專利名稱：基因檢測用載體,及檢測干擾素療法有效性的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于基因檢測用載體、對個體檢測干擾素療法有效性的方法、檢測干擾素療法對個體有效性的基因檢測用裝置、及檢測干擾素療法有效性的基因檢測用試劑盒。
近年來，丙型肝炎病毒(以下稱HCV)的感染者急劇增加，已成為極大的社會問題。
和其他病毒性疾病一樣，雖然早已明確干擾素療法對丙型肝炎有一定的效果，但是，干擾素療法并不是對所有的感染者都有效，仍有不少感染者對干擾素療法沒有顯示出效果。對干擾素療法不顯示效果的感染者，仍繼續(xù)采用干擾素療法，這不僅使感染者引起發(fā)燒和貧血等副作用，而且也延誤了其他方法的治療。
因此，迫切希望對實施治療的所有HCV感染者，在治療前預測干擾素療法是否有效，但是到目前為止，進行這種預測完全是不可能的。
本發(fā)明的目的就是提供在治療前預測干擾素療法對患者是否有效的方法。
上述目的通過下述的本發(fā)明即可達到。
根據(jù)本發(fā)明的第一個側(cè)面，提供一種基因檢測用載體，其特征是具有基體和在該基體上固定化而形成的多核苷酸，上述多核苷酸包括從以下組中選取的多核苷酸，即(at)下述序列表中序列1所示的多核苷酸、(bt)對上述(at)所示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1的441～455位所示的序列的多核苷酸、(dt)含有序列1的449～459位所示的序列的多核苷酸、(et)上述的互補鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第二個側(cè)面，提供一種基因檢測用載體，其特征是具有基體和在該基體上固定化而形成的多核苷酸。上述多核苷酸包括從以下組中選取的多核苷酸，即，(ag)下述序列表中序列2所示的多核苷酸、(bg)對上述(ag)所示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cg)含有序列2的441～455位所示的序列的多核苷酸、(dg)含有序列2的449～459位所示的序列的多核苷酸、(eg)上述的互補鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第三個側(cè)面，提供一種基因檢測用載體，特征是具有基體和固定在該基體上而形成的多核苷酸。該多核苷酸包括從以下組選取的多核苷酸，即(aa)下述序列表中序列3表示的多核苷酸、(ba)對上述(aa)中所示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ca)含有序列3的441～455位所示的序列的多核苷酸、(da)含有序列3的449～459位所示的序列的多核苷酸、(ea)上述的互補鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第四個側(cè)面，提供一種基因檢測用載體，特征是具有基體和固定在該基體上而構(gòu)成的多核苷酸、該多核苷酸包括從以下組中選取的多核苷酸，即(ac)下述序列表中序列4表示的多核苷酸、(bc)對上述(ac)中表示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cc)含有序列4的441～455位所示的序列的多核苷酸、(dc)含有序列4的449～459位所示的序列的多核苷酸、(ec)其他的互補鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第五個側(cè)面，提供一種使用了上述基因檢測用載體的DNA芯片。
根據(jù)本發(fā)明的第六個側(cè)面，提供一種檢測干擾素療法對個體有效性的方法，包括以下步驟1)將從上述個體采取的試樣多核苷酸，與上述基因檢測用載體接觸的步驟，2)檢測上述試樣多核苷酸和固定在基因檢測用載體上的多核苷酸的雜交反應，確定上述試樣中多核苷酸的堿基序列的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的第七個側(cè)面，提供一種檢測干擾素療法對個體有效性的方法，包括如下步驟1)將從個體采取的試樣多核苷酸與被固定在基體上而構(gòu)成的基因檢測用載體的探針多核苷酸相接觸的步驟，2)檢測固定在基體上的試樣多核苷酸和上述多核苷酸的雜交反應，確定上述試樣多核苷酸的堿基序列的步驟。
上述探針多核苷酸包括從以下組中選取的多核苷酸，即，(at)下述序列表中序列1中所示的多核苷酸、(bt)對上述(at)中所示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1中441～455位所示序列的多核苷酸、(dt)含有序列1中449～459位所示序列的多核苷酸、(et)上述的互補鏈。
(ag)下述序列表中序列2中表示的多核苷酸、(bg)對上述(ag)中所示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cg)含有序列2中441～455位所示序列的多核苷酸、(dg)含有序列2中449～459位所示序列的多核苷酸、(eg)上述的互補鏈。
(aa)下述序列表中序列3所示的多核苷酸、(ba)對上述(aa)中所示的多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ca)含有序列3的441～455位所示的序列的多核苷酸、(da)含有序列3的449～459位所示的序列的多核苷酸、(ea)上述的互補鏈。
(ac)下述序列表中序列4中所示的多核苷酸、(bc)對上述(ac)中所示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cc)含有序列4中441～455位所示的序列的多核苷酸、(dc)含有序列4中449～459位所示的序列的多核苷酸、(ec)上述的互補鏈。
根據(jù)本發(fā)明的第八個側(cè)面，提供一種檢測干擾素療法有效性的基因檢測用裝置，該裝置至少具有以下部分，即，上述基因檢測用載體、使固定在上述基體上的多核苷酸和含有帶有標記的多核苷酸試樣接觸，將固定在上述基體上的多核苷酸和上述帶有標記的多核苷酸置于雜交反應條件下的反應部分，和檢測上述帶有標記的多核苷酸所帶有的標記的標記檢測裝置。
根據(jù)本發(fā)明的第九個側(cè)面，提供一種檢測干擾素療法有效性的基因檢測用裝置，該裝置包括以下部分，即，上述基因檢測用載體、對電極在上述基因檢測用載體和上述相對電極之間施加電壓的電壓施加部分、使固定在上述基因檢測用載體上的上述多核苷酸和含有多核苷酸的試樣接觸，將固定在上述基體上的多核苷酸和上述試樣中的多核苷酸，置于雜交反應條件下的部分、和在上述雜交反應后，利用上述電壓施加裝置施加電壓時，測定基因檢測用載體和上述對電極間產(chǎn)生電信號的測定部分。
根據(jù)本發(fā)明的第十個側(cè)面，提供一種測定干擾素療法有效性的試劑盒，其特征是具有上述基因檢測用載體、和緩沖液。
根據(jù)本發(fā)明的第十一個側(cè)面，提供一種測定干擾素療法對個體有效性的試劑盒，其特征是具有上述基因檢測用載體、雙鏈識別體和緩沖液。


圖1是本發(fā)明實施例涉及的基因檢測用裝置的一例示意圖。
圖2是本發(fā)明實施例涉及的自動化的本發(fā)明電子檢測用裝置的一例示意圖。
圖3是MxA基因啟動子區(qū)域的堿基序列示意圖。
圖4是關(guān)于實施例中使用HhaI的RFLP電泳結(jié)果的示意圖。
圖5是對具有4種SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA啟動子，分別以該啟動子支配下的螢光素酶活性作為指標，比較對Hela細胞內(nèi)的干擾素α應答性結(jié)果的示意曲線圖。
圖6是對具有4種SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA啟動子，分別以該啟動子支配下的螢光素酶活性作為指標，比較對卵巢癌細胞內(nèi)的干擾素α應答性結(jié)果的示意曲線圖。
圖7是對具有4種SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA啟動子，分別以該啟動子支配下的螢光素酶活性作為指標，比較對Hela細胞內(nèi)的干擾素β應答性結(jié)果的示意曲線圖。
