利用人源化的小鼠來確定毒性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種確定藥劑是否會(huì)在人類中引起免疫毒性的方法。該方法包括向已被移植人造血干細(xì)胞(HSC)和施用一種或多種人細(xì)胞因子的非人類哺乳動(dòng)物施用該藥劑；以及確定藥劑是否在非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫毒性，其中如果所述藥劑在非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫毒性，則所述藥劑在人類中引起毒性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種確定藥劑施用是否在需要的個(gè)體中引起細(xì)胞因子釋放綜合征的方法。該方法包括向已移植HSC和施用一種或多種人細(xì)胞因子的非人類哺乳動(dòng)物施用該藥劑；和確定所述藥劑是否在非人類哺乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征，其中如果所述藥劑在非人類哺乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征，則該藥劑在人類中引起細(xì)胞因子釋放綜合征。
【專利說明】利用人源化的小鼠來確定毒性
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2011年12月6日提交的61/567, 466號(hào)美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)。
[0003] 上述申請的全文通過引用在此引入。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 由于接近于人體的模型往往無法準(zhǔn)確地預(yù)測許多不利的影響，臨床前和臨床試驗(yàn) 之間存在明顯的差距。在I期臨床試驗(yàn)中，施用TGN1412(開發(fā)用于治療自身免疫性疾病的 人源化超激動(dòng)（superagonistic)CD28單克隆抗體（IgG4))導(dǎo)致了與"細(xì)胞因子風(fēng)暴"癥狀 相關(guān)的災(zāi)難性事件。急需建立一個(gè)可以準(zhǔn)確地預(yù)測這種不利影響的模型。具有增強(qiáng)的人免 疫細(xì)胞移植特性的免疫缺陷NOD-scid IL2rY null小鼠給出了一種有吸引力的模型。然而， 由于在當(dāng)前的模型中觀察到弱的人類免疫反應(yīng)，它們的廣泛使用受到限制。
[0006] 因此，需要可以準(zhǔn)確地預(yù)測藥劑（例如，治療劑）對人體免疫系統(tǒng)的不利影響的改 進(jìn)的模型。
[0007] 發(fā)明概沭
[0008] 通過向小鼠注射人造血干細(xì)胞和人細(xì)胞因子（例如，人IL-I5和Flt-3L細(xì)胞因 子）改進(jìn)人源化小鼠模型的免疫反應(yīng)。本發(fā)明證明，細(xì)胞因子處理的人源化（CTH)小鼠模型 得以以高保真度預(yù)測了在臨床中或臨床前試驗(yàn)中使用的四種不同單克隆抗體的不利影響。
[0009] 因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種確定（一種或多種）藥劑是否會(huì)在人類中引 起免疫毒性的方法。該方法包括向已移植人造血干細(xì)胞（HSC)和施用一種或多種人類細(xì) 胞因子的非人類哺乳動(dòng)物施用該藥劑；以及確定藥劑是否會(huì)在非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫 毒性，其中，如果所述藥劑在非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫毒性，則所述藥劑在人類中引起毒 性。
[0010] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種確定施用（一種或多種）藥劑是否會(huì)在需要的個(gè) 體（例如，人）中引起細(xì)胞因子釋放綜合征的方法。該方法包括向已移植人造血干細(xì)胞 (HSC)和施用一種或多種人類細(xì)胞因子的非人類哺乳動(dòng)物施用該藥劑；以及確定所述藥劑 是否會(huì)在該非人類哺乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征，其中，如果所述藥劑在該非人類 哺乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征，則該藥劑在人類中引起細(xì)胞因子釋放綜合征。
[0011] 附圖簡要說明
[0012] 本專利或申請文件包含至少一張以彩色繪制的附圖。帶有彩色附圖的本專利或?qū)?利申請的副本將經(jīng)請求和支付必要費(fèi)用后由專利局提供。
