缺角家畜的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年1月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/752, 232和2013年8月 27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/870, 570的優(yōu)先權(quán)，其各自通過(guò)提述特此并入本文。
[0003] 政府支持聲明
[0004] 本文所述工作的方面由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所（National Institutes of Health) 的基金1R43RR033149-01 Al和USDA(美國(guó)國(guó)立糧食和農(nóng)業(yè)研究所（National Institute of Food and Agriculture)的生物技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目競(jìng)爭(zhēng)性基金號(hào)2012-33522-19766支 持。美國(guó)政府可以擁有這些發(fā)明的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本技術(shù)領(lǐng)域涉及經(jīng)遺傳修飾生物體，如細(xì)胞，或沒(méi)有角的動(dòng)物。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 在多種物種中移除家畜的角以使飼養(yǎng)這些動(dòng)物更加容易。有許多用來(lái)除去這些角 的方法。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 動(dòng)物可以遺傳修飾為使得它們沒(méi)有角。一種這樣的方法涉及牛無(wú)角等位基因 (polled allele)的漸滲（introgression)。因此，產(chǎn)生家畜品種來(lái)接收無(wú)角等位基因而不 改變它們的其它性狀。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是經(jīng)遺傳修飾的家畜動(dòng)物，其包含從有角等位基因 (horned allele)到無(wú)角等位基因的基因組修飾。所述動(dòng)物可以是具有有角等位基因的動(dòng) 物的第一品種，而無(wú)角等位基因存在于動(dòng)物的第二品種中。無(wú)角等位基因可以是天然的或 合成的。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是體外細(xì)胞，其包含對(duì)該細(xì)胞的有角等位基因的基因組修 飾。在有角等位基因（有角基因座）處的修飾是從有角等位基因到無(wú)角等位基因的修飾。 所述細(xì)胞可以是家畜細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是創(chuàng)建經(jīng)遺傳修飾的家畜生物體的方法，其包含改變家畜 原代細(xì)胞、家畜原代體細(xì)胞、家畜干細(xì)胞、家畜原生殖細(xì)胞、家畜合子、家畜胚泡，或家畜胚 胎的天然有角等位基因，其中將所述有角等位基因改變?yōu)闊o(wú)角等位基因。
[0013] 實(shí)施方案包括任意以上方法，其包含在沒(méi)有報(bào)告基因的情況下將細(xì)胞暴露于歸巢 內(nèi)切核酸酶（位點(diǎn)特異性?xún)?nèi)切核酸酶），創(chuàng)建克隆細(xì)胞的集落，并測(cè)試集落成員的子集來(lái)鑒 定在靶定染色體位點(diǎn)處摻入修飾的集落。
[0014] 進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及根據(jù)一種或多種這些方法制備的生物體（經(jīng)遺傳修飾的 動(dòng)物、經(jīng)遺傳修飾的建立者動(dòng)物，或經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞）。實(shí)施方案包括這些技術(shù)中涉及的 質(zhì)粒、載體，以及分離的核酸，例如位點(diǎn)特異性?xún)?nèi)切核酸酶和HDR模板以及用于表達(dá)它們的 載體。
[0015] 本發(fā)明的實(shí)施方案包括經(jīng)修飾的細(xì)胞用于產(chǎn)生家畜動(dòng)物的用途。一種用于產(chǎn)生所 述動(dòng)物的技術(shù)是克隆。
