專利名稱：：一種根瘤固氮菌株系ry5菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物營養(yǎng)和牧草栽培
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種生物固氮技術(shù)，尤其是涉及一種能使柱花草高效結(jié)瘤并達(dá)到高產(chǎn)的根瘤菌。
背景技術(shù)：
：柱花草(StylosanthesguianensisSW.)又名熱帶苜蓿、巴西苜蓿，原產(chǎn)于南美洲。1982年中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院引自國際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)，并在海南試種成功，現(xiàn)在已大面積推廣于華南各省(區(qū))。柱花草在盛花期的干物質(zhì)中含粗蛋白質(zhì)16.020.0%，粗脂肪1.82.5%，租纖維17.019.0%，無氮浸出物38.044.0%，粗灰分8.010.0%，是一種優(yōu)良的熱帶豆科牧草。中國南方如廣東、廣西等省(區(qū))，將柱花草與果樹間種，除了用于飼草外，還可起到覆蓋、保持水土和改土培肥的作用。如果與禾本科牧草如狗尾草等混播，可建成良好的人工草地用于放牧。柱花草通常選擇排水良好、土層深厚、土質(zhì)較好的沙壤或壤土種植。但在貧瘠土壤中，柱花草幼苗不能形成根瘤，或僅有一些由土著根瘤侵染形成的無效根瘤，在貧瘠的土地上豆科植物結(jié)種根瘤菌可增加產(chǎn)量1550%。為提高柱花草結(jié)瘤率，固氮肥土，宜用柱花草根瘤菌拌種，可有效提高柱花草的結(jié)瘤率。因此篩選能使柱花草高效結(jié)瘤并達(dá)到高產(chǎn)的根瘤菌具有重要的意義。柱花草以其高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及耐粗放管理的特性在引進(jìn)后很快成為我了我國南方豆科牧草的主推品種。在柱花草引進(jìn)之初由于種植地土壤中柱花草土著菌的含量極低，柱花草不能很好的結(jié)瘤固氮，主要依靠施肥獲得高產(chǎn)。這樣就不能體現(xiàn)出真正的高產(chǎn)和耐粗放管理。目前我國還沒篩選出適合于我國氣候土壤條件的菌株，故從我國種植柱花草的不同類型土壤條件的土著菌中篩選適合于特定區(qū)域的柱花草高效固氮根瘤菌有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種根瘤固氮菌株系RY5，一種能使柱花草高效結(jié)瘤并達(dá)到高產(chǎn)的根瘤菌。本發(fā)明人于2009年2月于廣西柳州百棚畜牧場(N=24°06.120'，E=109°18.00'，H=125m)采集到一株經(jīng)嚴(yán)冬后仍然存活的柱花草根瘤。剪掉柱花草地上部分將整個(gè)根系連同根瘤一起裝入保鮮袋后置于冰袋中低溫保存。經(jīng)分離及純化得到一種根瘤固氮菌株系RY5(Bradyrhizobiumsp.RY5)，于2009年11月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNo:M209269。其16sDNA序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY5的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)將采集到的根瘤，剪掉柱花草地上部分將整個(gè)根系連同根瘤一起裝入保鮮袋后置于冰袋中低溫保存，以備后續(xù)的分離和純化操作。具體的分離及純化過程包括以下步驟(1)將柱花草的根系沖洗干凈，將根瘤帶2mm的根剪下于培養(yǎng)皿中用2級(jí)水將表面沖洗干凈；3(2)將沖洗干凈的根瘤滅菌后搗碎，蘸取乳白色汁液在YMA固體培養(yǎng)基上劃線，將劃好的板倒置于保鮮袋中置于28士rc培養(yǎng)箱黑暗中培養(yǎng)；(3)在培養(yǎng)的第3天開始檢查培養(yǎng)基上是否有長出菌落，直至第15天左右，將菌落標(biāo)記出來記錄形態(tài)和光澤度；(4)排除非根瘤菌菌落后根據(jù)上述標(biāo)記的菌落將生長單菌落的時(shí)間相差3天以上的菌落及板上生長形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色不一致的菌落挑出，在新的YMA培養(yǎng)基上劃板并編號(hào)。