專利名稱：人腫瘤壞死因子α口服劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口服劑，具體地說，本發(fā)明涉及一種人腫瘤壞死因子α口服劑。
腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factorα簡稱TNFα)是由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子。人的有活性的TNFα由3個分子量為17KDa的非糖蛋白單體構(gòu)成單體呈片層折疊結(jié)構(gòu)，它們之間通過一個Cys69—Cys101間的二硫鍵非共價組成體。不同種屬哺乳動物來源的TNFα在一級結(jié)構(gòu)上具有極高的同源性，在生物學(xué)活性上也無明顯的種屬特棄性。純化的TNFα等電點在5.3左右；pH6-8時穩(wěn)定；對酸敏感對蛋白水解酶(胰蛋白酶、糜蛋白等)敏感；50％的飽和硫酸銨可使其沉淀。在反復(fù)凍融和無保護劑時，室溫下失活。
TNFα基因為單拷貝基因。人的基因大小為2.67kb，定位于人第6號染色體?；蚪M由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成；編碼一個由233個氨基酸組成的前體蛋白、其前76個氨基酸為信號肽、使TNFα前體能跨膜存在于細(xì)膜上，通過降解后，分出含157個氨基酸的成熟蛋白、糖基化。人TNFα基因第1外顯于編碼81％的信號肽，第4外顯子編碼89％成熟型TNFα氨基酸序列。
用TNFα對腫瘤作臨床的免疫治療是十幾年來發(fā)展較快的新型抗瘤療法、對臨床手術(shù)、放療、化療等常規(guī)手段是有效補充。這在美國、日本和德國都取得了較好的進展。美國的Genentech公司在臨床試驗中用TNFα治療乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等方面居領(lǐng)先地位；Cetus公司把TNFα和IL—2聯(lián)用開創(chuàng)了復(fù)合生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑法。日本的重組產(chǎn)品已進入臨床試驗，對胸、腹水晚期轉(zhuǎn)移癌、大腸癌、膽囊癌等取得了好的進展。德國BASF公司年產(chǎn)可達500g，德國用TNFα在胃腸道腫瘤、肝癌、卵巢腫瘤、乳腺癌等方面取得了成功，尤其在控制癌性胸腹水方面的療效居世界前列。我國衛(wèi)生部1998年初已批準(zhǔn)上海、西安的5家單位開始臨床試驗。
臨床上給藥途徑早年多為靜脈、肌肉和皮下注射，近年來為了減輕TNFα的毒性，常采用局部注射或局部灌注方法，治療中、晚期腫瘤。給藥量從10μg/m2到400μg/m2。較多的治療方案是2周為1療程，每個療程中連續(xù)5天給藥，每天給50μg/m2。給藥量主要取決于藥效，通常80萬單位/m2有效。
雖然1975年巳分離、純化了TNFα，并闡明了結(jié)構(gòu)，1985年已經(jīng)用大腸桿菌基因工程得到了TNFα的重組產(chǎn)品；但是至今TNFα還停留在臨床階段，世界各國的醫(yī)藥行政部門都未批準(zhǔn)TNFα作為商品藥，在市場上出售。這主要由于從最初的臨床試驗時發(fā)現(xiàn)，TNFα有嚴(yán)重的全身毒性作用，對人的毒性作用要比小鼠高20倍。
這種毒性作用主要表現(xiàn)在發(fā)熱(35—100％)，寒顫(70—100％)，惡心頭痛(20—70％)。乏力(20—77％)、食欲下降(24—46％)，；還發(fā)生腹瀉、血小板降低、白細(xì)胞減少、GTP上升、體液潴留、肌痛，甚至內(nèi)毒素性休克。這就大大限制了了TNFα的臨床應(yīng)用劑量，嚴(yán)重影響其治療腫瘤的效果。
至今能選擇性地、又直接殺傷腫瘤的藥物很少，癌癥的死亡率仍高于其他各種疾病。TNFα被發(fā)現(xiàn)后大家對其抱有極大的希望。但全身毒性的嚴(yán)重性，限制了它的應(yīng)用。十幾年來各國學(xué)者正在千方百計降低TNFα的毒性，主要從兩方面取得了一些進展第一方面是改變給藥途徑。1990年前后，美國曾經(jīng)試驗用基因治療，即把TNFα直接注入腫瘤組織。第二方面是用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對TNFα的結(jié)構(gòu)進行改造，改構(gòu)的目的是降低毒性和提高抗腫瘤。十幾年來已突變成功了數(shù)十種TNFα的衍生物，其中有些毒性有明顯得下降，而抗腫瘤活性有顯著提高。雖然如此，各國仍然還在作臨床試驗。
