CT申請(qǐng)WO 2011/072246)，其中每個(gè)DNA結(jié)合重 復(fù)負(fù)責(zé)識(shí)別目標(biāo)DNA序列中的一個(gè)堿基對(duì)。可以裝配殘基以靶向DNA序列。簡言之，確定 用于TALEN結(jié)合的目標(biāo)位點(diǎn)，并創(chuàng)建包含核酸酶和一系列識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)的RVD的融合蛋白。 在結(jié)合后，核酸酶切割DNA，使得細(xì)胞修復(fù)機(jī)器能夠運(yùn)行以在切割末端處產(chǎn)生遺傳修飾。術(shù) 語TALEN表示包含轉(zhuǎn)錄激活物樣（TAL)效應(yīng)器結(jié)合域和核酸酶域的蛋白，并包括本身功能 性的單體TALEN以及其它要求與另一個(gè)單體TALEN二聚化的TALAN。當(dāng)兩個(gè)單體TALEN相 同時(shí)二聚化可以產(chǎn)生同二聚體TALEN，或者當(dāng)單體TALEN不同時(shí)可以產(chǎn)生異二聚體TALEN。 已顯示了 TALEN在永生化的人類細(xì)胞中通過兩種主要的真核DNA修復(fù)途徑（非同源末端連 接（NHEJ)和同源性指導(dǎo)的修復(fù)）來誘導(dǎo)基因修飾。
[0063] 本文中提供了用于將TALEN導(dǎo)入細(xì)胞或胚胎中，以及從其形成動(dòng)物的多個(gè)工作 例。用于TALEN處理的細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞、永生化細(xì)胞、原代細(xì)胞、原代體細(xì)胞、合子、生殖 細(xì)胞、原生殖細(xì)胞、胚泡，或干細(xì)胞。實(shí)施例10詳細(xì)說明了用于修飾精原干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。這些細(xì)胞提供了用于動(dòng)物（例如家畜）遺傳修飾的另一種方法。遺傳修飾或基因編輯 可以在從供體睪丸分離的精原干細(xì)胞（雄性種系干細(xì)胞，本文中縮寫為GSC)中在體外執(zhí) 行。將經(jīng)修飾的細(xì)胞移植到受體的生殖細(xì)胞消減的睪丸中。植入的精原干細(xì)胞產(chǎn)生帶有遺 傳修飾的精子，其可以用于通過人工受精（Al)或體外受精（IVF)的繁殖，來得到建立者動(dòng) 物。這一方法具有超出產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的建立者的優(yōu)勢(shì)。一個(gè)這樣的優(yōu)勢(shì)當(dāng)用于特定疾病 模型的建立者不健康并且不適合生長到生殖年齡時(shí)是明顯的。如此，導(dǎo)入GSC中的相同修 飾可以植入健康個(gè)體的睪丸中，從而允許從健康動(dòng)物繁殖品系來產(chǎn)生新生兒小豬中的疾病 模型。
[0064] 在精原干細(xì)胞中產(chǎn)生TALEN介導(dǎo)的插入和缺失（indel)的可能性和效率首先通過 轉(zhuǎn)染編碼革巴向至豬杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因座（Duchene Muscular Dystrophy locus) (DMD) 的外顯子7的TALEN的質(zhì)粒來探索。盡管生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為25%，幾種核轉(zhuǎn)染條件、質(zhì)粒量 和孵育溫度的測試產(chǎn)生了 19% NHEJ的最大效率，TALEN活性在30°C培養(yǎng)的復(fù)制物中最高。 GSC在30°C培養(yǎng)超過5天后仍然存活，雖然整體來說，生殖細(xì)胞的存活在37°C更高。與質(zhì) 粒DNA相比轉(zhuǎn)染TALEN編碼mRNA導(dǎo)致家畜體細(xì)胞和GSC的更大的活性和存活力兩者。值 得注意的是，雖然在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，mRNA轉(zhuǎn)染的活性峰值沒有超過質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，但是達(dá)到相 同水平的修飾要求顯著更低的mRNA量。實(shí)施例11詳細(xì)描述了在原生殖細(xì)胞（禽）中成功 的TALEN刺激的HDR。
