脂質(zhì)體或能夠?qū)⒑怂?遞送到細(xì)胞的其它非病毒方法，如電穿孔，顯微注射，或磷酸鈣沉淀。
[0089] 在轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中，核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單元（即可操作地連接到目標(biāo)核酸序列的 調(diào)控區(qū)）側(cè)翼有轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)。已開發(fā)了幾種轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（包括，例如Sloping Beauty (見美國專利號 6, 613, 752 和美國公布號 2005/0003542) ;Frog Prince (Miskey 等， (2003)Nucleic Acids Res. 31:6873) ；Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology 8(Suppl. I) :S7;Minos (Pavlopoulos 等，（2007) Genome Biology 8 (Suppl. I) :S2) ;Hsmarl(Miskey 等，（2007))M〇1 Cell Biol. 27:4589);以及Passport)來將核酸導(dǎo)入細(xì)胞（包括小鼠、人和 豬細(xì)胞）中。Sleeping Beauty和Passport轉(zhuǎn)座子尤其有用。轉(zhuǎn)座酶可以作為蛋白遞送，與 目標(biāo)核酸在相同的核酸構(gòu)建體上編碼，可以在分開的核酸構(gòu)建體上引入，或作為mRNA(例 如，體外轉(zhuǎn)錄并加帽的mRNA)提供。
[0090] 核酸可以整合到載體中。載體是廣義的術(shù)語，其包括設(shè)計(jì)為從攜帶者（carrier) 移動到目標(biāo)DNA中的任意特定DNA區(qū)段。載體可以稱為表達(dá)載體，或載體系統(tǒng)，其為引起 DNA插入基因組或其它靶定DNA序列（如附加體、質(zhì)粒，或甚至病毒/噬菌體DNA區(qū)段）中 需要的一組組分。在動物中用于基因遞送的載體系統(tǒng)（如病毒載體（例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺 伴隨病毒以及整合噬菌體病毒），以及非病毒載體（例如轉(zhuǎn)座子））具有兩個基本組分：1) 由DNA (或RNA，其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA)組成的載體，以及2)轉(zhuǎn)座酶、重組酶，或其它整合酶，其識 別載體和DNA目標(biāo)序列兩者，并將載體插入目標(biāo)DNA序列中。載體最常含有一個或多個表 達(dá)盒，其包含一個或多個表達(dá)控制序列，其中表達(dá)控制序列是控制并調(diào)節(jié)另一個DNA序列 或mRNA分別轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的DNA序列。
[0091] 許多不同類型的載體是已知的。例如，質(zhì)粒和病毒載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）是已 知的。哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒通常具有復(fù)制起點(diǎn)，適合的啟動子和可選的增強(qiáng)子，以及還有任意 必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，以及5' 側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。載體的例子包括：質(zhì)粒（其也可以是其他種類載體的攜帶者），腺病毒、腺 伴隨病毒（AAV)、慢病毒（例如HIV-USIV或FIV)，逆轉(zhuǎn)錄病毒（例如ASV、ALV或MoMLV)， 以及轉(zhuǎn)座子（例如 Sleeping Beauty、P-元件、Tol-2、Frog Prince、piggyBac) 〇
[0092] 如本文所使用的，術(shù)語核酸指代RNA和DNA兩者，包括例如cDNA、基因組DNA、合成 (例如化學(xué)合成）DNA，以及天然存在的和經(jīng)化學(xué)修飾的核酸，例如合成的堿基或替代主鏈。 核酸分子可以是雙鏈或單鏈的（例如有義或反義單鏈）。術(shù)語轉(zhuǎn)基因在本文中廣泛使用，指 代其遺傳材料已經(jīng)使用遺傳工程技術(shù)改變的經(jīng)遺傳修飾的生物體或遺傳工程化生物體。因 此，敲除偶蹄動物是轉(zhuǎn)基因的，無論外源性基因或核酸是否在動物或其后代中表達(dá)與否。
