. U./ml青霉素和鏈霉素以及2mM L-谷氨酰胺的 DMEM中在5% 0)2于37或30°C (如所示）維持豬或牛成纖維細(xì)胞。對(duì)于轉(zhuǎn)染，除了另有說 明，使用NEON轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（Life Technologies)通過轉(zhuǎn)染遞送所有TALEN和HDR模板。簡單 的說，達(dá)到100%匯合的低傳代奧斯薩巴豬（Ossabaw)、蘭德瑞斯豬（Landrace)、和Wagyu， 或荷爾斯泰因牛成纖維細(xì)胞以1:2分開，并在次日在70% -80%匯合時(shí)收獲。每次轉(zhuǎn)染由 500, 000-600, 000個(gè)重懸于"R"緩沖液的細(xì)胞構(gòu)成，所述細(xì)胞與質(zhì)粒DNA或mRNA以及寡聚 物混合，并通過以下參數(shù)使用100 μ 1尖端電穿孔：輸入電壓；1800V ;脈沖寬度；20ms ;以及 脈沖數(shù)；1。通常來說，每次轉(zhuǎn)染中包括2-4 μ g TALEN表達(dá)質(zhì)?；?-2 μ g TALEN mRNA和 2-3 μ M對(duì)于感興趣基因特異性的寡聚物。與那些量的偏差示于圖例中。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞以 60:40分到6孔板的兩個(gè)分開的孔中，分別在30或37 °C培養(yǎng)三天。三天后，細(xì)胞群在37 °C 擴(kuò)增直到至少第10天，來評(píng)估編輯的穩(wěn)定性。
[0116] 實(shí)施例5:稀釋克隆
[0117] 轉(zhuǎn)染后三天，50-250個(gè)細(xì)胞接種到IOcm皿中并培養(yǎng)直到集落個(gè)體直徑達(dá)到約 5mm。在這點(diǎn)時(shí)，添加 6ml 以 1:5 (vol/vol)稀釋于 PBS 的 TRYPLE (Life Technologies)，并 吸出集落，轉(zhuǎn)移到24孔皿孔的孔中并在相同420種條件下培養(yǎng)。收集達(dá)到匯合的集落并分 開，用于冷凍保存和基因型分型。樣品制備：從6孔皿的孔中收集第3和第10天的轉(zhuǎn)染細(xì)胞 群，并將 10-30%重懸于50 μ I IxPCR裂解緩沖液：10mM Tris-Cl pH 8.0, 2mM EDTA, (λ 45% Tryton Χ-100 (vol/vol)，0· 45% Tween-20 (vol/vol)，新鮮補(bǔ)充有 200 μ g/ml 蛋白酶 Κ。使 用以下參數(shù)在熱循環(huán)儀中處理裂解液：55°C 60分鐘，95°C 15分鐘。來自稀釋克隆的集落 樣品使用20-30 μ 1裂解緩沖液如上處理。
[0118] 實(shí)施例6
[0119] 通過PRC進(jìn)行POLLEN漸滲的檢測，其使用Fl引物（見實(shí)施例3,上文）和"Ρ"引物 (5,-ACGTACTCTTCATTTCACAGCCTAC) (SEQ ID NO: 23)，使用 IX MyTaq Red 混合物（Bioline) 持續(xù) 38 個(gè)循環(huán)（95°C，25s ;62°C，25s ;72°C，60s)。使用（F2:5, -GTCTGGGGTGAGATAGTTTTC TTGG(SEQ ID N0:24) ;R2-5'-GGCAGAGATGTTGGTCTTGGGTGT)(SEQ ID N0:25)進(jìn)行第二次PCR 測定法。通過這兩次測試的候選物通過使用側(cè)翼Fl和Rl引物的PCR，隨后通過TOPO克隆 和測序分析。
[0120] 實(shí)施例7 :擴(kuò)增子測序和分析