每一次對(duì)新劃板的菌落都采用上述方法進(jìn)行一次純化直至同一塊板上的菌落生長形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色一致為止。通過逐級(jí)純化將純化后的板進(jìn)行鏡檢和回接后劃入YMA斜面中保存。所述菌株菌落形態(tài)根瘤菌生長初期菌落水樣的半透明或白色不透明點(diǎn)狀物后期菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊、粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)24天菌落直徑達(dá)24mm為快生型根瘤菌，培養(yǎng)510天菌落才lmm的為慢生型根瘤菌。菌體形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從中挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，在100倍顯微鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3)iim的小桿菌。內(nèi)常含D-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆粒或使菌體呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G-)，無芽孢，菌體單個(gè)或成對(duì)。本發(fā)明同時(shí)提供了所述根瘤固氮菌株系RY5菌株回接柱花草的方法，包括以下步驟(1)將分離純化出來的根瘤RY5用無菌水洗入液體YMA培養(yǎng)基中，用封口膜封口，在搖床中180r/min搖菌3天后測定菌液的OD值，當(dāng)OD大于0.6時(shí)得菌液；(2)將柱花草種子在95%(體積比濃度)的乙醇中浸泡后在用0.1%(質(zhì)量體積濃度，O.lgHgCl2/100ml水)的HgCl2溶液處理，用無菌水沖洗，排放于培養(yǎng)皿中滅菌的發(fā)芽紙上，用滅菌的O.05mmol/L硫酸鈣溶液浸濕發(fā)芽紙，放在28t:的培養(yǎng)箱中黑暗催芽3天，待苗長到4厘米時(shí)移入滅菌沙培箱中；(3)從步驟(2)所述沙培箱中選取壯實(shí)的苗用步驟(1)制備得到的菌液浸泡15分鐘后栽種在裝滿滅菌砂的花盆中，每棵種苗加入菌液12ml，保證每棵種苗的接菌量達(dá)到1.0X109個(gè)以上。大約四周后檢查結(jié)瘤情況，結(jié)瘤則為根瘤菌。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY5制備得到的菌劑。將保存的菌活化于平板上，待平板上最后一筆菌長出來后將菌洗入液體YMA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌(28士rC、180轉(zhuǎn)/分鐘)得到的菌懸液(含菌量大于1.0Xl(f個(gè))拌種、直接回接到植物根部或拌土。也可以按比例混合菌體吸附材料制成菌劑使用，所述菌體吸附材料優(yōu)選草炭、蛭石或珍珠巖等；所述比例優(yōu)選10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠巖。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供柱花草接種所述根瘤固氮菌株系RY5菌的方法。所述根瘤固氮菌株系RY5菌通過搖菌制備得到液體菌劑可在播種前用菌液浸種、育苗前浸泡植株根部、移植后澆于柱花草根部土壤中，也可以將菌液混合菌體吸附材料例如草炭、蛭石、珍珠巖等制成菌劑移植前混施于土壤中。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的RY5根瘤菌在酸性條件下生長很好，并且在無菌沙培條件下施用液體菌劑能使TPRC2、TPRC5的產(chǎn)量是不接菌的2.4倍和3.7倍。在大田土壤條件下產(chǎn)量也分別是不接菌的3.1倍和2.3倍。RY5具有耐酸性和高產(chǎn)的品質(zhì)比較適合于我國南方的酸性紅壤地區(qū)。在上述地區(qū)施用RY5根瘤菌不但可以大幅度的提高柱花草產(chǎn)量和質(zhì)量，還能改變土壤的酸性環(huán)境。