見血青的離體保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
:
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)±或，具體地，涉及植物見血青(Liparisnervosa(Thunb.Lindl.))的離體保存方法。
【背景技術(shù)】
:
[0002]見血青(Liparisnervosa (Thunb.Lindl.))為蘭科(Orchidaceae)羊耳蒜屬(Liparis)地生草本植物，廣泛分布于世界熱帶與亞熱帶地區(qū)。其莖(或假鱗莖)圓柱狀，肉質(zhì)肥厚，為民間常用中藥，具有清熱解毒、涼血止血的功效，可用于多種出血性疾病及毒蛇咬傷、皮炎、跌打損傷等癥。見血青的多糖提取液和總生物堿具有較好的抗氧化性和抑菌效果，具有很高的藥用價值；同時，見血青還具有觀賞價值，是盆花的好材料。見血青已被列為國家二級保護植物。目前，關(guān)于羊耳蒜屬植物各方面的研究越來越多，其中如專利公開號為CN102274403A的關(guān)于見血青總生物堿的提取方法，CN104813937A的關(guān)于見血青再生及快速繁殖方法，兩者從化學(xué)成分和組培快繁方面對該植物進行了研究；同屬植物紫花羊耳蒜(L nigra)、長唇羊耳蒜(L.pauliana)、北方羊耳蒜(L.makinoana)和羊耳蒜(L.japonica)等也具有止血止痛等功效，也已有組培快繁方面的研究報道。隨著對該屬植物組培快繁工作的深入、以及人們對于該屬植物野生資源的過度采收和其野生環(huán)境的日益遭受破壞，進一步開展該屬物種的離體保存方法的研究，將對羊耳蒜屬植物種質(zhì)資源的開發(fā)、利用和保護提供重要的理論來源和技術(shù)支持。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)尚未見有見血青離體保存方法的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

:
[0003]本發(fā)明的目的在于提供現(xiàn)有技術(shù)中沒有的一種極具藥用價值和觀賞潛力的植物見血青的離體保存方法。通過對見血青的種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)和離體保存等步驟，建立了見血青的快繁和離體保存體系，繼代周期達3年以上。該方法對羊耳蒜屬植物種質(zhì)資源的開發(fā)、利用和保護提供重要的理論來源和技術(shù)支持。
[0004]為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
[0005]見血青的離體保存方法，用見血青果莢，經(jīng)表面消毒，將果莢破開，取外植體種子，接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，長出帶葉子的小苗，經(jīng)叢芽增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得假鱗莖，假鱗莖轉(zhuǎn)接在離體保存培養(yǎng)基中，離體保存的小苗經(jīng)常規(guī)煉苗后進行移栽。
[0006]如所述的見血青的離體保存方法，其中所述的培養(yǎng)基如下:(I)種子萌發(fā)培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基為MS大量元素減半，其余成分與MS相同的1/2MS培養(yǎng)基；(2)叢芽增殖培養(yǎng)基:含大量元素、微量元素和鐵鹽的MS+B5有機物+IAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+肌醇100mg/L ；
(3)離體保存培養(yǎng)基:1/2MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L ;以上培養(yǎng)基(I)和(2)添加蔗糖20g/L，(3)添加蔗糖40g/L，活性炭l-2g/L ;所有培養(yǎng)基均添加瓊脂5.8g/L固化，pH5.8，在如下培養(yǎng)條件下培養(yǎng):培養(yǎng)溫度25±2°C，光照強度10-20 μ mol/ (m2.s)，光照12h/d。
[0007]如所述的見血青的離體保存方法，其中所述的外植體種子的獲得是選擇野外生長發(fā)育良好、沒有病蟲害的見血青果莢，在果莢成熟未開裂之前采摘，將其表面附著物搽洗干凈，將經(jīng)過初步處理的蒴果用75%酒精進行表面消毒20-30S，再用無菌水沖洗5遍，用0.1% HgClyK溶液進行消毒15_20min，在無菌條件下用無菌水反復(fù)水洗3遍，濾紙吸干果莢表面水分，然后切開果莢，將種子散落到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，接種7周后，出現(xiàn)原球莖分化，10周后出現(xiàn)葉原基分化。
