植物。在馬鈴薯中，當(dāng)綠色部分開(kāi)始變干時(shí)， 采集成熟塊莖(階段3)，洗凈土壤，干燥并且在完全黑暗下保持在4°C。
[0147] 通過(guò)分別向pK7GWIWG2(II)和pJCV52二元載體中引入相應(yīng)的GAME9DNA片段來(lái)產(chǎn)生 GAME9沉默(RNAi)和過(guò)度表達(dá)(OX)構(gòu)建體。產(chǎn)生用于使GAME9在番茄和馬鈴薯中沉默和過(guò)度 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系并且根據(jù)Itkin等，（2011，同上)制備和分析組織提取物。
[0148] 下表1描述用于產(chǎn)生本文所述的構(gòu)建體的低聚核苷酸。如先前所述（Itkin等， 2001，同上;W0 2012/095843)產(chǎn)生GAME4沉默構(gòu)建體(RNAi ; GAME4i)、GAME4過(guò)度表達(dá)構(gòu)建體 (GAME4oe)和GAME8沉默構(gòu)建體。
[0149] 表1:用于構(gòu)建體產(chǎn)生的低聚核苷酸
[0150]
[0151]
[0152] 共表達(dá)分析
[0153] 使用番茄GAME1 ( Solyc07g043490 )和其馬鈴薯直系同源基因 SGT1 (PGSC003DMG400011749)作為共表達(dá)分析中的'誘餌'，產(chǎn)生共表達(dá)的基因（對(duì)于單獨(dú)地每種 '誘餌'）的列表(按降序排序，r值2 0.8)。隨后鑒定兩種同源性基因（在番茄和馬鈴薯中分 別是Solycl2g006460和PGSC0003DMG400024274)，其與"誘館"基因高度相關(guān)(在兩種物種中 r值>0.9)。這些基因鑒定為糖苷生物堿代謝4 (GAME4，W0 2012/095843)。進(jìn)一步添加 GAME4 基因作為先前(GAME 1)共表達(dá)分析的'誘餌'。使用兩種物種中的GAME 1 (SGT1)和GAME4的共 表達(dá)列表來(lái)構(gòu)建共表達(dá)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。如下進(jìn)行分析:使用來(lái)自不同組織和器官(果肉、果皮、 種子、根、葉、芽、花朵、花粉)和發(fā)育階段的番茄RNAseq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(總共25次實(shí)驗(yàn)）（Itkin 等，2011，同上）和來(lái)自不同組織和器官的馬鈴薯RNAseq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（總共40次實(shí)驗(yàn)）（US 2012/0159676)。首先，使用R script來(lái)進(jìn)行共表達(dá)分析（對(duì)于每個(gè)物種）并且使用Perl script構(gòu)建共表達(dá)的基因的列表作為FASTA文件。最后，使用BLASTall工具(Camacho C.等， 200931(：生物信息(81?：81〇11^〇^11)10:421)找出兩個(gè)物種之間的共同同源物。將同源物相 似性的tblastx標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為p值>0.05，最少25個(gè)核苷酸，并且至少60 %相似性作為每種基因 的總同一性。利用Cytoscape程序（Shannon P·等，2003.Genome Res· 13:2498-2504)使共表 達(dá)網(wǎng)絡(luò)可視化。
[0154]系統(tǒng)發(fā)育分析
[0155] 使用Muscle算法比對(duì)蛋白質(zhì)序列并且通過(guò)SeaView V4.3.5程序使用PhyML 3.0最 大似然方法化1?08行〇-1?〇辦181162]\1等，2008.81(：植物生物學(xué)（81?：?131^8丨〇1.)8:131)利 用以下設(shè)置來(lái)分析和可視化系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)：模型-LG;使用近似似然比檢驗(yàn)（aLRT) Shimodaira-Hasegawa樣（SH樣)程序作為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算分枝支持（分枝支持_aLRT(SH 樣））；不變位點(diǎn)-優(yōu)化；跨位點(diǎn)速率變化-優(yōu)化；樹(shù)搜索操作-對(duì)NNI和SPR最好；起始樹(shù)-BioNJ，優(yōu)化樹(shù)形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。分枝上的數(shù)字指示支持每個(gè)節(jié)點(diǎn)的自舉迭代的分率。用于制備 這種樹(shù)和生物體名稱的蛋白質(zhì)的登錄號(hào)列于下表2中；樹(shù)呈現(xiàn)于圖12中。