[0121] 從轉(zhuǎn)染群體分離DNA并將100-250ng加到50 μ 1根據(jù)制造商的推薦裝配的 PLATINUM TAQ DNA POLYMERASE HIGH FIDELITY (Life Technologies)。每個(gè)樣品分配帶有 獨(dú)特條形碼（barcode)的引物組來實(shí)現(xiàn)多重測序。PCR產(chǎn)物的一部分溶解于2. 5%瓊脂糖凝 膠上來確定大小，之后使用MINELUTE PCR PURIFICATION試劑盒（Qiagen)進(jìn)行PCR清潔。 樣品經(jīng)量化并合并到單個(gè)樣品中用于測序。單個(gè)組合樣品摻入25% PhiX(用于序列遞送） 并在Illumina MISEQ測序儀上測序，產(chǎn)生150個(gè)堿基對(duì)配對(duì)末端讀出。讀出質(zhì)量使用具有 重疊末端的FASTQC讀出對(duì)（Read-pairs)評(píng)估，并使用來自EC-UTILS包的FASTQ-JOIN連 接。使用自定義PERL腳本來多路分解（demultiplex)連接的讀出并計(jì)算插入類型。在多 路分解步驟中，需要與正向和反向引物的準(zhǔn)確匹配。克隆的動(dòng)物通過RELP測定和測序來測 定基因型。
[0122] 實(shí)施例8 :用編碼TALEN的mRNA轉(zhuǎn)染家畜細(xì)胞導(dǎo)致有效的目標(biāo)切割
[0123] 如先前所描述的（〇3118〇11，2010)，將了41^~。0嫩〇^1^~對(duì)口6511.1和01?7.1)克 隆到PT3TS克隆載體中T3啟動(dòng)子的下游，并根據(jù)制造商的方案使用MINELUTE PCR純化試 劑盒（Qiagen)純化，之后使用 MMESSAGE MACHINE T3 試劑盒（Applied Biosciences)合成 mRNA。還可見 Carlson2013。代替由 3'-〇-Μθ-πΛ}(5'）ρρρ(5'）6 RNA 帽類似物（New England Biolabs)，5-甲基胞苷三磷酸假尿啼啶三磷酸（TriLink Biotechnologies, San Diego, CA) 和兩種標(biāo)準(zhǔn)核糖核苷酸，腺苷三磷酸和鳥苷三磷酸組成的核糖核苷酸混合物，使用 MMESSAGE MACHINE T3試劑盒（Applied Biosciences)從相同的載體合成經(jīng)修飾的mRNA。 用DNA酶處理mRNA合成反應(yīng)，之后使用MEGACLEAR REACTION CLEANUP試劑盒（Applied Biosciences)純化。a)使用具有以下設(shè)置的NEON核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（Life Technologies)將指 定量的P6511. ITALEN轉(zhuǎn)染到豬成纖維細(xì)胞中（每個(gè)重復(fù)500, 000-750, 000個(gè)細(xì)胞）：1次 脈沖，1800v ;20ms寬度和100 μ 1尖端（tip)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在30或37攝氏度培養(yǎng)3天， 之后通過調(diào)查者測定法（Transgenomic)進(jìn)行插入缺失分析。如描述于Guischin等，2010 的那樣計(jì)算NHEJ百分比，并繪制在圖上。4微克編碼p6511. ITALEN的質(zhì)粒DNA (pDNA)也在 相同的條件下轉(zhuǎn)染，用于％ NHEJ的比較。b)mRNA結(jié)構(gòu)、組成或體外合成反應(yīng)方案對(duì)TALEN 活性具有很小的影響。編碼DMD7. ITALEN的mRNA通過使用標(biāo)準(zhǔn)的或經(jīng)修飾的核糖核苷酸， 單獨(dú)地（"I"在分開的反應(yīng)中左和右TALEN)或在同一個(gè)反應(yīng)（雙重"D"）中合成。接著， 將反應(yīng)分為兩個(gè)重復(fù)，其中一個(gè)根據(jù)制造商的方案使用Poly(A)加尾（Tailing)試劑盒 (Ambion)加上額外的polyA尾。