[0093] 根據(jù)允許縮寫"T"代表"T"或者"U"的常規(guī)實(shí)踐（DNA或RNA可以是該情況），本 文中所列的核酸序列意圖代表DNA和RNA序列兩者。多核苷酸是至少三個核苷酸亞單位 的核酸分子。多核苷酸類似物或多核酸是化學(xué)修飾的多核苷酸或多核酸。在一些實(shí)施方 案中，多核苷酸類似物可以通過使用備選的官能團(tuán)取代多核苷酸的糖-磷酸骨架的部分來 產(chǎn)生。嗎啉代修飾的多核苷酸（本文稱為"嗎啉代"）是多核苷酸類似物，其中堿基由嗎啉 代-磷二酰胺主鏈連接（見例如美國專利號5, 142, 047和5, 185, 444)。除了嗎啉代外，多核 苷酸類似物的其它例子包括其中的堿基由聚乙烯主鏈相連的類似物，其中的堿基通過由假 肽2-氨基乙基-甘氨酸基團(tuán)形成的酰胺鍵相連的肽核酸（PNA)，其中的核苷亞單位由甲基 膦酸酯基團(tuán)相連的類似物，其中連接核苷亞單位的磷酸殘基被磷酰胺（phosphoroamidate) 基團(tuán)取代的類似物，以及硫代磷酸化（phosphorothioated)DNA，含有具有2'0_甲基基團(tuán)的 糖部分的類似物）。本發(fā)明的多核苷酸可以通過公知以及常規(guī)使用的固相合成技術(shù)產(chǎn)生。 或者，可以使用適合用于此類合成的其它方法（例如，常見的分子克隆和化學(xué)核酸合成技 術(shù)）。類似技術(shù)還可以用于制備多核苷酸類似物，如嗎啉帶或硫代磷酸衍生物。另外，多核 苷酸和多核苷酸類似物可以商購獲得。對于寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的組合物的例子是鹽， 其包括例如（a)使用陽離子（如納、鉀、銨等）形成的鹽；(b)使用無機(jī)酸（如鹽酸、氫氫溴 酸）形成的酸加成鹽（c)使用有機(jī)酸（例如，例如乙酸、草酸、酒石酸）形成的鹽；和（d)從 陰離子元素（如氯、溴和碘）形成的鹽。
[0094] 序列比對是排列DNA、RNA或蛋白序列來鑒定相似性區(qū)域的方法。核苷或氨基酸殘 基的比對序列通常表示為矩陣內(nèi)的行，殘基間插入缺口，使得相同或相似的字母以連續(xù)的 列比對。
[0095] 多肽
[0096] 存在有通?？梢栽诎被嵝蛄兄挟a(chǎn)生而不改變活性的多種保守改變。這些改變被 稱作保守取代或突變；也就是說，用屬于具有特定的大小或特征的氨基酸分組的氨基酸取 代另一個氨基酸。氨基酸序列的取代可以選自氨基酸所屬的類別的其它成員。例如，非極 性（疏水）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，和賴 氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰 胺。帶正電荷（堿性）氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷（酸性）的氨基酸包 括天冬氨酸和谷氨酸。這些改變預(yù)期實(shí)質(zhì)上不影響通過聚丙烯酰氨凝膠電泳或等電點(diǎn)測定 的表觀分子量。示例性的保守取代包括但不限于，Lys取代Arg及反之亦然來保持正電荷； Glu取代Asp及反之亦然來保持負(fù)電荷；Ser取代Thr使得游離一OH得到保持；以及Gln取 代Asn來保持游離NH2。此外，在一些情況下，可以在多肽序列或?qū)?yīng)的核酸序列中產(chǎn)生點(diǎn) 突變、缺失，和插入，而不損失多肽或核酸片段的功能。取代可以包括例如1個，2個，3個， 或更多殘基。本文所述的氨基酸殘基采用單字母氨基酸標(biāo)示符或三字母縮寫。本文使用的 縮寫與標(biāo)準(zhǔn)的多肽命名法，J. Biol. Chem.，（1969) ,243,3552-3559 -致。本文中以氨基末 端到羧基末端的常規(guī)方向通過用左和右取向的式表示所有氨基酸殘基序列。
[0097] 在一些情況下，可能需要測定肽與本文所列的序列的百分比同一性。在這種情況 下，百分比同一性按照肽或肽部分的殘基數(shù)量測量。例如，90%同一性的多肽也可能是較大 肽的部分。實(shí)施方案包括具有列于本文的序列的指示同一性和/或保守取代的此類多肽。
[0098] 術(shù)語純化的在本文中關(guān)于多肽使用時表示沒有天然存在的對應(yīng)物（例如肽模擬 物（peptidomimetic))，或已經(jīng)化學(xué)合成，并且如此基本不被其它多肽污染，或從與其天然 伴隨的其它大多數(shù)細(xì)胞組分（例如，其它細(xì)胞蛋白，多核苷酸，或細(xì)胞組分）分離或純化的 多肽。純化的多肽的例子是至少70% (按干重計(jì)）不含與其天然伴隨的蛋白和天然存在 的有機(jī)分子的多肽。因此，純化多肽的制劑可以是例如至少80%、至少90%，或至少99% (按干重計(jì)）的多肽。多肽還可以經(jīng)工程化而含有標(biāo)簽序列（例如多聚組氨酸標(biāo)簽、myc標(biāo) 簽，或FLAG標(biāo)簽），其促進(jìn)多肽被純化或標(biāo)記（例如，在親和基質(zhì)上捕獲，在顯微鏡下顯 現(xiàn)）。因此，包含多肽的純化的組合物指代純化的多肽，除非另有說明。