圖1根瘤菌RY5回接檢驗(yàn)圖圖2根瘤菌RY5菌落圖圖3根瘤菌RY5革蘭氏染色圖片圖4回接根菌RY5后TPRC2、TPRC5兩個(gè)品種柱花草生長情況圖5RY5瓊脂糖凝膠電泳圖圖6NCBI比對(duì)圖圖7RY5根瘤菌聚類分析圖圖8回接RY5TPRC2、TPRC5鮮重圖圖9回接RY5TPRC2、TPRC5干重圖圖10RY5根瘤菌在不同酸性條件下的生長曲線圖11施用RY5草炭菌劑后TPRC2、TPRC5干重圖圖12RY5在不同鹽濃度中的生長情況具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)例1根瘤菌RY5的獲得和培養(yǎng)本發(fā)明人于2009年2月于廣西柳州百棚畜牧場(N=24°06.120'，E=109°18.00'，H=125m)采集到一株經(jīng)嚴(yán)冬后仍然存活的柱花草根瘤。剪掉柱花草地上部分將整個(gè)根系連同根瘤一起裝入保鮮袋后置于冰袋中低溫保存。經(jīng)分離及純化得到一種根瘤固氮菌株系RY5(Bradyrhizobiumsp.RY5)，于2009年11月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO:M209269。(1)從冰袋中取出柱花草的根系在自來水下沖洗23遍將根系沖洗干凈，用剪刀將新鮮完整、顏色暗紅的根瘤帶2mm的根剪下于培養(yǎng)皿中用2級(jí)水將表面沖洗干凈；此過程要確保根瘤表面的完整。(2)將沖洗干凈的根瘤轉(zhuǎn)移到滅菌后的培養(yǎng)皿中，加入95%的酒精浸泡5分鐘后，將酒精倒出，用無菌水沖洗45次，加入0.1%(質(zhì)量體積濃度，O.lgHgCl2/100ml水)的HgCl2溶液滅菌23分鐘，迅速將HgCl2倒出并加入無菌水，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈工作臺(tái)操作，用無菌水沖洗6遍以上，將無菌水倒出，選取根瘤轉(zhuǎn)移至滅菌后的培養(yǎng)皿中(可在火焰上滅菌)，用滅菌后的鑷子和接種環(huán)將根瘤搗碎，蘸取乳白色汁液在準(zhǔn)備好的YMA固體培養(yǎng)基上劃線。將劃好的板倒置于保鮮袋中置于培養(yǎng)箱(28士rc、黑暗)中培養(yǎng)。YMA培養(yǎng)基配方如表1:表lYMA(YeastMannitolAgar)培養(yǎng)基配方(L—0<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)在培養(yǎng)的第3天開始檢查培養(yǎng)基上是否有長出菌落，直至第15天左右，將菌落標(biāo)記出來記錄形態(tài)和光澤度。在培養(yǎng)過程中從以下三點(diǎn)來確定是否為根瘤菌a.菌落形態(tài)根瘤菌生長初期菌落水樣的半透明或白色不透明點(diǎn)狀物后期菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊、粘質(zhì)或多或少。培養(yǎng)24天菌落直徑達(dá)24mm為快生型根瘤菌，培養(yǎng)510天菌落才1mm的為慢生型根瘤菌。b.菌體形態(tài)標(biāo)記初步確認(rèn)為根瘤菌菌落，從中挑取菌苔涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，在100倍顯微鏡下觀察。根瘤菌為(0.50.9)X(1.20.3)iim的小桿菌。內(nèi)常含D-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆?；蚴咕w呈環(huán)節(jié)狀，革蘭氏陰性(G-)，無芽孢，菌體單個(gè)或成對(duì)。C.通過將分離出的根瘤菌在無菌條件下回接到柱花草上，能結(jié)瘤的則為根瘤菌。根瘤菌RY5的形態(tài)特征根瘤菌RY5為慢生根瘤菌屬的一種，培養(yǎng)50個(gè)小時(shí)后沿第一筆涂布的痕跡開始有水樣帶狀半透明的突起，到第4天以后突起開始明顯并逐漸獨(dú)立成為單獨(dú)的菌落，第5天后最后一筆出現(xiàn)1.02.Omm的菌落圓形，邊緣完整，表面光滑，凸起水珠狀，無色透明度極高，粘性分泌物較少。見附圖2所示RY5根瘤菌菌落。RY5號(hào)的最適生長條件為溫度28°C，pH=4.86.O，轉(zhuǎn)速180r/min.能夠廣泛的應(yīng)用碳原和氮原，在各種植物來源的綜合抽提液上能很好的生長，在YMA培養(yǎng)基上比在蛋白胨培養(yǎng)基上生長好。