[0124] 從質(zhì)粒DNA表達(dá)TALEN已經(jīng)是一種用于誘導(dǎo)家畜細(xì)胞中TALEN介導(dǎo)的插入缺失的 有效方法；然而，TALEN編碼質(zhì)?？赡苷系郊?xì)胞的基因組中。相反，mRNA不能整合到宿主 細(xì)胞的基因組中。為了避免TALEN編碼質(zhì)粒的整合，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來確定是否能通過轉(zhuǎn)染編 碼TALEN的mRNA來達(dá)到相似水平的TALEN活性。使用標(biāo)準(zhǔn)或經(jīng)修飾的核糖核苷酸產(chǎn)生編碼 p6511. ITALEN對(duì)的TALEN mRNA。通過核轉(zhuǎn)染將兩個(gè)量的每種TALEN mRNA制備物轉(zhuǎn)染到豬 成纖維細(xì)胞中，在30或37攝氏度培養(yǎng)3天，之后分析插入缺失。對(duì)于所有在30攝氏度孵 育的mRNA轉(zhuǎn)染，NHEJ百分比都是相似的，而對(duì)于在37攝氏度孵育的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可以觀察到 劑量反應(yīng)。然而，在這一重復(fù)中，不能檢測到經(jīng)修飾的和標(biāo)準(zhǔn)的核糖核苷酸之間NHEJ百分 比的顯著性差異，沒有使用相等的量。值得注意的是，在30攝氏度孵育的所有組中的mRNA 轉(zhuǎn)染顯著地勝過了在相同條件下作為質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的p6511. 1TALEN。
[0125] 進(jìn)行了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)以在第二個(gè)基因座，豬DMD檢測修飾的相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸合 成的mRNA的影響。這一實(shí)驗(yàn)也評(píng)價(jià)polyA尾的增加是否影響TALEN的活性，以及每一個(gè) TALEN單體（左和右單體）是否能夠在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（雙重）中合成，或者它們是否必須 單獨(dú)合成并在轉(zhuǎn)染前混合。一或四微克DMD7. ITALEN mRNA轉(zhuǎn)染到豬成纖維細(xì)胞中，并在30 或37攝氏度培養(yǎng)三天。與p6511. ITALEN-樣，觀察到在30攝氏度培養(yǎng)的細(xì)胞中TALEN活 性的差別不大，提示經(jīng)修飾的核糖核苷酸、mRNA的體外多聚腺苷酸化或mRNA的雙重轉(zhuǎn)錄對(duì) 活性都沒有影響?？梢栽?7度培養(yǎng)的重復(fù)中再次觀察到劑量反應(yīng)，因?yàn)?yg mRNA勝過了 1 μ g轉(zhuǎn)染。還有，在37度重復(fù)中，多聚腺苷酸化的mRNA似乎勝過了非腺苷酸化的mRNA。
[0126] 值得注意的是，當(dāng)編碼DMD7. ITALEN的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到豬成纖維細(xì)胞中時(shí)，注意到 了相對(duì)于培養(yǎng)至第14天的細(xì)胞，在第3天測量到的％NHEJ水平的顯著下降（40-60%)。這 種％ NHEJ的下降在本文所示的任何mRNA轉(zhuǎn)染重復(fù)中都沒有觀察到，第14天的修飾水平數(shù) 據(jù)未示出。因此mRNA轉(zhuǎn)染似乎是優(yōu)于DNA轉(zhuǎn)染的，不僅在于TALEN活性，也在于在延長的 培養(yǎng)期后維持修飾細(xì)胞的高比例。不受限于具體的理論，相信這一結(jié)果是由于當(dāng)相對(duì)于質(zhì) 粒DNA使用mRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞存活力的改善。
[0127] 實(shí)施例9 :在無選擇的情況下分析通過mRNA轉(zhuǎn)染創(chuàng)建的集落