[0156] 表2:用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的序列的登錄號(hào) [0157]
[0158]
[0159]
[0160] 代謝物分析
[0161] 如先前所述（Itkin等，2011，同上）制備植物組織提取物并且通過(guò)UPLC-qTOF-MS測(cè) 定半極性化合物(包括留體生物堿和留體皂苷)的分布和測(cè)定番茄葉的植物留醇含量。
[0162] 定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法
[0163] 如先前所述（Itkin等，2011，同上）分離RNA并進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。此外，使用TIP41 基因（23)作為馬鈴薯樣品的內(nèi)源性對(duì)照。低聚核苷酸列于上表1中。
[0164] 重組酶的產(chǎn)生
[0165] 從cDNA擴(kuò)增GAME2、GAME17和GAME18并且使用BamH I和Pst I(GAME2、GAME18)或者 BamHI和XhoI(GAME17)限制位點(diǎn)亞克隆到pACY⑶UET-1中，并且通過(guò)測(cè)序證實(shí)插入。將所得 質(zhì)粒PAC-GAME2/17/18轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 DE3。關(guān)于GAME酶的表達(dá)，將新鮮過(guò)夜培養(yǎng)物以 1:100稀釋在含30μg/ml氯霉素的25ml 2xYT培養(yǎng)基中并且在37°C和250rpm下溫育，直至達(dá) 到A6Q()nmS〇. 4。隨后，添加 IPTG達(dá)到0.5mM的濃度，并且在18°C和250rpm下持續(xù)溫育過(guò)夜。第 二天，通過(guò)離心采集細(xì)胞，并且將細(xì)胞團(tuán)塊再次懸浮在2ml的50mM Tris HC1 pH=7.0、15% 甘油、O.lmM EDTA和5mMf3-巰基乙醇中。在通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞后，通過(guò)離心除去不溶性 物質(zhì)，并且將可溶性級(jí)分用于酶的表征。將蛋白質(zhì)儲(chǔ)存在_20°C下直至進(jìn)一步分析。
[0166] 底物的制備
[0167] 對(duì)于水解，將35mg的α-番茄素溶解在3ml的IN HC1中，并且在100°C下溫育15分鐘。 隨后，將溶液放置在冰上，并且添加 NH3直至溶液的pH為9.0。用4ml水/飽和丁醇萃取溶液。 將丁醇相在真空下蒸發(fā)至干燥，將殘余細(xì)胞團(tuán)塊溶解在lml甲醇中并儲(chǔ)存在-20°C下直至進(jìn) 一步使用。使用以25%乙腈水溶液和0.1%甲酸進(jìn)行的等度洗脫，在Luna 5μπι C18(2) 100 A的LC柱150\21.2臟(？1^11〇11161^^，1^4)上分離€[-番茄素的降解產(chǎn)物。使用3100質(zhì)譜 檢測(cè)器(Waters)檢測(cè)化合物，并收集。將級(jí)分冷凍干燥，并且通過(guò)LC-MS確定化合物的純度。 對(duì)于產(chǎn)物的鑒定，依次使用連接至Waters 2996PDA檢測(cè)器的Waters Alliance 2795HPLC和 以正電離模式操作的QTOF Ultima V4.00.00質(zhì)譜儀(Waters,MS technologies,UK)來(lái)進(jìn)行 液相色譜與四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（1(：-(^(^-15)。