[0099] 多肽可包括化學(xué)修飾；該術(shù)語在本語境中指代在氨基酸的天然存在的化學(xué)結(jié)構(gòu)中 的改變。這種修飾可以對側(cè)鏈或末端產(chǎn)生，例如改變氨基末端或羧基末端。在一些實(shí)施方 案中，修飾對于創(chuàng)建化學(xué)基團(tuán)是有用的，所述化學(xué)基團(tuán)可以便利地用于將多肽連接到其它 材料，或附于治療劑。
[0100] 重組酶
[0101] 本發(fā)明的實(shí)施方案包括將靶向性核酸酶系統(tǒng)與重組酶（例如RecA蛋白，Rad51)或 其它與DNA重組相關(guān)的DNA結(jié)合蛋白一同施用。重組酶與核酸片段形成細(xì)絲，并且實(shí)際上搜 索細(xì)胞DNA來尋找與序列基本同源的DNA序列。例如重組酶可以與充當(dāng)HDR模板的核酸序 列組合。接著，重組酶與HDR模板組合以形成細(xì)絲并放入細(xì)胞中。重組酶和/或與重組酶 組合的HDR模板可以作為蛋白、mRNA，或用編碼重組酶的載體置于細(xì)胞或胚胎中。美國公布 2011/0059160(美國系列號12/869,232)的公開內(nèi)容通過提述特此并入本文中用于所有目 的；在沖突的情況下，以本說明書為準(zhǔn)。術(shù)語重組酶指代遺傳重組酶，其在細(xì)胞中酶促催化 兩條相對較長的DNA鏈之間相對短的DNA部分的連接。重組酶包括Cre重組酶，Hin重組酶、 RecA、RAD51、Cre，以及FLP。Cre重組酶是來自PI噬菌體的I類拓?fù)洚悩?gòu)酶，其催化IoxP 位點(diǎn)之間的DNA的位點(diǎn)特異性重組。Hin重組酶是由198個氨基酸組成的21kD蛋白，其存 在于細(xì)菌沙門氏菌屬（Salmonella)中。Hin屬于DNA轉(zhuǎn)化酶的絲氨酸重組酶家族，其中它 依賴于活性位點(diǎn)絲氨酸來啟動DNA切割和重組。RAD51是人類基因。由該基因編碼的蛋白 是RAD51蛋白家族的成員，其輔助DNA雙鏈斷裂的修復(fù)。RAD51家族成員與細(xì)菌RecA和酵 母Rad51同源。Cre重組酶是實(shí)驗(yàn)中用來刪除側(cè)翼有IoxP位點(diǎn)的特定序列的酶。FLP指代 衍生于面包酵母釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的2μ質(zhì)粒的翻轉(zhuǎn)酶（Flippase) 重組酶（FLP或Flp)。
[0102] 本文中，"RecA"或"RecA蛋白"指代RecA樣重組蛋白家族，其具有基本上全部 或大部分相同的功能，特別是：（i)將寡核苷酸或多核苷酸正確定位到其同源目標(biāo)以用于 DNA聚合酶的后續(xù)延伸的能力；（ii)在拓?fù)鋵W(xué)上制備雙鏈體核酸以合成DNA的能力；和 (iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸復(fù)合物高效尋找并結(jié)合互補(bǔ)序列的能力。表征 得最好的RecA蛋白來自于大腸桿菌；除了蛋白的最初等位形式外，已鑒定了許多突變體 RecA樣蛋白，例如RecA803。此外，許多生物體具有RecA樣鏈轉(zhuǎn)移蛋白，包括例如酵母、果 蠅（Drosophila)、哺乳動物（包括人），以及植物。這些蛋白包括例如Reel、Rec2、Rad51、 Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2以及DMC1。重組蛋白的一個實(shí)施方案是來自大腸 桿菌的RecA?；蛘撸琑ecA蛋白可以是大腸桿菌的突變體RecA-803蛋白，來自另一種細(xì)菌來 源的蛋白，或來自另一種生物體的同源重組蛋白。
[0103] 經(jīng)遺傳修飾的動物
[0104] 本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可以用于將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入非人類動物中，來產(chǎn)生建立者 動物，其中核酸構(gòu)建體整合到基因組中。這些技術(shù)包括但不限于原核（pronuclear)顯微注 射（美國專利號4, 873, 191)，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的對種系的基因轉(zhuǎn)移（retrovirus mediated gene transfer into germ)，對胚胎干細(xì)胞的基因革El向，胚胎的電穿孔，精子介導(dǎo)的基因 轉(zhuǎn)移（Lavitrano 等，（2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235 ;Lavitrano 等， (2006) R印rod. Fert. Develop. 