[0128] 如實(shí)施例8中，1至4微克編碼TALEN的mRAN加到?；蜇i原代成纖維細(xì)胞。細(xì) 胞在暴露于TALEN后在30°C培養(yǎng)三天，并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并將其以1-20個(gè)細(xì)胞/cm2的密度 范圍鋪到IOcm培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)細(xì)胞10-15天，直到可以觀察到直徑為3-4_的集落個(gè)體。 使用p-200移液器在溫和抽吸下吸出集落，并排入帶有500 μ 1培養(yǎng)基的24孔板的孔中 (Carlson，2011)。選擇帶有清晰確定集落（約10-30個(gè)/板）的板用于集落抽吸以限制從 多個(gè)集落吸出細(xì)胞的機(jī)會(huì)。一旦在24孔皿中集落達(dá)到70-90%匯合，收獲一部分用于插入 缺失分析，而剩余部分冷凍保存。插入缺失分析的結(jié)果位于成纖維細(xì)胞克隆的基因型分布 表的最后五行中。這些結(jié)果證明，可以不使用選擇標(biāo)志物從TALEN mRNA轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞 容易地分離集落。通過在第3天來源群體的修飾水平準(zhǔn)確預(yù)測分析克隆中的突變頻率。也 可以容易地鑒定帶有雙等位修飾的克隆。
[0129] 成纖維細(xì)胞克隆中的基因型分布表
CN 105142396 A 兄明干ι 23/27 頁
[0132] A通過PCR產(chǎn)物測序鑒定雙等位K0。使用這一技術(shù)，僅可以鑒定重疊或純合缺失。 Β在兩周內(nèi)，使用相同的TALEN對(duì)轉(zhuǎn)染并回收成纖維細(xì)胞兩次。
[0133] ε 5/15的雙等位集落確定為雙重移碼等位基因。
[0134] °僅分析在PCR擴(kuò)增子中具有可辨識(shí)的大體缺失（gross deletion)的集落。
[0135] E通過高限定熔解分析鑒定雙等位KO集落。僅能夠鑒定純合修飾。
[0136] ?- 95%置信區(qū)間超出預(yù)期的雙等位無效假設(shè)。
[0137] 實(shí)施例10 :DNA和mRNA編碼的TALEN在精原干細(xì)胞中是活性的
[0138] 從IOwk齡公豬中分離豬生殖細(xì)胞，并通過差異富集。使用ΑΜΑΧΑ NUCLE0FECT0R 系統(tǒng)Amaxa溶液"V"和"L"以及"Β"使用Χ-001和Χ-005程序?qū)⒕幋aeGFP和DMD特異性 TALEN的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到生殖細(xì)胞中。也見Carlson 2013。每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)使用IO6個(gè)富集的生 殖細(xì)胞，和指定微克的TALEN編碼質(zhì)粒DNA進(jìn)行。同樣的方法用于遞送編碼DMD7. ITALEN的 mRNA。核轉(zhuǎn)染之后，它們?cè)?% 0)2氣氛中在37°C或30°C培養(yǎng)5天。通過對(duì)GFP和UCH-Ll表 達(dá)共定位的免疫焚光分析來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法（trypan blue exclusion) 來評(píng)價(jià)細(xì)胞存活力。
[0139] 實(shí)施例11 :原生殖細(xì)胞中TALEN刺激的HDR
[0140] 也在雞的原生殖細(xì)胞（PGC)中的雞Ddx4基因座處檢測TALEN刺激的HDR。針對(duì)內(nèi) 含子l(Tall. 1)和外顯子7 (Tal7. 1)構(gòu)建兩個(gè)TALEN對(duì)，并且其功能在DFl雞細(xì)胞中證實(shí)。 還可見實(shí)施例8和Carlson 2013。隨后，每個(gè)TALEN對(duì)與供體靶向載體共轉(zhuǎn)染，所述供體靶 向載體經(jīng)設(shè)計(jì)成將GFP和Ddx4基因的外顯子2融合。正如所期待的，使用Tal 1.1的切割 刺激了同源重組，而Tal 7.(其位于供體靶向載體中的同源序列外）不刺激HDR。
[0141] 實(shí)施例12 :通過TALEN刺激的HR將牛無角等位基因漸滲入有角細(xì)胞中