[0016] 實(shí)施方案包括經(jīng)修飾的動(dòng)物或者其后代作為家畜的用途。用于產(chǎn)生細(xì)胞或動(dòng)物的 方法可以用于產(chǎn)生帶有無(wú)角表型的家畜建立者動(dòng)物。
[0017] 以下專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)提述特此并入本文用于所有目的；在沖突的情況下，以本說(shuō)明 書(shū)為準(zhǔn)：US 2010/0146655、US 2010/0105140、US 2011/0059160、US 2011/0197290,2 月 24 日提交的美國(guó)系列號(hào)13/404, 662、2011年2月25日提交的美國(guó)系列號(hào)61/446, 651，2012年 6月21日提交的美國(guó)系列號(hào)61/662, 767,以及2012年8月24日提交的13/594, 694。這些 專(zhuān)利申請(qǐng)的每一個(gè)通過(guò)提述特此并入本文用于所有目的。
[0018] 附圖簡(jiǎn)述
[0019] 圖1.組a)牛有角/無(wú)角基因座的圖解。設(shè)計(jì)TALENs來(lái)在箭頭指示處切割有角 變體。組b)四種TALENs的有義鏈序列。組c)對(duì)使用編碼每種TALEN對(duì)的mRNA轉(zhuǎn)染后三 天的有角荷爾斯泰因牛（Holstein)成纖維細(xì)胞細(xì)胞的調(diào)查者（Surveyor)分析。TALEN ID 和轉(zhuǎn)染后的孵育溫度在凝膠上方標(biāo)明。序列標(biāo)識(shí)符如下：HP 1.1左和右（SEQ ID NO: 1和 2);HP1.2左和右（SEQIDN0:3和4);HP1.3左和右（SEQIDN0:5和6) ;HP1.4左和右 (SEQ ID N0:7 和 8)。
[0020] 圖2. TALEN介導(dǎo)的POLLED (無(wú)角）漸滲。組a)將無(wú)角等位漸滲到荷爾斯泰因牛 (HORNED (有角））細(xì)胞中的策略圖解。所述POLLED (無(wú)角）等位基因（底部）是帶有IObp 缺失（未示出）的212bp串聯(lián)重復(fù)（紅色箭頭）。TALEN開(kāi)發(fā)為特異性靶向HORNED等位基 因（綠色垂直箭頭），其可以使用POLLED HDR質(zhì)粒通過(guò)同源重組修復(fù)。組b)帶有POLLED 純合或雜合漸滲的集落的代表性圖像。使用了三組引物用于候選集落的陽(yáng)性分類(lèi)：F1+R1、 F2+R2和Fl+P (POLLED特異性）。PCR產(chǎn)物的身份通過(guò)對(duì)F1+R1擴(kuò)增子測(cè)序來(lái)確定。
[0021] 圖3.在分離的集落中無(wú)角轉(zhuǎn)化的例子。從圖2中所述的細(xì)胞群增殖個(gè)別的集落。 通過(guò)圖2中所述的PCR方法分析每個(gè)集落?？寺?在389和591bp (箭頭）兩處都有產(chǎn)物， 指示對(duì)無(wú)角等位基因的雜合轉(zhuǎn)化。使用的修復(fù)模板長(zhǎng)為591個(gè)殘基。
[0022] 圖4.組a)將有角等位基因轉(zhuǎn)化為無(wú)角等位基因的圖解。將HP I. 3TALEN加上短 的修復(fù)模板引入有角細(xì)胞中。修復(fù)模板通過(guò)PCR從有角安格斯?；蚪MDNA產(chǎn)生；標(biāo)明了 同源性長(zhǎng)度。組b)在使用Gal4:RecA包被的2yg TALEN mRNA+500ng ssDNA轉(zhuǎn)染的有角荷 爾斯泰因牛成纖維細(xì)胞中對(duì)無(wú)角轉(zhuǎn)化的PCR評(píng)估。每一泳道/PCR反應(yīng)由從轉(zhuǎn)染群稀釋的 約3個(gè)細(xì)胞等同物組成。從有角細(xì)胞中使用引物btHP-Fl和btHP-Rl的PCR產(chǎn)生389bp的 產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化為無(wú)角導(dǎo)致202個(gè)堿基對(duì)的凈插入；因此相同引物的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生591bp的產(chǎn) 物（左邊緣的箭頭）。其產(chǎn)物指示無(wú)角轉(zhuǎn)化的反應(yīng)數(shù)示于右上角。組c)在使用2 μ g TALEN mRNA+1500ng ssDNA轉(zhuǎn)染的有角荷爾斯泰因牛成纖維細(xì)胞中對(duì)無(wú)角轉(zhuǎn)化的PCR評(píng)估。其產(chǎn) 物指示無(wú)角轉(zhuǎn)化的反應(yīng)數(shù)示于右上角。
