用于黃瓜子房離體再生的聯(lián)合用培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物離體再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于黃瓜子房離體再生的聯(lián)合用培 養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜（Cucumis sativus L.)是世界上的主要蔬菜之一，栽培歷史悠久，黃瓜富含 纖維素、多種維生素和礦質(zhì)元素，有很高的營養(yǎng)及藥用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者喜愛。由于種 內(nèi)資源有限，很難通過常規(guī)育種方法研制出黃瓜新品種，利用基因工程技術(shù)將是今后黃瓜 品種改良的有效手段。因此建立高效的黃瓜離體再生體系，對(duì)于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因等研宄十 分必要。
[0003] 自1979年佐滕正孝獲得首例黃瓜再生植株以來，黃瓜組織培養(yǎng)開始逐漸發(fā)展，至 今國內(nèi)外對(duì)黃瓜再生培養(yǎng)的研宄已有一些成功的報(bào)道。黃瓜再生分化的主流方法是通過子 葉、子葉節(jié)培養(yǎng)，以器官直接發(fā)生途徑得到再生植株。在器官發(fā)生途徑中，伴隨有少量或沒 有愈傷組織，但這些愈傷組織不分化。這種發(fā)生途徑存在很多問題：①基因型制約大，部分 基因型不能通過該途徑分化得到植株；②工作量大：種子滅菌-無菌苗培養(yǎng)-子葉/子葉節(jié) 切取-接種子葉/子葉節(jié)-誘導(dǎo)分化-再生苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)-再生苗生根培養(yǎng)，每個(gè)步驟缺一 不可；③通過該途徑得到的分化苗少，單個(gè)子葉節(jié)/子葉僅能分化1-2棵完整植株，再生頻 率低；④需要耗費(fèi)大量的種子，如果需要1000個(gè)外植體，需要使用500-1000顆飽滿、新鮮的 種子。而且受到制種周期和制種成本的制約，成本昂貴。
[0004] 通常，在黃瓜的組織培養(yǎng)中，影響組織培養(yǎng)成功率的因素主要有外植體、培養(yǎng)基、 激素等，高效的離體再生需要多種因素的配合。有一些利用黃瓜子葉、下胚軸、葉片、葉柄等 外植體通過愈傷組織方式再生植株的報(bào)道，但普遍存在基因型制約大、再生率低、重復(fù)性差 等問題。
[0005] 另外也有利用子房作為外植體的，如：杜勝利等（黃瓜雌核發(fā)育及染色體倍性鑒 定與加倍研宄，天津：南開大學(xué)，2002)利用黃瓜未授粉子房建立離體再生體系，但該方法 得到再生植株不僅再生頻率低，而且是單倍體、二倍體及多倍體的混合，需要對(duì)再生植株進(jìn) 行染色體倍性鑒定來區(qū)分，大大增加了工作量。
[0006] -直以來，研宄者都試圖利用組織培養(yǎng)的方法方便而高效地得到黃瓜再生植株， 以便滿足育種和品種改良的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供用于黃瓜子房高效離體再生的聯(lián)合用培養(yǎng)基。
[0008] 本發(fā)明提供了用于黃瓜子房離體再生的聯(lián)合用培養(yǎng)基，它包括愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基、愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基、不定苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基，
[0009] 所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：以NB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為30~ 40g/L 的碳源、4 ~7g/L 的凝膠劑、1. 2 ~2. Omg/L 的 TDZ、0. 2 ~0. 5mg/L 的 NAA ;
[0010] 所述愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為 30 ~40g/L 的碳源、4 ~7g/L 的凝膠齊lj、L 5 ~3. Omg/L 的 6-BA、0. 01 ~0· lmg/L 的 NAA ; [0011] 所述不定苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為30~40g/L 的碳源、5~7g/L的凝膠劑、0. 1~0. 5mg/L的6-BA ;
[0012] 所述生根培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為30~40g/L的碳 源、7g/L的凝膠劑、0. 05mg/L的IBA。
[0013] TDZ :噻苯隆，是一種細(xì)胞分裂素；
[0014] NAA :萘乙酸，是一種生長(zhǎng)素；
[0015] 6-BA :6_芐氨基嘌呤，是一種細(xì)胞分裂素；
[0016] IBA :吲噪乙酸，是一種生長(zhǎng)素；
[0017] ΑΒΑ:脫落酸；
[0018] NB 培養(yǎng)基組分：KNO3 2830mg/L、（NH4)2SO4 463mg/L、CaCl2 125. 33mg/L、 KH2PCM 400mg/L、MgSO4 90. 37mg/L、H3BO3 3mg/L、MnSO4 · H2010mg/L、ZnSO4 · 7H20 2mg/L、 Na2MoO4 · 2H20 0· 25mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、CoCl2 · 6H20 0· 025mg/L、KI 0· 75mg/L、 FeS04.7H20 27.8mg/L、Na2EDTA.2H20 37.26mg/L、肌醇 100mg/L、煙酸 VB5 lmg/L、維生素 B1 10mg/L、維生素 B6 lmg/L;
