上培養(yǎng)，愈傷團面積增大， 由淡黃色逐漸變?yōu)辄S綠色。將面積大于3cm 2的愈傷組織再切割為大小為0. 5cm2的小愈傷 團，愈傷組織可繼續(xù)生長并持續(xù)分化。通過這種方式，1個愈傷組織可持續(xù)擴繁，得到大量愈 傷組織。60天后愈傷組織由黃綠色變綠色，并且開始出現(xiàn)綠色突起的芽點，到90天左右見 到葉、芽分化，繼續(xù)培養(yǎng)得到叢生芽。
[0206] 培養(yǎng)條件：溫度為25°C，光照16h/d，光強25001x。
[0207] (4)不定苗的再生及生根培養(yǎng)
[0208] 將叢生芽轉(zhuǎn)移到不定苗伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使不定苗伸長至2cm高時切下轉(zhuǎn)入生 根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0209] 培養(yǎng)條件均為：溫度為25°C，光照16h/d，光強25001x。
[0210] 4、實驗結(jié)果
[0211] 本發(fā)明方法可得到黃瓜的離體再生植株。
[0212] 試驗例4本發(fā)明聯(lián)合用培養(yǎng)基用于制備黃瓜子房離體再生植株
[0213] 1、實驗材料
[0214] 同試驗例3。
[0215] 2、實驗用培養(yǎng)基
[0216] 依照本發(fā)明實施例3方法制備的聯(lián)合用培養(yǎng)基。
[0217] 3、實驗方法
[0218] ⑴材料處理
[0219] 于黃瓜開花前5h取未授粉子房，自來水沖洗2h，在超凈工作臺上用75%乙醇表面 消毒30s，用10%的NaClO溶液滅菌lOmin，再用無菌水沖洗3遍，得到處理好的子房。
[0220] (2)愈傷組織的誘導(dǎo)
[0221] 將步驟（1)得到的處理好的子房縱剖為兩半，果皮接觸培養(yǎng)基接種于愈傷組織誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中；
[0222] 首先熱激處理：溫度35°C，黑暗下48h ;然后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為25°C，光 照16h/d，光強25001x，30天繼代1次。
[0223] 在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，子房切片胚珠不膨大，培養(yǎng)30天后子房腔內(nèi)壁出現(xiàn)很 多松脆的淡黃色愈傷組織。
[0224] (3)愈傷組織的增殖及分化
[0225] 將淡黃色愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，愈傷團面積增大， 由淡黃色逐漸變?yōu)辄S綠色。將面積大于3cm 2的愈傷組織再切割為大小為0. 5cm2的小愈傷 團，愈傷組織可繼續(xù)生長并持續(xù)分化。通過這種方式，1個愈傷組織可持續(xù)擴繁，得到大量愈 傷組織。40天后愈傷組織由黃綠色變綠色，并且開始出現(xiàn)綠色突起的芽點，到90天左右見 到葉、芽分化，繼續(xù)培養(yǎng)得到叢生芽。
[0226] 培養(yǎng)條件：溫度為25°C，光照16h/d，光強25001x。
[0227] (4)不定苗的再生及生根培養(yǎng)
[0228] 將叢生芽轉(zhuǎn)移到不定苗伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使不定苗伸長至2cm高時切下轉(zhuǎn)入生 根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0229] 培養(yǎng)條件均為：溫度為25°C，光照16h/d，光強25001x。
[0230] 4、實驗結(jié)果
[0231] 本發(fā)明方法可得到黃瓜的離體再生植株。
[0232] 試驗例5本發(fā)明聯(lián)合用培養(yǎng)基用于制備黃瓜子房離體再生植株
[0233] 1、實驗材料
[0234] 華北型黃瓜品種'川翠3號'，種植于四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研宄所塑料大棚內(nèi)， 株行距、水肥管理按照一般水平進行管理。
[0235] 2、實驗用培養(yǎng)基
[0236] 依照本發(fā)明實施例4方法制備的聯(lián)合用培養(yǎng)基。
[0237] 3、實驗方法
[0238] (1)材料處理
[0239] 于黃瓜開花前8h取未授粉子房，自來水沖洗2h，在超凈工作臺上用75%乙醇表面 消毒30s，用10%的NaClO溶液滅菌lOmin，再用無菌水沖洗3遍，得到處理好的子房。
[0240] (2)愈傷組織的誘導(dǎo)
[0241] 將步驟（1)得到的處理好的子房縱剖為兩半，果皮接觸培養(yǎng)基接種于愈傷組織誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中；
[0242] 首先熱激處理：溫度34°C，黑暗下48h ;然后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為24°C，光 照16h/d，光強20001x，30天繼代1次。
[0243] 在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，子房切片胚珠不膨大，培養(yǎng)60天后子房腔內(nèi)壁出現(xiàn)很 多松脆的淡黃色愈傷組織。
[0244] (3)愈傷組織的增殖及分化
[0245] 將淡黃色愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，愈傷團面積增大， 由淡黃色逐漸變?yōu)辄S綠色。將面積大于3cm 2的愈傷組織再切割為大小為0. 5cm2的小愈傷 團，愈傷組織可繼續(xù)生長并持續(xù)分化。通過這種方式，1個愈傷組織可持續(xù)擴繁，得到大量愈 傷組織。60天后愈傷組織由黃綠色變綠色，并且開始出現(xiàn)綠色突起的芽點，到120天左右見 到葉、芽分化，繼續(xù)培養(yǎng)得到叢生芽。