[0023] 圖5. TALEN和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的在豬APC處的HDR的比較。組a) APC14. 2TALEN(SEQ ID N0:9 和 10)和 gRNA 序列 APC14. 2Gla(SEQ ID NO: 12)相對(duì)于野生 型APC序列（SEQ ID NO: 11)示出。下方，示出了 HDR寡聚物（oligo) (SEQ ID NO: 13)，其遞 送4bp的插入，產(chǎn)生一個(gè)新的HindIII位點(diǎn)。接著，將使用2 μ M寡聚物HDR模板，和1 μ g TALEN mRNA，各1 μ g編碼hCas9的質(zhì)粒DNA和gRNA表達(dá)質(zhì)粒；或1 μ g編碼hCas9的mRNA 和0. 5 μ g gRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的豬成纖維細(xì)胞分開(kāi)并在30或37 °C培養(yǎng)三天，接著在37 °C 擴(kuò)增直到第10天。組b)顯示RFLP和調(diào)查者分析結(jié)果的圖表。
[0024] 發(fā)明詳述
[0025] 如本文所報(bào)道的，已使用遺傳技術(shù)產(chǎn)生缺角家畜動(dòng)物（hornless livestock animals)。通常有角但因?yàn)樽园l(fā)突變而沒(méi)有角的動(dòng)物稱(chēng)為無(wú)角動(dòng)物（polled animal)。為 了保護(hù)乳牛場(chǎng)操作員和牛的安寧，在美國(guó)、歐洲和其它地區(qū)的大部分乳牛例行手動(dòng)去除角。 去角是痛苦的，引起動(dòng)物應(yīng)激的暫時(shí)性上升，增加動(dòng)物生產(chǎn)的費(fèi)用，以及盡管打算保護(hù)動(dòng)物 免受后續(xù)損傷，該實(shí)踐被一些人視為不人道的。一些肉牛品種是天然無(wú)角的（例如安格斯 牛），即稱(chēng)為POLLED的性狀，其是顯性的。本文所列的技術(shù)通過(guò)提供不必經(jīng)歷去角的動(dòng)物 而改善動(dòng)物福利。最近在1號(hào)染色體上鑒定了兩種賦予無(wú)角性（polledness)的等位變體。 帶有任一種這些突變的乳牛是罕見(jiàn)的，并且與其有角對(duì)應(yīng)物相比，通常在牛奶場(chǎng)遺傳選擇 指數(shù)（dairy genetic selection indices)上排名要低得多。可以通過(guò)傳統(tǒng)的雜交繁育完 成POLLED等位基因?qū)τ薪瞧贩N的減數(shù)分裂漸滲，但雜交動(dòng)物的遺傳價(jià)值將受到損害，并要 求選擇培育許多過(guò)長(zhǎng)世代來(lái)恢復(fù)生產(chǎn)能力。
[0026] 幾十年來(lái)遺傳學(xué)家一直在尋找無(wú)角性的遺傳基因座。簡(jiǎn)單地說(shuō)，二十年來(lái)無(wú)角性 一直是密集現(xiàn)代研究的一個(gè)目標(biāo)。見(jiàn) Allais-Bonnet 等，（2013)Novel Insights into the Bovine Polled Phenotype and Horn Ontogenesis in Bovidae. PLoS ONE 8(5):e63512〇 在許多品種中，無(wú)角突變快速定位到牛的I號(hào)染色體，但是由于各種原因，無(wú)角性的遺傳 成因的實(shí)際位點(diǎn)難以捉摸。然而，就在最近，已顯示至少存在兩種無(wú)角等位基因（一個(gè) "Celtic"和一個(gè)"Friesian"），并且對(duì)于其每一種提出了候選突變。Medugorac等，（2012) Bovine polledness-an autosomal dominant trait with allelic heterogeneity. PLoS One 7:e39477。這些突變中沒(méi)有一個(gè)位于已知的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)中。本文中，發(fā)明者顯示 了在非無(wú)角（有角）動(dòng)物中的相當(dāng)位點(diǎn)處產(chǎn)生遺傳變化能產(chǎn)生無(wú)角表型。
