)衍生半乳糖基異麥芽酚的反應(yīng)例，用麥牙糖代替乳糖進(jìn)行衍生。(a)化學(xué)衍生反應(yīng)在50ml容量的茄型瓶中稱取3.60g(0.01mol)麥芽糖一水合物，并加入3.0ml無水乙醇，用放入其中的攪拌子劇烈攪拌進(jìn)行分散。此時，保持以下狀態(tài)攪拌麥芽糖一水合物的不溶部分使其無局部化地均勻分散在整個無水乙醇中。在劇烈攪拌時，加入1.0m1哌啶并均勻混合，然后，在約15分鐘內(nèi)用移液管緩慢滴加0.44ml乙酸。將裝有水冷凝管的茄型瓶置于調(diào)節(jié)至78℃的硅油浴中進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)熱分布在瓶內(nèi)并開始部分沸騰時，加入約0.5ml三乙胺。在放置燒瓶以后，麥芽糖一水合物由于熱而開始溶解，溶液由黃色變成棕色。約12小時后，加入相同體積的三乙胺以保持堿性。24小時后，從回流裝置中取出燒瓶，并在繼續(xù)進(jìn)行純化操作前使燒瓶的溫度恢復(fù)到室溫。此時，反應(yīng)物的性狀是深棕色焦油狀物質(zhì)。
用摻有熒光劑的硅膠制得的板對反應(yīng)物進(jìn)行TLC分析(氯仿/甲醇/水(65∶25∶4混合液))，結(jié)果是在與物質(zhì)A相同的Rf值(約0.5)處觀察到用主波長254nm的紫外線照射時有吸收的點。當(dāng)噴以茴香醛-硫酸顯色劑并加熱時，斑點變黃并進(jìn)一步變成深藍(lán)色。(b)純化(b-1)LH-20凝膠初步純化使必要體積的LH-20凝膠預(yù)先通過甲醇/水(1∶2)以使其平衡，并負(fù)載與最少量的相同溶劑混合的反應(yīng)液。用相同的溶劑展開，合并含有目的化合物的部分。蒸發(fā)所得的部分并濃縮至干，得到棕色油狀物(0.49g)。(b-2)硅膠柱色譜法純化在用重量為樣品的20-30倍的200目硅膠制備的柱上加樣，并進(jìn)行展開。再次用水飽和的乙酸乙酯/甲醇(3∶1)，然后用氯仿/甲醇/水混合液(飽和量的水加到4∶1氯仿/甲醇中)再次進(jìn)行色譜，蒸發(fā)純化的部分并濃縮至干，得到淡黃色樹脂狀物質(zhì)(0.49g)。(b-3)結(jié)晶用甲醇結(jié)晶該淡黃色樹脂狀物質(zhì)，得到無色針狀結(jié)晶(0.37g)。
這樣得到的物質(zhì)顯示與物質(zhì)A相同的色譜行為和NMR譜。實施例3擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)液中物質(zhì)A的存在表明擔(dān)子菌培養(yǎng)液中的生理活性物質(zhì)可能是在還原末端具有異麥芽酚結(jié)構(gòu)的各種糖鏈長度的葡糖苷。
因此，通過與實施例1相同的方法制備擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液，在60℃下攪拌20小時進(jìn)行反應(yīng)，接著將整個反應(yīng)液加熱至120℃或更高，持續(xù)20分鐘，使反應(yīng)液中的酶等失活，然后，用以下光譜特征作為指標(biāo)，尋找具有更高分子量的有效成分。
(a)1H-NMR譜顯示由甲基酮的甲基氫導(dǎo)致的峰和由2，3-二取代呋喃環(huán)的4，5-位的氫導(dǎo)致的AB系統(tǒng)峰。
(2)13C-NMR譜顯示由吡喃葡萄糖導(dǎo)致的6個峰和由異麥芽酚導(dǎo)致的6個峰。
更具體地說，在色譜柱(DIAION HP-20，容量約500ml)上負(fù)載80ml(20g固體)上述濃縮液，然后用1.5升水洗脫，將洗脫液真空干燥，得到18g粉末。將該部分溶于45ml水中，并分散在兩個離心管中，每管的量為22.5ml，在攪拌各溶液時，將4倍體積即90ml乙醇滴加，在3000rpm下離心10分鐘，合并所得的上清液，濃縮并冷凍干燥，得到粉末(12g)。將該粉末溶于50ml水中，通過柱色譜(DOWEX 50W-X8(H+型))純化，進(jìn)一步通過柱色譜(AMBERLITE IRA-400(CO32-型))純化所得的10.8g水洗脫部分，濃縮并冷凍干燥，得到8.64g水洗脫粉末，進(jìn)一步通過柱色譜(SEPHADEX G-15)進(jìn)行純化，得到2.16g符合上述(a)和(b)的成分。
所得的物質(zhì)具有以下物理性質(zhì)。