根瘤菌RY5的生理特性根瘤菌RY5經(jīng)革蘭氏染色在顯微鏡下呈紫色，形狀為小短桿狀體，大小為0.50.9iimX1.23.0iim，細(xì)胞單個(gè)或成對(duì)，?？梢姵扇号帕?。為革蘭氏陰性菌。見附圖3所示根瘤菌RY5革蘭氏染色圖片。(4)排除非根瘤菌菌落后根據(jù)上述標(biāo)記的菌落將生長單菌落的時(shí)間相差3天以上的菌落及板上生長形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色不一致的菌落挑出在新的培養(yǎng)基上劃板并編號(hào)。每一次對(duì)新劃板的菌落都采用上述方法進(jìn)行一次純化直至同一塊板上的菌落生長形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色一致為止。通過逐級(jí)純化將純化后的板進(jìn)行鏡檢和回接后劃入YMA斜面中保存。(5)回接驗(yàn)證柱花草根瘤菌a.菌液的準(zhǔn)備將分離純化出來的根瘤RY5用無菌水洗入準(zhǔn)備好的液體YMA培養(yǎng)基中，用封口膜封口，在搖床中180r/min搖菌3天后測定菌液的OD值，當(dāng)OD大于0.6時(shí)(即每ML菌液含菌量多于1.0X109個(gè))即得菌液，可用于回接。所述液體YMA培養(yǎng)基是在表1的培養(yǎng)基中將瓊脂除去，并調(diào)節(jié)ra值為7。b.無菌種苗的準(zhǔn)備精選柱花草種子數(shù)粒在95%的乙醇中浸泡5分鐘，取出后在0.1%的他(]12中處理5分鐘，用無菌水沖洗510遍，然后排在滅過菌、放好發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿中，用滅過菌的0.05mmol/L硫酸鈣溶液浸濕發(fā)芽紙，放在28°C的培養(yǎng)箱中黑暗催芽3天。待苗長到4厘米時(shí)候把苗移入準(zhǔn)備好的滅過菌的沙培箱中，待用。c.回接從沙培箱中選取壯實(shí)的苗放到培養(yǎng)皿中用步驟(5)a制備得到的菌液浸泡15分鐘，用鑷子將種苗栽種在裝滿滅菌砂的小花盆中，每盆中呈菱形狀栽植4株，每棵種苗加入菌液12ml，保證每裸種苗的接菌量達(dá)到1.0X1(^個(gè)以上。大約四周后拔起苗查看是否結(jié)瘤，結(jié)瘤則為根瘤菌。根瘤RY5經(jīng)回接檢驗(yàn)后結(jié)瘤明顯，可證明分離物為純的根瘤菌。見附圖1所示根瘤菌RY5回接檢驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例2根瘤菌RY5的16SrDNA序列測序及類別的確定為了確定根瘤菌RY5的系統(tǒng)發(fā)育地位，對(duì)所分離得到的菌株的16SDNA系列進(jìn)行測序。首先利用omega公司的試劑盒進(jìn)行總DNA的提取(此方法不是常規(guī)的方法，用試劑盒提取是一種高效、便捷的方法，但和常規(guī)方法相比成本有點(diǎn)稍高)，然后利用引物進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增。上游引物35fc:CTKAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAAC;下游引物1492r:TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。反應(yīng)條件如下PCR反應(yīng)>Primer:35fc，1492r>PCRrecipe:10XReactionBuffer5.0iiLd證s(10mM)1.0iiLP35fc(25Pmo1)引物0.5iiLP1492r(25Pmo1)引物0.5iiLTaqDNA聚合酶(5u/iiL)1.OiiL模板DNA1.0iiL補(bǔ)超純水至41iiL>PCRprocedure94t:預(yù)變性3min94t:變性50s56。C退火50s35個(gè)循環(huán)72。C延伸60s72t:最后延伸5min擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢驗(yàn)結(jié)果見附圖5所示RY5瓊脂糖凝膠電泳圖，送北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQIDNOl所示。