一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，所述牛胚胎體外培養(yǎng)液組成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液。本發(fā)明將海藻糖和大豆甙元組合應(yīng)用于牛胚胎體外，相比于單獨(dú)使用海藻糖或者大豆甙元，可以顯著顯著提高體外胚胎的發(fā)育率，其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液，以及利用所述牛胚胎體外培養(yǎng)液進(jìn)行牛胚胎體外培養(yǎng)的方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代繁殖生物技術(shù)的發(fā)展及胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的逐步完善，利用體外受精技術(shù)生產(chǎn)體外胚胎呈現(xiàn)出潛在的廣闊應(yīng)用前景。家畜胚胎體外生產(chǎn)尤其是體細(xì)胞核移植是快速擴(kuò)大優(yōu)秀種群數(shù)量的有效途徑。雖然通過(guò)體外受精技術(shù)已經(jīng)獲得了活的后代，但體外受精后的早期胚胎體外發(fā)育率較低，限制了胚胎體外生產(chǎn)在實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。
[0003]體內(nèi)早期胚胎的發(fā)育在避光、低氧氣濃度(約7%)的雌性生殖道內(nèi)完成，并且有輸卵管和子宮分泌的粘液保護(hù)。但胚胎的體外培養(yǎng)在約含20%氧氣的培養(yǎng)箱中完成，這種高濃度氧氣將對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激。并且體外胚胎脫離了母體的保護(hù)，不僅會(huì)受到氧化應(yīng)激的損傷，還面臨日光或燈光刺激、滲透壓變化等因素的影響。這些不利因素直接導(dǎo)致了目前體外胚胎的早期發(fā)育率顯著低于體內(nèi)胚胎，已成為體外受精等胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)推廣應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。
[0004]海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子通過(guò)半縮醛羥基縮合而成的非還原性雙糖，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)熱、酸都不敏感，并具有獨(dú)特的生物學(xué)特性、對(duì)生物抗脫水的保護(hù)作用、抗冷凍保護(hù)作用和抗高滲保護(hù)作用，在各種惡劣環(huán)境下，海藻糖表現(xiàn)出對(duì)物種的生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子良好的保護(hù)作用。對(duì)于海藻糖的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。CN103450288A、CN103146779A、CN102965412A、CN102337313A、CN101831474A、CN1807465A 等多種專利申請(qǐng)公開(kāi)了海藻糖的合成或純化方法。CNlOl 181279A、CN1302812C、CN100571707C、CN101443344A等多種專利公開(kāi)了海藻糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。而CN101513221A、CN103250880A等多種專利公開(kāi)了海藻糖用作動(dòng)物飼料添加劑的用途。但到目前為止，尚未見(jiàn)有關(guān)海藻糖用于家畜繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是用于胚胎體外培養(yǎng)的報(bào)道。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，本申請(qǐng)發(fā)明人就海藻糖用于牛胚胎體外培養(yǎng)進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的研究，從而完成了本發(fā)明，該培養(yǎng)液具有緩解體外環(huán)境對(duì)早期胚胎的多種應(yīng)激損傷，提高卵母細(xì)胞體外受精后胚胎發(fā)育率的功能。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液，所述牛胚胎體外培養(yǎng)液組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆式元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL,鏈霉素100 μ g/mL,血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液。
[0008]所述海藻糖已有多種制取方法，屬于已知工藝和成熟技術(shù)，并已有商品出售，較為成熟的生產(chǎn)和銷售廠家有河南華諾海藻生物工程有限公司、武漢富瑞斯凱材料供應(yīng)有限公司、廈門美拉德食品配料有限公司、Sigma公司等。本發(fā)明中所用海藻糖購(gòu)自Sigma公司，純度大于98%。
[0009]所述大豆式兀已有多種制取方法,屬于已知工藝和成熟技術(shù)，并已有商品出售，較為成熟的生產(chǎn)和銷售廠家有西安融升生物科技有限公司、成都新基科技有限公司、Sigma公司等，本發(fā)明中所用大豆甙元購(gòu)自Sigma公司。由于大豆甙元不溶于水，因此通常先用少量有機(jī)溶劑如DMSO溶解之后再進(jìn)行培養(yǎng)基的配制。
[0010]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液組成如下:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述牛胚胎體外培養(yǎng)液組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆式元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL,鏈霉素100 μ g/mL,血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述培養(yǎng)液組成如下:
3.利用權(quán)利要求1所述牛胚胎體外培養(yǎng)液進(jìn)行牛胚胎體外培養(yǎng)的方法，所述方法包括:將受精后的早期牛胚胎用SOF培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，放入所述含海藻糖的牛胚胎體外培養(yǎng)液中，于38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)，進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述早期牛胚胎由牛卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下: (O配制牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL，大豆甙元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL，鏈霉素100 μ g/mL,血清體積百分含量8%~20%，溶劑為M199培養(yǎng)液； (2)將牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100μ L的培養(yǎng)小滴，置38~39°C環(huán)境中預(yù)熱1~3小時(shí)，牛卵母細(xì)胞經(jīng)沖洗后放入預(yù)熱后的培養(yǎng)小滴，在38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)20~24小時(shí)； (3)用受精培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100yL的受精小滴，置38~39°C環(huán)境中預(yù)熱1~3小時(shí)，將儲(chǔ)存在液氮罐中的凍精解凍，然后與步驟(2)培養(yǎng)后的牛卵母細(xì)胞一同放入受精小滴，在38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)15~18小時(shí)，進(jìn)行受精，得到受精后的早期胚胎； (4)配制牛胚胎體外培養(yǎng)液，組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆甙元0.1~10μ g/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100 μ g/mL，血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養(yǎng)液； (5)用步驟(4)牛胚胎體外培養(yǎng)液在一次性塑料培養(yǎng)皿上形成體積為50~100μ L的培養(yǎng)小滴，置38~39°C環(huán)境中預(yù)熱1~3小時(shí)，將受精后的早期胚胎沖洗后，放入培養(yǎng)小滴中，在38~39°C、5%C02的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)所述受精培養(yǎng)液為含5~lOmg/mL肝素的BO液、或者Tyrode’ s改良液。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103881965SQ201410130173
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】王爭(zhēng)光, 李正操, 俞頌東 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)