18, 19-23)，以及體細(xì)胞（例如卵丘細(xì)胞或乳腺細(xì)胞），或成 體、胎兒或胚胎干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)化，接著進(jìn)行核移植。原核顯微注射、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移， 以及體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移以及胞質(zhì)注射、原生殖細(xì)胞移植，以及胚泡嵌合體的產(chǎn)生（其中生殖細(xì) 胞在胚胎中增殖）是特別有用的技術(shù)。
[0105] 通常來說，在原核顯微注射中，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入受精卵中；1個或2細(xì)胞受精 卵用作含有來自精子頭部的遺傳材料的原核，并且卵在原生質(zhì)內(nèi)可見。原核分期的受 精卵可以在體外或體內(nèi)獲得（即從供體動物的輸卵管中手術(shù)回收），并且可以產(chǎn)生體外 受精卵。例如，在豬中，成熟的卵母細(xì)胞可以在500 μ I Minitube P0RCPR0 IVF MEDIUM SYSTEM(Minitube, Verona, WI)中在Minitube 5孔受精皿中受精。在體外受精（IVF)的準(zhǔn) 備中，可以將新鮮收集的或冷凍的公豬精液清洗，并在P0RCPR0 IVF培養(yǎng)基中重懸至4xl05個精子。精子濃度可以使用計(jì)算機(jī)輔助精液測試（SPERMVISI0N，Minitube，Verona，WI)分 析。最后，體外授精可以在10 μ 1體積中以終濃度為約40個能動精子/卵母細(xì)胞進(jìn)行，這 取決于公豬。將所有受精的卵母細(xì)胞在5. 0% 0)2氣氛中在38. 7°C孵育6小時。授精后 六小時，推定的合子可以在NCSU-23中清洗兩次并移到0. 5ml的相同培養(yǎng)基中。該系統(tǒng)通 ?？梢栽诖蠖鄶?shù)公豬間以10-30%的多精授精率（polyspermic insemination rate)產(chǎn)生 20-30 %的胚泡。
[0106] 在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移中，可以將經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞或分裂球（例如，胚胎卵裂球、胎兒 成纖維細(xì)胞，成體耳成纖維細(xì)胞，或顆粒細(xì)胞）導(dǎo)入無核的卵母細(xì)胞中來建立組合細(xì)胞。在 一些約定中，停滯于減數(shù)分裂-2的卵母細(xì)胞稱為"卵細(xì)胞（egg)"。產(chǎn)生胚胎后（例如，通 過融合和活化卵母細(xì)胞），在活化后約20至24小時，將胚胎轉(zhuǎn)移到受體雌性的輸卵管中。 可以使用標(biāo)準(zhǔn)的育種技術(shù)，從最初的雜合建立者動物創(chuàng)建在目標(biāo)核酸方面純合的動物。
[0107] 實(shí)施例1 =TALEN設(shè)計(jì)和產(chǎn)生
[0108] 使用在線工具"TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGTER"鑒定候選 TALEN 目標(biāo) DNA 序 列和 RVD 序列。接著，通過遵循 Golden Gate Assembly 方案，使用 pCGOLDYTALEN(Addgene ID 38143)和 RCIscript-GOLDYTALEN(Addgene ID 38143)作為最終目的載體構(gòu)建用于 TALEN DNA轉(zhuǎn)染或體外TALEN mRNA轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒（Carlson 2012)。通過使用PureLink? HIPURE PLASMID MIDIPREP 試劑盒（Life Technologies)制備最終的 pC-Goldy TALEN 載體，并在使用前測序。使用QIAPREP SPIN MINIPREP試劑盒（Qiagen)制備的組裝 RCIscript載體通過SacI線性化作為模板使用，用于使用mMESSAGE mMACHINE? T3試劑盒（Ambion)的體外TALEN mRNA轉(zhuǎn)錄，如先前所指示的（Carlson, 2010)。代替由 3'-0-Mem7G(5'）ppp(5'）G RNA 帽類似物（New England Biolabs)，5-甲基胞苷三磷酸假尿 啼啶三磷酸（TriLink Biotechnologies, San Diego, CA)和腺苷三磷酸鳥苷三磷酸組成的 核糖核苷酸混合物，如以前描述的（Carlson 2012)，從RCIScript-GOLDYTALEN載體合成修 飾的mRNA。最終核苷酸反應(yīng)濃度對于帽類似物是6mM，對于鳥苷三磷酸是I. 5mM，而對于其 它核苷酸是7. 5mM。所得的mRNA在使用MEGACLEAR REACTION CLEANUP試劑盒（Applied Biosciences)純化前，使用DNA酶處理。
