專利名稱：發(fā)酵制備L－氨基酸的方法及編碼accDA基因的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼accDA基因的核苷酸序列，及通過用其中accDA基因被擴(kuò)增的棒桿菌發(fā)酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的方法。
L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸用于動物飼料，人的內(nèi)服藥及制藥工業(yè)。
已知那些氨基酸由棒狀細(xì)菌，尤其是谷氨酸棒桿菌的菌株發(fā)酵生產(chǎn)。由于其非常之重要性，一直嘗試改進(jìn)制備方法。改進(jìn)的方法可涉及與發(fā)酵過程相關(guān)的措施，如攪拌及氧補(bǔ)給，或營養(yǎng)培養(yǎng)基基的組分如發(fā)酵期糖的濃度，或如經(jīng)離子交換層析加工產(chǎn)物形式，或微生物自身的內(nèi)在性質(zhì)。
為改進(jìn)那些微生物的性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇方法，以此獲得對抗代謝物如賴氨酸同源物S-[2-氨乙基]-半胱氨酸有抗性的菌株，或在調(diào)節(jié)方面重要氨基酸的營養(yǎng)缺陷體，并產(chǎn)生L-氨基酸。
幾年來，通過擴(kuò)增氨基酸生物合成的各個基因，并研究對L-氨基酸生產(chǎn)的影響，重組DNA技術(shù)已被用于改進(jìn)谷氨酸棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)菌株。此方面的文章見于Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，見工業(yè)微生物學(xué)，Demain和Solomon編輯，Benjamin Cummings，英國倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6，261-272(1994)，Jetten和Sinskey(Critical Reviews inBiotechnology 15，73-103(1995)和Sahm et al.(紐約科學(xué)院年報(bào)782，25-39(1996)。
乙酰輔酶A羧化酶催化乙酰輔酶A羧化為丙二酸單酰輔酶A。源自E.coli的此酶由4個亞單位組成。accB基因編碼生物素羧基載體蛋白，accC基因編碼生物素羧化酶，accA和accD基因編碼轉(zhuǎn)羧酶(Cronan和Rock，膜脂的生物合成，見《大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌》(F.C.Weidhardt編輯)1996，PP.612-636，美國微生物學(xué)會)，由于此酶羧化?；o酶A形式的?；虼似湟卜Q為?；o酶A羧化酶。
谷氨酸棒桿菌的accBC基因的的核苷酸序列已由Jager等測定(Archives of Microbiology 166，76-82(1996))，且通常可從歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，Germany)的數(shù)據(jù)庫獲得，登記號為U35023。accBC基因編碼乙酰輔酶A羧化酶的攜帶生物素羧基載體蛋白結(jié)構(gòu)域及生物素羧化酶結(jié)構(gòu)域的亞單位。
本發(fā)明的目的是提供一種新的通過發(fā)酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的改良方法。
L-氨基酸尤其L-賴氨酸用于動物的飼料，人內(nèi)服藥及制藥工業(yè)。因而提供新改進(jìn)的制備L-氨基酸的方法通常是令人感興趣的。
應(yīng)了解后文提及的任何L-賴氨酸或賴氨酸不只意味著其本體，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了來自棒桿菌的一優(yōu)選重組DNA，其能在棒狀微生物中復(fù)制，且至少含有示于SEQ ID NO1的編碼accDA基因的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了如權(quán)利要求1所述的能復(fù)制的DNA，其具有(i)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，(ii)至少一個在遺傳密碼簡并區(qū)內(nèi)相應(yīng)于(i)序列的序列，或(iii)至少一個與互補(bǔ)于(i)或(ii)序列的序列雜交的序列，且任選地(iv)在(i)內(nèi)的中性有義突變。
本發(fā)明還提供了通過導(dǎo)入所述能復(fù)制的DNA而轉(zhuǎn)化的棒狀微生物，尤其棒桿菌屬。
本發(fā)明還涉及用棒桿菌經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸的方法，所述棒桿菌尤其是已產(chǎn)生L-氨基酸，且其中編碼accDA基因的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是過量表達(dá)的。
最后，本發(fā)明還提供了一種在棒桿菌中，通過本發(fā)明的新accDA基因和已知accBC基因的聯(lián)合過量表達(dá)而擴(kuò)增?；o酶A羧化酶的方法。
在此，術(shù)語“擴(kuò)增”指通過增加基因的拷貝數(shù)應(yīng)用強(qiáng)啟動子或應(yīng)用編碼具有高活性的相應(yīng)酶的基因或任選的這些措施的結(jié)合，從而增加微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的細(xì)胞內(nèi)活性。
