異構(gòu)體(Q)。
[0074]圖12示出植物CYP450蛋白質(zhì)家族中的GAME基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。分枝上的數(shù)字指示 支持每個(gè)節(jié)點(diǎn)的自舉迭代的分率。
【具體實(shí)施方式】
[0075] 本發(fā)明公開參與留體生物堿的生物合成途徑的一系列共表達(dá)的基因。本發(fā)明還公 開這種途徑中的關(guān)鍵基因，改變其表達(dá)導(dǎo)致隨之而來(lái)的留體生物堿分布變化。改變留體生 物堿的產(chǎn)生水平可導(dǎo)致對(duì)病原體抗性增加的包含升高含量的留體生物堿的改良植物，或在 植物可食用部分中具有降低含量的這些次要化合物的植物并因此產(chǎn)生改良作物?？蛇x地或 另外，控制本發(fā)明中揭示的基因的表達(dá)可用于產(chǎn)生所希望的留體生物堿，以供未來(lái)例如用 于制藥工業(yè)中。特別是，本發(fā)明公開用于產(chǎn)生不含有毒量的在這些植物的可食用部分中通 常存在的有害留體生物堿的茄屬作物的手段和方法。本發(fā)明的植物因此具有顯著的營(yíng)養(yǎng)和 商業(yè)價(jià)值。
[0076]
[0077] ^文所用，術(shù)語(yǔ)"茄果類"是指茄屬植物。
[0078]術(shù)語(yǔ)"基因"是指包含產(chǎn)生RNA或多肽所需的編碼序列的核酸（例如，DNA或RNA)序 列。多肽可由全長(zhǎng)編碼序列或其任何部分編碼。術(shù)語(yǔ)"其部分"當(dāng)關(guān)于基因使用時(shí)是指所述 基因的片段。所述片段的大小范圍可為幾個(gè)核苷酸到整個(gè)基因序列減去一個(gè)核苷酸。因此， "包含基因的至少一部分的核酸序列"可包含基因片段或整個(gè)基因。
[0079] 術(shù)語(yǔ)"基因"任選地也涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)域并且包括與編碼區(qū)域在5 '和3 '端 在任一端上距離約lkb相鄰定位以使得所述基因?qū)?yīng)于全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度的序列。位于編碼 區(qū)域的5'并且存在于mRNA上的序列被稱為5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)域的3'或下游并且存 在于mRNA上的序列被稱為3 '非翻譯序列。
[0080]術(shù)語(yǔ)"多聚核苷酸"、"多聚核苷酸序列"、"核酸序列"和"分離多聚核苷酸"在本文 可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋核苷酸序列等。多聚核苷酸可為RNA或DNA或其雜合物的聚合物， 其為單鏈或雙鏈的，直鏈或支鏈的，并且其任選地含有合成、非天然或改變的核苷酸堿基。 所述術(shù)語(yǔ)也涵蓋RNA/DNA雜合物。
[0081 ]術(shù)語(yǔ)"RNA干擾"或"RNAi"是指由小的雙鏈RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)的沉默或降低。它是 在動(dòng)物和植物中序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過(guò)程，其由在其雙鏈體區(qū)域中與沉默基因 的序列同源的抑制性RNA(iRNA)起始。所述基因?qū)τ谏矬w可為內(nèi)源性或外源性的，整合存 在于染色體中或存在于未整合至基因組中的轉(zhuǎn)染載體中。所述基因的表達(dá)被完全或部分抑 制。RNAi也可視為抑制靶RNA的功能;所述靶RNA的功能可為完全或部分的。
[0082] 通常，術(shù)語(yǔ)RNAi分子是指包含正義和反義序列的單鏈或雙鏈RNA分子。例如，RNA干 擾分子可為包含自身互補(bǔ)的正義和反義區(qū)域的雙鏈多聚核苷酸分子，其中所述反義區(qū)域包 含與靶核酸分子的互補(bǔ)性?？蛇x地，RNAi分子可為具有自身互補(bǔ)的正義和反義區(qū)域的單鏈 發(fā)夾多聚核苷酸，其中所述反義區(qū)域包含與靶核酸分子的互補(bǔ)性或者它可能是具有兩個(gè)或 更多個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和包含自身互補(bǔ)的正義和反義區(qū)域的莖的環(huán)狀單鏈多聚核苷酸，其中所述反 義區(qū)域包含與靶核酸分子的互補(bǔ)性，并且其中所述環(huán)狀多聚核苷酸可在體內(nèi)或體外加工以 產(chǎn)生能夠介導(dǎo)RNAi的活性分子。
[0083]術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"或"其互補(bǔ)序列"在本文用于指在整個(gè)互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)能夠與另一個(gè)指 定多聚核苷酸形成Watson和Crick堿基配對(duì)的多聚核苷酸的序列。這個(gè)術(shù)語(yǔ)適用于僅基于 其序列而非任何特定組的將實(shí)際結(jié)合兩個(gè)多聚核苷酸的條件的多聚核苷酸對(duì)。