圖8是對具有4種SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA啟動子，分別以該啟動子支配下的螢光素酶活性作為指標，比較對卵巢癌細胞內(nèi)的干擾素β應答性結(jié)果的示意曲線圖。
圖9是本發(fā)明一實施例中形成的基因檢測用載體的示意圖。
圖10是本發(fā)明另一實施例中形成的基因檢測用載體的示意圖。
圖11是本發(fā)明又一實施例中形成的基因檢測用載體的示意圖。
以下詳細說明本發(fā)明。
序列1、序列2、序列3、和序列4的多核苷酸是包含人MxA基因啟動子區(qū)域的多核苷酸，本發(fā)明者們首先發(fā)現(xiàn)存在于這些多核苷酸的455位的單堿基多型(Single nucleotide polymorphism)(以下稱SNP)與干擾素療法效果的應答性有關(guān)。
在各個多核苷酸的441～456位上存在著干擾素應答序列(interferon-stimulated response element)(以下稱ISRE)。
序列1的441～456位的ISRE堿 基序列「GGTTTCGTTTCTGCTC」(序列5)，ISRE的15位(相當于序列1的455位，序列1中的455位，根據(jù)將轉(zhuǎn)錄起始位點取為+1的通常的表示方法，相當于-88位)是胸腺嘧啶。
序列2中的441～456位的ISRE堿基序列是「 GGTTTCGTTTCTGCGC」(序列6)、ISRE的15位(相當于序列2的455位。序列2中的455位，根據(jù)將轉(zhuǎn)錄起始位點取為+1的通常的表示方法，相當于-88位)是鳥嘌呤。
序列3的441～456位的ISRE堿基序列是「GGTTTCGTTTCTGCAC」(序列7)、ISRE的15位(相當于序列3中455位序列3中的455位，根據(jù)將轉(zhuǎn)錄起始位點取為+1的通常的表示方法，相當于-88位)是腺嘌呤。
序列4中的441～456位的ISRE堿基序列是「GGTTTCGTTTCTGCCC」(序列8)、ISRE的15位(相當于序列4中455位序列4中455位，根據(jù)將轉(zhuǎn)錄起始位點取為+1的通常的表示方法，相當于-88位)是胞嘧啶。
以下在本說明書中，將序列1、序列2、序列3和序列4中455位都稱作SNP位點(SNP Site)。
這些ISE的SNP位點以外的區(qū)域。各序列都是一樣的。這些ISRE中具有15位的核苷酸為胸腺嘧啶的ISE(序列5)的HCV感染者，對于干擾素療法是有效的，不具有15位的核苷酸為胸腺嘧啶的ISRE(序列5)的HCV感染者，對干擾素療法是無效的，本發(fā)明者們從流行病學的角度已得到證實。
即，如實施例中詳述的那樣，已經(jīng)證實，具有455位的核苷酸為鳥嘌呤純合的序列1的多核苷酸(以下記作G/G同型)的HCV感染者，與具有雜合455位的核苷酸為胸腺嘧啶的序列1的多核苷酸，和455位的核苷酸為鳥嘌呤的序列1的啟動子區(qū)域(以下記作G/T異型)的HCV感染者，或者是具有純合序列1中多核苷酸(以下記作T/T同型)的HCV感染者相比較，對干擾素療法是無效的。
或者，具有純合455位的核苷酸不為胸腺嘧啶的MxA基因啟動子區(qū)域的HCV感染者(以下記作非-T/非-T同型)，與T/非-T異型或T/T同型的HCV感染者比較，顯示出對干擾素療法無效。作為非-T/非-T同型的組合，有G/G、G/A、G/C、A/A、A/G、C/C。作為T/非-T組合，有T/G、T/A、T/C。
因此，在實施干擾素療法之前，通過確定在包含例如HCV感染者所具有的人MxA基因啟動子區(qū)域的多核苷酸ISRE中SNP位點的核苷酸，可以檢測知道干擾素對該HCV感染者的有效性。
本發(fā)明的基因檢測用載體等，將從被檢者提取多核苷酸的核酸鏈序列的檢測探針，可使用包括上述SNP位點的該SNP位點的堿基序列為胸腺嘧啶的序列1中的多核苷酸、其片段或它們的互補鏈。
使用本發(fā)明的這種基因檢測用載體等，在治療前可以研究包含被檢者具有的人MxA基因啟動子區(qū)域的多核苷酸中上述SNP位點是否是胸腺嘧啶。根據(jù)這種研究，可以預測干擾素療法對上述被檢者的有效性。
本發(fā)明的基因檢測用載體等，作為檢測從被檢者提取的多核苷酸的核酸鏈序列的檢測探針，可使用含有上述SNP位點、SNP位點的堿基序列為g的序列2的多核苷酸、其片段或它們的互補鏈、或者該SNP位點的堿基序列為a的序列3的多核苷酸、其片段或它們的互補鏈、或者該SNP位點的堿基序列為c的序列4的多核苷酸、其片段或它們的互補鏈。
使用本發(fā)明的這種基因檢測用載體等，可研究包含被檢者具有的人MxA基因啟動子區(qū)域的多核苷酸中上述SNP位點的序列，通過這種研究，可以預測干擾素療法對上述被檢者的有效性。
對于實施干擾素療法的所有疾病，除了丙型肝炎外，還有膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、星細胞瘤、皮膚惡性黑色素瘤、乙型肝炎、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病、亞急性硬化性全腦炎、病毒性腦炎、免疫抑制患者的全身性帶狀皰疹及水痘、上咽頭未分化癌、伴有聽力低下的病毒性內(nèi)耳感染癥、皰疹性角膜炎、扁平濕疣、尖銳濕疣、由腺病毒和皰疹病毒感染引發(fā)的結(jié)膜炎、生殖器皰疹、口唇皰疹、子宮頸癌、癌性胸水癥、角化棘皮瘤、基底細胞癌、δ型慢性活動性肝炎等。作為上述干擾素療法中使用的干擾素有干擾素α、β或ω等。
對患有這些疾病的被檢者實施干擾素療法之前，可使用本發(fā)明的基因檢測用載體等檢測干擾素療法的有效性。
以下對本發(fā)明的各個側(cè)面進行更詳細的說明。
第一，本發(fā)明提供基因檢測用載體，可用于在實施干擾素療法之前，對患有干擾素療法有效疾病的患者，檢測干擾素療法的有效性。
<基因檢測用載體的概述>
本發(fā)明的基因檢測用載體，可將上述規(guī)定的多核苷酸固定在基板、多孔質(zhì)物體、微滴度板、玻璃珠等基體上，即可制成。
用于固定多核苷酸基體的材質(zhì)、大小、形狀等沒有特殊限制，可以使用任何能固定多核苷酸的基體。
作為基體的材質(zhì)，例如可使用硅、玻璃、石英玻璃、氧化鋁、蘭寶石、鎂橄欖石、碳化硅、氧化硅、氮化硅、磁性體等無機材料；聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚酯酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯縮醛、丙烯酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、密胺樹脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈丁二烯苯乙烯聚合物、硅氧烷樹脂、聚苯醚、聚砜、硝基纖維素、尼龍、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯砜、聚醚砜、聚醚酮、氟乙烯共聚物、聚甲基戊烯等有機材料。也可以使用上述無機材料和有機材料的復合體。
在基體上固定多核苷酸的方法，例如可使用Science251767-773(1991)中公開的方法。除了該方法外，還知道有將多核苷酸固定在基體上的改進方法，使用這些改進方法也可以固定多核苷酸。
使用由有機材料或玻璃形成的基體時，在基體表面上覆蓋一層聚賴氨酸和氨基硅烷的面，可穩(wěn)定地固定多核苷酸。
本說明書中，所謂「多核苷酸」是指2個以上核苷通過磷酸酯連接形成的物質(zhì)?！负塑铡拱撗鹾颂呛塑蘸秃颂呛塑眨幌抻谶@些。
進而，本發(fā)明的在基體上固定的多核苷酸，可使用RNA、DNA、PNA、甲基磷酸酯核酸、S-Oligo的寡核苷酸，和cNDA、cRNA等多核苷酸等。
本說明書中，所謂「啟動子區(qū)域」，不僅僅指與TATA盒等轉(zhuǎn)錄起始反應直接有關(guān)的區(qū)域，而且也指存在于該區(qū)域附近或遠處，對轉(zhuǎn)錄起始反應的效率施加影響的包括調(diào)節(jié)序列的序列。因此，對于「啟動子區(qū)域」術(shù)語，不僅注意與轉(zhuǎn)錄起始反應有關(guān)的序列、調(diào)節(jié)序列，與必須注意包含兩者連接的序列。