本發(fā)明提供的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素中，或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸。尤其是棒狀細(xì)菌特別是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中，特別提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌屬尤其谷氨酸棒桿菌的菌株是下列的已知野生型菌株谷氨酸棒桿菌 ATTC13032醋谷氨酸棒桿菌ATTC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌 ATTC13870Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌 ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020及產(chǎn)生L-氨基酸的突變株以及由其產(chǎn)生的菌株如谷氨酸棒桿菌 FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌 FERM-P1712谷氨酸棒桿菌 FERM 6463及谷氨酸棒桿菌 FERM-P6464。
本發(fā)明人已成功地從谷氨酸棒桿菌中分離出新accDA基因。通過首先在E.coli中構(gòu)建此微生物的基因文庫，從谷氨酸棒桿菌中分離accDA基因或其它基因?；蛭膸斓臉?gòu)建由通常熟知的教材或手冊中的方法進(jìn)行，例如Winnacker的名為《從基因到克隆，基因技術(shù)導(dǎo)論》(Verlag Chemie，Weinheim，德國，1990)的教科書，或Sambrook等的名為《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)的手冊。一非常熟知的基因文庫是由Kohara等(Cell 50，495-508(1987))在λ載體中構(gòu)建的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子和普通遺傳學(xué)252，255-265(1996))闡述了用粘粒載體SuperCos I(Wahl et al.，美國科學(xué)院院刊84，2160-2164)在E.coliK-12菌株NM 554(Raleigh et al.，核酸研究16，1563-1575(1988))中構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。Bormann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)闡述了用粘粒pHC 79(Hohn and Collins，基因11，291-298(1980))構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。E.coli中的谷氨酸棒桿菌的基因文庫也可用如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC 9(Viera et al.，基因19，259-268(1982))的質(zhì)粒構(gòu)建。限制及重組缺陷的E.coli菌株是尤其合適的宿主。例如Grant等闡述的菌株DH5αmcr(美國科學(xué)院院刊87，4645-4649(1990))。用粘?？寺〉拈LDNA片段接著可被亞克隆入適于測序的通用載體，并隨之測序，如Sanger等所述(美國科學(xué)院院刊74，5463-5467(1977))。
以此方式可獲得源自谷氨酸棒桿菌的編碼accDA基因的新DNA序列，且如SEQ ID NO1是本發(fā)明的一部分。accDA基因的編碼區(qū)(cds)在SEQ ID NO2中示出。相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列也經(jīng)上述方法衍生自本發(fā)明的DNA序列。所得accDA基因產(chǎn)物的氨基酸序列在SEQ ID NO3中示出。
由于遺傳密碼的簡并性，得自SEQ ID NO1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。相似地，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，保守氨基酸取代，如在蛋白質(zhì)中用甘氨酸和丙氨酸互換，或用天冬氨酸和谷氨酸互換，此互換本領(lǐng)域技術(shù)人員已知是有義突變，其不引起蛋白活性基本改變，即它們是中性的。也知在蛋白質(zhì)N和/或C末端的改變基本上不削弱其功能，或者甚至能穩(wěn)定蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在Ben-Bassat等(細(xì)菌學(xué)雜志169，751-757(1987))，O＇Regan等(基因77，237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)3，240-247(1994))，Hochuli等(Bio/Technology 6，1321-1325(1988))及熟知的關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材中發(fā)現(xiàn)關(guān)于此主題的信息。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)accDA基因在棒桿菌中的過量表達(dá)增進(jìn)L-賴氨酸生產(chǎn)。
可以通過增加相應(yīng)基因的拷貝數(shù)達(dá)到過量表達(dá)，或者可以突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以相同的方式起作用。在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸期間，通過以誘導(dǎo)型啟動子的方式增加表達(dá)也是可能的。也可以通過延長mRNA壽命的方法改善表達(dá)。另外也可通過阻止酶蛋白質(zhì)的降解增加酶活性?；蚧蛘呋驑?gòu)建體可以以可變拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中或者整合進(jìn)染色體，并擴(kuò)增。另外，基因的過量表達(dá)也可以通過改變營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成與培養(yǎng)技術(shù)來完成。