[0065] 在一些實(shí)施方案中，可以使用單體TALEN。TALEN通常作為跨越具有間隔物的兩分 識(shí)別位點(diǎn)的二聚體發(fā)揮功能，使得兩個(gè)TAL效應(yīng)器域的每一個(gè)融合到FokI限制酶的催化 域，每一個(gè)所得的TALEN的DNA識(shí)別位點(diǎn)被間隔物序列分開，并且每一個(gè)TALEN單體與識(shí)別 位點(diǎn)的結(jié)合允許Fokl二聚化并在間隔物內(nèi)創(chuàng)建雙鏈斷裂。然而，也可以構(gòu)建單體TALEN， 使得單個(gè)TAL效應(yīng)器與不需要二聚化來發(fā)揮功能的核酸酶融合。一種此類核酸酶例如是 FokI的單鏈變體，其中兩個(gè)單體作為單個(gè)多肽表達(dá)。其它天然存在或工程化的單體核酸酶 也可以起到這一作用。用于單體TALEN的DNA識(shí)別域可以衍生于天然存在的TAL效應(yīng)器。 或者，DNA識(shí)別域可以經(jīng)工程化來識(shí)別特定的DNA目標(biāo)。工程化的單鏈TALEN可以更易于 構(gòu)建和采納，因?yàn)槠鋬H要求一個(gè)工程化的DNA識(shí)別域?？梢允褂脙蓚€(gè)不同DNA結(jié)合域（例 如一個(gè)TAL效應(yīng)器結(jié)合域和一個(gè)來自于另一類分子的結(jié)合域）產(chǎn)生二聚體DNA序列特異性 核酸酶。TALEN可以作為跨越具有間隔物的兩分識(shí)別位點(diǎn)的二聚體發(fā)揮功能。這種核酸酶 結(jié)構(gòu)也可以用于從例如一個(gè)TALEN單體和一個(gè)鋅指核酸酶單體生成的目標(biāo)特異性核酸酶。 在這種情況下，TALEN和鋅指核酸酶單體的DNA識(shí)別位點(diǎn)可以通過適當(dāng)長度的間隔物分開。 兩個(gè)單體的結(jié)合可以允許FokI二聚化，并在間隔物序列內(nèi)創(chuàng)建雙鏈斷裂。除了鋅指之外的 其它DNA結(jié)合域（例如同源域、myb重復(fù)或亮氨酸拉鏈），也可以融合到FokI并充當(dāng)TALEN 單體的配偶來創(chuàng)建功能性核酸酶。
[0066] 術(shù)語核酸酶包括外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。術(shù)語內(nèi)切核酸酶指代能夠催化DNA 或RNA分子（優(yōu)選DNA分子）內(nèi)的核酸之間的鍵的水解（切割）的任意野生型或變體 酶。內(nèi)切核酸酶的非限制性例子包括Π 類限制性內(nèi)切核酸酶，如FokI，HhaI，HindIII， 如《，81^(：13(3〇1?1，88111，和41￥1。當(dāng)具有通常長度約12-45個(gè)堿基對(duì)〇^)，更優(yōu)選 14-45 bp的多核苷酸識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，內(nèi)切核酸酶還包含切點(diǎn)罕見內(nèi)切核酸酶（rare-cutting endonucleases)。切點(diǎn)罕見內(nèi)切核酸酶在限定基因座處誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSB)。切點(diǎn)罕 見內(nèi)切核酸酶可以是例如歸巢內(nèi)切核酸酶，即由工程化鋅指域與限制性酶（如FokI)或化 學(xué)內(nèi)切核酸酶的催化域融合得到的嵌合鋅指核酸酶（ZFN)。在化學(xué)內(nèi)切核酸酶中，化學(xué)或 肽切割劑與核酸聚合物或另一個(gè)識(shí)別特定目標(biāo)序列的DNA綴合，從而將切割活性靶向到特 定的序列?