所謂「ISRE」是指因干擾素α、β或γ刺激誘導的在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)存在的約12～15個核苷酸形成的堿基序列。
作為固定在基體上的多核苷酸，可舉出以下(a)～(e)的。
(a)序列1，2，3，4中任何一個表示的多核苷酸、(b)對上述(a)中所示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸。
作為缺失的實例，有128位、133位、152位、508位、和543位的缺失，作為置換的實例，有330位的置換(G→T)、542位的置換(G→G)，作為附加的實例，有向501位的附加(C)。
在上述序列1，2，3，4的多核苷酸或上述多核苷酸的片段上，可使用連接至少1個從以下基因中選出的功能性多核苷酸而形成的修飾的多核苷酸，即，含有啟動子、增強子、上游活化序列、沉默基因、上游抑制序列、衰減子、PolyA尾、核轉(zhuǎn)移信號、Kozak序列、ISRE、耐藥性因子、信號肽的基因、跨膜區(qū)域的基因、包括螢光素、綠色螢光蛋白、藻菁苷、辣根過氧化酶在內(nèi)的標記蛋白質(zhì)的基因、干擾素應答性蛋白質(zhì)的基因、非干擾素應答性蛋白質(zhì)的基因。
序列1，2，3，4所示上述多核苷酸的堿基序列中，與干擾素療法有效性有關(guān)的是位于455位的SNP位點中的1個核苷酸，所以要固定在基體上的多核苷酸也可以是含有上述455位的SNP位點的多核苷酸片段。
使用上述片段作為固定在基體上的多核苷酸時，最好是11～30個核苷酸。固定在基體上的多核苷酸長度過長時，難以識別出1個核苷酸的不同。另一方面，固定在基體上的多核苷酸的長度過短時，難以確定試樣中所含多核苷酸的堿基序列。
作為固定在基體上適宜的多核苷酸，是以下片段。
(c)是含有上述455位中SNP位點的序列1、序列2、序列3、序列4的多核苷酸片段，包含有以相當于序列1、序列2、序列3、序列4中441～456位的序列5、序列6、序列7、序列8所表示序列的多核苷酸(即上述ISRE)片段。
(d)是含有上述455位中SNP位點的序列1、序列2、序列3、序列4的多核苷酸片段，含有相當于序列1至序列4中449～459位的序列9、10、11、12的多核苷酸片段。特別是(d)，由于含有大致以上述SNP為中心而前后同等長度的堿基序列，所以可以進行高精度的堿基序列確定。為了進行更高精度的檢測，最好是含有相當于序列1至序列4中447～461位的核苷酸片段。
進而，作為固定在基體上適宜的多核苷酸，也可以是(e)在上述(a)～(d)表示的多核苷酸的互補鏈。
上述序列5、序列6、序列7、序列8表示序列(即上述ISRE)的互補鏈是序列13、14、15、16表示的序列。
上述序列9、序列10、序列11、序列12表示的序列的互補鏈，分別是以序列17、序列18、序列19、序列20表示的序列。
本發(fā)明的基因檢測用載體是將固定在基體上的上述規(guī)定多核苷酸作為探針，檢測該探針與從被檢者提取的多核苷酸的雜交反應，確定被檢者的包含人MxA基因啟動子區(qū)域的多核苷酸序列，調(diào)查在上述SNP位點上有什么而使用的。
<基因檢測用載體的使用方法>
以下對使用上述基因檢測用載體具體確定從被檢者提取多核苷酸序列的方法進行說明。
使用上述基因檢測用載體確定從被檢者提取多核苷酸序列的方法有(1)使用標記物質(zhì)的方法、(2)電化學的方法2種。
首先，對(1)使用標記物質(zhì)的方法進行具體說明。
首先從包括人在內(nèi)的哺乳動物等被檢者，采取含有多核苷酸的試樣(血液等體液、血細胞成分、生物檢測組織、培養(yǎng)細胞等)。由于多核苷酸廣泛存在于體內(nèi)，所以可以是從個體采取的任意試樣，優(yōu)選的試樣是血液。
接著，根據(jù)需要，進行酚提取和乙醇沉淀等分離提取操作、PCR等擴增操作后，提取上述試樣中所含試樣多核苷酸。作為提取多核苷酸的方法，例如除了酚提取，乙醇沉淀外，可使用任意的提取方法。提取mRNA時，也可用寡dT柱。當試樣多核苷酸的量很少時，可根據(jù)需要也可進行對試樣多核苷酸擴增的操作。
隨后，向試樣多核苷酸附加標記物質(zhì)，進行獲得標記多核苷酸的標記操作。也可以在沒有附加標記的試樣多核苷酸內(nèi)，混合含有附加標記物質(zhì)的多核苷酸的2次探針。
作為標記物質(zhì)，可以是螢光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)、半抗原、氧、放射性同位素、電極活性物質(zhì)等可檢測的物質(zhì)，對此沒有特殊限定。對試樣多核苷酸的標記最好是對啟動子區(qū)域進行標記。對啟動子區(qū)域進行標記，可使用各種公知的手法，根據(jù)使用標記的引物的PCR反應，可同時進行擴增操作和標記操作，這是非常有用的。
接著，將試樣多核苷酸和基體上的多核苷酸置于雜交反應的條件下。即，首先，將進行了上述標記的試樣多核苷酸添加到雜交用的反應溶液中后，使該反應溶液和本發(fā)明的基因檢測用載體接觸。在試樣多核苷酸上存在基體上的核苷酸互補鏈的活，該試樣多核苷酸和基體上的多核苷酸進行雜交反應，而固定在基體上。
雜交反應條件，反應溫度為10～90℃，反應時間為1分鐘到過夜。反應中也可以用攪拌或振動等操作以便提高反應速度。雜交用的反應溶液是離子強度為0.01～5，pH5～1O的緩沖液。反應溶液中也可添加作為雜交促進劑的硫酸葡聚糖、和鮭精DNA、牛胸DNA、EDTA、表面活性劑等。
隨后進行適當洗。
接著，為了確定被檢者的上述SNP位點上有什么，可檢測試樣多核苷酸和基體上的多核苷酸之間有無雜交反應。
在基體上固定的含有上述(a)～(e)任何一種的多核苷酸中，若檢測出上述SNP位點為胸腺嘧啶的多核苷酸或其互補鏈與試樣多核苷酸進行雜交，則包含受檢者的人MxA基因啟動子區(qū)域的多核苷酸的SNP位點是胸腺嘧啶。另一方面，若測出上述SNP位點為鳥嘌呤的多核苷酸或其互補鏈與試樣多核苷酸進行雜交，則包含受檢者的人MxA基因啟動子區(qū)域的多核苷酸的SNP位點是鳥嘌呤。同樣也可為腺嘌呤、胞嘧啶。
這種檢測，根據(jù)標記的種類使用適當?shù)臋z測裝置，通過檢測試樣中的標記多核苷酸或2次探針中的標記進行。在標記物為螢光物質(zhì)時，例如，可以使用熒光檢測器檢測標記。作為基因檢測用載體，在一個基體上可同時固定上述(a)～(e)中任何一個多核苷酸中上述SNP位點是胸腺嘧啶或其互補鏈的、是鳥嘌呤或其互補鏈的、是腺嘌呤或其互補鏈的、是胞嘧啶或其互補鏈的組中的至少1種，這時，多核苷酸的種類與基體上的各多核苷酸的位置以及標記的種類的至少一項必須特定。根據(jù)被檢測標記的位置以及標記的種類至少一項，就可以知道試樣中的多核苷酸和基體上的什么多核苷酸進行了雜交。
使用(1)的標記物質(zhì)的方法中，即使使用將從被檢者采取的試樣多核苷酸固定在基體上的基因檢測用載體，也可確定試樣多核苷酸的序列。即，預先附加不同標記的序列是從已知的(a)～(e)中選取的多核苷酸，與上述SNP的堿基種類不同的多核苷酸溶液接觸，將溶液中的多核苷酸和電極上的試樣多核苷酸置于雜交反應的條件下。若溶液中存在基體上試樣多核苷酸的互補鏈，該試樣多核苷酸和基體上的多核苷酸進行雜交反應，而固定在基體上。隨后通過檢測標記物質(zhì)的種類，即可檢測和哪一種序列的多核苷酸發(fā)生了雜交反應，也就能夠知道試樣多核苷酸的序列。
使用以上方法，試樣多核苷酸和上述SNP位點具有胸腺嘧啶的多核苷酸或其互補鏈進行雜交時，受驗者在上述SNP位點具有胸腺嘧啶，故可預測此受檢者干擾素療法是有效的。與其相反，試樣中的多核苷酸和上述SNP位點具有鳥嘌呤的多核苷酸或其互補鏈進行雜交，而且和上述SNP位點具有胸腺嘧啶的多核苷酸或其互補鏈不進行雜交時，在上述SNP位點不具有胸腺嘧啶，故此，可預測受檢者對干擾素療法無效。
以下關(guān)于(2)的電化學方法進行具體說明。
在上述使用(1)的標記物質(zhì)的方法中，通過檢測標記物質(zhì)，進行檢測試樣多核苷酸和基體上的多核苷酸有無雜交反應，而在(2)的電化學方法中，電化學地檢測有無雜交反應。