[0008]如所述的見血青的離體保存方法，其中所述的叢芽增殖培養(yǎng)是將經(jīng)種子萌發(fā)培養(yǎng)得到的帶有一片葉子的見血青小苗，去除須根后接種至叢芽增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種5個外植體，45天后出現(xiàn)芽分化，并在原假鱗莖的頂部或基部長出新的假鱗莖，繼續(xù)在此培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)2-3次，60天繼代一次，增值率達1: 5，新增殖出的假鱗莖大小為0.2cm X 0.3cm_0.3cm X 0.4cm，呈淡綠色。
[0009]如所述的見血青的離體保存方法，其中所述的離體保存培養(yǎng)是將經(jīng)叢芽增殖培養(yǎng)得到的新增殖的假鱗莖轉(zhuǎn)接在離體保存培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)瓶接種5個，培養(yǎng)60天后，假鱗莖轉(zhuǎn)為墨綠色并增大，基部的假鱗莖呈近圓形，頂部的假鱗莖長圓柱形，不斷長出新假鱗莖，繼續(xù)在離體保存培養(yǎng)基中培養(yǎng)，假鱗莖增大和分化同時氣生根生成；在此培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)瓶口用保鮮膜纏繞數(shù)圈封嚴(yán)，培養(yǎng)基增加到每瓶75ml，繼代周期延長至3年以上，所用培養(yǎng)瓶為白色透明玻璃瓶，直徑7.5cm X高9.0cm，容積300ml。
[0010]如所述的見血青的離體保存方法，其中所述的移栽是將離體保存3年以上的見血青帶根小苗進行移栽，先將瓶苗放在大棚內(nèi)煉苗I周，然后從培養(yǎng)瓶中取出生根苗，洗去附著的培養(yǎng)基，晾干水分后進行移栽，移栽基質(zhì)為經(jīng)5%甲醛水溶液消毒過的腐殖土:沙土 =2: 1，栽好后澆透定根水，早期視苗生長狀況進行及時通風(fēng)或補水處理，待試管苗長出新葉后，可揭膜粗放管理。
[0011]具體地，本發(fā)明的見血青的離體保存方法，是取野外生長發(fā)育良好、沒有病蟲害的見血青果莢，在果莢成熟但未開裂之前采摘，帶回實驗室，用紗布將蒴果表面附著物搽洗干凈，用75%酒精消毒20-30s，再用無菌水沖洗5遍，用0.1% HgCl2水溶液消毒15_20min，在無菌條件下用無菌水反復(fù)水洗3遍，濾紙吸干果莢表面水分；然后用解剖刀切開果莢，將種子散落到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，接種7周后，原球莖分化，10周后，葉原基分化，將帶有一片葉子的見血青小苗去除須根后接種至叢芽增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種5個外植體，45天芽分化，在原假鱗莖的頂部或基部長出新的假鱗莖；繼續(xù)在此培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)2-3次，60天繼代一次，增值率達1: 5，將新增殖的假鱗莖轉(zhuǎn)接在離體保存培養(yǎng)基上，每瓶接種5個，培養(yǎng)60天后，假鱗莖轉(zhuǎn)為墨綠色并增大，基部的假鱗莖呈近圓形，頂部的假鱗莖長圓柱形，并不斷長出新的假鱗莖，繼續(xù)在離體保存培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在假鱗莖增大和分化的同時有氣生根生成，在此培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)瓶口用保鮮膜纏繞數(shù)圈封嚴(yán)，培養(yǎng)基增加到每瓶75ml，繼代周期延長至3年以上，將保存3年以上的見血青帶根小苗進行常規(guī)煉苗后，移栽到基質(zhì)為經(jīng)5%甲醛水溶液消毒過的腐殖土:沙土 = 2: I ;所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基為MS大量元素減半，其余成分與MS相同的1/2MS培養(yǎng)基；叢芽增殖培養(yǎng)基為:含大量元素、微量元素和鐵鹽的MS+B5有機物+IAA0.5mg/L+KT 0.5mg/L+肌醇100mg/L ;離體保存培養(yǎng)基為:1/2MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L ;種子萌發(fā)培養(yǎng)基和叢芽增殖培養(yǎng)基添加蔗糖20g/L，離體保存培養(yǎng)基添加蔗糖40g/L，活性炭l-2g/L ;上述三種培養(yǎng)基均添加瓊脂5.8g/L固化，pH5.8，在如下培養(yǎng)條件下培養(yǎng):培養(yǎng)溫度25±2°C，光照強度10-20 μ mol/ (m2.s)，光照12h/do
[0012]如所述的見血青的離體保存方法，其中所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基和叢芽增殖培養(yǎng)基為40ml，離體保存培養(yǎng)基為75ml。