；瘜W(xué)內(nèi)切核酸酶也包括合成的核酸酶，如鄰二氮雜菲、DNA切割分子，以及已知 結(jié)合特定DNA序列的三鏈體形成寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotides，TF0)的 綴合物。根據(jù)本發(fā)明，這些化學(xué)內(nèi)切核酸酶包含于術(shù)語"內(nèi)切核酸酶"中。這些內(nèi)切核酸 酶的例子包括 I-See I，I-Chu L I-Cre I，I-Csm I，Pi-See L PI-Tti L PI-Mtu I，I-Ceu I,I-See IL I-See III, HO, Pi-Civ I,PI-Ctr L PI-Aae I,PI-Bsu I, PI-Dha I, PI-Dra L PI-Mav L PI-Meh I, PI-Mfu L PI-Mfl I, PI-Mga L PI-Mgo I, PI-Min L PI-Mka L PI-Mle I, PI-Mma I, PI-30Msh L PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu L PI-Rma I, Pl-Spb I, PI-Ssp L PI-Fae L PI-Mja I, PI-Pho L Pi-Tag L PI-Thy I, PI-Tko I, PI-Tsp I, I-Msolo
[0067] 同源性指導(dǎo)的修復(fù)（HDR)
[0068] 同源性指導(dǎo)的修復(fù)（HDR)是細(xì)胞中修復(fù)ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)損傷的一種機(jī) 制。當(dāng)存在有與損傷位點(diǎn)具有顯著同源性的序列的HDR模板時(shí)，細(xì)胞可以使用這一修復(fù)機(jī) 制。特異性結(jié)合在該術(shù)語在生物領(lǐng)域中通常使用時(shí)指代分子以與非目標(biāo)組織相比相對(duì)較 高的親和力結(jié)合目標(biāo)，并且通常涉及多個(gè)非共價(jià)相互作用，如靜電相互作用、范德華相互作 用、氫鍵鍵合等等。特異性雜交是一種具有互補(bǔ)序列的核酸之間的特異性結(jié)合的形式。蛋 白也可以特異性結(jié)合DNA，例如，在TALEN或CRISPR/Cas9系統(tǒng)中或通過Gal4基序。等位基 因的漸滲指代將外源性等位基因通過模板引導(dǎo)方法復(fù)制到內(nèi)源性等位基因上的過程。在一 些情況下，內(nèi)源性等位基因?qū)嶋H上可以被切出并由外源性核酸等位基因代替，但現(xiàn)在的理 論是這一過程是復(fù)制機(jī)制。由于等位基因是基因?qū)?，它們之間具有顯著的同源性。等位基 因可以是編碼蛋白的基因，或其可以具有其它功能，如編碼生物活性RNA鏈，或提供位點(diǎn)以 接受調(diào)節(jié)蛋白或RNA。
[0069] HDR模板是包含漸滲的等位基因的核酸。模板可以是dsDNA或單鏈DNA (ssDNA)。 ssDNA模板優(yōu)選的是從約20到約5000個(gè)殘基，雖然也可以使用其它長度。技術(shù)人員將立即 理解，明確陳述的范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都是涵蓋的；例如，從500到1500個(gè)殘基，從20 到 100個(gè)殘基，等等。模板可以進(jìn)一步包含側(cè)翼序列，其提供與要取代的內(nèi)源性等位基因或 DNA鄰近的DNA的同源性。模板還可以包括結(jié)合靶向性核酸酶系統(tǒng)的序列，并因此是系統(tǒng)的 DNA結(jié)合成員的關(guān)聯(lián)結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語關(guān)聯(lián)指代通常相互作用的兩種生物分子，例如受體及其 配體。在HDR過程的語境中，生物分子中的一個(gè)可以設(shè)計(jì)為帶有結(jié)合意圖（例如關(guān)聯(lián)）DNA 位點(diǎn)或蛋白位點(diǎn)的序列。