[0013] 圖1 :注射TGN 1412引起一大組全身性促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。在TGN 1412-IgG4(小鼠抗-人⑶28抗體5· 11A1的人源化形式（同種型：人IgG4/Kappa)，在本文 也被稱為TGN1412)和TGN1412-AA (小鼠抗-人⑶28抗體5. 11A1的人源化FcR-非結(jié)合形 式（同種型：人IgG4/Kappa))處理組的血清中在處理前48小時(shí)、注射后2小時(shí)和24小時(shí) 測量細(xì)胞因子產(chǎn)生。也將值與鹽水注射的對照組進(jìn)行了比較。通過BD FACSArray分析來 測定人白介素-2〇111^-2)、1111^-6、1111^-8、1111^-10、1111^-4、11正^￥和於嚦-〇的量。各個(gè) 符號(hào)代表一只小鼠。相同的符號(hào)表不在不同時(shí)間點(diǎn)的相同的小鼠。η值表不在每一組中使 用的小鼠的數(shù)目，來自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0014] 圖2A-2B :在TGN1412處理后注意到T細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比和絕對數(shù)的變化。在指 示時(shí)間點(diǎn)對小鼠采血和分析PBMC的人CD45 (hCD45)。（2A)顯示了按照流式細(xì)胞分析，門控 于人⑶45細(xì)胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分比和門控于來自小鼠 PBMC的⑶45+⑶3+ 細(xì)胞上的CD4+和CD8+的百分比的比較。（2B)根據(jù)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算的活細(xì)胞數(shù)和從 流式細(xì)胞分析獲得的相應(yīng)細(xì)胞群的百分比之間的相關(guān)性計(jì)算不同細(xì)胞譜系的絕對數(shù)。
[0015] 圖3 :向沒有用IL-15和FLT3L細(xì)胞因子處理的人源化小鼠注射TGN1412-lgG4未 伴隨細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加。在處理前48小時(shí)、注射后2和24小時(shí)測量TGN1412-IgG4處理 組的血清中的細(xì)胞因子產(chǎn)生。也將值與鹽水注射的對照組進(jìn)行比較。通過BD FACSArray 分析測定 1111^-2、1111^-6、1111^-8、1111^-113、11幾 -4、11正^￥和1^嚦-〇的量。各個(gè)符號(hào)代表一 只小鼠。相同的符號(hào)表示在不同時(shí)間點(diǎn)的相同的小鼠。η值表示在每組中使用的小鼠的數(shù) 目，來自單一的實(shí)驗(yàn)。
[0016] 圖4Α-4Β :在未用IL-15和FLT3L細(xì)胞因子處理的人源化小鼠的TGN1412處理后 注意到Τ、Β和ΝΚ細(xì)胞百分比和絕對數(shù)的變化。在指示時(shí)間點(diǎn)對小鼠采血和分析PBMC的人 ⑶45(h⑶45)。（4Α)顯示了按照流式細(xì)胞分析，門控于人⑶45細(xì)胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、 ⑶56+的百分比和門控于來自小鼠的PBMC的⑶45+⑶3+細(xì)胞上的⑶4+和⑶8+的百分比的比 較。（4B)根據(jù)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算的活細(xì)胞數(shù)和從流式細(xì)胞分析獲得的相應(yīng)細(xì)胞群的百 分比之間的相關(guān)性計(jì)算不同細(xì)胞譜系的絕對數(shù)。
[0017] 圖5 :注射0KT3引起一大組全身的促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。在處理前48小時(shí)、注射 后2小時(shí)和24小時(shí)，在0KT3治療組的血清中測量細(xì)胞因子的產(chǎn)生。也將值與鹽水注射的 對照組進(jìn)行比較。通過 BDFACSArray 測定 hIL-2、hIL-6、hIL-8、hIL-Ι β、hIL-4、hlFN- γ 和hTNF-α的量。各個(gè)符號(hào)代表一只小鼠。相同的符號(hào)表不在不同時(shí)間點(diǎn)的相同的小鼠。 η值表示在每一組中使用的小鼠的數(shù)目，來自三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0018] 圖6Α-6Β :在0ΚΤ3處理后注意到幾個(gè)細(xì)胞百分比和絕對數(shù)的變化。在指示時(shí)間點(diǎn) 對小鼠采血和按在圖1中提到的分析PBMC的人CD45(hCD45)。（6Α)顯示了按照流式細(xì)胞 儀分析，門控于來自小鼠 PBMC的人⑶45細(xì)胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分?jǐn)?shù)的比 較。（6B)示出不同細(xì)胞譜系的絕對數(shù)。