(i)1H-NMR譜(在氘代水中，270MHz)在δ6.85和7.35處檢測到推測由呋喃環(huán)上的AB系統(tǒng)導(dǎo)致的微弱、寬質(zhì)子信號。
(ii)13C-NMR譜(氘代水中)
在δ26(-C(O)CH3)、111(C-4)、141(C-3)、145(C-5)和188(-C(O)-)處觀察到推測由異麥芽酚導(dǎo)致的微弱信號。
根據(jù)上述，推測所得的物質(zhì)具有下式表示的結(jié)構(gòu) 該物質(zhì)(下文稱為“物質(zhì)B”)是在異麥芽酚和寡糖(由不同聚合度的D-葡萄糖分子組成)間的化合物的混合物(在以上通式(II)中，n＝2-20)，從事先制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的平均分子量為850。寡糖主要包括具有α-1，4糖苷鍵的葡萄糖分子，和包括部分具有α-1，6鍵或其它鍵的葡萄糖分子。
以與實施例1(2)相同的方式，追蹤擔(dān)子菌培養(yǎng)液、米糠提取液·酶反應(yīng)液、二者的反應(yīng)液等中物質(zhì)B的增多和減少，結(jié)果證明物質(zhì)B僅在擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)液中生成。在擔(dān)子菌培養(yǎng)液、米糠提取液·酶反應(yīng)液中均不存在物質(zhì)B，表明物質(zhì)B通過二者的反應(yīng)開始生成。另外，如后述的實施例4所示，確認(rèn)了物質(zhì)B也具有生理活性。實施例4比較了在實施例1中得到的物質(zhì)A和在實施例3中得到的物質(zhì)B的生理活性作用

圖1-3顯示了給予物質(zhì)A、物質(zhì)B和粗濃縮物后，在脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-2)濃度的測定結(jié)果，圖5和圖6顯示了在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子(TNF-α和IFN-γ)的濃度。結(jié)果顯示，物質(zhì)A表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力，物質(zhì)B表現(xiàn)的IFN-γ誘導(dǎo)能力優(yōu)于粗濃縮物的。
另外，對于巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)物質(zhì)A具有強的細(xì)胞因子誘導(dǎo)。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)通過將擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)液濃縮至干而得到的粉末中，含有約10％生理活性強的成分，包括一系列具有含異麥芽酚作為苷元的葡糖苷結(jié)構(gòu)的化合物。可以采用常規(guī)方法如柱色譜法，用光譜特征作為指標(biāo)，將這些化合物純化至高純度。
因此，與使用植物組織材料從擔(dān)子菌培養(yǎng)物生產(chǎn)生理活性物質(zhì)的常規(guī)方法相比，可以獲得不含雜物質(zhì)的生理活性物質(zhì)，它們可用作食品、飼料和藥品。
本發(fā)明的生理活性物質(zhì)的糖苷并不包含在擔(dān)子菌培養(yǎng)液中，它們不是僅僅通過米糠提取液與酶反應(yīng)而制備的，擔(dān)子菌培養(yǎng)液和米糠提取液·酶反應(yīng)液二者的反應(yīng)是不可欠缺的。
根據(jù)上述，物質(zhì)A可以用作以擔(dān)子菌為原料的保健品、藥品等的生產(chǎn)方法和生產(chǎn)管理中的指標(biāo)成分。也就是說，當(dāng)檢測到物質(zhì)A時，可以推定在生產(chǎn)這種產(chǎn)品中使用了擔(dān)子菌培養(yǎng)液與米糠提取液·酶反應(yīng)液的反應(yīng)。另外，物質(zhì)A的生成量隨擔(dān)子菌的培養(yǎng)方法和條件、米糠提取液·酶反應(yīng)液的制備條件(所用酶的種類、酶反應(yīng)的條件等)、兩者的反應(yīng)條件等而變化，因此，可以將物質(zhì)A用作指標(biāo)，對本發(fā)明的具有生理活性作用的新物質(zhì)的生產(chǎn)進(jìn)行管理。