在電化學的方法中，作為基因檢測用載體，使用固定多核苷酸的電極。固定多核苷酸的電極(以下稱本發(fā)明的電極)是在由導電物質(zhì)形成的基體上，固定上述(a)～(e)中任何一種多核苷酸而形成的。
固定多核苷酸的最好導電性物質(zhì)雖然是金，但也可使用其他材料。例如可以使用金的合金、銀、鉑、汞、鈀、硅、鍺、鎵、鎢等金屬單質(zhì)及其合金，或者石墨、精碳(グラシ一カ一ボン)等碳，或者它們的氧化物、化合物。也可將這些導電性物質(zhì)，利用電鍍、印刷、濺射、蒸鍍等方法形成在其他基板上。
在由導電性物質(zhì)形成的基體上固定多核苷酸的方法，沒有特殊限定。例如，利用導入了巰基的多核苷酸和金結(jié)合，簡單進行。除此之外，也可以用物理吸附、化學吸附、疏水結(jié)合、嵌埋、共價鍵等進行固定。也可使用生物素-抗生物蛋白結(jié)合和碳化二亞胺等縮合劑。這些情況，首先用具有官能團的分子修飾導電性物質(zhì)的表面，可很容易進行固定。為了抑制多核苷酸在基體表面的非特異吸附，最好用巰基乙醇等硫醇、和硬脂胺等脂質(zhì)涂敷基體表面。
以下以一個實例講述在金基體上固定多核苷酸的方法。首先，用去離子水洗金基體后，進行活化處理，活化中使用0.1～10mmol/L的硫酸容液。在該溶液中，在-0.5～2V(相對于Ag/AgCl)的范圍內(nèi)、在1v/s～100000v/s范圍內(nèi)掃描電位。由此，直到金基體表面被活化到能固定多核苷酸的狀態(tài)為止。
在要固定化的多核苷酸中5’或3’末端上導入巰基。巰基化的多核苷酸，溶解在DTT等還原劑的溶液中直到固定化之前，在使用前，以凝膠過濾或醋酸乙酯的提取操作除去DTT。固定化是將探針溶解在離子強度0.01～5，pH5～10的緩沖液中，形成1ng/ml～1mg/ml，浸漬活化即后的基體。固定化反應，在4～100℃范圍內(nèi)進行10分鐘到過夜。固定多核苷酸后的基體，最好在無核酸分解酶(核酸酶)的條件下保存，可能的話進行遮光保存。
在基體上固定多核苷酸時，使用叫作DNA點樣器(スポッタ一)和DNA陣列的固定化裝置，能比較容易地固定多核苷酸。這時為了不損傷基體的表面，最好使用噴墨方式或靜電方式的點樣器。也可以在基體表面上直接進行多核苷酸的合成。
本發(fā)明的電極結(jié)構(gòu)，最好是將導電體和與該導電體電連接的本發(fā)明電極配置在基板上構(gòu)成所謂DNA芯片。DNA芯片的制作，是在基板上，最好在絕緣性基板上配設用絕緣材料適當涂覆的金屬線等導電體后，再將上述固定了規(guī)定多核苷酸的上述電極與上述導電體可通電地連接。
具有不同序列的多核苷酸必須分別固定在相互絕緣的多個不同的電極上，將多個電極設置在基板上時，要設置在基板上的電極數(shù)從實用性上說為101～105個。
在基板上設置多個本發(fā)明的電極時，再設置掃描線，也可在上述導電體和掃描線的各交點上配置開關(guān)元件。利用它依次在各電極上施加電壓，并能迅速確定每個電極是否發(fā)生雜交反應。
在用本發(fā)明的電極檢測有無雜交反應中，和其他一般電化學檢測法相同，除了本發(fā)明的電極外，至少配置對電極，根據(jù)需要適當配置參比電極。配置參比電極時，例如可使用銀/氯化銀電極、汞/氯化汞電極等一般的參比電極。這些電極最好和本發(fā)明的電極配置在同一個基板上。
使用本發(fā)明的電極，確定從被檢者采取的多核苷酸的序列，進行以下操作。
首先，從包括人在內(nèi)的哺乳動物等被檢者采取含核酸的試樣，根據(jù)需要進行上述的提取操作、擴增操作、根據(jù)需要附加標記。這些操作和(1)的方法相同，但不一定必須附加標記。
接著，使含有上述試樣的溶液和本發(fā)明的電極接觸，將試樣多核苷酸和電極上的多核苷酸置于雜交反應的條件下。若試樣多核苷酸中存在基體上多核苷酸的互補鏈，該試樣多核苷酸和基體上的多核苷酸進行雜交反應，固定在基體上。該操作，及條件和(1)的方法相同，隨后，洗本發(fā)明的電極。
然后，通過在本發(fā)明的電極附近添加導電性的雙鏈識別體溶液，在由電極上固定的多核苷酸和試樣多核苷酸進行雜交形成的雙鏈的多核苷酸上嵌入著雙鏈的識別體。檢測試樣多核苷酸和基體上的多核苷酸之間有無雜交反應，可按如下進行，即，向電極施加電壓時，檢測由在電極上的雙鏈的多核苷酸中嵌入的雙鏈的識別體產(chǎn)生的電信號。
此處使用的雙鏈的識別體沒有特殊限定，例如，可使用ヘキスト33258、吖啶橙、米帕林、多腦河霉菌素、金屬嵌入(メタロィンタ一カレ一タ一)、雙吖啶等雙嵌入、三嵌入、多嵌入等。可以使用稱作金屬嵌入的釕、鈷、鐵等的金屬配合物、和溴乙錠等有機化合物。除了這些之外，還可使用ヘキスト33258和花菁色素等的基團合劑、抗體、酶等生物高分子。
雙鏈識別體濃度隨其種類而不同，一般來說范圍為1ng/ml～1mg/ml。這時使用離子強度為0.001～5、pH5～10的緩沖液。
使本發(fā)明的電極和雙鏈的認識體反應后，根據(jù)需要進一步洗電極。以本發(fā)明的電極為作用電極，在該作用電極和另設的對電極之間施加電位，通過測定兩極間的電流，檢測電化學的信號。檢測電化學的信號也可以用這樣的2個電極(作用電極和對電極)進行，或者用作用電極、對電極、參照極3極進行。在電化學信號檢測中，以恒定速度掃描電位、或者施加脈沖、或者施加恒定電位。測定中，使用恒電位計、數(shù)字伏-歐-毫安表、函數(shù)發(fā)生器等裝置控制電流、電位。根據(jù)得到的電流值從標準曲線計算出目的基因濃度。
將上述(a)～(e)中任何一個多核苷酸中，上述SNP位點為胸腺嘧啶者或其互補鏈、上述SNP位點為鳥嘌呤者或其互補鏈、上述SNP位點為腺嘌呤者或其互補鏈、上述SNP位點為胞嘧啶者或其互補鏈，分別固定在彼此絕緣的不同電極上并構(gòu)成配置在同一基板上的DNA芯片，可進行高精度測定。這時從各電極檢測出與各核苷酸相對應的電化學信號。
使用(2)的電化學方法，使用將從被檢者采取試樣的多核苷酸固定在電極上的電極，也能確定試樣多核苷酸的序列。即，通過與預先已知序列的(a)～(e)中任何一個多核苷酸的溶液接觸，將溶液中的多核苷酸和電極上的試樣多核苷酸置于雜交反應條件下。若溶液中存在基體上的試樣多核苷酸的互補鏈，該試樣多核苷酸與基體上的多核苷酸發(fā)生雜交反應，而固定在基體上。通過檢測這種雜交反應，即可檢測試樣多核苷酸的序列。
以上述方法檢測試樣多核苷酸與上述SNP位點具有胸腺嘧啶的多核苷酸或其互補鏈的雜交反應時，被檢者在上述SNP位點有胸腺嘧啶，故此，可預測對干擾素療法是有效的。與此相反，檢測出試樣中的多核苷酸與上述SNP位點具有胸腺嘧啶以外的多核苷酸或其互補鏈的雜交反應，而且，沒有檢測出和上述SNP位點具有胸腺嘧啶的多核苷酸或其互補鏈的雜交反應時，被檢者在SNP位點上不具有胸腺嘧啶，故此，可預測對干擾素療法是無效的。
<電檢測粗>
以下示出使用本發(fā)明的電極進行確定從被檢者提取多核苷酸序列的一例基因檢測裝置。即，該基因檢測用裝置包括上述本發(fā)明的電極、與固定在電極上的多核苷酸完成雜交反應的反應部分、對上述電極上被固定的核酸施加電壓的施加裝置、和測定由該施加裝置工作產(chǎn)生的信號的測定裝置。
<電檢測裝置的基本構(gòu)成>
圖1中示出了這種基因檢測用裝置的基本實施例。圖1中，11是固定了多核苷酸12的電極。13是反應槽，電源14通過電極11和反應槽13連接形成電路，在電路內(nèi)部配置電流計15、電壓計16和可變電阻17，在反應槽13內(nèi)進行雜交反應后，施加電壓，測定流過電路中的電流等。
在使用圖1的基因檢測用裝置進行檢測時，將緩沖液和含有從被檢者采取的多核苷酸的試樣裝入反應槽13內(nèi)，在試樣多核苷酸和電極11上的多核苷酸12之間進行雜交反應。雜交反應的溫度和時間等條件如上所述。接著，最好洗凈反應槽13和電極11，向反應槽13內(nèi)裝滿含有插入劑的雜交溶液，啟動電源14，使用電流計15和電壓計16測量電流值或電壓值等。
圖1中示出了本發(fā)明基因檢測用裝置的最基本形態(tài)，為了使檢測完全自動化，本發(fā)明的基因檢測用裝置也可以采用更復雜的結(jié)構(gòu)，如圖2所示。
<自動化的電檢測裝置結(jié)構(gòu)>
如圖2所示的檢測裝置20，具有保持多核苷酸固定化電極的電極托架21、反應槽22、第1洗凈槽23、插入劑反應槽24、第2洗凈槽25、及電化學測定槽26，以及載有反應槽22、第1洗凈槽23、插入劑反應槽24、第2洗凈槽25、及電化學測定槽26的移動裝置27，以及分析單元28、及操作單元29。這些槽之間的電極移動，使用移動裝置27，通過動作反應槽等，即可達到。
