利用蠶蛹制備降血糖肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，包括如下步驟：1)在脫脂干蠶蛹粉中加入水后攪勻，然后調(diào)節(jié)pH值為3.8～4.2，作為反應(yīng)起始物；于35℃～40℃，在反應(yīng)起始物中加入酸性蛋白酶，于攪拌狀態(tài)下保溫酶解反應(yīng)3.5～4.5h；終止反應(yīng)后離心，得上清液，該上清液為酶解液；2)用脫色活性炭對(duì)酶解液于35～35℃進(jìn)行脫色處理，所得的脫色后酶解液經(jīng)過(guò)濾，得粗濾酶解液；利用截留分子量3Kda的中空纖維聚砜超濾膜對(duì)粗濾酶解液進(jìn)行超濾，先利用真空濃縮機(jī)將此超濾酶解液濃縮至原重的25～40％，然后真空冷凍干燥，得到具有降血糖功能的肽粉。
【專利說(shuō)明】利用蠶蛹制備降血糖肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及利用蠶蛹制備降血糖肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，糖尿病已成為繼腫瘤、心血管疾病之后嚴(yán)重威脅人類健康的慢性病，是威脅人類健康的三大慢性疾病之一，餐后高血糖是糖尿病的主要風(fēng)險(xiǎn)因子，α —葡萄糖苷酶抑制劑能通過(guò)抑制小腸上皮絨毛膜刷狀緣上α —葡萄糖苷酶的活性，減少食物中碳水化合物的消化，延緩葡萄糖的生成，在降低餐后血糖中具有重要作用。目前已開發(fā)出一些化學(xué)合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑(如阿卡波糖片)，并應(yīng)用于臨床治療。但化學(xué)合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)人體能產(chǎn)生一定的副作用，如損害肝臟、導(dǎo)致胃腸氣脹和腸功能紊亂等。
[0003]目前人們已從深海魚、牛奶等食物中分離到了具有降血糖活性的多肽。但這些方法原料成本相對(duì)較高。
[0004]已有研究中，張海娜發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白以堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶制備ACE活性抑制肽，同時(shí)具有一定降低小鼠血糖的功效，但活性不高，且未報(bào)道其降血糖機(jī)制。李國(guó)榮通過(guò)堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解蠶蛹粉制備的多肽，能抑制酵母的α-葡萄糖苷酶活性，但未涉及動(dòng)物體α-葡萄 糖苷酶的抑制活性，且活性不高。蠶蛹源活性肽針對(duì)動(dòng)物體內(nèi)α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究尚無(wú)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種成本低、降血糖效果好的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，包括如下步驟:
[0007]I)、在脫脂干蠶蛹粉中按照1:13~17(較佳為1:15)的重量比加入水后攪勻，然后調(diào)節(jié)PH值為3.8~4.2 (較佳為4.0)，作為反應(yīng)起始物；于35°C~40°C，在反應(yīng)起始物中加入為脫脂干蠶蛹粉重量2~3%的酸性蛋白酶，于攪拌狀態(tài)下保溫(35°C~40°C)酶解反應(yīng)3.5~4.5h(較佳為4h)；
[0008]將酶解反應(yīng)所得產(chǎn)物于1min內(nèi)(一般為5~10分鐘)升溫至95~100°C，并保溫8~12min(較佳為1min);然后自然冷卻至室溫以終止反應(yīng)；然后離心,得上清液,該上清液為酶解液；
[0009]2)、用脫色活性炭對(duì)所述酶解液于35~35°C (較佳為40°C )進(jìn)行脫色處理，所得的脫色后酶解液經(jīng)過(guò)濾，得粗濾酶解液；
[0010]利用截留分子量3Kda的中空纖維聚砜超濾膜(即，聚砜中空纖維超濾膜)對(duì)粗濾酶解液進(jìn)行超濾，工作壓力0.1~0.2Mpa，工作溫度O~45°C (例如為20~45°C )，得到超濾酶解液；
[0011]先利用真空濃縮機(jī)將此超濾酶解液濃縮至原重的25~40%，然后真空冷凍干燥，得到具有降血糖功能的肽粉(即，降血糖肽)。