將所得的序列結(jié)果在美國美國國立生物信息中心(NCBI)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)根瘤菌菌株RY5與已知菌株AY628222BradyrhizobiumSP.PAV40相似性達(dá)99%，見附圖6所示NCBI比對(duì)圖。應(yīng)用軟件DNAStar和TREEC0麗對(duì)所測的菌株進(jìn)行聚類，見附圖7所示RY5根瘤菌聚類分析圖。由比對(duì)結(jié)果和聚類圖可知RY5為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)的新株系，命名為熱研5號(hào)(RY5)。實(shí)施例3根瘤菌RY5的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)為了確認(rèn)RY5對(duì)柱花草的作用，用兩個(gè)柱花草品種(TPRC2、TPRC5)用沙培的方法將根瘤RY5回接到柱花草根部，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)(菌、砂和種苗的處理參見回接實(shí)驗(yàn))以不接種根瘤為對(duì)照(CK)，進(jìn)行回接對(duì)比。整個(gè)過程中采用低氮營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。柱花草TPRC2、TPRC5回接根瘤菌RY2后對(duì)柱花草的生理指標(biāo)影響見表2和附圖8、附圖9。附圖8和附圖9中左邊方柱(a)為TPRC2，左邊方柱(b)為TPRC5。(附圖8、9和附圖11中其他方柱圖為現(xiàn)有根瘤菌對(duì)照結(jié)果，與本發(fā)明技術(shù)沒有直接關(guān)系，未做標(biāo)注)由表2、附圖8和附圖9可以看出回接根瘤菌RY5后柱花草TPRC2、TPRC5的根瘤數(shù)、根瘤干重、株高、植株鮮重、和固氮酶活性都比對(duì)應(yīng)的對(duì)照(CK)大幅度增加，差異達(dá)到極顯著。根瘤菌RY5回接到柱花草TPRC2和TPRC5后能提高柱花草的結(jié)瘤數(shù)，使兩個(gè)品種的柱花草都能達(dá)到高產(chǎn)。見附圖4回接根菌RY5后的結(jié)瘤情況。當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時(shí)，對(duì)人、動(dòng)物和植物無害，不會(huì)污染環(huán)境，反而增加了土壤間根瘤菌的群體，對(duì)柱花草的結(jié)瘤固氮有促進(jìn)的作用。表2根瘤菌RY5回接到TPRC2、TPRC5后對(duì)柱花草生理指標(biāo)的影響基因型菌株根瘤數(shù)(個(gè))株高(cm)地上鮮重(g)地上干重(g)CK06.6±0.50.47±0.030.14±0.01TPRC2RY5141.75±27.7312.19±1.451.91±0.200.34±0.04CK04.8±0.240.34±0.050.09±0.01TPRC5RY5147±7.0510.71±0.481.835±0.050.33±0.01實(shí)施例4根瘤菌RY5菌劑及應(yīng)用所述菌劑是將保存的菌活化后在液體YMA培養(yǎng)基中搖菌，待菌液濃度達(dá)到1X109個(gè)/ml時(shí)即可用以制作菌劑施用。將剛搖出的菌用無菌水稀釋或直接用來浸泡柱花草種子60分鐘，對(duì)于移苗種植的柱花草將無菌條件下育出的苗在種植前將根部在上述菌液中浸泡30分鐘以上，亦可將苗種植于大田中后往苗根部土壤中澆上述菌液(每株苗根部澆510ml)。也可以按比例混合菌體吸附材料制成菌劑于播種或移植前混施于土壤中。所述菌體吸附材料優(yōu)選草炭、蛭石或珍珠巖等；所述比例優(yōu)選10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠巖。RY5草炭菌劑施用于土壤中對(duì)柱花草產(chǎn)量的影響如前述沙培準(zhǔn)備無菌種子和育苗.將根瘤菌從固體培養(yǎng)基上吸入三角瓶中28°C培養(yǎng)96小時(shí)，用無菌水洗脫菌體，并用無菌水稀釋，用漩渦打旋器均勻菌體，測定OD值(入=600nm)，保證田間接種時(shí)每粒種子的含菌量大于109個(gè)。將草炭粉碎(過2mm篩孔)后在12rC滅菌40分鐘后冷卻備用。在播種前將不同菌液按10ml菌液50g草炭的比例倒入8草炭中，并充分混合讓草炭吸收菌液。育苗前將混合好的菌劑混施于土壤中。小區(qū)面積為20m、設(shè)四個(gè)重復(fù)。