專利名稱：：一種根瘤固氮菌株系bxyd3及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種根瘤固氮菌株系BXYD3及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生物固氮是生命科學(xué)中的重大基礎(chǔ)研究課題之一，它在生產(chǎn)實(shí)際中發(fā)揮著重要作用。共生固氮是生物固氮中最重要的一種。豆科植物與根瘤菌的共生由于具有固氮能力強(qiáng)、固氮量大、抗逆能力強(qiáng)等特點(diǎn)，成為生物固氮研究的焦點(diǎn)。國內(nèi)外大量試驗(yàn)證明，接種根瘤菌在多數(shù)土壤中可以提高豆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。接種高效根瘤菌，作為大豆增產(chǎn)的主要措施，在我國北方已得到了大面積的應(yīng)用。當(dāng)前，大豆已成為華南廣大酸性缺磷紅壤很有價值的豆科作物之一。長期以來，雖然大豆在酸性缺磷紅壤區(qū)具有一定的種植面積，但由于南方土壤偏酸性，普通根瘤菌在南方地區(qū)鮮有應(yīng)用。其中一個原因是接種根瘤菌劑，遇到了根瘤菌能否耐酸和耐鋁的問題。為了提高根瘤菌的結(jié)瘤率和固氮效果，必須選育耐酸、耐鋁的根瘤菌株以適應(yīng)酸性土壤條件，這樣才能獲得高產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種根瘤固氮菌株系統(tǒng)BXYD3，該根瘤固氮菌株系是慢生根瘤菌屬的新菌株系，具有耐酸鋁、高效固氮的特點(diǎn)。本發(fā)明的另一個目的是提供上述根瘤固氮菌株系BXYD3在豆科植物共生固氮中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明公開的根瘤固氮菌株系BXYD3已于2007年7月28號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:M207123。一、根瘤固氮菌株系BXYD3的分離1)取新鮮根瘤，用水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分；2)放入95%的酒精中處理3分鐘，再放入0.1免HgCl2中，滅菌35分鐘，取出后用無菌水沖洗56次；3)在用火焰滅過菌的載玻片上切成兩半，用無菌鑷子夾住半個瘤，切口面向YMA培養(yǎng)基表面劃線，YMA培養(yǎng)基的配方如表1所示，倒置后在28。C下培養(yǎng)；表lYMA(YeastMannitolAgar)培養(yǎng)基配方(L")試劑名用量試劑名用量甘露醇10gK2HP040.25gMgS04-7H200.2gKH2P040.25gNaClO.lgCaC033g(保存時加)酵母粉3g瓊脂15g4)待長出菌體后，先根據(jù)以下兩個方面初步判斷是否為根瘤菌:①菌落形態(tài)根瘤菌的菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊、粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)35天菌落直徑達(dá)24rnrn為快生型根瘤菌，培養(yǎng)710天菌落才1mm的為慢生型根瘤菌。②菌體形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從中挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3),的小桿菌。內(nèi)常含J3-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆粒或使菌體呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G-)，無芽孢，菌體單個或成對。5)根據(jù)上述兩個方面，從平板上挑選形態(tài)上像根瘤菌的菌落在平板上劃線培養(yǎng)。3天之后觀察菌落情況，一直觀察到15天，因?yàn)槁鼍?15天出現(xiàn)菌落。二、根瘤固氮菌株系BXYD3的性質(zhì)1、形態(tài)特征本菌株在菌落形態(tài)上，均為慢生型，圓形較小、乳白色、半透明、粘質(zhì)較多。在YMA平板上生長57天后的直徑為0.82.0mm。2、培養(yǎng)特性該菌的最適生長條件為pH=7.0，溫度28。C，轉(zhuǎn)速180r/min。能夠利用廣泛的炭源和氮源。3、生理特性經(jīng)革蘭氏染色反應(yīng)鏡檢均為G.，呈小短桿狀。4、功能特性根瘤固氮菌株系BXYD3具有固氮能力強(qiáng)、固氮量大、抗逆能力強(qiáng)、耐酸鋁等特點(diǎn)。當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時，對人、動物和植物無害，不會污染環(huán)境，反而增加了土壤間根瘤菌的群體，對豆科植物的結(jié)瘤固氮有促進(jìn)的作用。