[0013]更具體地，本發(fā)明取野外選擇生長發(fā)育良好、沒有病蟲害的見血青果莢，在果莢成熟但未開裂之前采摘帶回實驗室，用紗布將其表面附著物搽洗干凈。將經(jīng)過初步處理的蒴果用75%酒精進行表面消毒20-30S，再用無菌水沖洗5遍，用0.1 % HgCljK溶液進行消毒15-20min，在無菌條件下用無菌水反復(fù)水洗3遍，濾紙吸干果莢表面水分。然后用解剖刀切開果莢，將種子散落到培養(yǎng)基(I)中。接種后約7周，出現(xiàn)原球莖分化，10周后出現(xiàn)葉原基分化。然后將帶有一片葉子的見血青小苗去除須根后接種至叢芽增殖培養(yǎng)基(2)上，每瓶接種5個外植體。45天后出現(xiàn)芽分化，并在原假鱗莖的頂部或基部長出新的假鱗莖。繼續(xù)在此培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)2-3次，60天繼代一次，增值率可達1: 5。新增殖出的假鱗莖大小0.3cmX0.4cm左右，呈淡綠色。將新增殖的假鱗莖轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基(3)上，每瓶接種5個，培養(yǎng)60天后，假鱗莖轉(zhuǎn)為墨綠色并增大，基部的假鱗莖呈近圓形，大小0.ScmX 1.0cm左右；頂部的假鱗莖長圓柱形，1.0cmX 2.5cm，并不斷有新的假鱗莖長出。繼續(xù)在(3)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在假鱗莖增大和分化的同時有氣生根的生成。在此培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)瓶口用保鮮膜纏繞數(shù)圈封嚴(yán)，培養(yǎng)基增加到75ml左右每瓶，繼代周期可延長至3年以上，大大延長了繼代周期，縮短了繼代次數(shù)，維持了種質(zhì)資源的遺傳性。將保存3年以上的見血青帶根小苗進行常規(guī)煉苗后，移栽到基質(zhì)為經(jīng)5%甲醛水溶液消毒過的腐殖土:沙土 = 2: 1，移栽成苗率90%以上。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)益性在于:對于羊耳蒜屬植物，特別是見血青野生資源，本發(fā)明提供了該屬物種的離體保存方法，為進一步開展該屬物種的離體保存方法的研究，對羊耳蒜屬植物種質(zhì)資源的開發(fā)、利用和保護提供重要的理論來源和技術(shù)支持，能夠解決和緩解對該屬植物的過度采收和其野生環(huán)境的日益遭受破壞的嚴(yán)重問題。
【具體實施方式】
:
[0015]為了更好地說明本發(fā)明的實質(zhì)，下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案和實施例的描述，也許同領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上還可以對本發(fā)明技術(shù)方案進行一些修改和改進。因此，在不偏離本發(fā)明主要技術(shù)方案的基礎(chǔ)上所做的修改和改進，均應(yīng)屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
[0016]實施例1:
[0017]1、材料:見血青(Liparis nervosa (Thunb.exA.Murray) Lindl.)。
[0018]2、材料類別:見血青的種子。
[0019]3、培養(yǎng)條件:(I)種子萌發(fā)培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基為1/2MS(MS大量元素減半，其余成分與MS同)；(2)叢芽增殖培養(yǎng)基:MS+B5維生素+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+肌醇100mg/L ；(3)離體保存培養(yǎng)基:1/2MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L。以上培養(yǎng)基(I)和(2)添加蔗糖20g/L，(3)添加蔗糖40g/L，活性炭l_2g/L。所有培養(yǎng)基均添加瓊脂5.8g/L固化，pH5.8，培養(yǎng)溫度均為25±2°C，光照強度10-20 μ mol/(m2.s)，光照12h/d。所用培養(yǎng)瓶均為白色透明玻璃瓶，直徑7.5cmX高9.0cm,容積約300ml ; (I)和(2)所用的培養(yǎng)基約為40ml，離體保存所用的(3)培養(yǎng)基約為75ml。
[0020]4、生長與分化情況
[0021]4.1外植體的獲得:野外選擇生長發(fā)育良好、沒有病蟲害的見血青(Liparisnervosa (Thunb.exA.Murray) Lindl.)果莢，在果莢成熟未開裂之前采摘帶回實驗室，用紗布將其表面附著物搽