[0027] 然而，可以在動(dòng)物中創(chuàng)建無(wú)角性，并且不干擾動(dòng)物的基因組而做到這一點(diǎn)。在衍 生于有角乳用公牛（horned dairy bull)的成纖維細(xì)胞中完成了 Celtic POLLED等位基 因（也稱(chēng)為Pc等位基因）（替換IObp的212bp重復(fù)）的非減數(shù)分裂漸滲。從安格斯牛品 種采集到含有包括Celtic POLLED等位基因的1594bp片段的質(zhì)粒HDR模板（圖l，a組）。 TALEN經(jīng)設(shè)計(jì)使得其能夠切割HORNED等位基因，但使POLLED等位基因保持不受影響。令 人驚訝的是，這一實(shí)驗(yàn)表明，作為mRNA遞送的一對(duì)TALEN具有與質(zhì)粒表達(dá)盒相比相似的活 性（數(shù)據(jù)未示出）。因此，進(jìn)行作為mRNA遞送TALEN以消除TALEN表達(dá)質(zhì)粒的可能的基因 組整合的實(shí)驗(yàn)。226個(gè)集落中的五個(gè)（2% )通過(guò)了圖1的b組所示的每一個(gè)PCR測(cè)試以確 定POLLEN的漸滲。五個(gè)克隆中的三個(gè)對(duì)于POLLED漸滲是純合的，并通過(guò)測(cè)序確認(rèn)為與意 圖的等位基因100%相同（數(shù)據(jù)未示出）。
[0028] 基于動(dòng)物交配或人工繁殖技術(shù)的傳統(tǒng)育種計(jì)劃涉及將多種基因混合以期最終產(chǎn) 生創(chuàng)建或組合期望性狀的基因的良好組合。轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供加速傳統(tǒng)育種過(guò)程的希望。轉(zhuǎn) 基因方法的一些缺點(diǎn)在于盡管該方法是一種改進(jìn)，但是它是緩慢、昂貴且勞動(dòng)力密集的。低 效率和結(jié)果的不可預(yù)測(cè)性是常見(jiàn)的。此外，僅對(duì)想要的基因組位點(diǎn)做出改變的方法不是公 知的。
[0029] 發(fā)明人開(kāi)發(fā)了可用于農(nóng)業(yè)、研究工具，或生物醫(yī)學(xué)目的的大致各種家畜細(xì)胞和/ 或動(dòng)物中的多種基因的精確、高頻的編輯。這些家畜基因編輯方法包括TALEN和CRISPR/ Cas9刺激的同源性指導(dǎo)修復(fù)（HDR)，其使用質(zhì)粒、rAAV和寡核苷酸模板進(jìn)行。發(fā)明者在本 文中顯示了將牛POLLED等位基因漸滲到有角荷爾斯泰因牛成纖維細(xì)胞中。這一例子證明 了可以創(chuàng)建各種沒(méi)有角的乳牛品種。并且可以不干擾動(dòng)物的其他基因或基因組的其它部 分而完成這種改變。發(fā)明者開(kāi)發(fā)出這些方法來(lái)達(dá)到如此高的效率以致遺傳改變可以不需 要報(bào)告物和/或不需要選擇標(biāo)志物而完成。此外，所述方法可以用于建立者世代（founder generation)，來(lái)產(chǎn)生僅在意圖位點(diǎn)具有意圖變化的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。這些方法證明了無(wú) 角和缺角等位基因?qū)τ糜谘芯?、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的家畜細(xì)胞、大型哺乳動(dòng)物，和家畜的 無(wú)減數(shù)分裂種內(nèi)和種間漸滲。
[0030] 圖1描述了用于確定是否能產(chǎn)生結(jié)合并切割牛DNA中的適當(dāng)位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性核 酸酶的實(shí)驗(yàn)。問(wèn)題之一是確定是否能結(jié)合串聯(lián)重復(fù)，記住由于分子間重組的高可能性，在期 望結(jié)合位點(diǎn)處的重復(fù)序列可以混淆靶向。此外，這些結(jié)合在培養(yǎng)的活細(xì)胞中必須是高效的 并相互協(xié)作。由于無(wú)角等位基因與有角等位基因的高度相似性，有角等位基因尤其是一項(xiàng) 挑戰(zhàn)。TALEN結(jié)合位點(diǎn)的選擇位置不是明顯的；成功的TALEN設(shè)計(jì)可以切割并結(jié)合有角基 因座但不允許TALEN切割無(wú)角等位基因。發(fā)現(xiàn)這些設(shè)計(jì)是本發(fā)明研究中的一項(xiàng)重大成就。 這一方法的成功無(wú)法預(yù)測(cè)。如圖1所示，選擇作為目標(biāo)的有角等位基因具有212個(gè)殘基，而 無(wú)角等位基因具有那212個(gè)殘基的重復(fù)。無(wú)角等位基因還具有重復(fù)間的10個(gè)堿基對(duì)（bp) 的缺失。a)組描述了 212bp序列，帶有要在末端刪除的10bp，位于左TALEN(通過(guò)實(shí)心倒三 角標(biāo)記）和右TALEN (通過(guò)實(shí)心三角標(biāo)記）之間。