枸杞erf轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與抗逆應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枸杞ERF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與抗逆應(yīng)用，編碼枸杞ERF轉(zhuǎn)錄因子的LcERF基因，是SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明從枸杞中分離出編碼ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的完整cDNA，連接到植物表達載體上，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因植株進行了抗逆性分析，結(jié)果表明ERF轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)逆境信號，有效提高植物的耐鹽堿能力。
【專利說明】枸杞ERF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與抗逆應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種編碼枸杞ERF轉(zhuǎn)錄因子的LcERF基因、該 基因編碼的蛋白質(zhì)、包括含有該基因的重組載體及基因的抗逆應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 植物的逆境包括非生物逆境（如干旱、鹽堿和低溫等）和生物逆境（如真菌、細(xì) 菌、病毒和線蟲等引起的病、蟲害以及雜草危害）。其中干旱、鹽堿和低溫是影響陸生植物生 長和限制作物產(chǎn)量的主要的非生物脅迫因子。與能移動的動物不同，植物總是直接生活在 復(fù)雜多變的自然環(huán)境中。這些逆境都會使植物受到不同程度的生理傷害，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致 植物死亡。為了適應(yīng)這些脅迫環(huán)境，植物在漫長的的進化過程中演化出了對這些非生物脅 迫的抗性機制，如：氣孔關(guān)閉、細(xì)胞膜及胞質(zhì)成分的改變等。植物在生物與非生物脅迫的作 用下，能夠通過信號傳導(dǎo)途徑，使一些基因的表達受逆境調(diào)控，從而對脅迫作出應(yīng)答。
[0003] 一般認(rèn)為，植物對干旱和高鹽等逆境的抗性受多基因控制，因此，利用基因工程技 術(shù)導(dǎo)入單個功能基因雖然能增加植物的某種單一抗性，但并不能從整體上綜合提高植物的 抗逆性。轉(zhuǎn)錄因子作為功能基因表達的調(diào)節(jié)開關(guān)，可以對不同的基因進行精確的調(diào)節(jié)，在植 物逆境信號傳遞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，所以通過增強某個轉(zhuǎn)錄因子的作用，可促使多 個與抗逆有關(guān)的功能基因表達，這是使植物抗逆性狀獲得綜合改良的一條非常有效的途 徑。
[0004] AP2/ERF類蛋白是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，ERF (ethylene-responsive element binding factor)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的一個亞家族，每個 成員都含有一個由大約58-59個氨基酸組成的非常保守的DNA結(jié)合域。從蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)分析，ERF類轉(zhuǎn)錄因子含有4個功能域，即DNA結(jié)合域（DNA-binding domain)，轉(zhuǎn) 錄調(diào)控域（transcription regulation domain)(包括激活和抑制域），寡聚化位點 (oligomerization)以及核定位信號（nuclear localization signal，NLS) 〇 其中，高度保 守的ERF/AP2DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有由58-59個氨基酸殘基組成的包含3個β折疊和1個α 螺旋，通過與目的基因上游啟動子區(qū)域中富含GC的順式作用元件（如DRE元件、GCC-box 等）相互作用，參與調(diào)控植物細(xì)胞周期、生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、次生代謝、生物和非生物脅迫 應(yīng)答及植物激素信號傳導(dǎo)等多種信號途徑，在脅迫信號傳遞過程中起重要作用。ERF轉(zhuǎn)錄因 子可以調(diào)控多個與植物抵抗干旱、高鹽、低溫及病原菌等有關(guān)的功能基因的表達，從整體上 增強植物的抗逆性，提高其穩(wěn)定性，對于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潛在應(yīng)用 價值，并將有巨大的應(yīng)用前景。
[0005] 研究表明，大部分ERF基因的表達都受干旱、鹽堿、低溫、凍害、病害和機械傷害等 逆境脅迫的誘導(dǎo)。枸杞（Lycium chinense Mill)是生長在干旱、半干旱地區(qū)的一種重要爺 科植物，廣泛分布于中國西北地區(qū)和其他溫暖的熱帶國家，如韓國、日本和一些歐洲國家。 除了其重要的藥用及營養(yǎng)價值外。枸杞還具有巨大的環(huán)境適應(yīng)能力，是一種重要的耐鹽性 植物品種。因此在枸杞中克隆新的ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因，研究其基本的生物學(xué)特性和功能， 可為整個植物抗逆基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及脅迫應(yīng)答反應(yīng)機理提供理論基礎(chǔ)，并為改良作物抗逆性 提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種編碼枸杞ERF轉(zhuǎn)錄因子的LcERF基因。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種該基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有該基因的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種含有該重組載體的宿主細(xì)胞。
[〇〇1〇] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供該基因的用途。
[〇〇11] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0012] 一種編碼枸杞ERF轉(zhuǎn)錄因子的LcERF基因，它是SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
[0013] 上述基因編碼的蛋白質(zhì)，它是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0014] 一種含有上述基因的重組載體pCAMBIA2300-LcERF，它含有SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列。
[0015] 一種含有重組載體pCAMBIA2300-LcERF的宿主細(xì)胞。
[0016] 上述基因在制備轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆應(yīng)用。
[〇〇17] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0018] 本發(fā)明從枸杞中分離出編碼ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的完整cDNA，連接到植物表達載體 上，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因植株進行了抗逆性分析，結(jié) 果表明ERF轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)逆境信號，有效提高植物的耐鹽堿能力。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1.用PI、P2引物對枸杞cDNA的PCR電泳圖。
[0020] 圖2. LcERF基因連接pMD18-T載體的PCR驗證結(jié)果。
[0021] 圖 3. pMD18-T_LcERF 載體示意圖。
[0022] 圖 4. pCAMBIA2300-LcERF 載體示意圖。
[0023] 圖5.轉(zhuǎn)基因煙草基因組PCR。
[0024] 圖6在200mmol/LNaCl的生長條件下，轉(zhuǎn)基因煙草苗和野生型對照苗圖。
[0025] 圖7在300mmol/L NaCl的生長條件下，轉(zhuǎn)基因煙草苗和野生型對照苗圖。 【具體實施方式】
[0026] 下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0027] 下述實施例中所涉及的具體實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法或按照制造廠 商說明書建議的條件實施。
[0028] 實施例1
[0029] 枸杞中ERF轉(zhuǎn)錄因子LcERF基因的克隆
[0030] 利用Trizol試劑，從100mg的新鮮的枸杞葉片中提取totalRNA，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組 的Uni gene序列設(shè)計上游引物，枸杞中ERF轉(zhuǎn)錄因子LcERF基因的上游引物為：LcERFf : 5-，ATGTATCAACCCATTTCTACTGAGTTAGC-3，（SEQ ID N0.3)，利用 3，F(xiàn)ULLRACE Core Set Ver. 2. 0(TaKaRa，Japan)試劑盒擴增得到完整的基因序列。具體步驟：①以totalRNA為 模板，利用3' RACE Adaptor引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成1st Strand cDNA，反應(yīng)體系如下：
[0031]
【權(quán)利要求】
1. 一種編碼枸杞ERF轉(zhuǎn)錄因子的LcERF基因，其特征在于它是SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于它是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序 列。
3. -種含有權(quán)利要求1所述基因的重組載體pCAMBIA2300-LcERF，其特征在于它含有 權(quán)利要求1所述的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
4. 一種含有重組載體pCAMBIA2300-LcERF的宿主細(xì)胞。
5. 權(quán)利要求1所述的基因在制備轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK104087596SQ201410129689
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】季靜, 王昱蓉, 吳電云, 王罡, 關(guān)春峰, 賈翠翠 申請人:天津大學(xué)