[0070] -個(gè)用于減少對(duì)靶向性核酸酶系統(tǒng)的特異性結(jié)合的實(shí)施方案包括相對(duì)于其與內(nèi) 源性DNA的比對(duì)在HDR模板中做出改變。一種改變的類型設(shè)計(jì)為在關(guān)聯(lián)成員之間創(chuàng)建錯(cuò)配。 一種改變是插入或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基。另一種改變是使用一個(gè)殘基取代另一個(gè)不促進(jìn)結(jié) 合的殘基。術(shù)語殘基指代分子鏈中的單位，例如蛋白中的氨基酸或核酸中的堿基。一個(gè)進(jìn) 行改變的位置是系統(tǒng)的DNA結(jié)合成員的關(guān)聯(lián)結(jié)合位點(diǎn)。
[0071] 另一種改變類型設(shè)計(jì)為在與間隔物一起運(yùn)行的系統(tǒng)（例如TALEN對(duì)）中通過在間 隔物中產(chǎn)生改變來干擾核酸酶的運(yùn)行，改變可以在間隔物區(qū)域中產(chǎn)生。這些改變可以包括 缺失，例如，使得核酸酶受到阻礙而不能產(chǎn)生切口。這些各種改變?cè)诒疚闹型ǔ７Q為錯(cuò)配， 因?yàn)楫?dāng)序列比對(duì)時(shí)，它們創(chuàng)建錯(cuò)配；在這一語境中，缺失、插入，或取代是錯(cuò)配。核酸酶對(duì)需 要提供協(xié)同性的間隔；其活性可以通過對(duì)間隔物的增加或扣除來破壞。
[0072] 進(jìn)一步的實(shí)施方案在外源性等位基因中置入錯(cuò)配。系統(tǒng)的DNA結(jié)合成員設(shè)計(jì)為在 至少與內(nèi)源性等位基因部分重疊的位點(diǎn)處結(jié)合。一旦其被漸滲而與外源性等位基因具有同 一性，DNA結(jié)合成員具有降低的結(jié)合。因此，DNA結(jié)合成員的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)從優(yōu)選的內(nèi)源性等位 基因改變?yōu)榉莾?yōu)選的外源性等位基因。關(guān)聯(lián)位點(diǎn)可以涵蓋等位基因的全部，或僅其部分。令 人驚訝的是，將錯(cuò)配引入外源性等位基因?qū)τ诜€(wěn)定外源性等位基因的漸滲是需要的。顯然， 再切割的問題對(duì)漸滲的等位基因的穩(wěn)定性具有非常大的影響。顯示這一影響的數(shù)據(jù)之前尚 未由其他人獲得，因?yàn)榫哂邢喈?dāng)效率的方法并不是常規(guī)可用的。
[0073] 實(shí)施方案包括使用HDR模板化（templating)過程，在這些各個(gè)位置處通過殘基 的插入、缺失，或取代創(chuàng)建錯(cuò)配。例如，可以插入、缺失，或取代1-1000個(gè)殘基；技術(shù)人員 將立即理解在明確陳述的范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都是涵蓋的；例如1-3個(gè)殘基，至少10 個(gè)殘基，4個(gè)殘基，4-20個(gè)殘基，1-205個(gè)殘基，1-220個(gè)殘基，1-300個(gè)殘基，1-500個(gè)殘基， 10-1000個(gè)殘基，等等。這些中的一種或多種可以組合，例如在一個(gè)位置處的插入，在另一個(gè) 位置處的缺失，以及在其它位置處的取代。
[0074] 可以在無報(bào)告物的系統(tǒng)中進(jìn)行這些各種實(shí)施方案，并產(chǎn)生SNP或涉及SNP的實(shí)施 方案。細(xì)胞或動(dòng)物可以是例如家畜、豬、母牛、綿羊、山羊、雞、兔、魚、斑馬魚、犬、小鼠、貓、大 鼠，以及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。
[0075] 組合物和試劑盒
[0076] 本發(fā)明還提供組合物和試劑盒，其含有例如編碼位點(diǎn)特異性內(nèi)切核酸酶、CRISPR、 Cas9、ZNF，TALEN的核酸，它們的多肽，含有這些核酸分子或多肽的組合物，或工程化的細(xì)胞 系。還可以提供對(duì)于無角等位基因的漸滲有效的HDR。這些物品可以作為例如研究工具或 治療性使用。