在這一點(diǎn)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會從以下文獻(xiàn)中得到指導(dǎo)Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利EPS O 472 869，美國專利4,601,893，Schwarzer和Piihler(生物/技術(shù)9，84-87(1991)，Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO 96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學(xué)回顧60512-538(1996))和已知的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)教科書。
能過量表達(dá)accDA基因的質(zhì)粒的一實(shí)例是pZ1accDA(


圖1)，其包含在菌株MH20-22B/pZ1accDA中。質(zhì)粒pZ1accDA是E.coli-谷氨酸棒桿菌穿梭載體，其攜帶accDA基因并基于質(zhì)粒pZ1(Menkel etal.，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)55(3)，684-688(1989))。其他能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體，如pEKEx1(Eikmanns et al.，基因102，93-98(1991))或pZ8-1(EP 0 375 889)可以相同方式應(yīng)用。
本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)除本發(fā)明的新accDA基因之外的已知accBC基因在棒桿菌中的過量表達(dá)也增進(jìn)?；o酶A羧化酶的產(chǎn)生，accDA基因和accBC基因聯(lián)合過量表達(dá)的質(zhì)粒例如是pEK0accBCaccDA(圖2)，質(zhì)粒pEK0accBCaccDA是一E.coli-谷氨酸棒桿菌穿梭載體，其攜帶accBC和accDA基因，并基于質(zhì)粒pEK0(Eikmanns et al.，基因102 93-98(1991))。其它能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體，如pEKx1(Eikmanns et al.，基因102，93-98(1991))或pZ8-1(EP 0375 889)可以相同方式應(yīng)用。
另外，對L-氨基酸生產(chǎn)有利的是不僅accDA基因而且一或多種生物合成途徑的酶的過量表達(dá)，這樣，例如對于L-賴氨酸的制備，有可能·同時過量表達(dá)編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B 0 197 335)，或·同時擴(kuò)增賦予S-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段(EP-A 0 088 166)。另外，切斷非所需二級反應(yīng)以及過量表達(dá)accDA基因也可有利于L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的生產(chǎn)(為產(chǎn)生相應(yīng)的L-氨基酸可以更有利地阻斷不需要的次級反應(yīng)(Nakayama″生產(chǎn)氨基酸的微生物的培育″，見《微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生》，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編者)，學(xué)院出版社，倫敦，英國，1982)。
為生產(chǎn)L-賴氨酸，根據(jù)本發(fā)明制備的微生物可采用分批或流加方法或重復(fù)流加方法連續(xù)培養(yǎng)或不連續(xù)培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法總結(jié)在以下教科書中Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einfhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所使用的培養(yǎng)基必須完全滿足特定菌株的需要。各種微生物的培養(yǎng)基在美國細(xì)菌學(xué)會的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊”(華盛頓D.C.，美國)中有描述。可以利用的碳源包括糖和碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素；油和脂肪，如大豆油，向日葵油，花生油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸；醇，如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸，如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)使用或者混合使用。可以利用的氮源包括含氮有機(jī)化合物，如蛋白胨，酵母膏，肉膏，麥芽汁，玉米漿，大豆粉和尿素；或者無機(jī)化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)使用或者混合使用。可以利用的磷源是磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基必須還含有生長必需的金屬鹽，如硫酸鎂或者硫酸鐵。最后，除了以上所述的物質(zhì)外，對促生長必需的物質(zhì)如氨基酸和維生素也可以使用。合適的前體也可以添加至培養(yǎng)基中。所述的營養(yǎng)物質(zhì)可以以單批或者在培養(yǎng)期間適當(dāng)流加至培養(yǎng)基中。