三、根瘤固氮菌株系BXYD3的16SrDNA序列測序?yàn)榱髓b定根瘤菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，對所分離的菌株的16SrDNA序列進(jìn)行測序。首先提取菌株的總DNA，然后進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢驗(yàn)后，用于序列測定。測序結(jié)果如SEQIDNO:l所示。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取了8個參比菌株，應(yīng)用軟件GeneDoc和TREECONW對分離菌株和參比菌株的16SrDNA部分序列進(jìn)行了分析，構(gòu)建了分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖，得到反映待測大豆根瘤菌株與參比菌株之間進(jìn)化與發(fā)育關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定分離出來的根瘤固氮菌株系BXYD3為慢生根瘤菌屬(Sra々r/^W的新菌株系，并命名為華固3號。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXYD3具有耐酸鋁、高效結(jié)瘤的特性，接種該根瘤菌至少能夠提高大豆產(chǎn)量20-30%，可用于實(shí)際生產(chǎn)；2.通過接種本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXYD3，能達(dá)到改善大豆氮營養(yǎng)，從而達(dá)到大豆高產(chǎn)并且培肥土壤的目的；3.本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXYD3適用于華南酸性土壤地區(qū)，作為大豆常規(guī)栽培的措施之一。圖1為根瘤固氮菌株系BXYD3在YMA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；圖2為根瘤固氮菌株系BXYD3經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下的觀察圖像；圖3為根瘤固氮菌株系BXYD3的16SrDNA部分序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖4為大試管紙培裝置；其中，圖3中方框內(nèi)為根瘤固氮菌株系BXYD3。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1根瘤固氮菌株系BXYD3的分離和純化取新鮮根瘤，用水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分。先放入95%的乙醇中處理3分鐘，取出用無菌水沖洗56次，再放入0.2免HgCl2滅菌5分鐘，取出用無菌水沖洗56次。然后在用火焰滅過菌的載玻片上切成兩半，用無菌鑷子夾住半個瘤，切口面向YMA(表1)培養(yǎng)基表面劃線，倒置后在28'C下培養(yǎng)。待長出菌體后，從平板上挑選形態(tài)上像根瘤菌的菌落在平板上劃線培養(yǎng)。3天之后觀察菌落情況，一直觀察到15天，因?yàn)槁鼍?15天出現(xiàn)菌落。根據(jù)以下兩個方面可初步判斷是否為根瘤菌①菌落形態(tài)根瘤菌的菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊，粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)35天菌落直徑達(dá)24mm為快生型根瘤菌，培養(yǎng)710天菌落才lmm的為慢生型根瘤菌。②菌體形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從中挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3)Mm的小桿菌。內(nèi)常含P-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆?；蚴咕w呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G—)，無芽孢，菌體單個或成對。如菌落菌體均像根瘤菌，則將標(biāo)記好的那個菌落接入試管斜面培養(yǎng)保存。本實(shí)施例的菌株均為慢生型，在菌落形態(tài)上為圓形較小、乳白色、半透明、粘質(zhì)較多；在YMA平板上生長57天后的直徑為0.82.0mm(圖1);最適生長條件為pH=7.0，溫度28。C，轉(zhuǎn)速180r/min，能夠利用廣泛的炭源和氮源；經(jīng)革蘭氏染色反應(yīng)鏡檢均為G—，呈小短桿狀(圖2)。利用這個分離純化的方法，經(jīng)過若干代反復(fù)純化，在固體培養(yǎng)基YMA(表l)中劃線培養(yǎng)，得到多株純菌，純菌經(jīng)過回接試驗(yàn)驗(yàn)證其結(jié)瘤固氮能力，本實(shí)施例分離純化到耐酸鋁高效根瘤固氮菌株系BXYD3。