[0012]作為本發(fā)明的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法的改進(jìn):
[0013]步驟I)中酸性蛋白酶的酶活力為5萬(wàn)U/g。
[0014]作為本發(fā)明的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn):
[0015]所述步驟2)中的真空冷凍干燥為:于真空度為65Pa，冷阱溫度為_50°C，物料溫度為_25°C的條件下真空冷凍干燥，直至含水率< 7% (質(zhì)量％ )。
[0016]作為本發(fā)明的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn):
[0017]所述步驟I)中的離心為:3500~4500r/min下離心18~22min(較佳為4000r/min 離心 20min)。
[0018]作為本發(fā)明的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn):
[0019]所述步驟2)中的過(guò)濾為3層致密紗布袋粗濾。
[0020]作為本發(fā)明的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟2)中:脫色活性炭與酶解液的重量比為9~11% (較佳為10% );脫色處理時(shí)間為1.5~2.5h (較佳為 2h)。
[0021]備注說(shuō)明:
[0022]1、本發(fā)明中作為原料的脫脂干蠶蛹粉或蠶蛹蛋白粉，其含水率均< 1.5% (重量％ );脂肪含量< 3% (重量％ )。
[0023]2、本發(fā)明所指的室溫為10~30°C。
[0024]3、本發(fā)明的酸性蛋白酶，例如可選用上海源葉生物科技有限公司公司生產(chǎn)的M0010酸性蛋白酶BR。
[0025]4、采用本發(fā)明方法制備而得的降血糖活性肽的使用方法和用量為口服，每日兩次，每次2-3g。
[0026]本發(fā)明的利用蠶蛹制備利用蠶蛹制備降血糖肽的方法的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0027]I)、本發(fā)明所制備的降血糖肽是脫脂干蠶蛹或蠶蛹蛋白粉經(jīng)生物酶水解而得，對(duì)高血糖患者具有降血糖的作用，安全、無(wú)毒副作用，對(duì)血糖水平正常者可起到保健作用，對(duì)正常血糖水平無(wú)影響。
[0028]2)、本發(fā)明所采用的原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的技術(shù)轉(zhuǎn)化可以有效的提高絲廠蠶蛹副產(chǎn)物的附加值，對(duì)繼續(xù)促進(jìn)桑蠶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。
[0029]即，從而使采用繅絲后經(jīng)脫脂的干蠶蛹這一原料廣泛、價(jià)格低廉的蛋白質(zhì)源制備降血糖肽的技術(shù)具有更廣泛的應(yīng)用前景。
[0030]3)、本發(fā)明的產(chǎn)品可以作為藥品、保健食品、食品、食品添加劑、藥物增效劑等，工藝科學(xué)合理，操作簡(jiǎn)單，具有較強(qiáng)的工業(yè)實(shí)施性。
[0031]綜上所述，本發(fā)明是一項(xiàng)針對(duì)動(dòng)物體內(nèi)α -葡萄糖苷酶具有高抑制活性的蠶蛹蛋白源降血糖肽的制備方法，對(duì)于深化蠶蛹蛋白資源在功能食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。本發(fā)明以蠶蛹蛋白(脫脂干蠶蛹粉)為原料，選擇酸性蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行酶解，通過(guò)特定的酶解條件，制備所得的蠶蛹蛋白降血糖肽具有對(duì)α-葡萄糖苷酶活性高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】[0032]下述案例中的脫脂干蠶蛹粉的水分含量1.5 %，蛋白質(zhì)含量75.03 %，脂肪含量3%，上述％均為重量％ ;該脫脂干蠶蛹粉例如可購(gòu)自南通福麗爾生物制品有限公司。
[0033]實(shí)施例1、一種利用蠶蛹制取降血糖肽的方法，依次進(jìn)行以下步驟:
[0034]1)、稱取粉碎后的脫脂干蠶蛹粉10kg，加水150kg攪勻后，用適量HCl調(diào)節(jié)pH值為
