一種人源化小鼠的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種人源化小鼠，尤其是一種在人源細胞表達人 鼠融合CD47基因進而促進人源細胞在小鼠體內(nèi)正常生長發(fā)育并發(fā)揮功能的人源化小鼠。
【背景技術】
[0002] 人類免疫學、免疫病理學等的研宄發(fā)現(xiàn)轉化為臨床療法時常受到不能直接在人體 進行體內(nèi)實驗研宄的限制。人類疾病的小鼠模型雖然能提供很多有用信息，但是由于人類 生理與動物生理有顯著的差別，利用動物模型得到的實驗結果有時不能適用到人體上，而 非人類的靈長類動物研宄能夠填平物種親緣關系太遠而存在的差別溝壑，但是其使用受限 于其高昂的費用、缺乏近交系和倫理問題。在轉化醫(yī)學時代，復雜的生物學機制需要體內(nèi)實 驗分析，因此，這就需要一種新的動物模型，該模型要能支持體內(nèi)人體組織和細胞的研宄。 人源化小鼠剛好符合這個要求，該模型的使用能獲得對很多人類感染和炎癥疾病的深入研 宄。
[0003] 1988年世上第一個成功地用重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID)小鼠建立了異基因移植小 鼠模型【Mosier DE，et al. Nature 1988;335:256 - 9.】。目前制作免疫系統(tǒng)人源化小鼠是 通過在免疫缺陷小鼠移植人體造血干細胞。常見的受體鼠有NOD-scid IL2ry-/_小鼠、 BALB/c背景的Rag2-/-IL2r y-/-小鼠和C57BL/6背景的Rag2-/-IL2r y -/-CD47-/-小 鼠【Lavender KJ，et al. Blood. 2013, 122 (25): 4013-4020】。通過敲除IL2ry、Rag2基因 或Prkdc基因自然突變能導致免疫功能障礙，使B、T和NK細胞缺失，從而能進行異種移 植【Shultz LD，et al. Nat Rev Immunol. 2007 ;7:118-130;Ito M，et al. Blood 2002; 100:3175 - 3182 ；Shultz LD, et al. J Immunol. 2005；174:6477 - 6489]〇
[0004] NOD遺傳背景的小鼠相對缺乏吞細胞活性【Legrand N, et al. J Immunol 2006;176:2053 - 2058 ;Shultz LD，et al.J Immunol 1995;154:180 - 191】，而BALB/c 和C57BL/6小鼠吞噬細胞活性較強，阻礙了人源化T、NK細胞的發(fā)育。吞噬細胞的活性能 通過⑶47和SIRPa分子間的相互識別并結合而被抑制【Barclay AN. 2009;Curr Opin Immunol 21:47 - 52】。SIRPa表達在巨噬細胞和樹突狀細胞上，該分子能識別并結合 0)47分子，而⑶47分子廣泛表達于幾乎所有的細胞上【Kharitonenkov A, et al. Nature 1997；386:181 - 186 ；Seiffert M, et al. Blood 1999；94: 3633 - 3643 ；Lindberg FP, et al.J Cell Biol 1993;123:485 - 496】。不表達CD47的造血細胞會很快被血液中的巨 噬細胞和樹突狀細胞所清除【01 denborg PA,et al. Science 2000;288:2051 - 2054; Blazar BR,et al.J Exp Med 2001;194:541 - 550】，因此CD47是一個識別自身細胞的 必要標記物。由于人源細胞表達的⑶47不同于小鼠⑶47,小鼠SIRPa分子不能識別 人CD47分子，因此人源細胞容易被小鼠吞噬細胞吞噬，從而使建立人源化小鼠難于成 功。基于此，近來針對SIRPa和⑶47分子進行了基因修飾來阻止小鼠細胞吞噬人源細 胞，比如在人源造血干細胞轉入小鼠⑶47分子【Legrand N，et al.Proc Natl Acad Sci USA. 2011 ; 108(32):13224 - 13229】，在小鼠轉入人SIRPa基因【StrowigT, et al. Proc NatlAcadSciUSA. 2011 ;108(32): 13218 - 13223】，敲除小鼠CD47 基因【LavenderKJ，et al.Blood. 2013, 122(25) : 4013-4020】等，取得了較好的效果。