實(shí)施例2根瘤固氮菌株系BXYD3的16SrDNA序列測序提取菌株的總DNA，進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢驗(yàn)后，送到英駿公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果如SEQIDNO:l所示。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取了8個參比菌株，應(yīng)用軟件GeneDoc和TREECONW對分離菌株和參比菌株的16SrDNA部分序列進(jìn)行分析，構(gòu)建分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖，如圖3所示，從而確定分離出來的根瘤固氮菌株系BXYD3為慢生根瘤菌屬(Sm￡fyrWw&"m)的新菌株系，并命名為華固3號。實(shí)施例3回接試驗(yàn)回接試驗(yàn)復(fù)證采用上述的大試管紙培裝置(圖4)，大豆種子處理也如前所述。菌液培養(yǎng):用接種環(huán)在試管中挑一環(huán)根瘤菌到TY液體培養(yǎng)基中，TY液體培養(yǎng)基的配方如表2所示，用棉塞塞好后，用牛皮紙密封，放在震蕩器上培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約46天)，培養(yǎng)溫度為28r。表2TY液體培養(yǎng)基(/L)試劑名用量試劑名用量胰蛋白胨5g酵母酶解粉3gCaCl22H200.7g接種處理將催好芽的種子放到培養(yǎng)皿中用菌液浸泡15分鐘，用鑷子將種苗栽種在濾紙與管壁之間，每棵種苗加入菌液l-2mL，保證每棵種苗的接菌量達(dá)到1.0乂109個以上。另設(shè)不接種處理作為對昭。培養(yǎng)條件及測定指標(biāo)培養(yǎng)條件如前所述，放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察及補(bǔ)加營養(yǎng)液。移苗后30天收獲，觀察大豆的結(jié)瘤情況。以磷效率差異顯著的2個大豆基因型作為供試材料，其中巴西10號(BX10)為磷高效基因型，本地2號(BD2)為磷低效基因型。根瘤菌采用回接時固氮酶活性較高華固3號(根瘤固氮菌株系BXYD3)，另設(shè)不接種作為對照。本試驗(yàn)設(shè)兩個P水平(LP:2]Limol/L;HP:1000jimol/L)，統(tǒng)一進(jìn)行低氮處理(LN:50拜ol/L)。營養(yǎng)液的pH值模擬酸性紅壤中的酸度，調(diào)節(jié)pH值至5.5。每個處理設(shè)4個重復(fù)。從表3(不同營養(yǎng)條件下接種不同根瘤菌對大豆地上部干重的影響)和表4(低氮條件下接種不同根瘤菌對地上部干重的影響)中可以看出，在低氮處理下，接種根瘤菌能顯著提高大豆的地上部干重，并且不同品種對接種根瘤菌的反應(yīng)也具有基因型差異?？傮w而言，本地2號接種根瘤菌的效果好于巴西10號。在LNLP條件下，接種華固3號對本地2號品種有較好的效果；在LNLP和LNHP處理下，與對照(不接種處理)相比分別提高了22.42%、48.1%。表3不同營養(yǎng)條件下接種不同根瘤菌對大豆地上部干重的影響地上部干重(g/plant)基因型菌株LNLPLNHP本地2號CK0.158±0.0170.151±0.019華固3號0.193±0.0170.234±0.016巴西10號CK0.148±0.0230.148±0.021_華固3號_0.180±0.012_0.185±0扁_注LNLP表示低氮低磷、LNHP表示低氮高磷；表4低氮條件下接種不同根瘤菌對地上部干重的影響一基因型處理華固3號—本地2號LNLP22.42%LNHP48.腦巴西10號LNLP21.62%_LNHP_25.00%注LNLP表示低氮低磷、LNHP表示低氮高磷；表中百分?jǐn)?shù)為接種根瘤菌后與對照(LNLP不接種處理)相比提高的百分?jǐn)?shù)；計算公式為:(R-CK)/CK*100%。實(shí)施例4土培回接試驗(yàn)本試驗(yàn)供試大豆品種為6個，其中4個是由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)中心培育出的國審品種華春l號(HC-1)、華春2號(HC-2)、華夏1號(HX-1)、華夏3號(HX-3)，另外2個品種為巴西10號(BX10)和本地2號(BD2)。試驗(yàn)于2006年10月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)中心溫室中進(jìn)行。將采集的土壤風(fēng)干過篩后放在高壓滅菌鍋中滅菌。本試驗(yàn)選用我們分離出來的根瘤固氮菌株系BXYD3(華固3號)，另設(shè)不接種處理作為對照。試驗(yàn)設(shè)有2個氮水平處理低氮處理(LN,不施氮)和高氮處理(HN，5000(imol/L)。