4.0后，作為反應(yīng)起始物，控制溫度為35°C~40°C，在反應(yīng)起始物中加入酸性蛋白酶(酶活力為5萬(wàn)U/g)300g，繼續(xù)保溫(35°C~40°C )并不斷攪拌進(jìn)行酶解反應(yīng)4h。
[0035]反應(yīng)時(shí)間到達(dá)后，將酶解反應(yīng)所得產(chǎn)物于5~10分鐘內(nèi)升溫至95~100°C，并保溫(95~100°C ) 1min ;然后自然冷卻至室溫來(lái)終止反應(yīng)。
[0036]然后在4000r/min下離心20min,得上清液98kg,該上清液為酶解液；
[0037]2)、用9.8kg的脫色活性炭對(duì)此酶解液脫色2h，溫度控制在40°C;所得的脫色后酶解液經(jīng)3層致密紗布袋粗濾，得粗濾酶解液。利用中空纖維聚砜超濾膜(截留分子量3KDa)對(duì)粗濾酶解液進(jìn)行超濾，工作壓力0.1~0.2Mpa，工作溫度20~45 °C，得到超濾酶解液50kgo
[0038]利用真空濃縮機(jī)將此超濾酶解液濃縮至20kg，進(jìn)行真空冷凍(真空度達(dá)65Pa，冷阱溫度為_50°C，物料溫度為_25°C )至干燥(即，含水率≤ 7% )，得到具有降血糖功能的肽粉(蠶蛹肽)0.96kg，肽含量為90.2 %，產(chǎn)品得率為8.66%。
[0039]配制3mg/mL的上述蠶蛹肽溶液，測(cè)得其對(duì)小鼠腸內(nèi)α -葡萄糖苷酶抑制活性為73.9%，其 IC50 為 2.03mg/mL。
[0040]測(cè)試方法參考文獻(xiàn):PierreChapdelaine, Roland RTremblay, Jean Y Dube P-Nitropheno1-a-D-Glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activity inHuman Semen [J].CLIN CHEM1987, 2 (24) 208-211 進(jìn)行。
[0041]實(shí)施例2、一種利用蠶蛹制取降血糖肽的方法，依次進(jìn)行以下步驟:
[0042]I)、稱取粉碎后的脫脂干蠶蛹粉40kg，加水600kg攪勻后，用適量HCl調(diào)節(jié)pH值為
4.0后，作為反應(yīng)起始物，控制溫度為35°C~40°C，在反應(yīng)起始物中加入酸性蛋白酶(酶活力為5萬(wàn)U/g) 800g，繼續(xù)保溫并不斷攪拌進(jìn)行酶解反應(yīng)4h。
[0043]酶解時(shí)間到達(dá)后，將酶解反應(yīng)所得產(chǎn)物于5~10分鐘內(nèi)升溫至95_100°C，并保溫1min ;然后自然冷卻至室溫來(lái)終止反應(yīng)。
[0044]然后在4000r/min下離心20min,得上清液390kg,該上清液為酶解液；
[0045]2)、用39kg的脫色活性炭對(duì)此酶解液脫色2h，溫度控制在40°C ;所得的脫色后酶解液經(jīng)3層致密紗布袋粗濾，得粗濾酶解液。利用中空纖維聚砜超濾膜(截留分子量3KDa)對(duì)粗濾酶解液進(jìn)行超濾，工作壓力0.1~0.2Mpa，工作溫度20~45 °C，得到超濾酶解液200kg。
[0046]利用真空濃縮機(jī)將此超濾酶解液濃縮至50kg，進(jìn)行真空冷凍至干燥(真空度達(dá)65Pa，冷阱溫度為_50°C，物料溫度為_25°C )至干燥(即，含水率≤ 7% )，得到具有降血糖功能的肽粉3.68kg，肽含量為92.5%，產(chǎn)品得率為8.51%。
[0047]配制3mg/mL的上述蠶蛹肽溶液，測(cè)得其對(duì)小鼠腸內(nèi)α -葡萄糖苷酶抑制活性為75.1%, IC50 為 2.00mg/mL。
[0048]對(duì)比例1、將脫脂干蠶蛹粉按照【背景技術(shù)】中告知的“利用深海魚分離具有降血糖活性多肽”的方法進(jìn)行制備；[0049]g卩，以脫脂干蠶蛹粉替代等干重的深海魚，其余內(nèi)容等同于該方法。
[0050]所得結(jié)果為:
[0051]得到具有降血糖功能的肽粉0.89kg，肽含量為87.4%，產(chǎn)品得率為7.78%。
[0052]配制3mg/mL的上述蠶蛹肽，測(cè)得其對(duì)小鼠腸內(nèi)α _葡萄糖苷酶抑制活性為
28.6%, IC50 為 5.24mg/mL。