[0077] 載體和核酸
[0078] 可以將多種核酸導(dǎo)入偶蹄動(dòng)物或其它細(xì)胞中，用于敲除的目的，或獲得基因的表 達(dá)用于其它目的。可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的核酸構(gòu)建體包括目標(biāo)核酸序列。如本文所使 用的，術(shù)語核酸包括DNA、RNA，以及核酸類似物，以及雙鏈或單鏈（例如正義或反義單鏈） 的核酸。核酸類似物可以在堿基部分、糖部分，或磷酸主鏈處修飾以改進(jìn)例如核酸的穩(wěn)定 性，雜交，或溶解性。堿基部分處的修飾包括脫氧尿苷代替脫氧胸苷，以及5-甲基-2' -脫 氧胞苷和5-溴-2'脫氧胞苷代替脫氧胞苷。糖部分的修飾包括修飾核糖的2'羥基來形 成2'-0-甲基或2'-0-烯丙基糖?？梢孕揎椕撗鹾颂橇姿嶂麈渷懋a(chǎn)生嗎啉代核酸，其中每 一個(gè)堿基部分與六元嗎啉環(huán)或肽核酸相連，其中脫氧磷酸主鏈被假肽主鏈代替，而保留四 種喊基。見 Summerton 和 Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7 (3): 187;和 Hyrup等（1996)Bioorgan. Med. Chem. 4:5。此外，脫氧磷酸主鏈可以使用例如硫代磷酸或二 硫代磷酸主鏈、亞磷酰胺、或烷基磷酸三酯主鏈取代。
[0079] 目標(biāo)核酸序列可以可操作地連接到調(diào)控區(qū)，如啟動(dòng)子。調(diào)控區(qū)可以是豬調(diào)控區(qū)，或 者可以來自其它物種。如本文所使用的，可操作地連接指代將調(diào)控區(qū)相對(duì)于核酸序列以允 許或促進(jìn)目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)錄的方式定位。
[0080] 任意類型的啟動(dòng)子可以可操作地連接到目標(biāo)核酸序列。啟動(dòng)子的例子包括但不限 于組織特異性啟動(dòng)子，組成性啟動(dòng)子，以及對(duì)特定刺激物響應(yīng)或者不響應(yīng)的啟動(dòng)子。適合的 組織特異性啟動(dòng)子可以產(chǎn)生β細(xì)胞中核酸轉(zhuǎn)錄物的優(yōu)先表達(dá)，并包括例如人胰島素啟動(dòng) 子。其它組織特異性啟動(dòng)子可以導(dǎo)致例如肝細(xì)胞或心臟組織中的優(yōu)先表達(dá)，并分別可以包 括白蛋白或α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方案中，可以使用促進(jìn)核酸分子表達(dá)而 沒有顯著的組織或時(shí)間特異性的啟動(dòng)子（例如，組成性啟動(dòng)子）。例如，可以使用肌動(dòng) 蛋白啟動(dòng)子（如雞β -肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、miniCAG啟動(dòng)子，甘油醛-3-磷 酸脫氫酶（GAPDH)啟動(dòng)子，或3-磷酸甘油酸激酶（PGK)啟動(dòng)子）及病毒啟動(dòng)子（如單純皰 疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子，或巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子）。在一些實(shí) 施方案中，雞β肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子的融合作為啟動(dòng)子使用。見例如Xu等， (2001)Hum. Gene Ther. 12:563;和 Kiwaki 等，（1996)Hum. Gene Ther. 7:821 〇