堿性化合物，如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨或氨水，或者酸性化合物，如磷酸或者硫酸，用來適當(dāng)?shù)乜刂婆囵B(yǎng)物的pH值。消泡劑，如脂肪酸聚乙二醇酯，可以用來控制起泡。合適的選擇性作用物質(zhì)，如抗生素，可以添加至培養(yǎng)基中，以保持質(zhì)粒穩(wěn)定性。氧氣或含氧的氣體混合物，如空氣，引入培養(yǎng)基，以保持需氧條件。培養(yǎng)溫度通常從20℃至45℃，優(yōu)選地為25℃至40℃。培養(yǎng)繼續(xù)至形成最大量的所需L-氨基酸。這一目標(biāo)通常在10小時至160小時之內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
L-賴氨酸可以采用陰離子交換層析和隨后的茚三酮衍生化分析，如Spackman等所描述的(分析化學(xué)，30，1190(1958))。
下列微生物已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國)·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pZ1accDA，保藏號為DSM 12785。·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pEK0accBCaccDA，保藏號為DSM12787。
本發(fā)明的方法可用于經(jīng)發(fā)酵棒桿菌制備L-氨基酸，尤其是L-天冬氨酸，L-天冬酰胺、L-高絲氨酸，L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸。其尤其用于制備L-賴氨酸。
實(shí)施例通過以下實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步詳加例證。
實(shí)施例1accDA基因的克隆及測序。
如Bormann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)所述，用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))構(gòu)建谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。
將選擇的粘粒用限制酶EcoRI和XhoI，根據(jù)限制酶生產(chǎn)者(Boehringer Mannheim)的指導(dǎo)進(jìn)行消化。形成的DNA片段與也已用限制酶EcoRI和XhoI處理的載體pUC 18(Norrander et al.，基因26，101-106(1983))混合，在用T4 DNA連接酶處理后，克隆入E.coli菌株DH 5αmcr(Grant et al.，美國科學(xué)院院刊87，4645-4645(1990))，如Sambrook等所述(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。如Sambrook等所述(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。將質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體中分離，并稱之為pUCaccDA，然后用由Promega(Heidelberg，德國)提供的試劑盒(Erase-a-Base)，經(jīng)外切核酸酶III消化制備亞克隆，將所述亞克隆通過Sanger等所述的雙脫氧鏈終止測序法(美國科學(xué)院院刊74，5463-5467(1977))進(jìn)行測序。測序是用自動閱讀測序試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)進(jìn)行。用Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)的自動激光熒光(A.L.F)測序儀進(jìn)行凝膠電泳分析，用HUSAR軟件程序包(Release 4.0，EMBL，Heidelberg，德國)分析所得核苷酸序列，此核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，對核苷酸序列的分析示出一1473堿基對的開放讀框，其被稱為accDA基因。谷氨酸棒桿菌的accDA基因編碼484個氨基酸的多肽。
實(shí)施例2accDA基因在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)accDA基因被亞克隆入載體pZ1(Menkel et al.，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)55，684-688(1989))中以在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)，通過用限制酶ClaI切割質(zhì)粒pUCaccDA(參見實(shí)施例1)進(jìn)行亞克隆。如實(shí)施例1所述分離所得1.6kb片段，用Klenow聚合酶和堿性磷酸酶處理，并用于與預(yù)先已用ScaI線性化的pZ1連接。將連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli DH 5αmcr(Grant et al.，美國科學(xué)院院刊87，4645-4645(1990))，并在含卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體，得到7.7kb穿梭載體pZ1accDA(