[0053]對(duì)比例2-1、將實(shí)施例1中的“酸性蛋白酶(酶活力為5萬(wàn)U/g)300g”改成“堿性蛋白酶(酶活力為10萬(wàn)U/g) 300g”，且將調(diào)節(jié)pH值為4.0相應(yīng)的更改成調(diào)節(jié)pH值為9-11 ；反應(yīng)溫度更改為50~60°C ;其余等同于實(shí)施例1。
[0054]所得結(jié)果為:
[0055]得到的具有降血糖功能的肽粉中肽含量為90.7%，產(chǎn)品得率為20.6%。
[0056]配制3mg/mL的上述蠶蛹肽，測(cè)得其對(duì)小鼠腸內(nèi)α -葡萄糖苷酶抑制活性為13.2%, IC50 為 11.36mg/mL。
[0057]通過(guò)上述結(jié)果可見，該案例雖然水解度相對(duì)高，因此得率較高；可是所得的蠶蛹肽對(duì)小鼠腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶抑制活性卻大大降低。
[0058]對(duì)比例2-2、將實(shí)施例1中的“酸性蛋白酶(酶活力為5萬(wàn)U/g)300g”改成“復(fù)合蛋白酶(酶活力為12萬(wàn)U/g) 200g”，且將調(diào)節(jié)pH值為4.0相應(yīng)的更改成調(diào)節(jié)pH值為6_8 ；反應(yīng)溫度為40~50°C ;其余等同于實(shí)施例1。
[0059]所得結(jié)果為:
[0060]得到具有降血糖功能的肽粉0.81kg，肽含量為91.3%，產(chǎn)品得率為7.4%。
[0061]配制3mg/mL的上述蠶蛹肽，測(cè)得其對(duì)小鼠腸內(nèi)α -葡萄糖苷酶抑制活性為7.8%,IC50 為 19.23mg/mL。
[0062]通過(guò)對(duì)比例結(jié)果可見，該案例所得的蠶蛹肽對(duì)小鼠腸內(nèi)α -葡萄糖苷酶抑制活性卻大大降低。
[0063]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，其特征是包括如下步驟:.1)、在脫脂干蠶蛹粉中按照1:13~17的重量比加入水后攪勻，然后調(diào)節(jié)pH值為3.8~.4.2，作為反應(yīng)起始物；于35°C~40°C，在反應(yīng)起始物中加入為脫脂干蠶蛹粉重量2~3%的酸性蛋白酶，于攪拌狀態(tài)下保溫酶解反應(yīng)3.5~4.5h ; 將酶解反應(yīng)所得產(chǎn)物于1min內(nèi)升溫至95~100°C，并保溫8~12min ;然后自然冷卻至室溫以終止反應(yīng)；然后離心，得上清液，該上清液為酶解液； . 2)、用脫色活性炭對(duì)所述酶解液于35~35°C進(jìn)行脫色處理，所得的脫色后酶解液經(jīng)過(guò)濾，得粗濾酶解液； 利用截留分子量3Kda的中空纖維聚砜超濾膜對(duì)粗濾酶解液進(jìn)行超濾，工作壓力0.1~.0.2Mpa，工作溫度O~45°C，得到超 濾酶解液； 先利用真空濃縮機(jī)將此超濾酶解液濃縮至原重的25~40%，然后真空冷凍干燥，得到具有降血糖功能的肽粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，其特征是: 所述步驟I)中酸性蛋白酶的酶活力為5萬(wàn)U/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，其特征是: 所述步驟2)中的真空冷凍干燥為:于真空度為65Pa，冷阱溫度為-50°C，物料溫度為_25°C的條件下真空冷凍干燥，直至含水率< 7%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，其特征是: 所述步驟I)中的離心為:3500~4500r/min下離心18~22min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，其特征是: 所述步驟2)中的過(guò)濾為3層致密紗布袋粗濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，其特征是: 所述步驟2)中:脫色活性炭與酶解液的重量比為9~11% ;脫色處理時(shí)間為1.5~.2.5h。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104031963SQ201410129977
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】張玉, 王偉, 王君虹 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院