所用的柱是連接至(：18預(yù)柱（2.0乂 4mm ;AJ0_4286;Phenomenex，USA)的分析型 Luna 3μηι C18(2) 1.Q0: A ;!50X2.0mm (Phenomenex，USA)。經(jīng)過(guò)脫氣的洗脫劑A[超純水：甲酸（1000:1，v/v)]和洗脫劑B[乙腈：甲 酸（1000:1，v/v)]以0.19ml/min的流速使用。梯度起始于5并且在45分鐘內(nèi)線性增加至 75%B，此后洗滌柱并且在下次注入前平衡15分鐘。注入體積為5μ1。這種程序得到幾毫克的 純?chǔ)胈番茄素(番茄堿-半乳糖苷-葡糖苷，T-Gal-Glu)和β?-番茄素(番茄堿-半乳糖苷-二葡 糖苷，T-Gal-Glu-Glu)。由于被T-Gal-Glu強(qiáng)烈污染，番前堿半乳糖苷(T-Gal)不能以這種方 式純化。因此，如先前所述（Itkin等，2011，同上），將5mg番茄堿與GAME1和UDP-半乳糖一起 在lml反應(yīng)混合物中溫育。通過(guò)固相萃取從UDP-半乳糖純化T-Gal。用6mL 100%甲醇調(diào)節(jié) Waters OASIS HLB 3cc柱(Waters Corp.，Milford,MA)，接著用4mL超純水沖洗。裝載補(bǔ)充 有10 %甲醇的反應(yīng)物并且隨后用4mL超純水洗滌濾筒。用lmL 75 %甲醇的超純水溶液(v: v) 和0.4mL 100%甲醇洗脫化合物。使用高速真空濃縮器從合并的洗脫液中除去溶劑，直至獲 得完全干燥的細(xì)胞團(tuán)塊。
[0168] 酶測(cè)定法
[0169] 將底物T-Gal、m_番茄素和γ_番茄素溶解在50%DMS0中達(dá)到1禮。使用5μg/ml酶、 8mM UDP-木糖和0.02mM底物在100μΙ的最終反應(yīng)體積中在含有5πιΜβ-巰基乙醇的50mM Tri s HC1 pH = 7.0中進(jìn)行酶測(cè)定法。在37°C下在攪拌下溫育2小時(shí)后，通過(guò)添加300μ1甲醇和 0.1%甲酸來(lái)終止反應(yīng)，并且接著短暫渦旋和超聲處理15分鐘。隨后，將萃取物在13,000rpm 下離心5分鐘并且經(jīng)由0·45μηι過(guò)濾器(Minisart SRP4,Biotech GmbH,Germany)過(guò)濾，并通 過(guò)LC-MS分析(參見(jiàn)上文）。通過(guò)LC-MS色譜圖中的峰面積來(lái)測(cè)量產(chǎn)物的量，并且與其中大腸 桿菌的酶制劑帶有空pACYCDUET-Ι的對(duì)照溫育進(jìn)行比較。用于檢測(cè)的物質(zhì)是α-番茄素 (C50H83N021 ;m/z = 1034 · 55( [Μ+Η] + ))、β1_番茄素 T-Gal-Glu-Glu(C45H75N017 ;m/z = 902 · 51 ([M+H]))、β2-番茄素（C44H73N016 ;m/z = 872 · 50([M+H] + ))、γ -番茄素 T-Gal-Glu (C39H65N012 ;m/z = 740 · 46( [M+H]))和T-Gal (C33H55N07 ;m/z = 578 · 41 ([M+H]))。
[0170] 病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)實(shí)驗(yàn)
[0171] 如先前所述(Orzaea D等，2009.植物生理學(xué)(Plant Physiol .)150:1122-1134;Li R等，2006質(zhì)譜雜志(J.Mass Spec. )41:1-22)構(gòu)建含有GAME基因片段的載體并進(jìn)行VIGS實(shí) 驗(yàn)。使用感染含有空載體和輔助載體PTRV1的農(nóng)桿菌的植物作為對(duì)照。用于制備pTRV2_DR_ GW載體的低聚核苷酸列于上表1中。
[0172] 野生番茄物種的基因組序列分析