三個(gè)月后收樣，其單株產(chǎn)量結(jié)果如附圖11。附圖11中左邊方柱(a)為TPRC2，左邊方柱(b)為TPRC5。在大田栽培柱花草中，施用RY5根瘤菌菌劑后使TPRC2和TPRC5的產(chǎn)量是不接根瘤菌(CK)的產(chǎn)量的3.1倍和2.1倍。實(shí)施例5根瘤菌RY5的對(duì)土壤的適應(yīng)實(shí)驗(yàn)根瘤菌、土壤環(huán)境和植株是一個(gè)相互作用的一個(gè)體系，只有將三者統(tǒng)一起來綜合考慮才能達(dá)到真正的高產(chǎn)及高效。為了確定RY5對(duì)土壤主要影響因素(酸堿性、及鹽堿性)的適應(yīng)情況，通過如下方法確定柱花草的耐酸、耐鹽性。為今后更加科學(xué)合理地使用RY5柱花草根瘤菌提供優(yōu)選的技術(shù)支持。將菌株RY5活化后，洗入YMA液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床(28±1°C、180r/min)下培養(yǎng)，待0D6。。約為1，分別吸取50ii1菌懸液接種到pH值為4、4.5、4.8、5、5.5、6、7(體積為50ml)YMA液體培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩器中28±1°C180rpm振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)液渾濁度的變化來檢測菌的生長情況，培養(yǎng)72小時(shí)后用分光光度計(jì)測量0De。。。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。RY5在ra值為4.56的環(huán)境中能較快的生長形成有效菌液，特別是在ra值為4.5生長最好。見附圖10RY5在不同ra值條件下的生長曲線圖。在菌的生長過程中能很快的提高菌液的ra值；故RY5施用于我國的南方酸性紅壤中有使柱花草增產(chǎn)和改善土壤酸性的雙重功效。根瘤菌RY5回接到柱花草TPRC2和TPRC5后能提高柱花草的結(jié)瘤數(shù)，使兩個(gè)品種的柱花草都能達(dá)到高產(chǎn)。見附圖4回接根菌RY5后的結(jié)瘤情況。當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時(shí)，對(duì)人、動(dòng)物和植物無害，不會(huì)污染環(huán)境，反而增加了土壤間根瘤菌的群體，對(duì)柱花草的結(jié)瘤固氮有促進(jìn)的作用。耐鹽抗性實(shí)驗(yàn)采用添加NaCl的YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)根瘤菌，3天后用分光光度計(jì)測定菌液的OD值，OD值的大小可以反映菌生長快慢的情況。各菌株經(jīng)活化后，接種于YMA液體培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩器中28±1°C下培養(yǎng)，待0D6。。約為1，分別吸取50i！1菌懸液接種到NaCl濃度為0、0.05、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/LYMA液體培養(yǎng)基中(pH值為5.5、體積為50ml)，置恒溫振蕩器中28±1°C180rpm振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)液渾濁度的變化來檢測菌的生長情況，培養(yǎng)72小時(shí)后用分光光度計(jì)測量0De。。。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。RY4在不同鹽濃度中的生長情況見附圖12。RY5根瘤菌在土壤環(huán)境中鹽濃度高于0.09mol/L時(shí)生長受到了很大的抑制，不能形成濃度大于1X109個(gè)/ml的菌液，當(dāng)溶液中的含菌量伴隨溶液鹽濃度的減小而增加，當(dāng)鹽濃度為0.05mol/L時(shí)開始可以形成濃度大于IX109個(gè)/ml的有效菌液。