[0246] 培養(yǎng)條件：溫度為24°C，光照16h/d，光強20001x。
[0247] (4)不定苗的再生及生根培養(yǎng)
[0248] 將叢生芽轉(zhuǎn)移到不定苗伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使不定苗伸長至2cm高時切下轉(zhuǎn)入生 根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0249] 培養(yǎng)條件均為：溫度為24°C，光照16h/d，光強20001x。
[0250] 4、實驗結(jié)果
[0251] 本發(fā)明方法可得到黃瓜的離體再生植株。
[0252] 試驗例6本發(fā)明聯(lián)合用培養(yǎng)基用于制備黃瓜子房離體再生植株
[0253] 1、實驗材料
[0254] 華北型黃瓜品種'津優(yōu)35'，種植于四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研宄所塑料大棚內(nèi)，株 行距、水肥管理按照一般水平進行管理。
[0255] 2、實驗用培養(yǎng)基
[0256] 依照本發(fā)明實施例1方法制備的聯(lián)合用培養(yǎng)基。
[0257] 3、實驗方法
[0258] ⑴材料處理
[0259] 于黃瓜開花前6h取未授粉子房，自來水沖洗2h，在超凈工作臺上用75%乙醇表面 消毒30s，用10%的NaClO溶液滅菌lOmin，再用無菌水沖洗3遍，得到處理好的子房。
[0260] (2)愈傷組織的誘導(dǎo)
[0261] 將步驟（1)得到的處理好的子房縱剖為兩半，果皮接觸培養(yǎng)基接種于愈傷組織誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中；
[0262] 首先熱激處理：溫度36°C，黑暗下72h ;然后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度為26°C，光 照16h/d，光強20001x，30天繼代1次。
[0263] 在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，子房切片胚珠不膨大，培養(yǎng)60天后子房腔內(nèi)壁出現(xiàn)很 多松脆的淡黃色愈傷組織。
[0264] (3)愈傷組織的增殖及分化
[0265] 將淡黃色愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，愈傷團面積增大， 由淡黃色逐漸變?yōu)辄S綠色。將面積大于3cm 2的愈傷組織再切割為大小為0. 5cm2的小愈傷 團，愈傷組織可繼續(xù)生長并持續(xù)分化。通過這種方式，1個愈傷組織可持續(xù)擴繁，得到大量愈 傷組織。60天后愈傷組織由黃綠色變綠色，并且開始出現(xiàn)綠色突起的芽點，到120天左右見 到葉、芽分化，繼續(xù)培養(yǎng)得到叢生芽。
[0266] 培養(yǎng)條件：溫度為26°C，光照16h/d，光強20001x。
[0267] (4)不定苗的再生及生根培養(yǎng)
[0268] 將叢生芽轉(zhuǎn)移到不定苗伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使不定苗伸長至2cm高時切下轉(zhuǎn)入生 根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0269] 培養(yǎng)條件均為：溫度為26°C，光照16h/d，光強20001x。
[0270] 4、實驗結(jié)果
[0271] 本發(fā)明方法可得到黃瓜的離體再生植株。
[0272] 試驗例7本發(fā)明得到的再生植株倍性鑒定
[0273] 1、實驗材料
[0274] 取試驗例1得到的'白絲條'再生植株20株，以'白絲條'正常二倍體植株葉片為 對照，利用流式細胞儀對20棵再生植株進行倍性鑒定。
[0275] 2、實驗方法
[0276] 配制 LBOl 解離液：15mM Tris，2mM Na2EDTA，0. 5mM 四鹽酸精胺，80mM KCl，20mM NaCl，0.1% (v/v)TritonX-100，15mM β 疏基乙醇，pH 7.0 ~8·0〇
[0277] 1)取黃瓜再生植株幼嫩葉片lg，蒸餾水洗凈，濾紙吸干后放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿里， 加入預(yù)冷的LBOl解離液1~2mL，用鋒利的刀片一次性快速切碎，整個過程，材料須浸沒在 解離液里，以便更好的游離細胞核；
[0278] 2)吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液，用400目的濾膜過濾到I. 5mL離心管中，然后置于4°C 冰箱中孵育5min ;
[0279] 3)離心，轉(zhuǎn)速：1000r/min，溫度：4°C，時間：5min ;
[0280] 4)棄上清后，再加入100 μ 1預(yù)冷的解離液，同時加入150 μ L預(yù)冷的染料，每個樣 共約250 μ 1細胞核懸浮液，然后置4°C冰箱避光染色IOmin ;
[0281] 5)移至上樣管，上機檢測，收集5000-10000個顆粒。
[0282] 3、實驗結(jié)果
[0283] 見圖8,流式細胞儀測定'白絲條'正常二倍體植株Gl、S、G2期平均PE-A值（圖 8a，8c)，再生植株Gl、S、G2期平均PE-A值（圖8b，8d)，表明再生植株與正常植株各時期 DNA的含量基本一致。
[0284] 8c和8d表明，'白絲條'正常植株、再生植株處于G1、G2、S等不同細胞周期的細胞 含量及對應(yīng)階段的DNA含量水平相當，表明20棵再生植株