針對目前存在的上述問題，本發(fā)明采用了藍(lán)藻基因工程的方法以藍(lán)藻為重組TNFα的宿主生產(chǎn)腫瘤壞死因子α。以降低毒性，并可直接作用于消化道的腫瘤。
本發(fā)明提供了一種人腫瘤壞死因子α口服劑，含有表達人腫瘤壞死因子α(hTNFα)的念珠藻。
本發(fā)明的口服劑中，所述的念珠藻最好是灰色念珠藻(Nostocmuscorum)。所述的編碼該腫瘤壞死因子α(hTNFα)的cDNA可具有如


圖1所示的核苷酸序列。
圖1所示的TNFαcDNA與原來的有6個堿基不同
本發(fā)明的口服劑中，所述的表達人腫瘤壞死因子α的念珠藻可以是CGMCC 0461。
本發(fā)明的口服劑的用量以純TNFα計為每人(成人)每天5-500μg，優(yōu)選50-300μg，更優(yōu)選100-200μg。
本發(fā)明的特點是利用藍(lán)藻作為宿主，它不含內(nèi)毒素，用它作為宿主生產(chǎn)重組產(chǎn)品可以簡化下游工序。本發(fā)明還有的一個特點是，藍(lán)藻本身含豐富的營養(yǎng)成分，所以以藍(lán)藻為宿主生產(chǎn)的TNFα經(jīng)過粗提取后可以直接口服。有利于藥物的吸收，克服了注射藥的許多缺欠。本發(fā)明的再一個特點是制備的口服劑十分穩(wěn)定。在室溫下放置15天，活性未受影響。而純化制成的針劑只能保存在低溫下，使用不方便。
附圖簡要說明
圖1是灰色念珠藻中的hTNFcDNA核苷酸序列及蛋白質(zhì)氨基酸序列實施例菌株及載體質(zhì)粒1.藍(lán)藻藻種Nostoc muscorum灰色念珠藻，由法國巴斯德研究所提供。2.大腸桿菌菌株E.coli HB101作為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的受體菌。3.質(zhì)粒(1)pRL-TC由本實驗室構(gòu)建，將rhTNF插入質(zhì)粒pRL439的多克隆位點。pRL439上帶有psbA啟動子、氨芐青霉素抗性基因、以及非受損的bom區(qū)(轉(zhuǎn)移必需區(qū))(2)pDC-8。(3)RP4＋pRL542 in E.coli HB101，是一種輔助質(zhì)粒。二 藍(lán)藻的培養(yǎng)藍(lán)藻一般培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，置于Gallenkamp型光照冷卻旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中搖振培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速130rpm，25—30℃，10天更換一次培養(yǎng)液，傳代以1∶50接種。
純化藻種時可采用劃線分離和涂布分離的方法。在含有1.5％瓊脂的固體培養(yǎng)基平板上，倒置照光培養(yǎng)，待出現(xiàn)單藻落后，光鏡下確認(rèn)藻種，重復(fù)劃線純化。
固體平板更適于藍(lán)藻藻種的保存。將平板置于弱光下，室溫可保存3-6個月。液體培養(yǎng)物靜置于室溫弱光下，兩周更換一次培養(yǎng)液。收集10天的藍(lán)藻培養(yǎng)物，加入滅菌甘油(終濃度為15％)，-70℃可保存兩年以上。
轉(zhuǎn)hTNF-α基因的Nostoc muscorum灰色念珠藻培養(yǎng)在含有新霉素25μg/ml的BG-11培養(yǎng)液中，培養(yǎng)方法與一般藍(lán)藻相同。三 穿梭表達載體pDC-TNF的構(gòu)建過程穿梭表達載體pDC-TNF的構(gòu)建過程主要分2步1)含有重組hTNFαcDNA全長的pRL-rhTNF質(zhì)粒經(jīng)XhoI酶切，在Klenow酶的作用下補平3’-末端后，繼以EcoRI消化，回收包含hTNFαcDNA的700bp片段，將此片段定向插入到pRL-439載體上緊隨啟動子PpsbA之后的SmaI和EcoRI位點中，如此得到的重組質(zhì)粒定名為pRL-TC；(2)用EcoRI/SalI雙酶切分別消化pRL-TC和pDC-8，回收pRL-TC的800bp左右的含PpsbA及hTNFαcDNA的片段和pDC-8的9.0kb片段，連接后得到穿梭表達載體pDC-TNF。四 轉(zhuǎn)化和篩選灰色念珠藻1.用三親接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化灰色念珠藻a.