SEQUENCELISTING〈110〉劉國道，董榮書，黃艷霞〈120〉一種根瘤固氮菌株系RY5菌株及其應(yīng)用〈130〉〈160>1〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>1374〈212>DNA90107]〈213〉人工序列0108]〈400>10109]ctteacacatgcaagtcgagcgggcgtegc0110]cgtggg雄gteccttttggttcgg朋c朋0111]gcccttecgggg朋3gatttatcgccg朋30112]3gggt朋tggccteccaaggCg3Cg3tC3g0113]tgggactgagacacggcccaaactcctecg0114]ggggcaaccctgatccagccatgccgcgtg0115]ttttgtgcggg朋gateatgacggteccgc0116]cagccgcggt朋tecg朋gggggctegcgt0117]teggcgggtcttteagtcaggggtg腿tc0118]actg朋gatcttgagtccggg卿ggtgElg0119]agatettcgcgtggcg朋gg0120]C3Cg朋3gCgtgggg3gc朋3caggatteg0121]aatgccagccgttegtgggtttectcacte0122]ctggggagtecggtcgcaag0123]tggagcatgtggttteattcgacgc朋cgc0124]ggaccggtcgcagagacgtgaccttctctt0125]gtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggt0126]ttegttgcteccatttegttgagcactcte0127]ggtggggEltgacgtcaagtcctcatggccc0128]ggcggtg織atgggatgcg朋ggggteac0129]tcggattgggctctgcaactcgagcccatg0130]cacgccacggtgaatecgttcccgggcctt0131]ggttttecctgEl卿Cggtgcgcteacccg朋tecgtcagcggc卿cgggtgElgt雄g60C3C3ggg朋3cttgtgcteateccggatea120gatcggcccgcgtctgattegctegttggt180tegctggtctg卿gg3tg3tcagccacat240gg￡lggC￡lgC￡lgtgggg朋tettggac朋tg3003gtg3tg朋ggccctegggttgteaagctc360朋g朋teagccccggcteacttcgtgccag420tgctcggaatcactgggcgt腿gggtgcg■ctggagctcaactccagaactgcctttgat540tgg雄tgcgElgtgt卿ggtgaaattcgt600cggctcactggcccggtectgacgctgagg660ateccctggtagtccacgccgte朋cgatg720gtggcgcagcteacgcttteagcattccgc780a朋gg朋ttgacgggggcccgcacaagcgg840gcagaaccttaccagcccttgacatgtcca■cggagcctgg朋C3C3ggtgctgcatggct960teagtcccgc朋Cg3gCgC3acccccgtcc1020aggagactgcCggtg3t朋gccgcgaggaa1080ttecgggctgggctecacacgtgctecaat1140ccctegcaaatctca朋朋gccgtctcagt1200朋gttgg朋tcgctegteatcgtggatcag1260gtecacaccgcccgtcacaccatgggagtt1320C朋gggElggCagccggccacggte137權(quán)利要求一種根瘤固氮菌株系RY5菌株(Bradyrhizobiumsp.RY5)，于2009年11月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNoM209269。2.—種權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY5菌株，其特征在于其16SDNA序列如SEQIDNOl所示。3.