因此該TALEN對(duì)放置在所述IObp缺失位 點(diǎn)的任一邊緣。TALEN對(duì)在IObp缺失的區(qū)域中切割有角等位基因。使用同源依賴(lài)性重組 (HDR)模板來(lái)引導(dǎo)212個(gè)殘基重復(fù)（實(shí)際上為202個(gè)殘基，因?yàn)槠錇閹в蠭Obp缺失的重復(fù)） 插入到TALEN結(jié)合的位置之間。如a)組所描述的，在無(wú)角上，左TALEN和右TALEN接著以 202個(gè)殘基分開(kāi)。并且減少對(duì)無(wú)角等位基因的再次切割。產(chǎn)生了各種TALEN來(lái)確定是否可 以合理實(shí)現(xiàn)結(jié)合和切割。b)組中的表格列出了一些經(jīng)測(cè)試的TALEN。c)組顯示了測(cè)試結(jié)果 及通過(guò)％ NHEJ測(cè)量的其效率。第三道的TALEN(HP1. 3)后續(xù)用于無(wú)角等位基因的漸滲。
[0031] 用于減少位點(diǎn)特異性（也稱(chēng)為靶向性）內(nèi)切核酸酶的再結(jié)合的實(shí)施方案包括將 外源性無(wú)角等位基因漸滲到細(xì)胞的染色體DNA中的同源性指導(dǎo)的修復(fù)（HDR)的方法，其包 括將靶向性核酸酶系統(tǒng)和含有外源性等位基因的HDR模板導(dǎo)入細(xì)胞中，所述靶向性核酸系 統(tǒng)包含DNA結(jié)合成員，用于特異性結(jié)合染色體DNA中的內(nèi)源性關(guān)聯(lián)有角等位基因序列，其中 所述靶向性核酸酶系統(tǒng)和HDR模板起作用以將染色體DNA改變?yōu)榕cHDR模板序列具有同一 性，并將外源性等位基因漸滲到染色體DNA中代替內(nèi)源性等位基因，其中所述HDR模板序列 經(jīng)設(shè)計(jì)為減少DNA結(jié)合成員與HDR模板序列的特異性結(jié)合。
[0032] 圖2顯示了用于將無(wú)角等位基因漸滲到帶有有角等位基因的細(xì)胞中的研究策略 和結(jié)果。有角等位基因在PCR引物Fl和Rl之間有1546個(gè)bp。在這一序列中，PRC引物 F2和R2之間有365個(gè)bp。帶有以箭頭代表的212bp序列的有角等位基因位于該區(qū)域中。 POLLED等位基因（底部）具有含IObp缺失（未示出）的212bp的串聯(lián)重復(fù)序列（以?xún)蓚€(gè) 箭頭示出）。PCR引物F2和R2之間的長(zhǎng)度為567bp ;567bp等于有角等位基因中的365bp 加上212bp重復(fù)減去IObp缺失。HDR模板的長(zhǎng)度為1594bp。一旦將模板序列漸滲到細(xì)胞 的染色體中，引物Fl和Rl之間有1746bp ; 1746bp等于有角等位基因的1546bp加上212bp 重復(fù)減去IObp缺失。此外，對(duì)于無(wú)角等位基因獨(dú)特的PCR產(chǎn)物在串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)中標(biāo)為P。 開(kāi)發(fā)了 TALEN來(lái)特異性靶向HORNED等位基因（圖I)，其能夠通過(guò)使用HDR模板的同源重 組來(lái)修復(fù)。稀釋接收TALEN和HDR模板的細(xì)胞并作為單細(xì)胞鋪板，將所述單細(xì)胞培養(yǎng)并允 許在克隆集落中復(fù)制。測(cè)試集落成員的無(wú)角等位基因。b組顯示了帶有POLLED純合或雜 合漸滲的集落的代表性圖像。使用三個(gè)引物組用于候選集落的陽(yáng)性分類(lèi)：Fl+Rl、F2+R2和 Fl+P (POLLED特異性）。通過(guò)測(cè)序F1+R1擴(kuò)增子來(lái)確定PCR產(chǎn)物的身份。
[0033] 圖3是無(wú)角轉(zhuǎn)化的例子。除了使用不同的HDR模板，無(wú)角等位基因以圖1和圖2 所述相似的方式漸滲到細(xì)胞中。模板長(zhǎng)591 bp:
[0034] 5? gtctggggtgagatagttttcttggtaggctgtgaaatgaagagtacgtggtaccaactactttctg agctcacgcacagctggacgtctgcgcctttcttgttatactgcagatgaaaacattttatcagatgtttgcctaag tatggattacatttaagatacatatttttctttcttgtctgaaagtctttgtagtgagagcaggctggaattatgtc tggggtgagatagttttctttgctctttagatcaaaactctcttttcatttttaagtctatcccaaaagtgtgggag gtgtccttgatgttgaattataggcag(SEQ ID NO: 14).