[0019] MS 培養(yǎng)基組分：KNO3 1900mg/L、NH4NO3 1650mg/L、KH2PO4 170mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、CaCl2 332. 2mg/L、Na2EDTA · 2H20 37. 26mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0· 25mg/L、MgSO4 180. 7mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、CoCl2 · 6H20 0· 025mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、MnSO4 · H2016. 9mg/L、KI 0· 83mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、煙酸 VB5 0· 5mg/L、維生素 B1 0· lmg/L、維生素 B6 0· 5mg/L。
[0020] NB培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基，在實(shí)際應(yīng)用中根據(jù)不同 培養(yǎng)階段和不同材料來源，通常需要在基本培養(yǎng)基中加入植物激素，例如不同種類和含量 的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等，合適的植物組織培養(yǎng)基組成是植物組織培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。
[0021] 進(jìn)一步地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：以NB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度 為 30g/L 的碳源、7g/L 的凝膠劑、L 2 ~2. 0mg/L 的 TDZ、0. 2 ~0· 5mg/L 的 NAA ;
[0022] 所述愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為 30g/L 的碳源、7g/L 的凝膠劑、2. 0 ~3. 0mg/L 的 6-BA、0. 01 ~0. lmg/L 的 NAA ;
[0023] 所述不定苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為30g/L的碳 源、7g/L的凝膠劑、0. 1~0. 5mg/L的6-BA ;
[0024] 所述生根培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為30g/L的碳源、7g/ L的凝膠劑、0· 05mg/L的IBA。
[0025] 更進(jìn)一步地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：以NB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃 度為30g/L的碳源、7g/L的凝膠劑、I. 5mg/L的TDZ、0. 2mg/L的NAA ;
[0026] 所述愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為 30g/L 的碳源、7g/L 的凝膠劑、2. 5mg/L 的 6-BA、0. 01mg/L 的 NAA ;
[0027] 所述不定苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為30g/L的碳 源、7g/L的凝膠劑、0· 5mg/L的6-BA ;
[0028] 所述生根培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加終濃度為30g/L的碳源、7g/ L的凝膠劑、0· 05mg/L的IBA。
[0029] 其中，所述碳源為蔗糖；所述凝膠劑為瓊脂。
[0030] 本發(fā)明提供了上述聯(lián)合用培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：
[0031] 稱取愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的各組分，混勻溶解后，得愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
[0032] 稱取愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基的各組分，混勻溶解后，得愈傷組織增殖及分化 培養(yǎng)基；
[0033] 稱取不定苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的各組分，混勻溶解后，得不定苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基；
[0034] 稱取生根培養(yǎng)基的各組分，混勻溶解后，得生根培養(yǎng)基。
[0035] 本發(fā)明還提供了上述聯(lián)合用培養(yǎng)基在黃瓜子房離體再生中的用途。
[0036] 本發(fā)明的聯(lián)合用培養(yǎng)基，可以用于黃瓜子房離體再生，使黃瓜子房通過愈傷組織 再生分化途徑得到形態(tài)正常的普通二倍體再生植株。
[0037] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0038] (1)基因型制約較?。簩?duì)中國黃瓜主要栽培類型華北型和華南型黃瓜均適用；
[0039] (2)可以實(shí)現(xiàn)黃瓜的高效離體再生：首先愈傷組織誘導(dǎo)率高，10粒種子可得到200 個(gè)子房，可誘導(dǎo)初始愈傷組織60個(gè)以上，大大節(jié)約種子使用量；其次愈傷組織增殖能力強(qiáng)， 在離體再生過程中再生的愈傷組織可以大量增殖，無限擴(kuò)繁；而且愈傷組織分化能力強(qiáng)，單 個(gè)直徑約3cm的愈傷組織可分化再生苗4-6苗，可達(dá)到黃瓜再生苗的持續(xù)不斷的、規(guī)?；?產(chǎn)；
[0040] (3)工作量?。号c主流的子葉/子葉節(jié)誘導(dǎo)得到再生植株方法相比，減少了從種子 得到無菌苗的培養(yǎng)步驟。
[0041] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0042] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】