營養(yǎng)液配方如大試管紙培試驗(yàn)，磷處理采用HP水平，其它操作同上。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，4個重復(fù)。把經(jīng)過消毒、催芽的大豆種子播種于塑料盆土壤中。每盆播種3棵，播種一周后進(jìn)行間苗，每盆只保留一棵長勢健壯的幼苗。間苗后，把培養(yǎng)好的根瘤菌菌液接種到幼苗的根部，每棵種苗加入菌液l2mL，保證每棵種苗的接菌量達(dá)到1.0Xl(f個以上。植株生長45天后收獲，取樣及各項(xiàng)指標(biāo)的測定同紙培試管試驗(yàn)。由表5(接種根瘤菌對不同大豆品種地上部干重(g/plant)的影響)中可以看出，不同大豆品種接種根瘤菌后，對大豆地上部干重的影響具有極顯著的基因型差異(F=31.23***)。在低氮處理下，接種根瘤固氮菌株系BXYD3后各個品種地上部干重均比對照的高；氮處理對地上部千重影響顯著，高氮處理下大豆的地上部干重顯著高于低氮處理下大豆的地上部干重。接種根瘤固氮菌株系BXYD3對大豆地上部干重影響也極顯著，并且氮與根瘤菌株系之間具有極顯著的交互作用。在高氮處理下，接種根瘤固氮菌株系BXYD3對大豆地上部干重影響不顯著。表5接種根瘤菌對不同大豆品種地上部干重(g/plant)的影響基因型一氮7jC平菌株BD2BXIOHC-1HC-2HX-1HX-3~0.39±0.030.66±0.020.59±0.040.69±0.160.88±0.081.02±0.02華固3號0,62±0.110.50±0.071.26±0.130.87±0.120.99±0.11HNCK0.95±0.030.92±0.091.18±0.081.20±0.111.23±0.071.34±0.14華固3號0.85±0.051.04±0.111.12±0.081.21±0.031.13±0.02F值GNRGxNGxRNxRGxNxR亂匕tFF重31.23***105.75***5.28**1.42ns1.22ns4.25*1.92ns注l)LN:低氮處理；HN:高氮處理；2)G表示基因型；N表示氮處理、R表示根瘤菌；GXR表示基因型與根瘤菌的交互作用；GXN表示基因型與氮處理的交互作用；NXR表示磷處理與根瘤菌的交互作用；GXNXR表示基因型、氮處理和根瘤菌三者的交互作用；3)*:0.0KPO.05;**:0.001<P<0.01;***:PO.001;ns:差異不顯著。實(shí)施例5田間接種試驗(yàn)本試驗(yàn)在廣東省湛江市遂溪大華農(nóng)場進(jìn)行。播種時期為2007年1月2728日。本試驗(yàn)設(shè)有2個處理接根瘤固氮菌株系BXYD3(華固3號)與不接根瘤菌劑處理，同時按50kgP/ha的施肥量施用磷肥，磷肥以底肥的方式按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)一次性施入。本試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，起壟栽培，播種密度為40cmxl0cm(行距x株距)。播種、施肥、灌溉、雜草及病蟲害按大豆常規(guī)管理執(zhí)行。第一次田間調(diào)查在大豆的開花結(jié)實(shí)期進(jìn)行，調(diào)査了單株平均株高、單株瘤重、結(jié)瘤數(shù)(結(jié)果見表6)、平均單株地上部干重、根干重、結(jié)莢數(shù)(結(jié)果見表7)。表6根瘤菌劑對大豆根瘤生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表6可見，接種根瘤固氮菌株系BXYD3能夠促使大豆結(jié)瘤。接種處理與不接種處理的根瘤個數(shù)與根瘤干重均存在著顯著性差異。從單株根瘤個數(shù)和根瘤干重的結(jié)果來看，接種處理達(dá)到較顯著水平(根瘤個數(shù)F產(chǎn)13.88材；根瘤干重F產(chǎn)10.25材)。由于湛江大華農(nóng)場前作是甘蔗，土著根瘤菌幾乎不存在，所以做了不接種處理的大豆沒有結(jié)瘤。接種處理的單株平均株高要比不接種處理的平均株高要高一些，這有利于提高大豆的產(chǎn)量。從試驗(yàn)結(jié)果說明施用根瘤菌劑對于改良土壤，利用根瘤菌的固氮能力來提供作物的需氮量有很大的意義。表7根瘤菌劑對大豆植物生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表7可見，施用大豆根瘤固氮菌株系BXYD3有明顯的增產(chǎn)效果，接種處理的大豆地上部干重明顯比不接種處理的高，增加的幅度大概是49.5~154.5%之間；同時，接種處理的根干重比不接種的高。是否接種對于結(jié)莢數(shù)有顯著的影響。接種處理能夠增加部分品種的結(jié)莢數(shù)，增加幅度是91.5116.6%之間。但對于粵春04-5的結(jié)莢數(shù)來說，接種效果不是很明顯；同時粵春04-5的地上部干重的增幅也不是很大。