權(quán)利要求
1.式(I)表示的包含異麥芽酚作為苷元的糖苷 式中，Sug是葡萄糖殘基或由兩個或更多個葡萄糖單元組成的糖鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的糖苷，其由式(II)表示 式中，n為0或1或更大的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的糖苷，其中，n為1-20。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項的糖苷，其中，所述的糖苷通過以下方法得到使通過培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液與米糠提取液和酶的反應(yīng)液反應(yīng)，然后通過柱色譜分離所述的糖苷。
5.前述式(II)中n為0的式(III)表示的2-乙?；?3-羥基呋喃-3-O-α-D-吡喃糖苷
6.包含權(quán)利要求1或2的糖苷作為有效成分的生理活性物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的生理活性作用是提高人細(xì)胞的細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力的作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的細(xì)胞因子為腫瘤壞死因子(TNF-α)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的細(xì)胞因子為干擾素-γ(IFN-γ)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的具有生理活性作用的物質(zhì)，其中，所述的細(xì)胞因子為白介素-2(IL-2)。
11.式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制備方法 式中的符號的意義與權(quán)利要求1中所述相同，所述方法包括以下步驟使通過培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液與米糠提取液和酶的反應(yīng)液反應(yīng)，然后進(jìn)行分離。
12.權(quán)利要求10中的式(I)表示的具有生理活性作用的糖苷的制備方法，所述方法包括以下步驟使通過培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的培養(yǎng)液與米糠提取液和酶的反應(yīng)液反應(yīng)；然后通過柱色譜，用表現(xiàn)出以下特征的成分作為指標(biāo)，分離所述的糖苷(1)1H-NMR譜顯示的由甲基酮的甲基氫導(dǎo)致的峰和AB系統(tǒng)特征的由2，3-二取代呋喃環(huán)的4，5-位氫導(dǎo)致的峰，(2)13C-NMR譜顯示的由吡喃葡萄糖導(dǎo)致的6個峰和由異麥芽酚導(dǎo)致的6個峰。
13.含有權(quán)利要求6-10之任一項的具有生理活性作用的物質(zhì)的食品。
14.含有權(quán)利要求6-10之任一項的具有生理活性作用的物質(zhì)的藥品。
15.含有權(quán)利要求6-10之任一項的具有生理活性作用的物質(zhì)的飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)表示的含有異麥芽酚作為苷元的新的糖苷，包含該糖苷的具有提高人細(xì)胞的細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力作用的生理活性物質(zhì)，其制備方法，以及包含該物質(zhì)的食品、藥品和飼料；式中，Sug是葡萄糖殘基或由兩個或更多個葡萄糖單元組成的糖鏈。
文檔編號A23L1/30GK1422277SQ01807800
公開日2003年6月4日 申請日期2001年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月8日
發(fā)明者藤井創(chuàng), 中川喬, 孫步祥 申請人:阿明諾化學(xué)株式會社