[0109] 實(shí)施例2 :CRISPR/Cas9設(shè)計(jì)和產(chǎn)生
[0110] 基因特異性gRNA序列根據(jù)其方法（Mali，2013)克隆到Church實(shí)驗(yàn)室gRNA載體中 (Addgene ID:41824)。通過共轉(zhuǎn)染 hCas9 質(zhì)粒（Addgene ID:41815)或從 RCIScript_hCas9 合成的mRNA來提供Cas9核酸酶。該RCIScript-hCas9通過將來自hCas9質(zhì)粒（含有 hCas9cDNA)的XbaI-AgeI片段亞克隆到RCIScript質(zhì)粒中來構(gòu)建。mRNA的合成除了使用 KpnI進(jìn)行線性化外如上述實(shí)施。
[0111] 實(shí)施例3 :供體修復(fù)模板制備
[0112] A)BB-HDR(1623bp)質(zhì)粒。從比利時藍(lán)牛基因組DNA PCR擴(kuò)增涵蓋比利時藍(lán)牛等位 基因的 l，695bp 片段（bt⑶F8BB 5-l:5'-C AAAGTTGGTGACGTGACAGAGGTC(SEQ ID N0:15); bt⑶F8BB 3-1:5' -GTGTGCCATCCCTACTTTGTGGAA (SEQ ID NO: 16))，并 TOPO 克隆到 PRC 2. I 載體（Life Technologies)中。此質(zhì)粒作為分析引物組的陽性對照模板，并用于通過PCR 使用以下引物（BB del HR 16235-1:5'-GATGTATTCCTCAGACTTTTCC(SEQ ID NO: 17) ;BB del HR 16233-1:5'-GTGGAATCTCATCTTACCAA(SEQ ID N0:18))衍生 l，623bp BB-HDR 模板，并如 前TOPO克隆。每種質(zhì)粒在使用前測序驗(yàn)證。使用Fast-Ion MIDI PLASMID END0-FREE試 劑盒（IBI Scientific)制備轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒。rAAV包裝。BB-HDR克隆到pAAV-MCS中，并使用 ADEN0-ASS0CIATED VIRUS HELPER-FREE 系統(tǒng)（Agilent)包裝。簡單的說，使用以下各 5 μ 1 轉(zhuǎn)染IOcm皿AAV-293細(xì)胞：pAAV-Helper、pAAV-RC和AAV-BB-HDR質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后兩天，細(xì)胞 通過刮到Iml培養(yǎng)基中從板移出。通過3次冷凍-融化循環(huán)釋放病毒顆粒，接著以最大速 度在微型離心機(jī)中離心5分鐘。吸出上清液并直接用于目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
[0113] B)無角1594模板。從安格斯牛基因組DNA PCR擴(kuò)增涵蓋383P0LLED等位基因的 1784bp片段（F1:5'-GGGCAAGTTGCTCAGCTGTTTTTG(SEQ ID N0:19) ;Rl-5'-TCCGCATGGTTTAGC AGGATTCA(SEQ ID N0:20))，并TOPO克隆到PRC 2.1 載體（Life Technologies)中。該質(zhì)粒 用作分析引物組的陽性對照模板，并用于通過PCR使用使用以下引物（I594F: 5' -ATCGAACC TGGGTCTTCTGCATTG(SEQ ID N0:21) ;R1:5'-TCCGCATGGTTTAGCAGGATTCA(SEQ ID N0:22))衍 生1，592bp HDR模板，并如前TOPO克隆。每種質(zhì)粒在使用前測序驗(yàn)證。使用Fast-Ion MIDI Plasmid Endo-Free 試劑盒（IBI Scientific)制備轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒，并與 2 yg HP I. 3TALEN mRNA 一起轉(zhuǎn)染5 μ g或10 μ g。所有寡核昔酸模板由Intergrated DNA Techinologies合 成，IOOnmole合成通過標(biāo)準(zhǔn)脫鹽純化，并在TE中重懸至400 μ M。
[0114] 實(shí)施例4 :組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0115] 在補(bǔ)充有10%胎牛血清、1001