<自動化電檢測裝置的使用方法>
檢測裝置20的使用方法如下。
首先，將試樣或含有預先從試樣提取的多核苷酸的溶液裝入反應槽22內(nèi)，將固定在電極固定托架21的上述電極浸入反應槽22中。接著，在反應槽22中進行雜交反應后，將電極固定托架21移入第1洗凈槽23內(nèi)，在第1洗凈槽23內(nèi)進行洗凈，除去與電極非特異結(jié)合的核酸和蛋白質(zhì)等。洗凈后，將電極固定托架21移入插入劑反應槽24內(nèi)，使插入劑嵌入雜交反應形成的2鏈多核苷酸。接著將電極固定托架21移入第2洗凈槽25內(nèi)，洗凈后，再將電極固定托架21移入電化學測定槽26內(nèi)，進行電化學測定。測定結(jié)束后，參考預先記錄在分析單元28中的標準曲線，輸出試樣中多核苷酸的濃度。以上操作都是通過與各槽及單元進行電連接的操作單元29進行。
本發(fā)明提供了一種備有本發(fā)明基因檢測用載體和緩沖液的試劑盒。這樣，若提供一套本發(fā)明的基因檢測用載體和緩沖液，就能很方便地直接進行檢測。
本發(fā)明試劑盒中使用的緩沖液，可以是雜交反應中使用的任意緩沖液。例如有磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、Tris緩沖液等，并不僅限于這些。
在試劑盒內(nèi)，備有與緩沖液共用的，或代替緩沖液的基因擴增用的引物、螢光色素標記核苷酸、酶、精制用柱子等。
本發(fā)明提供一種備有本發(fā)明電極和雙鏈的識別體的試劑盒。
本發(fā)明試劑盒中所使用的雙鏈識別體，例如，是關(guān)于本發(fā)明電極的上述雙鏈識別體。
試劑盒內(nèi)，備有與雙鏈的識別體共用的，或代替雙鏈的識別體的基因擴增用引物、酶、緩沖液、核苷酸等。
以下根據(jù)實施例更詳細地說明本發(fā)明。
實施例1在該實施例中，將具有以雜合或純合MxA基因啟動子區(qū)域的-88位(在序列1的堿基序列中相當于455位)的核苷酸為胸腺嘧啶的基因(以下記作MxA(T))的HCV感染者，與具有純合該核苷酸為鳥嘌呤的基因(以下記作MxA(G))的HCV感染者進行比較，證實對干擾素療法的應答性很好。
<被檢者>
從組織學上被證明是慢性丙型肝炎的，進行干擾素療法的115名患者和抗HCV陰性的健康者42名參加本研究。這些被檢者全部是日本人，相互間沒有血緣關(guān)系。
115名患者中，52名患者在干擾素療法結(jié)束后，在至少6個月的跟蹤觀察期間，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的水平處于正常范圍，而且是HCV的RNA一直處于陰性的持續(xù)應答者(以下記作SR)；63名患者與ALT水平無關(guān)，在跟蹤期間HCV的RNA一直為陽性，或者，是復發(fā)丙型肝炎的非應答者(以下記作NR)。對所有患者服用干擾素α和/或β，總用量超過300萬單位。
<MxA基因分析>
從患者和健康對照者采取的pBMC中提取核酸，將該核酸供給PCR，對包含MxA基因啟動區(qū)域的599核苷酸的DNA進行擴增。
PCR的概述如下。
將0.05μg核酸與Taq-Gold(Perkin Elmer)、序列12的寡核苷酸引物#MXAF01(正向引物，-569～-540位)、及序列6的寡核苷酸引物#MXAF02(反向引物、+30～+1位)混合后，在[95℃10分鐘]、[95℃10秒鐘]、[68℃60秒鐘]×55、[72℃7分鐘]的循環(huán)條件下進行反應。通過直接譯碼PCR產(chǎn)物，確定157個試樣中的12個序列。
通過確定序列，同時確定擴增區(qū)域中SNP位點后，構(gòu)建用于可識別地檢出等位基因核苷酸的RFLP系統(tǒng)。將所有患者的599核苷酸的PCR產(chǎn)物用HhaI(GCG↓C)進行消化，在瓊脂糖凝膠中進行電泳，以調(diào)查是生成482核苷酸帶，還是533核苷酸帶，或是兩者都生成。
<統(tǒng)計分析>
進行ィェ一ッ補正，或者不進行，根據(jù)費希爾的概率試驗比較組數(shù)據(jù)，在統(tǒng)計學中把p＜0.05看作是統(tǒng)計學上有顯著性的。
<結(jié)果>
通過進行12個樣品的序列確定，在MxA基因啟動子區(qū)域中同時確定多型位點。在該啟動子區(qū)域的-88位中存在SNP(G和T)，該SNP包含在類似圖3所示的ISRE區(qū)域中。
接著，在HhaI進行的RFLP中，對全部157個樣品確定MxA基因的基因型。在該分析中，在多型位點上具有鳥嘌呤的試樣，在電泳凝膠中呈現(xiàn)出482核苷酸的帶。與此相反，鳥嘌呤置換成胸腺嘧啶時，由于限制酶HhaI的識別位點消失，所以呈現(xiàn)出533核苷酸的帶。具有雜合多型位點為鳥嘌呤的啟動子區(qū)域和多型位點為胸腺嘧啶的啟動子區(qū)域時，可同時檢測出482核苷酸帶和533核苷酸帶(參見圖4)。
如表1所示，在NR組中，62％的患者具有純合上述多型位點為鳥嘌呤的啟動子區(qū)域(G·G同型)、在SR組中，31％的患者是G·G同型(p＝0.0009；SRvsNR)。與此相反，在NR組中，35％的患者具有以雜合上述多型位點為鳥嘌呤的啟動子區(qū)域和上述多型位點為胸腺嘧啶的啟動子區(qū)域(G·T異型)、而在SR組中，60％的患者為G·T異型(p＝0.0082；SRvs.NR)。T·T同型的患者，分別在NR組中為3.2％，在SR組中為10％(p＝0.2956；SRvs.NR)。
具有上述多型位點為鳥嘌呤啟動子區(qū)域的等位基因頻率，在SR組中為0.606，而在NR組中為0.794(p＝0.0018；SRvsNR)。
表1MxA啟動子-88 SR患者 NR 健康對照者 p位的多型 (n＝52)(n＝63) (n＝42) SR vs NR等位基因頻率G0.606 0.794 0.714 0.0018T0.394 0.296 0.286 0.0018接合型G·G同型 16(31％) 39(62％) 20(48％) 0.0009G·T異型 31(60％) 22(35％) 20(48％) 0.0082T·T同型 5(10％)2(3.2％) 2(4.8％) 0.2956**進行ィェ一ッ補正。
進而由與NR組相比較，在SR組中，G·G同型的個體顯著少的上述結(jié)果也可明確不依賴于患者感染的HCV基因型。
表2MxA啟動子中-88位 SR患者 NR患者 p的SNP接合型 SR vs NR基因型為1b的HCV N＝18 N＝42感染患者G·G同型 5(28％) 26(62％)0.0321*G·T異型 12(67％)14(33％)0.0170T·T同型 1(5.6％)2(4.8％)0.6051*基因型為2a或2b的 n＝34 n＝21HCV感染患者G·G同型 11(32％)13(62％)0.0318G·T異型 19(56％)8(38％) 0.1999T·T同型 4(12％)00.2722**進行ィェ一ッ補正。
從表2可知，在基因型為1b的HCV感染患者組(HCV 1b組)和基因型為2a或2b的HCV感染患者組(HCV2a/2b組)中，在NR組中62％都是G·G同型的個體，而SR組中則分別28％和32％是G·G同型的個體。從表2所示結(jié)果可以明確，不管患者感染HCV的基因型如何，在SR組中，G·G同型的個體顯著要少(HCV 1b組；p＝0.0321、HCV 2a/2b組；p＝0.0318)。
以上根據(jù)本實施例，證實了具有以雜合或純合上述多型位點為胸腺嘧啶的MxA啟動子區(qū)域的HCV感染者，不依賴于感染的HCV基因型，對于干擾素療法都顯示出很高的應答性。
本實施例也暗示出，具有以雜合或純合上述多型位點不為鳥嘌呤的MxA啟動子區(qū)域的HCV感染者，對干擾素療法也顯示出很高的應答性。
進而，由于ISRE中存在上述多型位點，也可以說，這些情況也適用于丙型肝炎以外的疾病。
實施例2如實施例1中所明確的，MxA啟動子的SNP為T型的HCV感染者，通過給以干擾素，肝炎的治療效果很高。另一方面，該SNP為G型時，治療效果很低、作為其理由，可解釋為起ISRE功能的堿基序列為T型，對于干擾素的刺激能進行準確的應答，G型由于和其序列僅1個堿基的差異，對于干擾素的刺激沒有應答，MxA蛋白質(zhì)的生成量很低。