[0005] 盡管在人源細胞表達小鼠⑶47能阻止吞噬細胞吞噬人源細胞，但是由于 CD47分子本身也是一個信號分子，它不僅能與SIRPa反應，還能與多種其他分子進 行反應（如thrombospondin,integrins,其他的SIRP家族成員SIRPy等）【van BeekEM,etal.JImmunol2005 :175:7781 - 7787:SarfatiM.etal.CurrentDrug Targets, 2008 ;9:842-850】，因此，CD47除了作為SIRPa配體而起到識別自我組織的 作用外，它還通過與其他配體結合而介導其他許多生理活動，比如影響T細胞功能等 (0)47與thrombospondin-1 (TSP-1)或可溶性⑶47單克隆抗體結合能抑制T細胞功能【AviceMN，etal.J.Immunol. 2000 ;165(8):4624_31;AviceMN，etal.J.Immunol. 2001; 167(5):2459-68；LiZ,etal.J.Immunol. 2001 ；166(4):2427-36；ffaclavicekM,et al.J.Immunol. 1997 ; 159 (11) : 5345-54】)、影響細胞自我更新（CD47與配體TSP-1結合后通 過抑制c-myc等的表達而影響細胞自我更新等【KaurS，etal.SciRep. 2013 ;3:1673】）、 以及影響炎性反應（⑶47與⑶47單克隆抗體或L-SIRP-alpha結合抑制IL-12R的表達并下 調(diào)活化的T細胞對IL-12 的反應【LatourS,etal.JImmunol. 2001 ; 167(5) : 2547-54.】）。 因此CD47不僅僅作為一個與它反應的受體的配體而存在，它本身也是一個信號分子或受 體，起到傳遞胞外信號進細胞的作用。
[0006] 在現(xiàn)有的制作人源化小鼠技術中，為了不使小鼠巨噬細胞和DC細胞吞噬人源細 胞，只是把小鼠⑶47基因表達于人源細胞上，該表達于人源細胞上的小鼠⑶47分子只是起 到讓小鼠吞噬細胞識別人源細胞為自身細胞而不吞噬人源細胞的作用，但是由于小鼠CD47 分子與人CD47分子存在差異，很多胞外信號并不能通過小鼠CD47分子被人源細胞感知并 觸發(fā)應有的生理反應，而本身就表達在人源細胞上的人CD47分子對小鼠CD47的配體或受 體又不能識別，從而使得人源細胞在小鼠體內(nèi)缺乏很多需要通過CD47傳遞的胞外信號的 刺激，細胞外的信息不能暢達至細胞內(nèi)，從而影響到人源細胞在小鼠體內(nèi)生長發(fā)育的正常 進行與功能的正常發(fā)揮。這一點已經(jīng)被我們實驗所證實，比如在表達了小鼠⑶47的人源T 細胞，小鼠TSP-1或可溶性CD47單克隆抗體不能抑制該人源T細胞的功能，而對于小鼠T 細胞則其功能能被小鼠TSP-1或可溶性CD47單克隆抗體抑制，說明在人源細胞表達的小鼠 CD47不能把胞外信息順利傳遞到人源細胞內(nèi)部。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有制備人源化小鼠技術的在人源細胞表達的小鼠 CD47不能順暢地把胞外信號進傳遞入胞內(nèi)的缺點，本發(fā)明通過基因改建提供一種人源化小 鼠，該小鼠不僅能使小鼠吞噬細胞識別人源細胞為自身細胞而不再吞噬人源細胞，而且能 使人源細胞在小鼠體內(nèi)獲得正常的胞外信息，促進其在小鼠體內(nèi)進行正常的生長發(fā)育并發(fā) 揮功能，從而提高人源化小鼠的應用價值。
[0008] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0009] 本發(fā)明的人源化小鼠，其人源細胞上表達小鼠-人融合⑶47基因，該基因的胞外 部分為小鼠CD47序列，而穿膜部分和胞內(nèi)部分為人CD47序列；或者胞外部分和穿膜部分為 小鼠CD47氨基酸序列，胞內(nèi)部分為人CD47氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明的人源化小鼠，人源細胞上表達的融合CD47分子，其胞外部分能被小鼠 SIRPa、TSP-1及其他小鼠CD47的配體或受體所識別，胞內(nèi)部分能很好地把胞外所受到的 信號讓人源細胞感知并作出應有的反應，達到既能使小鼠吞噬細胞識別人源細胞為自身細 胞而不再吞噬，又能使人源細胞在小鼠體內(nèi)環(huán)境下獲得正常的胞外信息的目的。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是轉入該小鼠-人融合⑶47基因的人源細胞，在不被小鼠吞噬 細胞吞噬的同時，能使小鼠體內(nèi)環(huán)境下胞外信息傳遞到人源細胞并被人源細胞所感知并作 出應有反應，使人源化小鼠中的人源細胞正常生長發(fā)育并發(fā)揮功能。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明融合CD47的載體質粒圖，其中各元件如下：
[0013]
[0014]
[0015] 圖2是經(jīng)免疫接種滅活的白色念珠菌3天后，對照人源化小鼠（人源細胞表達小 鼠CD47)和融合CD47人源化小鼠（人源細胞表達小鼠-人融合CD47)中人源CD4和白介 素4雙陽性細胞白介素表達強度的比較圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)