[0084] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"構(gòu)建體"是指包括所關(guān)注多聚核苷酸的人工組裝或分離核酸 分子。一般來(lái)說(shuō)，構(gòu)建體可包括所關(guān)注的一種或多種多聚核苷酸，標(biāo)記基因在一些情況下也 可以是所關(guān)注的基因和適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列。應(yīng)理解，構(gòu)建體中包括調(diào)節(jié)序列是任選的，例如， 在待使用宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列的情況下可能不需要這些序列。術(shù)語(yǔ)構(gòu)建體包括載體，但不 應(yīng)視為對(duì)其進(jìn)行限制。
[0085] 術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"是指核酸序列在單一核酸片段上的締合，以使得一個(gè)核酸序 列的功能受到另一個(gè)核酸序列的調(diào)節(jié)。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)（即，所述 編碼序列在所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下)時(shí)，將所述啟動(dòng)子與所述編碼序列可操作地連接。編 碼序列可以在正義或反義方向上可操作地連接至調(diào)節(jié)序列。
[0086] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子元件"、"啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)子序列"是指位于DNA聚合物 的編碼區(qū)域的5'端（即在前）的DNA序列。實(shí)際上已知的大部分啟動(dòng)子的位置在轉(zhuǎn)錄區(qū)域之 前。所述啟動(dòng)子充當(dāng)開關(guān)，從而激活基因的表達(dá)。如果基因被激活，則據(jù)稱它被轉(zhuǎn)錄，或參與 轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄涉及從基因合成mRNA。因此，啟動(dòng)子充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件以及提供基因向mRNA轉(zhuǎn)錄 的起始位點(diǎn)。
[0087] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)子"是指可以刺激啟動(dòng)子活性并且可能是啟動(dòng)子的固有 元件或插入以增強(qiáng)啟動(dòng)子的水平或組織特異性的異源元件的DNA序列。
[0088] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"是指功能性最終產(chǎn)物例如mRNA或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
[0089] 術(shù)語(yǔ)"遺傳修飾植物"是指人工包含至少一個(gè)遺傳修飾細(xì)胞的植物。所述遺傳修飾 包括內(nèi)源性基因的修飾，例如通過(guò)向所關(guān)注的內(nèi)源性多聚核苷酸或基因引入突變、缺失、插 入、可移位元件等。另外或可選地，遺傳修飾包括用異源性多聚核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。如本 文所用的"遺傳修飾植物"和"相應(yīng)的未被修飾的植物"分別是指包含至少一個(gè)遺傳修飾細(xì) 胞的植物和缺乏所述修飾的相同類型的植物。
[0090]根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"當(dāng)關(guān)于植物使用時(shí)（即，"轉(zhuǎn)基因植物"）是指在 一個(gè)或多個(gè)其細(xì)胞中含有至少一種異源性可轉(zhuǎn)錄多聚核苷酸的植物。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因物質(zhì)"大 致是指植物或其部分，包括在至少一個(gè)細(xì)胞中含有至少一種異源性多聚核苷酸的細(xì)胞或組 織。如本文所用的"轉(zhuǎn)基因植物"和"相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物"分別是指包含至少一個(gè)含有異源 性可轉(zhuǎn)錄多聚核苷酸的細(xì)胞的植物和缺乏所述異源性可轉(zhuǎn)錄多聚核苷酸的相同類型的植 物。
[0091 ]術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化體"或"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"包括原代轉(zhuǎn)化細(xì)胞和不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)目的源自所述細(xì) 胞的培養(yǎng)物。由于有意或無(wú)意的突變，所有后代的DNA含量可能不會(huì)精確相同。在轉(zhuǎn)化體的 定義中包括具有與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選相同功能性的突變后代。
