用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的dna分子標記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的DNA分子標記，以待檢測的葡萄砧木的DNA為模板，以寡聚脫氧核苷酸序列Seq01和Seq02作為引物對，對與葡萄根瘤蚜抗性相連鎖的DNA分子標記進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，對擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果中存在與所述DNA分子標記對應(yīng)的DNA條帶，則說明對應(yīng)的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若電泳結(jié)果中不存在與所述DNA分子標記對應(yīng)的DNA條帶，則說明對應(yīng)的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性。該分子標記可用于葡萄根瘤蚜抗性性狀的DNA分子標記輔助選擇育種；以該特定的DNA分子標記條帶為路標，可以進行葡萄根瘤蚜抗性基因的精細定位或通過染色體步移法接近葡萄根瘤蚜抗性基因，為葡萄根瘤蚜抗性基因的克隆打下基礎(chǔ)。
【專利說明】用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的DNA分子標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)植物育種中的葡萄育種【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于對葡萄毀滅性害蟲葡萄根瘤蚜抗性的快速鑒定的DNA分子標記及其作為葡萄砧木抗根瘤蚜育種的DNA分子標記進行早期輔助選擇在葡萄育種的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]葡萄根瘤蚜是葡萄的一種毀滅性蟲害，主要通過在土壤中取食幼嫩根系危害葡萄。常規(guī)的植保技術(shù)難以防治，目前最有效的預(yù)防方法是采用葡萄根瘤蚜抗性砧木，進行嫁接栽培。然而在葡萄砧木育種過程中，選育的砧木是否具有根瘤蚜抗性，需要進行砧木對葡萄根瘤蚜抗性的鑒定，通常采用葡萄砧木根系人工接種葡萄根瘤蚜后統(tǒng)計感染形成的根瘤數(shù)量進行鑒定，無根瘤形成或根瘤形成數(shù)量少的為具有抗性，形成根瘤數(shù)量多的為感性。但該抗性鑒定需要在特殊的隔離條件下進行以避免蟲害擴散，此外鑒定需要2年以上的重復(fù)試驗鑒定，耗費時間較長，操作過程中的環(huán)境條件可能會影響鑒定結(jié)果的準確性。本發(fā)明專利提供了一種葡萄根瘤蚜抗性的DNA分子標記，可以快速區(qū)分待檢測葡萄砧木有無葡萄根瘤蚜抗性，從而解決葡萄根瘤蚜抗性鑒定需要特定隔離條件、易受環(huán)境條件影響且需要年限較長的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0003]本發(fā)明的目的在于針對已有技術(shù)的不足，提出一種用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的與葡萄砧木根瘤蚜抗性性狀基因緊密連鎖的DNA分子標記。
[0004]為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0005]以待檢測的葡萄砧木的DNA為模板，對與葡萄砧木根瘤蚜抗性相連鎖的DNA分子標記進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，對擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果中存在與所述DNA分子標記對應(yīng)的DNA條帶，則說明對應(yīng)的葡萄砧木具有葡萄砧木根瘤蚜抗性，若電泳結(jié)果中不存在與所述DNA分子標記對應(yīng)的DNA條帶，則說明對應(yīng)的葡萄砧木不具有葡萄砧木根瘤蚜抗性。
[0006]所述DNA分子標記為微衛(wèi)星分子標記。
[0007]所述聚合酶鏈式反應(yīng)擴增采用寡聚脫氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作為引物對，SeqOl具有如SEQ.1D.N0.1所示的核苷酸序列，Seq02具有如SEQ.1D.N0.2所示的核苷酸序列。
[0008]所述DNA分子標記的序列根據(jù)不同品種其長度在3IObp。
[0009]采用本發(fā)明的特定DNA分子標記可對葡萄育種材料進行早期輔助選擇的育種。
[0010]本發(fā)明提供了一種在DNA水平上快速鑒定葡萄砧木對葡萄砧木根瘤蚜有無抗性的DNA分子標記，可以快速區(qū)分葡萄砧木有無葡萄砧木根瘤蚜抗性，解決了現(xiàn)有葡萄砧木根瘤蚜抗性鑒定需要特定隔離條件、易受環(huán)境條件影響且需要年限較長的問題。【專利附圖】

【附圖說明】:
[0011]圖1是本發(fā)明獲得的3IObp的特定DNA分子標記的電泳結(jié)果示意圖。M泳道為DNA分子量標準，泳道I~2分別為無根瘤蚜抗性葡萄砧木華佳8號和刺葡萄；泳道3~6分別依次為已知抗葡萄站木根瘤姆站木品種ric1、boerner、cina、Riparial81g。