[0035] 如箭頭所指示，12個(gè)集落中的一個(gè)具有表明無(wú)角等位基因的漸滲的PCR產(chǎn)物。
[0036] 圖4描述了用于將無(wú)角等位基因漸滲到細(xì)胞中的另一種方案。使用了 325bp的HDR 模板。漸滲的等位基因是紅安格斯牛無(wú)角，而接收者是有角荷爾斯泰因牛成纖維細(xì)胞。模板 具有29bp的上游重疊和84bp的下游重疊。212bp重復(fù)位于重疊間。重復(fù)用作天然212bp 序列的IObp缺失的代替。除了使用TALEN的熱變性（單鏈）寡聚物外，這一過(guò)程與圖1-3 中所描述的那些相似。如圖4，b和c組中所示，測(cè)試了兩種條件。在b)組中，使用經(jīng)Gal4: RecA包被的2yg TALEN mRNA+500ng ssDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。每條泳道/PCR反應(yīng)由從轉(zhuǎn)染群稀 釋的約3個(gè)細(xì)胞等同物組成。從角細(xì)胞（horb cell)使用btHP-Fl和btHP-Rl引物的PCR 產(chǎn)生389bp的產(chǎn)物。無(wú)角的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致202個(gè)堿基對(duì)的凈插入；因此相同引物的PRC產(chǎn)物導(dǎo) 致591bp的產(chǎn)物（左邊緣的箭頭）。產(chǎn)物指示無(wú)角轉(zhuǎn)化的反應(yīng)數(shù)示于右上角。c組）對(duì)使 用2ug TALEN mRNA+l，500ng ssDNA轉(zhuǎn)化的有角荷爾斯泰英牛成纖維細(xì)胞中無(wú)角轉(zhuǎn)化的PCR 評(píng)估。產(chǎn)物指示無(wú)角轉(zhuǎn)化的反應(yīng)數(shù)示于右上角。
[0037] 圖5顯示了使用CRISRP/cas9的等位基因漸滲。將這一方法與TALEN方法比較。 漸滲的等位基因是腺瘤性結(jié)腸息肉?。ˋdenomatous polyposis coli，APC)。在a組）中， APC14. 2TALEN和gRNA序列APC14. 2Gla相對(duì)于野生型APC序列示出。在下方，示出了 HDR 寡聚物，其遞送4bp的插入（見(jiàn)方框部分），產(chǎn)生新的HindIII位點(diǎn)。然后，將用2 μ M寡聚 物HDR模板，和1 μ g TALEN mRNA、各1 μ g編碼hCas9的質(zhì)粒DNA和引導(dǎo)RNA (gRNA)表達(dá)質(zhì) 粒；或者1 μ g編碼hCas9的mRNA和0. 5 μ g gRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的豬成纖維細(xì)胞分開(kāi)并在 30或37°C培養(yǎng)三天，其后在37°C擴(kuò)增直到第10天。在b組）中，該圖表顯示了 RFLP和調(diào) 查者分析的結(jié)果。正如以前所確定的，TALEN刺激的HDR在30°C最有效率，而CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的HDR在37°C最有效率。對(duì)于該基因座，TALENS比CRISPR/Cas9系統(tǒng)在刺激HDR上更 有效率，盡管調(diào)查者分析測(cè)量到了相似的DNA切割頻率。與TALEN形成對(duì)比，當(dāng)hCas9作為 mRNA遞送時(shí)相對(duì)于質(zhì)粒，HDR的差異很小。
[0038] 根據(jù)本文的公開(kāi)，教導(dǎo)了用位點(diǎn)特異性?xún)?nèi)切核酸酶（如TALEN)創(chuàng)建無(wú)角動(dòng)物。產(chǎn) 生經(jīng)遺傳修飾家畜的障礙之一在于使用常規(guī)最佳實(shí)施時(shí)，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞做出修飾的效率只有 百分之幾。即