1)發(fā)現(xiàn)，它是dsRNA的存在，由體外RNA制劑中存在的正義鏈和反義鏈的粘接形成，負(fù) 責(zé)產(chǎn)生干擾活性。
[0114] 本發(fā)明涵蓋使用RNA干擾(RNAi)來下調(diào)GAME9、GAME 11、BHLH或其組合的表達(dá)以降 低植物中的留體生物堿/糖苷生物堿的水平。在植物和動(dòng)物中，RNAi由RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合 物(RISC)介導(dǎo)，所述RISC是破壞與沉默觸發(fā)同源的信使RNA的序列特異性、多組分核酸酶。 已知RISC含有源自雙鏈RNA觸發(fā)的短RNA(約22個(gè)核苷酸）。短核苷酸RNA序列與受到抑制的 靶基因同源。因此，短核苷酸序列似乎充當(dāng)引導(dǎo)序列以指示多組分核酸酶RISC，來破壞特異 性mRNA 〇
[0115] 用于起始RNAi的dsRNA可從天然來源分離或通過已知手段產(chǎn)生，例如，從DNA轉(zhuǎn)錄。 如下文所示例，現(xiàn)在容易獲得用于產(chǎn)生針對(duì)靶序列的RNAi分子的質(zhì)粒和載體。
[0116] dsRNA可以兩個(gè)單獨(dú)鏈的形式從載體轉(zhuǎn)錄。在其他實(shí)施方案中，用于形成dsRNA的 兩個(gè)DNA鏈可能屬于相同的或兩個(gè)不同的雙鏈體，它們各自與至少部分互補(bǔ)序列的DNA鏈一 起形成所述雙鏈體。當(dāng)因此產(chǎn)生dsRNA時(shí)，待轉(zhuǎn)錄的DNA序列側(cè)接兩個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)啟動(dòng)子控 制一個(gè)鏈的轉(zhuǎn)錄，并且另一個(gè)啟動(dòng)子控制互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄。這兩種啟動(dòng)子可能是相同或不同 的?？蛇x地，單一啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)單鏈發(fā)夾多聚核苷酸的轉(zhuǎn)錄，所述多聚核苷酸具有粘接以產(chǎn) 生dsRNA的自身互補(bǔ)的正義和反義區(qū)域。
[0117] 抑制作用具序列特異性的原因在于，靶向?qū)?yīng)于RNA的雙鏈體區(qū)域的核苷酸序列 以進(jìn)行基因抑制。含有與靶基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA分子優(yōu)選用于抑制。此外 已發(fā)現(xiàn)相對(duì)于靶序列具有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列可有效用于抑制。因此，可通過 本領(lǐng)域中已知的序列比較和比對(duì)算法(參見Gribskov和Devereux,序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Stockton Press，1991，和其中引用的參考文獻(xiàn))并且通過例如在使用 默認(rèn)參數(shù)的BESTFIT軟件程序中所實(shí)施的Smith-Waterman算法（例如，University of Wisconsin Genetic Computing Group)計(jì)算核苷酸序列之間的差異百分比來優(yōu)化序列同 一性。抑制性RNA與靶基因部分之間的大于90 %的序列同一性或甚至100 %的序列同一性是 優(yōu)選的?？蛇x地，RNA的雙鏈體區(qū)域可在功能上定義為能夠與一部分革E基因轉(zhuǎn)錄物雜交的核 苷酸序列。相同的核苷酸序列的長(zhǎng)度可為至少25、50、100、200、300或400個(gè)堿基?？梢允褂?的dsRNA的長(zhǎng)度無上限。例如，dsRNA的范圍可以從基因的約21個(gè)堿基對(duì)(bp)至基因全長(zhǎng)或 更多。
[0118]根據(jù)某些目前典型的實(shí)施方案，所述沉默分子是靶向GAME9基因的RNAi，其包含以 SEQ ID N0:18所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列。根據(jù)其他典型的實(shí)施方案，所述沉默分子是 靶向GAMEll基因的RNAi，其包含以SEQIDN0 :19所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列。
[0119] 脫氧核酶分子