【具體實施方式】:
[0012]本發(fā)明提供一種通過檢測與葡萄砧木根瘤蚜抗性性狀基因緊密連鎖的DNA分子標記來判斷葡萄站木根瘤姆抗性是否存在的方法。本發(fā)明基于微衛(wèi)星(Simple sequencerepeat, SSR)分子標記技術(shù)，以本發(fā)明提供的寡聚脫氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作為SSR引物對，以待檢測的葡萄砧木的DNA為模板，對與葡萄砧木根瘤蚜抗性相連鎖的特定DNA片段即DNA分子標記進行聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)擴增，對擴增獲得產(chǎn)物進行電泳檢測后，篩選出了大小約為310bp左右的特定DNA條帶，與葡萄砧木根瘤蚜抗性存在緊密連鎖關(guān)系，即具有該特定DNA條帶的待檢測葡萄砧木具有葡萄砧木根瘤蚜抗性，無該特定條帶的待檢測葡萄無葡萄砧木根瘤蚜抗性。
[0013]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0014](1)采用常規(guī)的CTAB法或SDS法分別提取待檢測葡萄砧木(本次試驗采用的已知具有根瘤姆抗性的葡萄站木品種4個:Ric1、Boerner、cina、Riparial81g ;無根瘤姆抗性的葡萄砧木品種2個:華佳8號、刺葡萄)的葉片、莖段或根系部位的基因組DNA (即樣品DNA，取樣部位不影響檢測結(jié)果的一致性)，CTAB法提取樣品中DNA的步驟如下:①0.4g左右葉片經(jīng)液氮冷凍快速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入2ml離心管中；②立即加入65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液700 μ 1，β -巰基乙醇20 μ 1，劇烈震蕩至充分混勻，置65°C水浴中保溫30min，取出后冷卻至室溫；③加等體積的氯仿/異戊醇=24:1，輕輕地顛倒混勻，于室溫下12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中；④加等體積的氯仿/異戊醇=24:1，輕輕地顛倒混勻，于室溫下12000rpm離心10min,轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中?、菁尤氲润w積經(jīng)_20°C預(yù)冷的異丙醇，輕輕地顛倒混勻至有白色絮狀沉淀出現(xiàn)后，靜置于_20°C 30min使沉淀生成，于40C 12000rpm離心10min，倒掉上清液，保留沉淀物DNA ;⑥加入500 μ I預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA (13000rpm離心lmin)，倒掉上清液，保留沉淀DNA，并重復(fù)本步驟一次；⑦加入500 μ I預(yù)冷的無水乙醇洗滌DNA沉淀(13000rpm離心lmin)，倒掉上清液，沉淀物靜置風(fēng)干后溶于40 μ I ddH20中4°C過夜；⑧取溶解后的樣品DNA0.5 μ I用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA濃度、純度和降解程度。經(jīng)檢測樣品DNA的0D260/280介于1.8-2.0之間、經(jīng)0.7%的瓊脂糖核酸電泳檢測DNA樣品無雜質(zhì)、無明顯降解的條件下，將各待檢測葡萄砧木樣品DNA加水稀釋至終濃度為100 ng/uL待用；
[0015](2)將按照本發(fā)明提供的寡聚脫氧核苷酸序列seqOl和seq02合成的單鏈寡聚DNA，分別加水稀釋成lOumol/L水溶液，序列分別為:
[0016]SeqO1:5，-AAACCTAAAAAATGGAACAAGCC-3 ’
[0017]Seq02:5， -AATGTTCAATCAACTCCATGAGTC-3’
[0018](3)在每個 0.2mL 薄壁 PCR 管中加入:2uL2mmol/L 的 dNTP, 1.7uL25mmol/L 的MgCl2, 2ul 10X taq緩沖液，步驟(2)配置的seq01、seq02溶液各2.0uL,步驟(1)配置的待測樣品DNA溶液2uL,加入Taq聚合酶I個單位,加水至總體積20ul，輕微震蕩混勻，瞬時離心；
[0019](4)把上述離心管置于PCR儀上，執(zhí)行下述程序:94度，5分鐘；94度，60秒，55度，90秒，72度，90秒，循環(huán)35次；72度，5分鐘；程序結(jié)束；
[0020](5)把離心管中的產(chǎn)物進行6%的聚丙烯凝膠電泳或1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，檢查不同待測樣品DNA PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA條帶；