大腸桿菌的準(zhǔn)備在20ml含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中接種含有穿梭表達載體的大腸桿菌及含有接合質(zhì)粒RP4和輔助質(zhì)粒pRL528的大腸桿菌，37℃搖菌過夜。4000rpm離心5min收菌，重懸于5ml普通LB培養(yǎng)液中。等體積混合兩種菌液。b.藍(lán)藻的準(zhǔn)備藍(lán)藻培養(yǎng)物于4000rpm離心2min收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌兩次，再以適當(dāng)體積的培養(yǎng)液懸浮藻細(xì)胞。c.接合轉(zhuǎn)移將藻細(xì)胞與細(xì)菌混合后涂于混合纖維素酯微孔膜上，在無抗生素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天后，置于含新霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)光照培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。2.篩選和擴大培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因灰色念珠藻將得到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入BG-11培養(yǎng)液其中含有新霉素，繼續(xù)篩選并逐步擴大液體培養(yǎng)體積，經(jīng)分子生物學(xué)檢測后確定是否得到轉(zhuǎn)hTNF-α基因的灰色念珠藻。將得到的轉(zhuǎn)化的灰色念珠藻于2000年6月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國，北京，中關(guān)村)，保藏號為CGMCC NO.0461。五 產(chǎn)物的制備取對數(shù)生長后期轉(zhuǎn)hTNF-α基因的灰色念珠藻離心(轉(zhuǎn)速6000r/min)收藻，用緩沖液洗滌沉淀2次，加入裂解液(50mmol Tris-Cl PH8.0)重懸沉淀，用液氮凍融3次，冰浴中超聲10次(每次15-20s)，冷凍干燥此提取物。將冷凍干燥定量裝入口服膠囊(100mg/膠囊)約含100μg純hTNF-α，除藻細(xì)胞物質(zhì)外不含其他添加劑。最好保存在低溫中，在室溫下15天未發(fā)現(xiàn)喪失活性。六 轉(zhuǎn)基因念珠藻表達產(chǎn)物的細(xì)胞毒活性本發(fā)明將pDC-hTNFα表達載體成功地轉(zhuǎn)化絲狀體灰色念珠藻，得到了穩(wěn)定表達的人腫瘤壞死因子(hTNFα)的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻。本實驗通過檢測轉(zhuǎn)hTNF基因藍(lán)藻表達產(chǎn)物中hTNFα的細(xì)胞毒活性，確定其表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性及鑒定其體外藥效。1.hTNF基因念珠藻表達產(chǎn)物的提取1)粗提物制備于藻細(xì)胞對數(shù)生長中后期離心收藻，用緩沖液洗2次，除去培養(yǎng)液，-20℃冷藏備用。制備時將藻細(xì)胞溶于緩沖液，經(jīng)液氮反復(fù)凍融，冰水浴超聲破碎。離心得上清粗提物。2)EAE52纖維素離子交換層析DEAE52纖維素離子交換層析，柱規(guī)格2cm×30cm，用洗脫液平衡。上述粗提取液經(jīng)硫銨沉淀，溶液透析后上柱，分別以0M，0.1M，0.3MNaCl階段洗脫。收集含hTNFα的活性峰、透析、真空冷凍干燥濃縮。2.轉(zhuǎn)hTNF基因念珠藻提取物生物學(xué)活性采用常規(guī)的L929細(xì)胞毒試驗，檢測TNFα活性(方法參見文獻BryanT.Spofford，Raymond A.Daynes，Gale A.Granger，Cell-mediated immunityin vitroA highly sensitive assay for human lymphotoxin J.Immunol.1974，112，6)。
L929細(xì)胞系(1-3×104細(xì)胞/孔[PRMI 1640＋10％小牛血清，0.2ml])，接種在96孔塑料培養(yǎng)板上，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜(18hr)。棄凈培養(yǎng)液，加入終濃度為0.4μg/ml放線菌素D，不同稀釋度的灰色念珠藻提取物樣品各50μl，每一濃度設(shè)3個平行孔，37℃繼續(xù)保溫，18hr后觀察細(xì)胞存活情況。