[0142] 最近已鑒定了無角等位基因（Medugorac, Seichter等2012)，示意圖在圖1中。設(shè) 計(jì)了四個(gè)TALEN對(duì)來切割無角中的重復(fù)區(qū)域的3'（圖1)。使用編碼TALEN對(duì)的mRNA轉(zhuǎn)染 有角荷爾斯泰因牛成纖維細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后3天分析活性。調(diào)查者測定法揭示了每個(gè)TALEN 對(duì)的活性（圖1)。用HPL 3觀察到了峰值活性，因此選擇其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用2微克 HPL 3TALEN mRNA及指定量和處理的ssDNA修復(fù)模板一起轉(zhuǎn)染有角荷爾斯泰因牛原代成纖 維細(xì)胞（圖4)。轉(zhuǎn)染后三天的細(xì)胞群體通過PCR分析無角轉(zhuǎn)化。使用NLS-RecA-Gal4(Lia〇和Essner 2011)包被修復(fù)模板對(duì)于無角轉(zhuǎn)化的頻率有顯著影響（圖4, b和c組）。在個(gè) 體集落中無角轉(zhuǎn)化也很明顯（圖3)。
[0143] 方法：使用NEON轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在以下參數(shù)下（1次脈沖；1800v ;20ms寬度）轉(zhuǎn)染約 600, 000個(gè)細(xì)胞。每個(gè)轉(zhuǎn)染由2微克TALEN mRNA與指定的修復(fù)模板構(gòu)成。修復(fù)模板通過 以下方法使用Gal4:RecA包被。500納克（共3 μ 1)修復(fù)模板PCR產(chǎn)物在95°C孵育10分 鐘，并在冰上放置2分鐘，之后加入0. 8 μ 1緩沖液[IOOmM Tris OAc，pH 7. 5 ;500mM NaOAc ; IOmM DTT ; IOmM Mg (OAc) 2]，0· 6 μ I 16. 2mM ATP γ S (Sigma)和 1，250ng NLS-RecA-Gal4,總 反應(yīng)體積為8 μ 1。這一反應(yīng)接著在37°C孵育30分鐘并放置在冰上。全部的體積用于單一 轉(zhuǎn)染中。使用先前描述的方法（Carlson，Tan等，2012)培養(yǎng)和分析細(xì)胞。使用591bp HDR 模板。
[0144] 實(shí)施例13
[0145] 將通過漸滲無角等位基因的本文所描述的方法制成的細(xì)胞，或修飾的胚胎克隆和 /或放入替代雌性中，孕育，并作為包含無角等位基因的活體動(dòng)物出生。
[0146] 進(jìn)一步公開
[0147] 1. -種經(jīng)遺傳修飾的家畜動(dòng)物，其包含從有角等位基因到無角等位基因的基 因組修飾。2.項(xiàng)1的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是具有有角等位基因的動(dòng)物的第一品種，而所 述無角等位基因存在于動(dòng)物的第二品種中。3.項(xiàng)1或2的動(dòng)物，其中所述無角等位基 因選自下組：天然等位基因和合成等位基因。4.項(xiàng)3的動(dòng)物，其中所述天然等位基因 對(duì)于該品種是典型的，或是該品種中的突變體等位基因。5.項(xiàng)1-4任一項(xiàng)的動(dòng)物，其中 所述第一品種選自下組：赫里福德種牛（Hereford)、安格斯牛（Angus)、短角牛、夏洛萊 牛（Charolais)、利木贊牛（Limousin)、西門塔爾牛（Simmental)、婆羅門牛（Brahman)、 布蘭格斯萊牛（Brangus)、和Wagyu，以及圣熱特魯?shù)纤古＃⊿anta Gertrudis)、愛爾夏 牛（Ayrshire)、瑞士褐牛（Brown Swiss)、Canadienne、荷蘭白帶牛（Dutch Belted)、根 西乳牛（Guernsey)、荷爾斯泰因牛（荷爾斯泰因-黑白花牛）、澤西牛（Jersey)、克雷 牛（Kerry)、德文乳牛（Milking Devon)、短角乳牛、挪威紅牛（Norwegian Red)、布薩牛 (Busa)、Canadienne、艾爾沙尼亞紅牛（Estonian Red)、Fleckveih、弗里塞牛（Frieian)、 Girolando、伊拉瓦拉短角乳牛（Illawarra)、Irish Moiled、萊恩巴克牛（Lineback)、 Meuse Rhine Issel、Montbeliarede、諾曼底牛（Normande)、蘭德爾牛（Randall)、薩希瓦 爾牛（Sahhiwal)、Australian Milking Zebu、西門塔爾牛、Chianina Marchigiana、羅馬 諾拉肉牛（Romagnola)。