[0120] 能夠下調(diào)GAME9、GAME11或BHLH的表達(dá)的另一種試劑是脫氧核酶分子，其能夠特異 性裂解GAME9、GAME11或BHLH的mRNA轉(zhuǎn)錄物或DNA序列。脫氧核酶是能夠裂解單鏈和雙鏈靶 序列的單鏈多聚核苷酸。已經(jīng)提出了脫氧核酶的一般模型（"10-23模型"）。"10-23"脫氧核 酶具有15個(gè)脫氧核糖核苷酸的催化結(jié)構(gòu)域，其側(cè)接各自具有七至九個(gè)脫氧核糖核苷酸的兩 個(gè)底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域。這種類型的脫氧核酶可以在嘌呤：嘧啶結(jié)合處有效地裂解其底物RNA (關(guān)于脫氧核酶的評(píng)述，參見:Khachigian，L.M. (2002)分子治療學(xué)新見（Curr Opin Mol Ther)4,119-121)〇
[0121] 識(shí)別單鏈和雙鏈靶裂解位點(diǎn)的合成的工程改造脫氧核酶的構(gòu)建和擴(kuò)增的實(shí)例公 開于美國專利No. 6，326，174中。
[0122] 酶促低聚核苷酸
[0123] 術(shù)語"酶促核酸分子"或"酶促低聚核苷酸"是指在底物結(jié)合區(qū)域中與指定基因靶 標(biāo)具有互補(bǔ)性以及具有對(duì)GAME9、GAME11或BHLH的特異性裂解靶RNA具活性的酶促活性從而 使每個(gè)基因沉默的核酸分子?；パa(bǔ)區(qū)域允許酶促核酸分子與靶RNA充分雜交和后續(xù)裂解。術(shù) 語酶促核酸可與例如核糖酶、催化RNA、酶促RNA、催化DNA、適配酶或適配子結(jié)合核糖酶、催 化低聚核苷酸、核酶、脫氧核酶、RNA酶互換使用。本申請(qǐng)中描述的特定酶促核酸分子不受限 制并且本發(fā)明的酶促核酸分子需要與一個(gè)或多個(gè)靶核酸區(qū)域互補(bǔ)的特定底物結(jié)合位點(diǎn)，并 且其具有在底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)或周圍的核苷酸序列，其向分子賦予核酸裂解和/或連接活性。 美國專利No. 4,987,071公開了這類分子的實(shí)例。
[0124] 透變
[0125] 還可以通過向編碼相應(yīng)蛋白的核酸分子中引入一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變來抑制內(nèi)源性 GAME9、GAME 11或BHLH基因的表達(dá)。可以使用例如定點(diǎn)誘變來引入突變(參見例如Wu編，1993 酶學(xué)方法（Meth.In Enzymol.)第217卷，San Diego:Academic Press;Higuchi,〃重組PCR (Recombinant PCR)"，Innis等編，1990PCR Protocols,San Diego:Academic Press，Inc)〇 這種誘變可用于引入特定的所需氨基酸插入、缺失或取代。靶向誘變的若干技術(shù)是基于雙 鏈斷裂(DSB)在基因組中的靶向誘導(dǎo)，接著易錯(cuò)DNA修復(fù)。通過這種方法最常用于基因組編 輯的是定制設(shè)計(jì)的核酸酶，包括鋅指核酸酶和黃單胞菌源轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶 (TALEN)。
[0126] 基于細(xì)菌成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（c 1 us t er ed r egu 1 ar 1 y interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/Cas(CRISPR相關(guān)）II型原核適應(yīng)性免 疫系統(tǒng)，近來已開發(fā)了用于基因組工程改造的可選方法。這種基于RNA的技術(shù)極具特異性并 且允許由可定制小非編碼RNA引導(dǎo)的基因組DNA的靶向裂解，從而導(dǎo)致通過非同源末端接合 (non-homologous end joining，NHEJ)和同源性引導(dǎo)修復(fù)（homology-directed repair， HDR)機(jī)制的基因修飾(Belhaj K ·等，2013 4直物方法(Plant Methods) 2013，9:39)。
[0127] 可使用利用試劑如甲基磺酸乙酯(EMS)進(jìn)行化學(xué)誘變來獲得點(diǎn)突變?nèi)后w和對(duì)于 GAME9、GAME 11或BHLH基因的突變體的篩選可變得沉默或下調(diào)。在植物中，可以使用依賴于 從天然群體滲入基因的方法。培養(yǎng)物種和野生型物種重復(fù)雜交以便分離包含野生基因組的 給定區(qū)段的植物。某些植物物種，例如玉米或金魚草，具有天然轉(zhuǎn)座子。這些轉(zhuǎn)座子是自主 的，即轉(zhuǎn)座酶位于轉(zhuǎn)座子序列內(nèi)；或非自主的，不具有轉(zhuǎn)座酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以造成轉(zhuǎn) 座子"跳躍"并產(chǎn)生突變?？蛇x地，可以合成在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定位置具有隨機(jī)核苷酸以產(chǎn)生 隨機(jī)氨基酸取代的核酸序列。