棄測試樣品，細(xì)胞用0.1ml 0.2％結(jié)晶紫乙醇-水溶液(2∶98，V/V)室溫染色10min，用蒸餾水沖洗培養(yǎng)板，室溫晾干。加0.1ml 1％SDS溶液裂解細(xì)胞，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選OD630測定吸光值A(chǔ)，計算每組平均值和存活率。
％細(xì)胞毒活性＝1－(A實驗－A本底)/(A對照－A本底)以殺死50％細(xì)胞的hTNF-α稀釋度為一個活性單位。3.粗提物的細(xì)胞毒活性粗提物蛋白質(zhì)濃度為5.472mg/ml，樣品做不同稀釋度處理，加入96孔板(2～3萬個細(xì)胞/孔)處理后測定吸光度。計算樣品對L929細(xì)胞的抑制率，根據(jù)公式推算活性單位。結(jié)果如表1。表明細(xì)胞毒活性60000U/ml，比活10900U/mg。
重復(fù)實驗粗提物細(xì)胞毒活性55000U/ml，比活10000U/mg經(jīng)常規(guī)的L929細(xì)胞毒法檢測表明轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻粗提取物具有TNFα活性。4.過DEAE離子交換分離產(chǎn)物的細(xì)胞毒活性分離產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量0.04896mg/ml，對L929細(xì)胞毒活性檢測結(jié)果表明DEAE離子交換柱分離產(chǎn)物比活160000U/mg。上述粗提物經(jīng)DEAE52纖維素離子交換層析后，純度提高了16倍。
表1不同稀釋度基因表達產(chǎn)物的細(xì)胞毒活性測定
七 轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻制品的小鼠急性毒性1.hTNFα基因灰色念珠藻(野生藻種來自法國巴斯德研究所)是用pDC-hTNF表達載體轉(zhuǎn)化并得到穩(wěn)定表達三年hTNF的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻，經(jīng)細(xì)胞毒試驗和免疫學(xué)方法鑒定其具有生物學(xué)活性。大量培養(yǎng)，收集藻細(xì)胞，用蒸餾水洗去培養(yǎng)液后經(jīng)超聲破碎后冷凍干燥制成干粉。無病菌健康昆明小鼠20只，體重18—22g，雌雄各半，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所試驗動物室提供(該動物室獲“北京市動物實驗許可證”，所用種鼠獲清潔動物合格證)。2.急性毒性試驗是指動物一日內(nèi)單次或多次給藥后在7天或14天中，連續(xù)觀察動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況。我國臨床前毒理評價要求，急性毒性試驗的給藥途徑至少有一種與臨床給藥途徑一致。毒性試驗的觀察應(yīng)從定性和定量兩方面進行。所謂定性觀察就是觀察服藥的后動物的中毒表現(xiàn)等。所謂定量觀察就是觀察動物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，主要指標(biāo)半數(shù)致死量(lethal dose 50，LD50)。當(dāng)有些藥物用最大允許濃度和最大允許容量給予動物時，仍未測出LD50，可只求MTD值，即用最大濃度和最大允許容量一次給20只小鼠后，連續(xù)觀察7—14天，未見任何動物死亡，則MTD＞XX g/kg。(參見《新藥臨床前安全性評價與實踐》)。本試驗根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，屬后一種情況。因此采用最大濃度(25％，即25g干粉溶于100ml無菌生理鹽水)的冷凍干燥制品，以0.2ml/10g體重的體積給小鼠灌胃。給藥后連續(xù)14天觀察小鼠體重、活動情況、毛發(fā)、糞便、食欲等變化并記錄死亡數(shù)量及時間。3.口服給藥5g/kg體重后，連續(xù)14天觀察20只受試小鼠無一只死亡，活動正常、生長良好，體重增加到28—38g。4.試驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)hTNFα基因藍(lán)藻制品配制最大濃度(25％)，一次給20只小鼠，經(jīng)口服給藥(po)，動物不產(chǎn)生死亡。測得最大耐受劑量(MTD)＞5g/kg。