半夏人工種胚同步化的懸浮培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)、繼代增殖 及半夏人工種胚分化培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]半夏[/YfleWiateraate(Thunb.)Breit.]，又稱麻芋果、三步跳、三片葉、燕子 尾等，是天南星科半夏屬的一種多年生草本藥用植物，在我國廣泛分布（除內(nèi)蒙、黑龍江、吉 林、青海、新疆、西藏外，其余省份均有分布)。半夏是一種大宗藥材，以其塊莖入藥，味辛苦、 性溫、有毒，具有燥濕化痰、降逆止嘔等功效，對降壓、凝血、抗生育等也有一定作用。200多 種中成藥中含有半夏。
[0003] 隨著對半夏研究的深入，其藥用價值逐漸體現(xiàn)出來，藥用量逐年上升，加上野生資 源不集中、采挖難度大等導(dǎo)致半夏市場供不應(yīng)求。因此，半夏的人工種植經(jīng)濟效益高，市場 前景廣闊。人工種植雖在一定程度上緩解了半夏藥材的供需矛盾，但因其畝用種量大、連作 病害頻繁、種質(zhì)退化嚴重等因素，致使多數(shù)藥農(nóng)對半夏種植望而卻步。半夏組織培養(yǎng)技術(shù)的 成功雖為解決半夏繁殖和種質(zhì)創(chuàng)新提供了新的途徑，但組培苗栽種工作量大、管理程序繁 瑣、成活率低，故該項技術(shù)在半夏規(guī)模化種植中實用意義不大。
[0004] 人工種子技術(shù)的出現(xiàn)為半夏種子規(guī)模化生產(chǎn)和種質(zhì)提純復(fù)壯帶來了希望。其中， 半夏人工種胚同步化培養(yǎng)是該項技術(shù)的核心，也是關(guān)系到半夏人工種子規(guī)?；a(chǎn)能否實 現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對解決半夏規(guī)?；斯しN植中所需大量優(yōu)質(zhì)種子種苗問題具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種通過液體懸浮培養(yǎng)獲得半夏同步化人工種胚的方法，為 實現(xiàn)半夏人工種子規(guī)模化生產(chǎn)提供保障。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：首先以半夏無菌苗葉片或葉柄作為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生 愈傷組織，然后通過調(diào)整繼代培養(yǎng)基及繼代次數(shù)獲得適于懸浮培養(yǎng)的疏松愈傷組織，再經(jīng) 懸浮培養(yǎng)建立半夏微細均一細胞團懸浮體系，最后通過對植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和濃度、 蔗糖濃度、水解酪蛋白（CH)濃度及光照強度的調(diào)節(jié)，構(gòu)建優(yōu)化的半夏人工種胚同步化培養(yǎng) 條件。
[0007] 具體步驟如下： 步驟1 :采用半夏無菌苗葉片或葉柄作為外植體，置于MS添加2, 4-D1. 0~2. 0 mg/L 和6-BA 0. 5~1. 5 mg/L的固體培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)獲得愈傷組織； 步驟2 :選擇步驟1中增殖較快、疏松程度較高的愈傷組織，以MS為基本培養(yǎng)基，添加 2, 4-D0? 5~2. 0mg/L和6-BA0? 5~1. 5mg/L進行繼代增殖培養(yǎng)，每隔25~30d繼代 1次，連續(xù)繼代3次后獲得適于懸浮培養(yǎng)的顆粒狀離散愈傷組織； 步驟3 :挑選步驟2中增殖快、疏松程度高的愈傷組織，以不含蔗糖和瓊脂的MS液體培 養(yǎng)基添加 2, 4-D0? 5 ~1. 5mg/L+ 6-BA0? 2 ~1. 0mg/L+CH100 ~300mg/L+ 蔗糖 30~50g/L進行懸浮培養(yǎng)，每隔10~15d繼代1次，連續(xù)繼代3次后獲得適于進行人工 種胚膨大培養(yǎng)的細胞團； 步驟4:選擇步驟3中繼代3次后生長良好的細胞團，以MS+ 6-BA0. 5mg/L+CH300mg/L+蔗糖30g/L液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)物 質(zhì)2, 4-D0~0. 5mg/L、NAA0~0. 5mg/L、IBA0~2. 0mg/L進行細胞團膨大培養(yǎng)，培養(yǎng) 10 d左右可形成大量乳白色、質(zhì)地緊密、直徑約0.1 cm的細胞團； 步驟5 :將步驟4中的細胞團進行過篩處理，濾去單細胞和疏松細胞團，選取質(zhì)地緊密、 大小均一的微細胞團，置于MS+CH300mg/L+鹿糖10g/L再添加6-BA0~2.0mg/L、 IBA0~0. 2mg/L的液體培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)，10~15d后分化形成可用于制作半夏 人工種子的大量同步化人工種胚。