6.項(xiàng)1-5任一項(xiàng)的動(dòng)物，其中所述第二品種選自下組：安格斯 牛、安格斯紅牛（Red Angus)、無角紅牛（Red Poll)、蓋勒韋牛（Galloway)、白帶蓋勒韋牛 (Belted Galloway)'American White Park、英國白牛（British White)、Amerifax、牙買加 黑牛（Jamaica Black)、牙買加紅牛（Jamaica Red)、莫瑞灰牛（Murray Grey)、布蘭格斯萊 牛、布蘭格斯紅牛（Red Brangus)、Senopol、布爾羊（Boer goats)。7.項(xiàng)1-6任一項(xiàng)的動(dòng) 物，其中所述無角等位基因選自下組：Pc Celtic起源和PF Friesian起源。8.項(xiàng)1-7任 一項(xiàng)的動(dòng)物，其是建立者動(dòng)物或建立者動(dòng)物的后代。9.項(xiàng)1-8任一項(xiàng)的動(dòng)物，其沒有標(biāo)志 物和/或沒有報(bào)告物。10.項(xiàng)1-9任一項(xiàng)的動(dòng)物，其中所述基因組修飾僅在無角等位基因 處做出。11.項(xiàng)10的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的生物選自下組：牛、山羊、綿羊，和偶蹄 動(dòng)物。12.項(xiàng)1-11任一項(xiàng)的動(dòng)物或所述動(dòng)物的后代作為家畜的用途。13. -種體外的細(xì) 胞，其包含對(duì)所述細(xì)胞的有角等位基因的基因組修飾。14.項(xiàng)13的細(xì)胞，其中所述在有角 基因座的修飾是從有角等位基因修飾到無角等位基因的修飾。15.項(xiàng)13或14的細(xì)胞，其 中所述細(xì)胞是家畜細(xì)胞。16.項(xiàng)13-15任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自下組：牛、山羊、綿 羊，和偶蹄動(dòng)物。17.項(xiàng)13-15任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自下組的家畜細(xì)胞：赫里 福德種牛、安格斯牛、短角牛、夏洛萊牛、利木贊牛、西門塔爾牛、婆羅門牛、布蘭格斯萊牛、 和Wagyu，以及圣熱特魯?shù)纤古?、愛爾夏牛、瑞士褐牛、Canadienne、荷蘭白帶牛、根西乳牛、 荷爾斯泰因牛（荷爾斯泰因-黑白花牛）、澤西牛、克雷牛、德文乳牛、短角乳牛、挪威紅牛、 布薩牛、Canadienne、艾爾沙尼亞紅牛、Fleckveih、弗里塞牛、Girolando、伊拉瓦拉短角乳 牛、Irish Moiled、萊恩巴克牛、Meuse Rhine Issel、Montbeliarede、諾曼底牛、蘭德爾牛、 薩希瓦爾牛、Australian Milking Zebu、西門塔爾牛、Chianina Marchigiana、和羅馬諾拉 肉牛。18.項(xiàng)13-17任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原代細(xì)胞，原代體細(xì)胞，或合子。19.項(xiàng) 13-17任一項(xiàng)的細(xì)胞，其為家畜干細(xì)胞或原生殖細(xì)胞。20.項(xiàng)13-19任一項(xiàng)的細(xì)胞，其包含 當(dāng)所述細(xì)胞經(jīng)歷修飾時(shí)編碼無角等位基因的同源依賴性重組模板。21.項(xiàng)20的細(xì)胞，其進(jìn) 一步包含定點(diǎn)（site-directed)內(nèi)切核酸酶來在細(xì)胞的有角等位基因處切割染色體DNA。 22.項(xiàng)12-21任一項(xiàng)的細(xì)胞用于克隆動(dòng)物的用途。23. -種分離的（或合成的，或從自然 界分離的）核酸，其編碼無角等位基因并包含與天然有角等位基因重疊的序列，例如作為 mRNA和/或HDR模板。24. -種質(zhì)粒或其它載體，其表達(dá)項(xiàng)23的分離的核酸。2