圖1)。如Haynes所述(FEMS微生物學(xué)通訊61，329-334(1989))，通過電穿孔將其摻入菌株DSM 5715中，并在LBHIS瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體(Liebl et al.，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊65，299-304(1989))給出谷氨酸棒桿菌菌株DSM 5715/pZ1accDA。
實(shí)施例3
用菌株DSM 5715/pZ1accDA制備L-賴氨酸在CgIII培養(yǎng)基(Keilnauer et al.，細(xì)菌學(xué)雜志175，5595-5603(1993))中預(yù)培養(yǎng)之后，將菌株DSM5715/pZ1accDA在生產(chǎn)培養(yǎng)基CgXII(Keilnauer et al.，細(xì)菌學(xué)雜志175，5595-5603(1993))中培養(yǎng)。加入4％的葡萄糖和50mg/l的硫酸卡那霉素。
在培養(yǎng)48小時后，測定在660nm的光密度以及產(chǎn)生的L-賴氨酸的濃度，試驗(yàn)結(jié)果見于表1。
表1
實(shí)施例4accBC和accDA的聯(lián)合表達(dá)(i)構(gòu)建表達(dá)載體pEK0accBC accDA用限制酶AgeI和SmaI消化含accBC的質(zhì)粒pWJ71(Jager et al.，Archives of Microbiology 166，76-82(1996))，然后用Klenow聚合酶和堿性磷酸酶處理。在一平行操作中，質(zhì)粒pUCaccDA用EcoRI/XhoI消化，然后用Klenow聚合酶和堿性磷酸酶處理。如Sambrook等所述(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，通過制備分離將攜帶accDA的2.1kb片段從瓊脂糖凝膠中分離。將所述片段與已如上述制備的載體pWJ71連接，通過KpnI/SalI消化將攜帶accBCaccDA的4.6kb片段從所得質(zhì)粒中切割出，并再經(jīng)制備瓊脂糖凝膠電泳分離。為將此片段與谷氨酸棒桿菌/E.coli穿梭載體pEK0(Eikmanns et al.，Gene 102，93-98(1991))連接，將pEK0用限制酶KpnI和SalI消化，然后用Klenow聚合酶和堿性磷酸酶處理。將此方法制備的載體與攜帶accBCaccDA的4.6kb片段連接。所得載體pEK0accBCaccDA示于圖2。如實(shí)施例2所述，通過電穿孔將此載體摻入菌株ATCC13032，得到谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13032/pEK0accBCaccDA。
(ii)?；o酶A羧化酶活性的測定在CGIII培養(yǎng)基(Keilhauer et al.，細(xì)菌學(xué)雜志175，5595-5603(1993))中預(yù)培養(yǎng)之后，將菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032/pEK0accBCaccDA在CGXII培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基見Keilhauer等所述(Keilhauer et al.，細(xì)菌學(xué)雜志175，5595-5603(1993))。經(jīng)離心收集細(xì)胞，并將沉淀細(xì)胞用60mM Tris-HCl(pH7.2)洗一次，并在相同緩沖液中重懸浮，通過10分鐘超聲處理將細(xì)胞消化(Branson Sonifier W-250，Branson Sonic Power Co.Danbury，USA)然后在4℃離心30分鐘分離出細(xì)胞碎片，并將上清液在酶測試中用作粗提物。酶測試的反應(yīng)混合物含有60mM Tris-HCl(pH7.2)，65mM KHCO3，1mM ATP，1.5mM MgCl2，4mM?；o酶A(選擇乙酰輔酶A或丙酰輔酶A)，和4mg粗提物，反應(yīng)體積1ml。將測試混合物在30℃溫育，然后在15，30，45及60秒取100μl樣品，并通過HPLC分析(Kimura et al.，細(xì)菌學(xué)雜志179，7098-7102(1997))測定丙二酸單酰輔酶A或甲基丙二酸單酰輔酶A的濃度。如表2所示，菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032/pEK0accBCaccDA呈現(xiàn)對乙酰輔酶A和丙酰輔酶A的高?；o酶A羧化酶活性，而對照菌株對乙酰輔酶A和丙酰輔酶A僅呈低?；o酶A羧化酶活性。
表2.谷氨酸棒桿菌中酰基輔酶A羧化酶的比活性(μmol/min.mg蛋白)。
本說明書有以下附圖
圖1質(zhì)粒pZ1accDA的圖譜。圖2質(zhì)粒pEK0accBCaccDA的圖譜。
序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司于利希研究中心有限公司<120>發(fā)酵制備L-氨基酸的方法及編碼accDA基因的核苷酸序列<130>990042BT<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2123<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>基因<222>(508)..