FDA認(rèn)為，若劑量＞5g/kg時可視為無毒。因此，判斷此hTNFα的轉(zhuǎn)基因灰色念珠藻制品，對小鼠口服給藥不顯示毒性。八 轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻制品體內(nèi)抗腫瘤活性1.用常規(guī)方法檢測口服轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻制品對小鼠可移植性腫瘤肉瘤S180實體瘤的抑瘤活性。試驗分設(shè)空白對照組，轉(zhuǎn)空載體念珠藻和兩種劑量轉(zhuǎn)hTNFα基因念珠藻制品組。健康昆明小鼠接種瘤細(xì)胞后第二天，分別口服灌胃給轉(zhuǎn)hTNFα基因念珠藻制品或轉(zhuǎn)空載體念珠藻，對照組給予0.4ml生理鹽水，連續(xù)6～9次后處死動物，取瘤稱重，計算平均瘤重和抑制率，并進行統(tǒng)計學(xué)處理。2.前后進行了兩次實驗，兩次實驗結(jié)果均顯示口服轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻制品對小鼠S180實體瘤具有一定抗腫瘤活性。第一次實驗給予轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻制品1.25g/kg/天，共9次，對S180實體瘤的抑瘤率可達46.6％(生理鹽水對照組瘤重/用藥組瘤重＝1.03g/0.55g)。第二次實驗給予轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻制品2.5g/kg/天，共6次，對S180實體瘤的抑瘤率可達30.3％(轉(zhuǎn)空載體念珠藻對照組瘤重/用藥組瘤重＝1.81g/1.26g)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，兩次實驗P值均小于0.05，具有顯著性差異，表明口服轉(zhuǎn)hTNFα基因灰色念珠藻制品對S180實體瘤有效。同時，實驗表明轉(zhuǎn)空載體念珠藻對S180生長無影響。
權(quán)利要求
1.一種人腫瘤壞死因子α口服劑，含有表達人腫瘤壞死因子α(hTNFα)的念珠藻細(xì)胞或其裂解液。
2.按照權(quán)利要求1所述的口服劑，其中所述的念珠藻是灰色念珠藻(Nostoc muscorum)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服劑，其中，編碼該腫瘤壞死因子α(hTNFα)的cDNA有如下所示的核苷酸序列5’ ATG GTT CGT TCT TCT TCT CGT ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTAGCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCCCTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAGGGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCCACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACCAAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAGGGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAGCTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GACTTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG TGA 3’
4.按照權(quán)利要求1所述的口服劑，其中，所述的表達人腫瘤壞死因子α的念珠藻是CGMCC 0461。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人腫瘤壞死因子α口服劑,含有表達人腫瘤壞死因子α(hTNFα)的念珠藻。本發(fā)明的口服劑毒性低,并可直接作用于消化道的腫瘤。
文檔編號C12N15/28GK1329921SQ00109459
公開日2002年1月9日 申請日期2000年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月26日
發(fā)明者施定基, 劉鳳龍, 邵寧, 彭國宏, 林晨, 冉亮 申請人:中國科學(xué)院植物研究所