[0128] 過度表達(dá)
[0129] 根據(jù)其他實(shí)施方案，本發(fā)明提供具有選自編碼GAME9轉(zhuǎn)錄因子的基因、編碼2-酮戊 二酸依賴性雙加氧酶的基因、編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(BHLH)的基因或其組合的至 少一種基因的增強(qiáng)表達(dá)的遺傳修飾植物，其中所述遺傳修飾植物相比于相應(yīng)的未被修飾的 植物具有增加量的至少一種留體生物堿或其糖基化衍生物。在植物中，留體生物堿在保護(hù) 植物免受各種病原體影響中起作用。留體生物堿被稱為植物抗菌素，即在微生物激發(fā)前存 在于植物中或者在感染后僅由預(yù)先存在的組分產(chǎn)生的低分子量抗微生物化合物。GAME9、 GAME1UBHLH或其任何組合在植物的不可食用部分中的過度表達(dá)因此可以增強(qiáng)植物對(duì)于甾 體-生物堿敏感性病原體的抗性。
[0130] 轉(zhuǎn)基因植物
[0131 ]可以通過如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來進(jìn)行編碼選自GAME9轉(zhuǎn)錄因子、2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶和BHLH-轉(zhuǎn)錄因子的本發(fā)明蛋白質(zhì)的多聚核苷酸或使編碼其的基 因沉默的分子的克隆?？墒褂酶鞣NDNA構(gòu)建體以在所需生物體中表達(dá)所需基因或靶向所述 基因的沉默分子。
[0132] 根據(jù)某些實(shí)施方案，基因或靶向其的沉默分子構(gòu)成包含基因或其沉默分子的表達(dá) 的所有必要元件的表達(dá)載體的一部分。根據(jù)某些實(shí)施方案，通過組成性啟動(dòng)子來控制表達(dá)。 根據(jù)某些實(shí)施方案，所述組成性啟動(dòng)子對(duì)植物組織具特異性。根據(jù)這些實(shí)施方案，所述組織 特異性啟動(dòng)子選自根、塊莖、葉和果實(shí)特異性啟動(dòng)子。根特異性啟動(dòng)子描述于例如 Martinez，E.等，2003.當(dāng)代生物學(xué)(Curr. Biol. )13:1435-1441中。果實(shí)特異性啟動(dòng)子尤其 描述于Estornell L.Η等，2009 ·植物生物技術(shù)雜志（Plant Biotechnol · J· )7 : 298-309和 Fernandez A. I ·等，2009植物生理學(xué)(Plant Physiol · )151:1729-1740中。塊莖特異性啟動(dòng) 子描述于例如Rocha-Sosa M，等，1989 .歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志（ΕΜΒ0 J. )8 : 23-29 ; McKibbin R.S.等，2006.植物生物技術(shù)雜志(Plant Biotechnol .J. )4(4):409-18 中。葉特 異性啟動(dòng)子描述于例如Yutao Yang，Guodong Yang，Shijuan Liu，Xingqi Guo和Chengchao Zheng.中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)（Science in China Series C:Life Sciences. )46:651-660 中。
[0133] 根據(jù)某些實(shí)施方案，表達(dá)載體還包含在3 '非編碼序列處的調(diào)節(jié)元件。如本文所用， "3'非編碼序列"是指位于編碼序列下游的DNA序列并且包括多聚腺苷酸化識(shí)別序列和編碼 能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的其他序列。多聚腺苷酸化信號(hào)的特征通常在于 影響多腺苷酸區(qū)域向mRNA前體的3 '端的添加。不同的3 '非編碼序列的使用由Inge 1 brecht I L等，（1989.植物細(xì)胞(Plant Cell)l :671-680)示例。
[0134] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明中所述的核酸序列和轉(zhuǎn)化載體的各種組分可操作 地連接，以導(dǎo)致所述核酸或核酸片段的表達(dá)。用于可操作地連接本發(fā)明的構(gòu)建體和載體的 組分的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些技術(shù)包括使用連接子，例如合成連接子，例 如包括一個(gè)或多個(gè)限制酶位點(diǎn)。