(1980)<223>accDA<400>1ctcgagcggg agtcggtgat cggccactct ctaagcaatg ccggctttaa aataaagcaa 60cttatatgtt tctcaccaca tctggccgac gaccacgaag tatgttgtcg atcacagcta 120aacgtgtgaa tgtgaagtta cctaactcac attgcaatgc gatagcgatt tggaaaactc 180actcccccca atatcttaac ttaaacttaa aagtagtgtt ttacctgcat ttataaaagt 240tcccgatcta ccccctcttt accccgaaat accccttttg caaagattgc aaacacaaca 300gtgcaatagt taacgggctt cacacgtcac cattctgtcc ggttttaggc tatgttcggg 360acgtctaggc aaaaagtagt tttgtgagat gaaacgcata atccgtcatt ttttacgcaa 420tcgatagcct aaattgggct tagatcttcc gcctctaaat aggtatgcag agacattcga 480attaattaac aaagccattt ttcggccgtg gagaagcgtt ttccgactat ggtgtggggc 540atggaacaca cttcagcatt gacgctcata gactcggttt tggaccctga cagcttcatt 600tcttggaatg aaactcccca atatgacaac ctcaatcaag gctatgcaga gaccttggag 660cgggctcgaa gcaaggccaa atgcgatgaa tcggtaatta 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435 440 445gtc gcc gaa acc gag cac ttt gtt gaa gaa att ctc ggc aca atc agc1392Val Ala Glu Thr Glu His Phe Val Glu Glu Ile Leu Gly Thr Ile Ser450 455 460aac gcc ctc tcc gaa ttg gat aac aat ccg gag agg gcg gga cgc gac1440Asn Ala Leu Ser Glu Leu Asp Asn Asn Pro Glu Arg Ala Gly Arg Asp465 470 475 480agt cgc ttc aca cga ttt gag cgt tta gcg cag1473Ser Arg Phe Thr Arg Phe Glu Arg Leu Ala Gln485 490<210>3<211>491<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>3Val Glu Lys Arg Phe Pro Thr Met Val Trp Gly Met Glu His Thr Ser1 5 10 15Ala Leu Thr Leu Ile Asp Ser Val Leu Asp Pro Asp Ser Phe Ile Ser20 25 30Trp Asn Glu Thr Pro Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Gln Gly Tyr Ala Glu35 40 45Thr Leu Glu Arg Ala Arg Ser Lys Ala Lys Cys Asp Glu Ser Val Ile50 55 60Thr Gly Glu Gly Thr Val Glu Gly Ile Pro Val Ala Val Ile Leu Ser65 70 75 80Asp Phe Ser Phe Leu Gly Gly Ser Leu Gly Thr Val Ala Ser Val Arg
85 90 95Ile Met Lys Ala Ile His Arg Ala Thr Glu Leu Lys Leu Pro Leu Leu100 105 110Val Ser Pro Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Gln Glu Asp Asn Arg Ala115 120 125Phe Val Met Met Val Ser Ile Thr Ala Ala Val Gln Arg His Arg Glu130 135 140Ala His Leu Pro Phe Leu Val Tyr Leu Arg Asn Pro Thr Met Gly Gly145 150 155 160Ala Met Ala Ser Trp Gly Ser Ser Gly His Leu Thr Phe Ala Glu Pro165 170 175Gly Ala Gln Ile Gly Phe Leu Gly Pro Arg Val Val Glu Leu Thr Thr180 185 190Gly His Ala Leu Pro Asp Gly Val Gln Gln Ala Glu Asn Leu Val Lys195 200 205Thr Gly Val Ile Asp Gly Ile Val Ser Pro Leu Gln Leu Arg Ala Ala210 215 220Val Ala Lys Thr Leu Lys Val Ile Gln Pro Val Glu Ala Thr Asp Arg225 230 235 240Phe Ser Pro Thr Thr Pro Gly Val Ala Leu Pro Val Met Glu Ala Ile245 250 255Ala Arg Ser Arg Asp Pro Gln Arg Pro Gly Ile Gly Glu Ile Met Glu260 265 270Thr Leu Gly Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Gly Ala Arg Ala Gly Ala275 280 285Leu Ser Pro Ala Val Arg Val Ala Leu Ala Arg Ile Gly Gly Arg Pro290 295 300Val Val Leu Ile Gly Gln Asp Arg Arg Phe Thr Leu Gly Pro Gln Glu305 310 315 320Leu Arg Phe Ala Arg Arg Gly Ile Ser Leu Ala Arg Glu Leu Asn Leu325 330 335Pro Ile Val Ser Ile Ile Asp Thr Ser Gly Ala Glu Leu Ser Gln Ala340 345 350Ala Glu Glu Leu