從這種狀況考慮時，可以推測MxA啟動子的SNP為C型及A型的HCV肝炎患者，也和G型一樣，MxA啟動子對干擾素沒有應答，其治療效果也很低。
為了證明這些情況，在MxA啟動子的下游構(gòu)建具有螢光素酶基因的質(zhì)粒，使其轉(zhuǎn)染人細胞(HeLa細胞、及卵巢癌細胞)。同樣，對具有4種SNP(T型、G型、A型、C型)的MxA啟動子，分別調(diào)查作為它們對干擾素的應答結(jié)果而產(chǎn)生的螢光毒酶活性。
其結(jié)果示于圖5～圖8。圖5是使用干擾素α在Hela細胞內(nèi)進行誘導的實例。圖6是用干擾素α在卵巢癌細胞內(nèi)進行誘導的實例。圖7是使用干擾素β在Hela細胞內(nèi)進行誘導的實例。圖8是使用干擾素β在卵巢癌細胞內(nèi)進行誘導的實例。在這些圖中，+號表示添加干擾素時的螢光毒活性，-號表示沒有添加干擾素時的螢光素活性。這些結(jié)果都是3次試驗的平均值，以條線棒表示其標準偏差。
從圖中可知，在哪種場合，T型的MxA啟動子均呈現(xiàn)出最高值，具有A型和C型SNP的HCV肝炎患者，和G型一樣，對于干擾素α及干擾素β的應答性很低因此，可預測出利用干擾素的治療效果很低。
實施例3在本實施例中，一邊參照圖9，一邊對使用本發(fā)明基因檢測用載體預測干擾素療法有效性的預測操作進行說明。
首先，為制作本發(fā)明的基因檢測用載體，使用序列21和序列22的引物，對序列1的多核苷酸片段的含有上述SNP位點的該SNP位點為胸腺嘧啶的T型片段31，和序列2的多核苷酸的含有上述SNP位點的該SNP為鳥嘌呤的G型片段32進行擴增，用蒸餾水調(diào)制成2μg/μL。
接著，在各片段中添加等量的4mg/mL硝基纖維素(DMSO溶液)，熱變性后，在用聚賴氨酸被覆的載玻片33上點樣，待測定點充分干燥后，利用紫外線照射進行固定化處理，得到T型片段31和G型片段32被固定的基因檢測用載體。
接著，利用序列20和序列21的引物，對由被檢者血液中提取的試樣多核苷酸進行擴增處理后，在Pharmacia制的ECL制標記系統(tǒng)內(nèi)進行FITC標記，和預先調(diào)制的上述基因檢測用載體在65℃下反應12小時。反應后，用螢光檢測器測定信號。
從固定T型片段的測定點觀察到的螢光信號，從其結(jié)果判明本試驗中所用試樣多核苷酸的SNP為T型。
實施例4本實施例中，一邊參照圖10，一邊對使用固定了試樣中片段的基因檢測用載體的檢測進行說明。
對用序列21、序列22的引物使從被檢者提出的多核苷酸擴增的片段(試樣A41，試樣B42)，用蒸餾水調(diào)制成2μg/μL。接著，添加等量的4mg/L硝基纖維素(DMSO溶液)后，使其熱變性，在用聚賴氨酸被覆的載玻片43上點樣，待測定點充分干燥后，用紫外線照射進行固定化處理。
將以下片段和預先調(diào)制的DNA芯片在50℃下反應1小時，即，預先進行螢光標記的、序列1的多核苷酸片段即含有上述SNP位點的、該SNP位點為胸腺嘧啶的T型片段(JOE標記)，和預先進行螢光標記的序列2的多核苷酸片段即含有上述SNP位點的、該SNP位點為鳥嘌呤的G型片段(5-FA標記，和預先進行螢光標記的、序列3的多核苷酸片段即含有上述SNP位點的、該SNP位點為腺嘌呤的A型片段(TAMRA標記)，和預先進行螢光標記的，序列4的多核苷酸片段即含有上述SNP位點的、該SNP位點為胞嘧啶的C型片段(ROX標記)。
反應后，用螢光檢測器測定信號，結(jié)果只得到來自HEX螢光的信號，可以判明本試樣多核苷酸的SNP只為T型。
實施例5本實施例中，一邊參照圖11，一邊對利用電化學檢測的基因檢測用載體進行說明。
使用序列21和序列22的引物，對序列1的T型片段51和G型片段52進行擴增，用蒸餾水調(diào)制成2μg/μL。接著，與2-羥乙基二硫化物和1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)-碳化二行反應，向擴增產(chǎn)物的末端導入巰基。在預先制作的金電極53上點樣，在不使干燥的條件下反應1小時。樣品用序列21和序列22的引物擴增、熱變性后，和預先調(diào)制的DNA芯片在65℃下反應1小時。反應后，在10μmol/L的ヘキスト33258溶液中進行伏安測量，測定ヘキスト33258的氧化電流值。結(jié)果是只從固定了G型片段的電極上獲得顯著性的信號，可判明本試樣為G型。
序列表<110>株式會社東芝<120>基因檢測用載體，及檢測干擾素療法有效性的應用<130>A000001162<140><141><160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgctcccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>2<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcgcccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>3<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcacccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>4<211>581<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4atgagccaga ctccagggag gcctagaagt gggcaagggg aaacgggaaa ggaggaagat 60ggtatgggtg tgcctggtta ggggtgggag tgctggacgg agttcgggac aagaggggct 120ctgcagccat tggcacacaa tgcctgggag tccctgctgg tgctgggatc atcccagtga 180gccctgggag ggaactgaag acccccaatt accaatgcat ctgttttcaa aaccgacggg 240gggaaggaca tgcctaggtt caaggatacg tgcaggcttg gatgactccg ggccattagg 300gagcctccgg agcaccttga tcctcagacg ggcctgatga aacgagcatc tgattcagca 360ggcctgggtt cgggcccgag aacctgcgtc tcccgcgagt tcccgcgagg caagtgctgm 420aggtgcgggg ccaggagcta ggtttcgttt ctgcccccgg agccgccctc agcacagggt 480ctgtgagttt catttcttcg ccggcgcggg gcggggctgg gcgcggggtg aaagaggcga 540accgagagcg gaggccgcac tccagcactg cgcagggacc g 581<210>5<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5ggtttcgttt ctgctc 16<210>6<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6ggtttcgttt ctgcgc 16<210>7<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7ggtttcgttt ctgcac 16<210>8<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8ggtttcgttt ctgccc 16<210>9<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>9ttctgctcccg 10<210>10<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>10ttctgcgcccg 10<210>11<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11ttctgcacccg 