—種權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY5菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于是將采集到的根瘤滅菌處理后搗碎得到得汁液在YMA固體培養(yǎng)基上劃線后倒置于28±rC培養(yǎng)箱黑暗中培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述根瘤固氮菌株系RY5菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1)將柱花草的根系沖洗干凈，將根瘤帶2mm的根剪下沖洗干凈；(2)將沖洗干凈的根瘤滅菌后搗碎，蘸取乳白色汁液在YMA固體培養(yǎng)基上劃線，將劃好的板倒置于保鮮袋中置于2『C培養(yǎng)箱黑暗中培養(yǎng)；(3)在培養(yǎng)的第3天開始檢查培養(yǎng)基上是否有長出菌落，將菌落標(biāo)記出來記錄形態(tài)和光澤度；(4)排除非根瘤菌菌落，根據(jù)標(biāo)記的菌落將生長單菌落的時(shí)間相差3天以上的菌落及板上生長形態(tài)、菌落大小、菌落透明度、及燈光下的折射、菌落顏色不一致的菌落挑出，在新的培養(yǎng)基上劃板并編號(hào)，逐級(jí)純化后的板進(jìn)行鏡檢和回接后劃入YMA斜面中保存。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述根瘤固氮菌株系RY5菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)所述滅菌是采用95%的酒精浸泡后用無菌水沖洗，加入0.1%的HgCl2滅菌。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述根瘤固氮菌株系RY5菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于所述YMA固體培養(yǎng)基的組成為甘露醇10g，K2HP040.25g，MgS047H200.2g，KH2P040.25g，NaClO.lg，酵母粉3g，瓊脂15g。7.—種權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY5菌株回接柱花草的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將分離純化出來的根瘤RY5用無菌水洗入液體YMA培養(yǎng)基中，在搖床中180r/min搖菌3天后測定菌液的0D值，當(dāng)0D大于0.6時(shí)得菌液；(2)將柱花草種子滅菌后排放于培養(yǎng)皿中滅菌的發(fā)芽紙上，用滅菌的0.05mmol/L硫酸鈣溶液浸濕發(fā)芽紙，置于28±rc的培養(yǎng)箱中黑暗催芽，待苗長到4厘米時(shí)移入滅菌沙培箱中；(3)從步驟(2)所述沙培箱中選取壯實(shí)的苗用步驟(1)制備得到的菌液浸泡后栽種，每棵種苗加入菌液l2ml。8.—種菌劑，其特征在于是由權(quán)利要求1所述根瘤固氮菌株系RY5菌株菌液混合菌體吸附劑制備得到。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述菌劑，其特征在于所述菌體吸附劑為草炭、蛭石或珍珠巖；混合比例為10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠巖。10.—種柱花草接種所述根瘤固氮菌株系RY5菌株的方法，其特征在于將菌株活化、在搖床搖菌后進(jìn)行拌種處理或以菌液澆于柱花草根部土壤中或?qū)⒕夯旌暇w吸附材料制成菌劑在柱花草移植前混施于土壤中。全文摘要本發(fā)明公開了一種根瘤固氮菌株系RY5菌株及其應(yīng)用。所述菌株((Bradyrhizobiumsp.RY5))于2009年11月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNoM209269。本發(fā)明的根瘤固氮菌株系RY5具有很強(qiáng)的耐酸性，回接到柱花草TPRC2、TPRC5，能提高柱花草的有效根瘤結(jié)瘤數(shù)，使兩個(gè)品種的柱花草都能達(dá)到高產(chǎn)。當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時(shí)，增加了土壤間根瘤菌的群體，對(duì)柱花草的結(jié)瘤固氮有促進(jìn)的作用，且對(duì)人、動(dòng)物和植物無害，不會(huì)污染環(huán)境。文檔編號(hào)C12N1/20GK101781629SQ20091021431公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者劉國道,董榮書,黃艷霞申請(qǐng)人:劉國道;董榮書;黃艷霞