[0021](6)若加入了某一待檢測DNA的泳道有3IObp左右(根據(jù)電泳估計的數(shù)值)這一特定大小的DNA條帶產(chǎn)生，則該待測樣品DNA為來源于具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木植株，若無特定大小(310bp)的DNA條帶產(chǎn)生，則該待測樣品DNA為來源于無根瘤蚜抗性的葡萄砧木植株。
[0022]參見圖1，具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木能夠產(chǎn)生圖1中箭頭所示位置的特定大小的DNA片段所形成的條帶，不具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木不能產(chǎn)生相應(yīng)的所示位置的特定大小DNA片段所形成的條帶。圖1中1、2泳道為已知不具有根瘤蚜抗性的葡萄砧木經(jīng)檢測的結(jié)果，圖中3、4、5、6泳道為已知有根瘤蚜抗性的葡萄砧木經(jīng)檢測的結(jié)果，圖1中的M泳道為分子量標準，圖1中數(shù)字250、200以及150等數(shù)字表示為DNA條帶大小，單位為堿基對(base pair, bp)
[0023]采用無性繁殖的葡萄砧木可以用葉片、根系、莖段在任何季節(jié)提取DNA進行檢測，取樣部位和取樣時間不影響檢測結(jié)果。
[0024]本發(fā)明選擇了已知具有根瘤姆抗性的葡萄站木品種4個(包括Ric1、Boerner、cina、V.Riparial81g)和已知無根瘤姆抗性的葡萄站木品種2個(華佳8號、刺葡萄)進行了試驗，其中泳道I~2:依次為華佳8號、刺葡萄；泳道4~6:依次為Ric1、Boerner、cina、V.Riparial81g。以上材料均采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃。
[0025]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:本發(fā)明可以用于葡萄砧木根瘤蚜抗性性狀的DNA分子標記輔助選擇育種，用于葡萄砧木根瘤蚜抗性育種中的抗性材料的早期選擇和非抗性材料的淘汰；同時，以該特定的DNA條帶為路標，可以進行葡萄砧木根瘤蚜抗性基因的精細定位或通過染色體步移法接近葡萄砧木根瘤蚜抗性基因，從而為葡萄砧木根瘤蚜抗性基因的克隆打下基礎(chǔ)。
[0026]核苷酸序列表
[0027]〈110〉西北農(nóng)林科技大學(xué)
[0028]〈120〉用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的DNA分子標記及其應(yīng)用
[0029]<160>2
[0030]〈210〉I
[0031]<211>23
[0032]<212>DNA
[0033]〈213〉人工合成
[0034]〈400〉I
[0035]aaacctaaaa aatggaacaa gcc23
[0036]<210>2
[0037]<211>24[0038]<212>DNA
[0039]〈213〉人 工合成
[0040]<400>2
[0041]aatgttcaat caactccatg agtc24。
【權(quán)利要求】
1.用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的DNA分子標記，其特征在于:包括以下步驟:以待檢測的葡萄砧木的DNA為模板，以寡聚脫氧核苷酸序列SeqOl和Seq02作為引物對，對與葡萄根瘤蚜抗性相連鎖的DNA分子標記進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，對擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果中存在與所述DNA分子標記對應(yīng)的DNA條帶，則說明對應(yīng)的葡萄砧木具有葡萄根瘤蚜抗性，若電泳結(jié)果中不存在與所述DNA分子標記對應(yīng)的DNA條帶，則說明對應(yīng)的葡萄砧木不具有葡萄根瘤蚜抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的DNA分子標記，其特征在于:所述DNA分子標記是微衛(wèi)星分子標記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的DNA分子標記，其特征在于:所述聚合酶鏈式反應(yīng)采用了寡聚核苷酸序列SeqOl和Seq02作為引物對，SeqOl具有如SEQ.1D.N0.1所 示的核苷酸序列，Seq02具有如SEQ.1D.N0.2所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于葡萄砧木根瘤蚜抗性快速鑒定的DNA分子標記，其特征在于:所述DNA分子標記的序列長度為310bp。
5.一種權(quán)利要求1所述的分子標記的用途，其特征在于:采用上述特定DNA分子標記對葡萄育種材料進行早期輔助選擇的育種。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937885SQ201410129912
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】張軍科, 張娟 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)