10<210>12<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>12ttctgcccccg 10<210>13<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>13gagcag aaacgaaacc 16<210>14<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>14gcgcag aaacgaaacc 16<210>15<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>15gtgcag aaacgaaacc 16<210>16<211>16<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16gggcag aaacgaaacc 16<210>17<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17cgggagcagaa10<210>18<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18cgggcgcagaa10<210>19<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19cgggtgcagaa10<210>20<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20cgggggcagaa10<210>21<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>對人工合成序列的描述引物<400>21acacacccgt ttccaccctg gagaggccag 30<210>22<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>對人工合成序列的描述引物<400>22tgcgcagtgc tggagtgcgg cctccgctct 30
權(quán)利要求
1.一種基因檢測用載體，其特征是具有基體和固定在該基體上的多核苷酸，該多核苷酸含有從以下中選出的多核苷酸，即(at)下述序列表的序列1表示的多核苷酸、(bt)對上述(at)表示的多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸，進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1的441～455位表示序列的多核苷酸、(dt)含有序列1的449～459位表示序列的多核苷酸、(et)上述的互補鏈。
2.一種基因檢測用載體，其特征是具有基體和固定在該基體上的多核苷酸，該多核苷酸含有從以下中選出的多核苷酸，即(ag)下述序列表的序列2表示的多核苷酸、(bg)對上述(ag)表示的多核苷酸除455位外的1個或數(shù)個核苷酸，進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cg)含有序列2的441～455位表示序列的多核苷酸、(dg)含有序列2的449～459位表示序列的多核苷酸、(eg)上述的互補鏈。
3.一種基因檢測用載體，基特征是具有基體和固定在基體上的多核苷酸，該多核苷酸含有從以下中選出的多核苷酸，即，(aa)下述序列表的序列3表示的多核苷酸、(ba)對上述(aa)表示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸，進行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸、(ca)含有序列3的441～455位表示序列的多核苷酸、(da)含有序列3的449～459位表示的序列的多核苷酸、(ea)上述的互補鏈。
4.一種基因檢測用載體，其特征是具有基體和固定在該基體上的多核苷酸，該多核苷酸含有從以下中選出的多核苷酸，即，(ac)下述序列表序列4表示的多核苷酸、(bc)對上述(ac)表示的多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸，進行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸、(cc)含有序列4的441～455位表示序列的多核苷酸、(dc)含有序列4的449～459位表示序列的多核苷酸、(ec)上述的互補鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項記載的基因檢測用載體，固定在上述基體上的多核苷酸的長度為15～30個核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項記載的基因檢測用載體，其特征是上述基體由導電物質(zhì)形成，上述基因檢測用載體是電極。
7.一種DNA芯片，其特征是具有基板和在基板上形成的第1和第2電極，上述第1電極具有導電性基體和固定在該導電性基體上的從下述(at)至(et)中選出的至少1種多核苷酸，(at)下述序列表的序列1表示的多核苷酸、(bt)對上述(at)表示的多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸，進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1的441～455位表示序列的多核苷酸、(dt)含有序列1的449～459位表示序列的多核苷酸、(et)上述的互補鏈。上述第2電極具有由導電性物質(zhì)形成的基體和固定在該基體上的從下述(ag)至(eg)、(aa)至(ea)、(ac)至(ec)中選出的至少1種多核苷酸，(ag)下述序列表的序列2表示的多核苷酸、(bg)上述(ag)表示多核苷酸中除455位外的1個或多個核苷酸，進行缺失、置換或附加進行修飾的多核苷酸、(cg)含有序列2的441～455位表示序列的多核苷酸、(dg)含有序列2的449～459位表示序列的多核苷酸、(eg)上述的互補鏈。(aa)下述序列表中序列3表示的多核苷酸、(ba)對上述(aa)表示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸，進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ca)含有序列3的441～455位所示序列的多核苷酸、(da)含有序列3的449～459位所示序列的多核苷酸、(ea)上述的互補鏈(ac)下述序列表的序列4表示的多核苷酸、(bc)上述(ac)表示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸，進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cc)含有序列4的441～455位表示序列的多核苷酸、(dc)含有序列4的449～459位表示序列的多核苷酸、(ec)上述的互補鏈。
8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的基因檢測用載體，固定在上述導電性基體上的多核苷酸的長度為15～30個核苷酸。
9.一種檢測方法，是檢測干擾素療法對個體有效性的方法，包括以下步驟，1)使從上述個體采取試樣多核苷酸與權(quán)利要求1、2、3、4中任一項記載的基因檢測用載體進行接觸的步驟、2)檢測上述試樣多核苷酸和固定在上述基因檢測用載體上的多核苷酸的雜交反應，確定上述試樣中多核苷酸堿基序列的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9記載的檢測方法，還包括以下檢測步驟，由上述確定堿基序列的步驟確定的上述試樣多核苷酸的堿基序列，若含有下述(at)～(et)，則檢測干擾素療法對上述個體是有效的步驟，(at)序列1的記載的多核苷酸、(bt)對上述(at)表示序列1記載的多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個多核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有位于序列1的441～456位序列的多核苷酸、(dt)含有位于序列1的449～459位序列的多核苷酸、(et)上述(at)～(dt)記載的多核苷酸的互補鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求9記載的檢測方法，其特征是在與基因檢測用載體進行接觸的步驟之前，對從上述個體采取的多核苷酸進行附加標記的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11記載的檢測方法，其特征是上述標記是螢光色素、半抗原、酶、放射性同位素、電極活性物質(zhì)中的至少1種。