[0081] 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的一個(gè)例子是四環(huán)素（tet)_開啟啟動(dòng)子系統(tǒng)，其可以用于調(diào)節(jié)核 酸的轉(zhuǎn)錄。在這一系統(tǒng)中，突變的Tet阻抑物（TetR)融合到單純皰疹病毒VP 16反式激活 物蛋白的激活域以創(chuàng)建四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活物（tTA)，其由tet或多西環(huán)素（dox)調(diào)控。 在沒有抗生素時(shí)，轉(zhuǎn)錄最小，而在tet或dox存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄被誘導(dǎo)。備選的誘導(dǎo)型系統(tǒng)包括 蛻皮激素或雷帕霉素系統(tǒng)。蛻皮激素是一種昆蟲蛻皮激素，其產(chǎn)生蛻皮激素受體和超氣門 蛋白（ultraspiracle)基因（USP)產(chǎn)物的異二聚體控制。通過使用蛻皮激素或蛻皮激素類 似物（如幕黎甾酮AOimristerone A))處理誘導(dǎo)表達(dá)。施用到動(dòng)物來觸發(fā)誘導(dǎo)型系統(tǒng)的藥 劑稱為誘導(dǎo)劑。
[0082] 可以用于核酸構(gòu)建體的另外的調(diào)控區(qū)包括但不限于多聚腺苷酸化序列，翻譯控制 序列（例如內(nèi)部核糖體進(jìn)入?yún)^(qū)段，IRES)，增強(qiáng)子，誘導(dǎo)型元件，或內(nèi)含子。這些調(diào)控區(qū)可能 不是必要的，盡管它們可以通過影響轉(zhuǎn)錄、mRNA的穩(wěn)定性，翻譯效率等等來增加表達(dá)。在想 要時(shí)核酸構(gòu)建體中可以包含此類調(diào)控區(qū)以獲得核酸在細(xì)胞中的最優(yōu)表達(dá)。然而，有時(shí)可以 在沒有此類另外的元件的情況下獲得足夠的表達(dá)。
[0083] 可以使用編碼信號(hào)肽或選擇標(biāo)志物的核酸構(gòu)建體?？梢允褂眯盘?hào)肽，使得編碼的 多肽定向到特定的細(xì)胞位置（例如細(xì)胞表面）。選擇標(biāo)志物的非限制性例子包括嘌呤霉 素、更昔洛韋、腺苷脫氨酶（ADA)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（neo、G418、ΑΡΗ)，二氫葉酸還原酶 (DHFR)，潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶，胸苷激酶（TK)，以及黃嘌呤（xanthin，xanthine)-鳥嘌呤 磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（XGPRT)。此類標(biāo)志物對(duì)于在培養(yǎng)物中選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體是有用的。其 它的選擇標(biāo)志物包括熒光多肽，如綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
[0084] 在一些實(shí)施方案中，編碼選擇標(biāo)志物的序列在側(cè)翼可以有重組酶（如例如Cre 或Flp)的識(shí)別序列。例如，選擇標(biāo)志物在側(cè)翼可以有IoxP識(shí)別位點(diǎn)（由Cre重組酶識(shí) 別的34-bp識(shí)別位點(diǎn)）或者FRT識(shí)別位點(diǎn)，使得選擇標(biāo)志物可以從構(gòu)建體切除。見Orban 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:6861 (關(guān)于 Cre/lox 技術(shù)的綜述）及 Brand and Dymecki，Dev. Cell (2004) 6: 7。含有由選擇標(biāo)志物基因中斷的Cre-或Flp-可激活轉(zhuǎn)基因的 轉(zhuǎn)座子也可以用于獲得帶有轉(zhuǎn)基因的條件性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，驅(qū)動(dòng)標(biāo)志物/轉(zhuǎn)基 因表達(dá)的啟動(dòng)子可以是遍在的或者組織特異性的，其可以導(dǎo)致標(biāo)志物在FO動(dòng)物（例如豬） 中的遍在或組織特異性表達(dá)。