從單株地上部干重與根干重的結(jié)果來看，接種處理和品種之間的差異均達(dá)到極顯著水平(地上部干重F產(chǎn)23.81襯氣FG=13.9***;根干重5=29.94***^(3=8.67**);從單株結(jié)莢數(shù)結(jié)果來看，接種處理和品種之間的差異均達(dá)到顯著水平(Ff7.8*，F(xiàn)G=6.88*)。本試驗(yàn)研究表明，在不施用氮肥的情況下，單純使用根瘤固氮菌株系BXYD3有較明顯的增產(chǎn)效果，可見由本研究室研制出來的根瘤固氮菌株系BXYD3可以用于大面積的推廣施用。田間接種試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤固氮菌株系BXYD3后，植株干重、根瘤重、結(jié)莢數(shù)和產(chǎn)量均高于不接種對照。大豆接種根瘤固氮菌株系BXYD3有增產(chǎn)增效的效果。一種根瘤固氮菌株系BXYD3及其應(yīng)用.txtSEQUENCELISTING〈110〉華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種根瘤固氮菌株系BXYD3及其應(yīng)用<130〉<160>1〈170>Patent.Inversion3.2<210>1<211〉874〈212〉DNA〈213〉根瘤菌(BradyrhiMbiura)<400〉1tcagccatgcCgCgtg3gt.gatgaaggccctagggttgta犯gctcttttgtgCggg33g60ataatgacggtaccgcaagaat.aagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaat.a120cg犯gggggctagcgtt.gct.cggaatcactgggcgtaaagggtgcgtaggcgggtcttta180agtcaggggtga犯tcctggagctcaactccagaactgcctttgatactgaagatcttga240ggtgagtggaactgcgagtgattcgtagatattcgcaaga300acaccagtggc卿ggcggctcactggcccgatactgacgctgaggcacgaaagcgtggg360gagcaaacagcctggtagtccacgccgt犯acgatgaatgccagccgtta420gtgggtttactcactagtggcgcagctaacgctttaagceittccgcctggggagtacggt480CgC33gattaaaactc犯aggaattgacgggggcccgcac卿cggtggagcatgtggtt540taattcgacgcaacgcgcagaaccttaccagccctt.gacatcccggtcgcggactccaga600gacggagttcttcagttcggctggaccggsgcatggctgtcgt.cagctcg660tgtcgtgagatgttgggtt.3agtcccgcaacgagcgcaacccccgtcctt3gttgCt3CC720atttagttgagcactctaaggagactgccgggtgataagcCg3gg犯ggtgggg"g3Cg780tcgagtcct.catggccct.tacgggctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacaatg840ggatgct卿gggcgacctcttxgcaaatctC3￡l87權(quán)利要求1、一種根瘤固氮菌株系BXYD3，該菌株系屬于慢生根瘤菌屬，于2007年7月28號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CGMCCNOM207123。2、權(quán)利要求1所述的根瘤固氮菌株系BXYD3在豆科植物共生固氮中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種根瘤固氮菌株系BXYD3及其應(yīng)用，該菌株系是通過不同大豆品種分別捕捉土壤中的根瘤菌，從新鮮根瘤中對根瘤菌進(jìn)行分離和純化，并對菌株的16SrDNA部分序列進(jìn)行測定，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，確定為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)的新菌株系，并命名為華固3號。本發(fā)明的根瘤固氮菌株系BXYD3通過實(shí)驗(yàn)室盆栽、田間回接試驗(yàn)證明其具有耐酸鋁、高效結(jié)瘤的特性，接種該根瘤菌能夠提高大豆產(chǎn)量20～30％以上，可適用于華南酸性土壤地區(qū)，作為大豆常規(guī)栽培的措施之一。文檔編號C12N1/20GK101182476SQ200710032269公開日2008年5月21日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者嚴(yán)小龍,紅廖,曹桂芹申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)