[0092] 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可能是穩(wěn)定的或短暫的。術(shù)語(yǔ)"短暫轉(zhuǎn)化"或"短暫轉(zhuǎn)化的"是指在不存 在外源性多聚核苷酸整合至宿主細(xì)胞的基因組中的情況下將一個(gè)或多個(gè)外源性多聚核苷 酸引入細(xì)胞中。與此相反，術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的"是指一個(gè)或多個(gè)外源性多聚核 苷酸引入和整合至細(xì)胞基因組中。術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體"是指已經(jīng)將一個(gè)或多個(gè)外源性多聚核 苷酸穩(wěn)定整合至基因組或細(xì)胞器DNA中的細(xì)胞。應(yīng)理解，生物體或其用本發(fā)明的核酸、構(gòu)建 體和/或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以短暫地以及穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。
[0093] 基于本發(fā)明中公開的共表達(dá)的基因陣列，提出了從膽固醇至α-番茄素的途徑（圖 1)。先前已描述，利用GAME7 (US 2012/0159676)對(duì)膽固醇在C22處進(jìn)行羥基化，接著在C26位 置處進(jìn)行GAMES羥基化。然后將22,26_二羥基膽固醇在C16處羥基化并且在C22處氧化，接著 利用GAME11和GAME6閉合E環(huán)以形成呋喃留烷醇型糖苷配基。這種反應(yīng)次序得到本發(fā)明研究 結(jié)果的支持，當(dāng)沉默GAME11時(shí)，顯示膽留烷醇型皂苷的累積，缺乏C16處的羥基化和半縮醛E 環(huán)（圖8A-D)。利用GAME4將呋喃甾烷醇中間體氧化為其26-醛，它是由GAME12催化的氨基轉(zhuǎn) 移的底物。在C22處的氨基氮的親核攻擊導(dǎo)致形成番前登醇(tomatidenol)，將其脫氫為番 茄堿。隨后通過(guò)GAME1將番茄堿轉(zhuǎn)化為T-Gal(Itkin等，2011，同上hT-Gal反過(guò)來(lái)又被 GAME17葡糖基化形成γ-番茄素，其被GAME18進(jìn)一步葡糖基化形成β?-番茄素，其最后通過(guò) GAME2轉(zhuǎn)化為α-番茄素(圖1)。
[0094] 本發(fā)明現(xiàn)在表明，通過(guò)調(diào)節(jié)生物合成途徑中所涉及的酶和/或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，可 以改變留體生物堿、留體糖苷生物堿和任選地留體皂苷的水平。
[0095] 本發(fā)明現(xiàn)在表明，出乎意料的是，馬鈴薯植物中與成簇的酶編碼基因共表達(dá)的單 一基因的沉默導(dǎo)致留體糖苷生物堿查茄堿和α_茄堿的量顯著降低，而這種基因的過(guò)度表 達(dá)導(dǎo)致這些物質(zhì)的含量顯著增加（圖5和圖6)。發(fā)現(xiàn)這種基因包括包含ΑΡ2結(jié)構(gòu)域的編碼序 列，并且因此假定為轉(zhuǎn)錄因子，在本文稱為GAME9轉(zhuǎn)錄因子，由GAME9編碼。
[0096] 根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾植物，其包含具有選自編碼GAME9轉(zhuǎn)錄因 子的基因、編碼2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的基因、編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋(BHLH)轉(zhuǎn)錄因 子的基因或其組合的至少一種基因的改變的表達(dá)的至少一個(gè)細(xì)胞，其中所述遺傳修飾植物 相比于相應(yīng)的未被修飾的植物具有改變含量的至少一種留體生物堿或其糖基化衍生物。
[0097] 雖然在遺傳修飾植物中示例，但本發(fā)明的教導(dǎo)可進(jìn)一步能夠操縱留體生物堿或其 糖基化衍生物在能夠天然合成留體生物堿的任何生物體中的合成。如本文關(guān)于2_酮戊二酸 依賴性雙加氧酶(GAME11)所示例，操縱本發(fā)明的基因表達(dá)可進(jìn)一步導(dǎo)致留體皂苷合成的操 縱。
[0098] 因此，根據(jù)其他方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾生物體，其相比于未被修飾的生物 體包含具有至少一種基因的改變的表達(dá)的至少一個(gè)細(xì)胞，所述至少一種基因選自編碼 GAME9轉(zhuǎn)錄因子的基因、編碼2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的基因、編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (BHLH)轉(zhuǎn)錄因子的基因或其組合，其中所述遺傳修飾生物體相比于相應(yīng)的未被修飾的生物 體具有改變含量的選自留體皂苷、留體生物堿和其糖基化衍生物的至少一種化合物。
[0099] 出乎意料的是，本發(fā)明現(xiàn)在表明，通過(guò)調(diào)節(jié)留體生物堿生物合成途徑中所涉及的 酶和/或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，可以嚴(yán)重降低馬鈴薯塊莖中的SGA水平。