轉(zhuǎn)基因的組織特異性激活可以通過例如將遍在表達(dá)標(biāo)志物中 斷的轉(zhuǎn)基因的豬與以組織特異性的方式表達(dá)Cre或Flp的豬雜交，或通過以組織特異性的 方式表達(dá)標(biāo)志物中斷的轉(zhuǎn)基因的豬與遍在表達(dá)Cre或Flp重組酶的豬雜交來完成。轉(zhuǎn)基因 的受控表達(dá)或標(biāo)志物的受控切除允許轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
[0085] 在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)核酸編碼多肽。編碼多肽的核酸序列可以包括編碼"標(biāo) 簽"的標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽設(shè)計(jì)為促進(jìn)編碼多肽的后續(xù)操作（例如，促進(jìn)定位或檢測）。可 以將標(biāo)簽序列插入編碼多肽的核酸序列中，使得編碼的標(biāo)簽定位于多肽的羧基或氨基末 端。編碼的標(biāo)簽的非限制性例子包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)和FLAG?標(biāo)簽（Kodak，New Haven, CT)〇
[0086] 在其它實(shí)施方案中，目標(biāo)核酸序列誘導(dǎo)針對(duì)目標(biāo)核酸的RNA干擾，使得目標(biāo)核酸 的表達(dá)減少。例如，目標(biāo)核酸序列可以誘導(dǎo)針對(duì)編碼囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)（CFTR)多肽 的核酸的RNA干擾。例如，與CFTR DNA同源的雙鏈小干擾RNA (siRNA)或短發(fā)夾RNA (shRNA) 可以用于減少該DNA的表達(dá)。可以生成siRNA的構(gòu)建體，如例如描述于Fire等，（1998) Nature391:806;Romano 和 Masino(1992)Mol.Microbiol 6:3343;Cogoni 等，（1996)ΕΜΒ0 J. 15:3153 ;Cogoni 和 Masino(1999)Nature 399:166 ;Misquitta 和 Paterson(1999)Proc. Natl. Acad Sci. USA 96:1451;以及 Kennerdell 和 Carthew(1998)Cell 95:1017。可以生 成 shRNA 的構(gòu)建體，如描述于 McIntyre 和 Fanning (2006) BMC Biotechnology 6:1。一般來 說，shRNA轉(zhuǎn)錄為含有可以退火并形成短發(fā)夾的互補(bǔ)區(qū)的單鏈RNA分子。
[0087] 核酸構(gòu)建體可以使用 Sssl CpG 甲基化酶（New England Biolabs, Ipswich, MA)甲 基化。一般來說，核酸構(gòu)建體可以與緩沖液中的S-腺苷甲硫氨酸和Sssl CpG-甲基化酶在 37°C-起孵育?？梢酝ㄟ^將構(gòu)建體與1個(gè)單位HinPlI內(nèi)切核酸酶在37°C孵育1小時(shí)和通 過瓊脂糖凝膠電泳測定確認(rèn)超甲基化。
[0088] 可以使用多種技術(shù)，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入任意類型的胚胎、胎兒，或成年偶蹄動(dòng)物細(xì) 胞（包括例如生殖細(xì)胞，如卵母細(xì)胞或卵細(xì)胞，祖細(xì)胞、成體或胚胎干細(xì)胞，原生殖細(xì)胞，腎 細(xì)胞，如PK-15細(xì)胞、胰島細(xì)胞、β細(xì)胞、肝細(xì)胞，或成纖維細(xì)胞，如皮膚成纖維細(xì)胞）中。技 術(shù)的非限制性例子包括使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、能感染細(xì)胞的重組病毒，或