[0008] 作為優(yōu)選方案，所有培養(yǎng)基pH均調(diào)節(jié)為5. 8,培養(yǎng)溫度為（25 ± 1) °C，光照強度 2000lx，光照時間12h/d，懸浮培養(yǎng)基不含瓊脂，特殊情況另加說明。
[0009] 作為優(yōu)選方案，步驟1中誘導(dǎo)疏松愈傷組織的外植體為半夏無菌苗葉片，誘導(dǎo)愈 傷組織的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)為2, 4-D1.0mg/L+ 6-BA1.5mg/L;或外植體為半夏無菌苗 葉柄，添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)為2, 4-D1.0mg/L+ 6-BA1.0mg/L。
[0010] 作為優(yōu)選方案，步驟2中愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基為MS+ 2, 4-D2.0mg/L+ 6-BA1. 0mg/L〇
[0011] 作為優(yōu)選方案，步驟3中愈傷組織懸浮培養(yǎng)基為MS+ 2, 4-D1.0mg/L+ 6-BA 0.5mg/L+CH300mg/L+ 鹿糖 40g/L，黑暗培養(yǎng)。
[0012] 作為優(yōu)選方案，步驟4中選擇增殖快、分散程度高、性狀呈圓形或卵圓形的細胞 團，懸浮培養(yǎng)基為MS+ 6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+CH300mg/L+ 蔗糖 30g/L。
[0013] 作為優(yōu)選方案，步驟5中細胞團懸浮培養(yǎng)基為MS+ 6-BA0.5mg/L+IBA0.05 mg/L+CH300mg/L+ 鹿糖 10g/L。
[0014] 本發(fā)明達到的有益效果： 由于傳統(tǒng)的半夏人工種植采用塊莖繁殖，成本高、病害嚴重。本發(fā)明成功建立了半夏人 工種胚同步化懸浮培養(yǎng)方法，突破了半夏人工種子規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，從而為解 決半夏種子用量、種質(zhì)提純復(fù)壯并實現(xiàn)半夏藥材規(guī)范化、規(guī)模化人工種植提供了有效途徑。
【附圖說明】
[0015] 圖1為半夏人工種胚的誘導(dǎo)形成過程。圖中：A:外植體(葉片）;B:初代愈傷組織； C:3次繼代后的愈傷組織；D:細胞團懸浮系；E:膨大培養(yǎng)的細胞團；F:分化形成的人工種 胚。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0017] 實施例1 :愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng) 實施例中的材料半夏[/YfleWia teraate (Thunb.) Breit.]采自貴州赫章縣。
[0018] 選取長勢好的半夏無菌苗葉片或葉柄作為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，采用外植 體、2, 4-D、6-BA三因素三水平正交實驗設(shè)計進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（25 ± 1) °C，光照強度2000lx，光照時間12h/d。統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率及其鮮重(表1)。
[0019] 從表1可知，不同處理組合對半夏愈傷組織誘導(dǎo)率影響不大，但對形成愈傷組織 多少、愈傷組織顏色和質(zhì)地等影響較大。結(jié)論：將葉片接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L或葉柄接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基pH為 5. 8,下同)，誘導(dǎo)出的愈傷組織長勢較好且疏松。
[0020] 通過調(diào)整2, 4-D及