[0135] 根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)用于轉(zhuǎn)化植物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如本文所用， 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"描述外來DNA如DNA構(gòu)建體(包括表達(dá)載體)進(jìn)入受體細(xì)胞并改變受體細(xì)胞成為 轉(zhuǎn)化的遺傳變異或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化可能是穩(wěn)定的，其中將核酸序列整合至生物體 基因組中并且因而代表穩(wěn)定和遺傳特性，或者是短暫的，其中核酸序列被轉(zhuǎn)化但未整合至 基因組中的細(xì)胞表達(dá)，并且因而代表短暫的特性。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的核酸序列穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化成植物細(xì)胞。
[0136] 通?；诨蚧虻鞍踪|(zhì)的表達(dá)首先選擇根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)具有改變含量的所需 甾體生物堿或留體皂苷的遺傳變異植物。然后對(duì)于具有基因或蛋白質(zhì)的增強(qiáng)或異常表達(dá)的 植物分析留體生物堿和任選地留體皂苷的含量。
[0137] 使用本領(lǐng)域普通人員已知的分子基因?qū)W的標(biāo)準(zhǔn)方法來檢測(cè)突變的GAME9、GAME11 或BHLH基因和/或靶向所述基因的沉默分子的存在和/或所述基因的過度表達(dá)。
[0138] 為測(cè)量基因或沉默分子表達(dá)，應(yīng)從表達(dá)核酸的器官獲得cDNA或mRNA。樣品可在檢 測(cè)步驟之前進(jìn)一步加工。例如，細(xì)胞或組織樣品中的多聚核苷酸可與樣品的其他組分分離， 可擴(kuò)增等。所有獲自生物體的樣品（包括經(jīng)受任何種類的進(jìn)一步加工的那些)被視為獲自所 述生物體。
[0139] 基因或沉默分子的檢測(cè)通常需要從候選變異生物體獲得的多聚核苷酸的擴(kuò)增。 DNA擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。最常用的DNA擴(kuò)增方法是PCR(聚合酶鏈反應(yīng);參見 例如PCR 基礎(chǔ)：從背景到工作臺(tái)（PCR Basics: from background to Bench), Springer Verlag，2000;Eckert等，1991.PCR方法和應(yīng)用（PCR Methods and Applications)l:17)。其 他合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增和自持序列復(fù)制，和基于核酸的序列 擴(kuò)增(NASBA)。
[0140] 根據(jù)某些實(shí)施方案，包含GAME9、GAME11或BHLH基因或其沉默分子的核酸序列還包 含編碼可選擇標(biāo)記的核酸序列。根據(jù)某些實(shí)施方案，所述可選擇標(biāo)記賦予抗生素或除草劑 以抗性;在這些實(shí)施方案中，根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)抗生素或除草劑的抗性對(duì)其進(jìn)行選擇。
[0141] 如下文所示例和如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知來測(cè)量留體生物堿和/或留體皂苷的含 量。
[0142] 呈現(xiàn)以下實(shí)施例以更充分地說明本發(fā)明的一些實(shí)施方案。然而，它們不應(yīng)以任何 方式理解為限制本發(fā)明的寬泛范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下 容易地設(shè)計(jì)本文公開的原理的許多變化和修改。
[0143] 實(shí)施例
[0144] 材料和方法
[0145] 轉(zhuǎn)基因植物的植物材料、處理和產(chǎn)生
[0146] 如先前所述（Itkin等，2001，同上）采集番前（Solanum lycopersicum;小番前）和 馬鈴薯(Solanum tuberosum;栽培變種底西瑞)