Gly Ile Ala Ser Ser Ile Ala Arg Thr Leu Ser Lys355 360 365Leu Ile Asp Ala Pro Leu Pro Thr Val Ser Val Ile Ile Gly Gln Gly370 375 380Val Gly Gly Gly Ala Leu Ala Met Leu Pro Ala Asp Leu Val Tyr Ala385 390 395 400Ala Glu Asn Ala Trp Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ala405 410 415Ile Leu Phe Arg Asp Thr Asn His Ala Ala Glu Ile Ile Glu Arg Gln420 425 430Gly Val Gln Ala His Ala Leu Leu Ser Gln Gly Leu Ile Asp Gly Ile435 440 445Val Ala Glu Thr Glu His Phe Val Glu Glu Ile Leu Gly Thr Ile Ser450 455 460Asn Ala Leu Ser Glu Leu Asp Asn Asn Pro Glu Arg Ala Gly Arg Asp465 470 475 480
26Ser Arg Phe Thr Arg Phe Glu Arg Leu Ala Gln485 490
權(quán)利要求
1.源自棒桿菌并能在棒狀微生物中復(fù)制并至少含有SEQ IDNO.1所示編碼accDA基因的核苷酸序列的優(yōu)選地重組的DNA。
2.如權(quán)利要求1的能復(fù)制的DNA，其具有(i)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，(ii)至少一個在遺傳密碼簡并區(qū)內(nèi)相應(yīng)于(i)序列的序列，或(iii)至少一個與互補(bǔ)于(i)或(ii)序列的序列雜交的序列，且任選地(iv)在(i)內(nèi)的中性有義突變。
3.衍生自如權(quán)利要求1或2的核苷酸序列的蛋白質(zhì)氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示。
4.通過導(dǎo)入一或多個如權(quán)利要求1或2的能復(fù)制的DNA而轉(zhuǎn)化的棒狀微生物，尤其是棒桿菌屬。
5.具有如
圖1所示限制圖譜的穿梭載體pZ1accD，保藏在谷氨酸棒桿菌中，保藏號DSM 12785。
6.一種通過棒桿菌的發(fā)酵制備L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其中所用細(xì)菌中，accDA基因或編碼其的核苷酸序列被擴(kuò)增，且尤其是過量表達(dá)的。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中所用細(xì)菌中，所需L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因被額外擴(kuò)增。
8.如權(quán)利要求6的方法，其中所用細(xì)菌中，降低所需L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分阻斷。
9.如權(quán)利要求6-8的方法，其中使用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且此載體攜帶編碼accDA基因的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中應(yīng)用的是用質(zhì)粒載體pZ1accDA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，該質(zhì)粒保藏在谷氨酸棒桿菌中，保藏號DSM 12785。
11.如前述一或多條權(quán)利要求的方法，其中應(yīng)用產(chǎn)生L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-高絲氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸的棒桿菌。
12.如權(quán)利要求6-10的一或多條要求的方法，其中應(yīng)用產(chǎn)生L-賴氨酸的棒桿菌。
13.如權(quán)利要求6-11的一或多條要求的方法，其中除了accDA基因之外，accBC基因也是過量表達(dá)的。
14.如權(quán)利要求6的方法，其中編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因是同時過量表達(dá)的。
15.如權(quán)利要求6的方法，其中賦予S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性的DNA片段同時被擴(kuò)增。
16.如前述一或多條權(quán)利要求的經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L-氨基酸的棒桿菌，其中至少accDA基因被擴(kuò)增，b)在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌的細(xì)胞中富集所需L-氨基酸，c)分離所需氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼accDA基因的核苷酸序列,及用棒桿菌經(jīng)發(fā)酵制備L－氨基酸,尤其是L－賴氨酸的方法,在所述棒桿菌中accDA基因被擴(kuò)增。
文檔編號C12N15/60GK1275620SQ00109310
公開日2000年12月6日 申請日期2000年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月27日
發(fā)明者伊沃內(nèi)·蒂爾格, 洛塔爾·埃格林, 伯恩哈德·艾克曼斯, 赫爾曼·扎姆, 貝蒂娜·默克爾 申請人:德古薩－于爾斯股份公司, 于利希研究中心有限公司