[0100] 根據(jù)某些實(shí)施方案，選自編碼GAME9轉(zhuǎn)錄因子的基因、編碼2-酮戊二酸依賴性雙加 氧酶的基因、編碼BHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因或其組合的至少一種基因在遺傳修飾植物中的表達(dá) 相比于其在相應(yīng)的未被修飾的植物中的表達(dá)得到抑制，從而所述遺傳修飾植物相比于相應(yīng) 的未被修飾的植物包含降低含量的至少一種留體生物堿或其糖基化衍生物。
[0101]根據(jù)某些實(shí)施方案，所述遺傳修飾植物包含無(wú)毒量的留體生物堿或其糖基化衍生 物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"無(wú)毒量"是指以每千克可食用植物部分鮮重計(jì)，小于200mg的抗?fàn)I養(yǎng) 甾體生物堿或糖苷生物堿。根據(jù)某些示例性實(shí)施方案，所述遺傳修飾植物包含不可檢測(cè)量 的抗?fàn)I養(yǎng)留體生物堿或其糖基化衍生物。
[0102] 可以使用干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的多種分子(例如，反義、siRNA、核糖酶或脫氧核酶） 在基因組和/或轉(zhuǎn)錄物水平上，或者使用例如拮抗劑、裂解多肽的酶等在蛋白質(zhì)水平上實(shí)現(xiàn) 基因表達(dá)的下調(diào)或抑制。
[0103] 根據(jù)某些示例性實(shí)施方案，所述遺傳修飾植物是轉(zhuǎn)基因植物，其包含含有靶向選 自GAME9、GAME11和BHLH的基因的至少一種沉默分子的至少一個(gè)細(xì)胞。每種可能性代表著本 發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。
[0104] 根據(jù)一些實(shí)施方案，包含沉默分子的生物體相比于相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物具有升高 含量的至少一種留體皂苷或其衍生物。
[0105] 可以設(shè)計(jì)為GAME9、GAME11和BHLH中的至少一種的靶標(biāo)的沉默分子是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的。根據(jù)某些實(shí)施方案，所述沉默分子包含具有與GAME9基因的區(qū)域基本上互補(bǔ)的 核酸序列的多聚核苷酸，所述基因具有以SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6中的任一個(gè)所示的核 酸序列。
[0106] 根據(jù)某些其他實(shí)施方案，所述沉默分子包含具有與GAME11基因的區(qū)域基本上互補(bǔ) 的核酸序列的多聚核苷酸，所述基因具有以SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:12中的任一個(gè)所示 的核酸序列。
[0107] 根據(jù)某些其他實(shí)施方案，所述沉默分子包含具有與BHLH基因的區(qū)域基本上互補(bǔ)的 核酸序列的多聚核苷酸，所述基因具有以SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:17中的任一個(gè)所示的 核酸序列。
[0108] 反義分子
[0109] 反義技術(shù)是其中反義RNA或DNA分子與靶標(biāo)正義DNA或RNA鏈相互作用的過(guò)程。正義 鏈?zhǔn)? '至3'mRNA分子或DNA分子。正義鏈的互補(bǔ)鏈或鏡像鏈被稱為反義鏈。當(dāng)反義鏈與正義 mRNA鏈相互作用時(shí)，雙螺旋被識(shí)別為細(xì)胞外源的并且將被降解，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)生減少 或不存在。雖然DNA已經(jīng)是雙鏈分子，但可以將反義技術(shù)應(yīng)用至其，建立三鏈體形成。
[0110] RNA反義鏈可以是催化或非催化的。所述催化反義鏈(也稱為核糖酶)在特定序列 裂解RNA分子。非催化RNA反義鏈阻斷進(jìn)一步RNA加工。
[0111] 可通過(guò)用至少一種反義化合物(包括反義DNA、反義RNA、核糖酶、脫氧核酶、鎖定核 酸(LNA)和適配子)轉(zhuǎn)化生物體細(xì)胞或組織來(lái)實(shí)現(xiàn)GAME9、GAME1和BHLH基因或其任何組合的 細(xì)胞和/或組織水平的反義調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，所述分子被化學(xué)修飾。在其他實(shí)施方 案中，所述反義分子是反義DNA或反義DNA類似物。
[0112] RNA 干擾(RNAi)分子
[0113] RNAi是指引入同源性雙鏈RNA(dsRNA)以靶向特定基因產(chǎn)物，從而導(dǎo)致所述基因的 轉(zhuǎn)錄后沉默。這種現(xiàn)象首先由Guo和Kemphues(1995,細(xì)胞(Cell) ,81(4):611-620)報(bào)道于秀 麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans)中，并且隨后Fire等，（1998,自然（Nature)391: 806-81