13.根據(jù)權(quán)利要求9記載的檢測方法，其特征是上述基因檢測用載體是權(quán)利要求6中記載的基因檢測用載體，在確定上述試樣中多核苷酸堿基序列的步驟中的雜交反應的檢測，是檢測伴隨著上述雜交反應產(chǎn)生的電化學變化而進行的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13記載的治療預測方法，其特征是檢測伴隨著上述雜交反應產(chǎn)生的電化學變化，是在基因檢測用載體和對電極間施加電壓時，通過測定上述基因檢測用載體和上述對電極間產(chǎn)生的電信號而進行的。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求14的基因檢測裝置，其特征是在上述雜交反應時，向雙鏈多核苷酸中添加特異性附加導電性的雙鏈識別體，在上述基因檢測用載體和上述對電極間產(chǎn)生的電信號是從導電性的雙鏈識別體直接或間接地產(chǎn)生的。
16.一種檢測方法，是檢測干擾素療法對個體有效性的方法，包括以下步驟，1)將從上述個體采取的試樣多核苷酸固定于基體上而形成的基因檢測用載體與探針多核苷酸進行接觸的步驟、2)檢測上述基體上固定的試樣多核苷酸和上述多核苷酸的雜交反應，確定上述試樣多核苷酸堿基序列的步驟，上述探針多核苷酸是從以下中選取的多核苷酸，即，(at)下述序列表的序列1表示的多核苷酸、(bt)對上述(at)表示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(ct)含有序列1的441～455位表示序列的多核苷酸、(dt)含有序列1的449～459位表示序列的多核苷酸、(et)上述的互補鏈。(ag)下述序列表的序列2表示的多核苷酸、(bg)對上述(ag)表示多核苷酸除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cg)含有序列2的441～455位表示序列的多核苷酸、(dg)含有序列2的449～459位表示序列的多核苷酸、(eg)上述的互補鏈。(aa)下述序列表的序列3表示的多核苷酸、(ba)對上述(aa)表示多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸、(ca)含有序列3的441～455位表示序列的多核苷酸、(da)含有序列3的449～459位表示序列的多核苷酸、(ea)上述的互補鏈。(ac)下述序列表的序列4表示的多核苷酸、(bc)對上述(ac)表示的多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個核苷酸進行缺失、置換或附加修飾的多核苷酸、(cc)含有序列4的441～455位表示序列的多核苷酸、(dc)含有序列4的449～459位表示序列的多核苷酸、(ec)上述的互補鏈。
17.根據(jù)權(quán)利要求16記載的檢測方法，還包括以下步驟，即若由確定上述堿基序列的步驟所確定的上述試樣多核苷酸的堿基序列含有下述(at)～(et)，檢測干擾素療法對上述個體是有效的步驟，(at)序列1記載的多核苷酸，(bt)對上述(at)表示的序列1記載的多核苷酸中除455位外的1個或數(shù)個多核苷酸進行缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸，(ct)含有位于序列1的441～456位的序列的多核苷酸、(dt)含有位于序列1的449～459位的序列的多核苷酸、(et)上述(at)～(dt)中記載的多核苷酸的互補鏈。
18.根據(jù)權(quán)利要求16記載的檢測方法，其特征是在與基因檢測用載體接觸步驟之前，進行對上述探針多核苷酸附加標記的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18記載的檢測方法，其特征是上述標記是螢光色素，半抗原、酶、放射性同位素、電極活性物質(zhì)中的至少1種。
20.根據(jù)權(quán)利要求18記載的檢測方法，其特征是上述基因檢測用載體是在導電性基體上固定了從上述個體采取的試樣多核苷酸的電極，在確定上述試樣的多核苷酸堿基序列的步驟中，雜交反應的檢測是通過檢測伴隨雜交反應產(chǎn)生的電化學變化而進行的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20記載的檢測方法，其特征是檢測伴隨上述雜交反應產(chǎn)生的電化學變化，是通過測定在基因檢測用載體和對電極間施加電壓時的上述基因檢測用載體和上述對電極間產(chǎn)生的電信號而進行的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21記載的檢測方法，其特征是在上述雜交反應時，向雙鏈多核苷酸中添加特異性附加的導電性雙鏈的識別體，在上述基因檢測用載體和上述對電極間產(chǎn)生的電信號是從導電性的雙鏈的識別體上直接或間接產(chǎn)生的。
23.一種為檢測干擾素療法有效性的基因檢測用裝置，至少包括以下部分，即，從權(quán)利要求1、2、3、4中選出的至少1種基因檢測用載體，使固定在上述基體上的多核苷酸和含有附加標記的多核苷酸試樣接觸，將固定在上述基體上的多核苷酸和附加上述標記的多核苷酸置于雜交反應條件下的反應部分、對施加上述標記的多核苷酸檢測附加的標記的標記檢測裝置。
24.根據(jù)權(quán)利要求23記載的基因檢測用載體，其特征是上述標記是螢光色素、半抗原、酶、放射性同位素、電極活性物質(zhì)中的至少一種。
25.一種為檢測干擾素療法有效性的基因檢測用裝置，包括以下部分，即權(quán)利要求6中記載的基因檢測用載體、對電極、向上述基因檢測用載體和上述對電極間施加電壓的電壓施加部分、使固定在上述基因檢測用載體上的多核苷酸和含有多核苷酸的試樣接觸，將固定在上述基體上的多核苷酸和上述試樣中的多核苷酸置于雜交反應條件下的反應部分、在上述雜交反應后，利用上述電壓施加裝置施加電壓時，測定上述基因檢測用載體和上述對電極間產(chǎn)生電信號的測定部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求25記載的檢測干擾素療法有效性的基因檢測用裝置，其特征是在上述反應部分中，向由上述雜交反應產(chǎn)生的雙鏈多核苷酸中，添加特異性附加的導電性雙鏈識別體，在上述基因檢測用載體和上述對電極間產(chǎn)生的電信號是從上述雙鏈識別體上產(chǎn)生的。
27.一種用于測定干擾素治療有效性的試劑盒，其特征是具有權(quán)利要求1、2、3、4中記載的基因檢測用載體、和緩沖液。
28.一種用于檢測干擾素治療有效性的試劑盒，其特征是具有權(quán)利要求6記載的基因檢測用載體、雙鏈識別體、和緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對患者在治療前作為預測干擾素療法是否有效的基因檢測用載體,對個體檢測干擾素療法有效性的檢測方法,基因檢測用裝置、及檢測干擾素療法有效性的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1333377SQ01122009
公開日2002年1月30日 申請日期2001年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月22日
發(fā)明者土方美奈子, 三代俊治, 太田裕彥, 橋本幸二 申請人:株式會社東芝