[0173]對(duì)于通過(guò)三種番茄野生物種基因組（即潘那利番茄、醋栗番茄和克梅留斯基番茄） 的再測(cè)序獲得的部分基因組數(shù)據(jù)(Dr.Arnaud G.Bovy，未公布數(shù)據(jù))分析與番茄7號(hào)和12號(hào) 染色體上的SGA生物合成基因簇比對(duì)的序列（重疊群）的存在或不存在。TopHat toolkit (Trapnell C.2012·自然-實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Nat.Protoc· )7:562-578)用于定位作為參考基因組的 番茄基因組（ITAG 2.4)的野生物種的讀數(shù)。用IGV基因組瀏覽器使定位讀數(shù)可視化 (Robinson J T等，2011 ·自然-生物技術(shù)(Nat · Biotechnol · )29:24-26)。為了組裝和比對(duì)來(lái) 自三個(gè)野生物種的重疊群的序列與現(xiàn)有栽培番茄7號(hào)和12號(hào)染色體序列上的基因簇，使用 CLC工作臺(tái)、CAP3BWA和SAMtools套裝軟件和內(nèi)部Perl腳本的組合。
[0174] 實(shí)施例1:與SGA生物合成相關(guān)的基因
[0175] 為了發(fā)現(xiàn)與SGA生物合成相關(guān)的基因，使用來(lái)自番茄和馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 進(jìn)行共表達(dá)分析。作為馬鈴薯或番茄中的"誘館"的GAME1/SGT1(7號(hào)染色體)和GAME4(12號(hào) 染色體)的共表達(dá)以熱圖形式呈現(xiàn)于下表3-6中。與GAME1/SGT17號(hào)染色體)或GAME4(12號(hào)染 色體)高度共表達(dá)的基因以大的字體和粗體描繪。
[0176] 表3:登錄號(hào)、假定蛋白和共表達(dá)r值-番茄，7號(hào)染色體
[0177]
[0178]
[0179] 表4:登錄號(hào)、假定蛋白和共表達(dá)r值-馬鈴薯，7號(hào)染色體
[0180]
[0181]
[0182] 表5:登錄號(hào)、假定蛋白和共表達(dá)r值-番茄，12號(hào)染色體
[0183]
[0184]
[0185] 表6:登錄號(hào)、假定蛋白和共表達(dá)r值-馬鈴薯，12號(hào)染色體
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]將來(lái)自每個(gè)物種的16種基因與GAME1/SGT1共表達(dá)(表7,圖2)。這些基因之一，先前 稱為糖苷生物堿代謝4(GAME4)，編碼細(xì)胞色素 P450蛋白的88D子家族成員（圖3KGAME4和 GAME1/SGT1在番茄和馬鈴薯中顯示非常類似的表達(dá)分布(W0 2010/095843)。番茄和馬鈴薯 中的GAME1/SGT1和GAME4基因定位于7號(hào)和12號(hào)染色體中，以使得它們?cè)谖锢砩暇o接其共表 達(dá)基因中的幾個(gè)(圖2)。
[0190] GAME1/SGT1共表達(dá)基因簇跨越7號(hào)染色體上的約200Kbp基因組區(qū)域。與GAME1 - 起，番茄簇由7種共表達(dá)的基因組成。這些包括3種UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶[GAME2(在馬鈴薯中稱為 SGT3) ;GAME17和GAME18]、72A子家族的細(xì)胞色素 P450(GAME6)、2_酮戊二酸依賴性雙加氧酶 (GAME11)和纖維素合成酶樣蛋白?？磥?lái)，在馬鈴薯中，這個(gè)簇含有5種共表達(dá)的基因，因?yàn)槠?缺乏編碼GAME17和GAME18UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的番茄基因的同源物。利用四種重組簇集番茄 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行酶活性測(cè)定法。GAME 17和GAME 18當(dāng)分別與作為底物的番茄堿半乳糖苷 (T-Gal)和γ-番茄素(T-Gal-Glu)溫育時(shí)展現(xiàn)UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，而GAME2當(dāng)與作為底 物的β?-番茄素（T-Gal-Glu-Glu)溫育時(shí)顯示具有UDP-木糖基轉(zhuǎn)移酶活性（圖4，E至G)。 GAME1先前顯示充當(dāng)番茄中的番茄堿UDP-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（Itkin等，2011，同上）。當(dāng)4種重 組UGI1酶與番茄堿和所有糖苷供體(UDP-半乳糖、-葡萄糖和-木糖)在單一試管中溫育時(shí)，觀 測(cè)到最終SGA產(chǎn)物α-番茄素的累積（圖4H)。