[0019] 圖7 :阿侖單抗注射表現(xiàn)出促炎性細(xì)胞因子的略微增加。在在處理前48小時(shí)、注 射后2小時(shí)和24小時(shí)測量阿侖單抗治療組的血清中的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。也將值與鹽水注 射的對照組進(jìn)行比較。η值表示在每一組中使用的小鼠的數(shù)目，來自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0020] 圖8Α-8Β :阿侖單抗的注射與淋巴細(xì)胞、ΝΚ細(xì)胞和單核細(xì)胞的急劇減少相關(guān)聯(lián)。在 指示時(shí)間點(diǎn)對小鼠采血和按在圖1中提到的分析PBMC的人CD45(hCD45)。（8Α)顯示了按 照流式細(xì)胞分析，門控于來自小鼠 PBMC的人⑶45+細(xì)胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+和⑶56+的 百分?jǐn)?shù)的比較。（8B)示出不同細(xì)胞譜系的絕對數(shù)。
[0021] 圖9 :注射利妥昔單抗對全身性促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生沒有顯示出任何明顯的影 響。在處理前48小時(shí)、注射后2小時(shí)和24小時(shí)，測量利妥昔單抗處理組的血清中的細(xì)胞因 子產(chǎn)生。也將值與鹽水注射的對照組進(jìn)行比較。測量的不同細(xì)胞因子的量保持不變。η值 表示在每組中使用的小鼠的數(shù)目，來自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0022] 圖10Α-10Β :在所有所分析的不同細(xì)胞譜系中，只有Β細(xì)胞表現(xiàn)出百分比和總數(shù)的 變化。在指示時(shí)間點(diǎn)對小鼠采血和按在圖1中提到的分析PBMC的人CD45(hCD45)。（10A) 顯示了按照流式細(xì)胞分析，門控于來自小鼠 PBMC的人⑶45+細(xì)胞上的⑶3+、⑶14+、⑶19+和 CD56+的百分?jǐn)?shù)的比較。（10B)示出不同細(xì)胞譜系的絕對數(shù)。
[0023] 圖11A-11D :在細(xì)胞因子處理的小鼠（11A、11B)和未處理的小鼠（圖11C、11D)中 施用TGN1412-IgG4、TGN1412-AA、0KT3、阿侖單抗和利妥昔單抗后肝酶的檢測。（11A，11B) TGN1412-IgG4的施用與處理后24小時(shí)天冬氨酸和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST和ALT)水平的 升高相關(guān)。TGN1412-AA注射只與ALT的升高有關(guān)。施用0KT3、阿侖單抗和利妥昔單抗沒有 引起任何測試的肝酶的顯著增加。（11C，11D)施用TGN1412-IgG4沒有引起任何被測試的肝 酶的增強(qiáng)。
[0024] 圖12A-12B :將從2個(gè)對照人源化小鼠的脾臟中分離的細(xì)胞用人抗體染色并用流 式細(xì)胞術(shù)分析。示意圖顯示在（12A)⑶45+CD3+⑶4+和⑶45+⑶3+⑶4+人細(xì)胞上和（12B)天然 的、效應(yīng)和記憶⑶4+細(xì)胞上的⑶28的表達(dá)。
[0025] 圖13 :將從對照、TGN1214-IgG4和TGN1214-AA的脾臟中分離的總細(xì)胞計(jì)數(shù)和用不 同的人抗體染色。
[0026] 圖14 :對從對照、TGN1214_IgG4的脾臟中分離的總細(xì)胞計(jì)數(shù)和用不同的人抗體染 色。
[0027] 圖15 :向用人IL-15和FLT3L人細(xì)胞因子質(zhì)粒處理的小鼠施用TGN1412和0KT3弓| 起一大組全身性促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，雖然阿侖單抗注射表現(xiàn)出hIL-6和hIL-8細(xì)胞因 子的略微增加。利妥昔單抗注射對促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生沒有顯示出任何明顯的影響。在 處理前48小時(shí)、注射后2小時(shí)和24小時(shí)，測量16附412-1 864、16附412-44、0〇3、阿侖單抗 和利妥昔單抗處理組的血清中的細(xì)胞因子產(chǎn)生。也將值與鹽水注射的對照組進(jìn)行了比較。 通過 BDFACSArray 分析來測定 hIL-2、hIFN- γ、hIL-6、hIL-8、hTNF- a、hIL-l β 和 hIL-4 的 量。每個(gè)符號(hào)代表一只小鼠。η值表示在每組中使用的小鼠的數(shù)目，來自至少三個(gè)獨(dú)立的實(shí) 驗(yàn)。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（非參數(shù)AN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*Ρ < 0. 05 ;**Ρ < 0. 005 ; 彡 0. 0001。
[0028] 圖16Α-16Η:在注射了 IL-15和FLT3L人類細(xì)胞因子質(zhì)粒的小鼠進(jìn)行TGN1412、 0KT3、阿侖單抗和利妥昔單抗處理后注意到T、NK和B細(xì)胞的細(xì)胞百分比和絕對數(shù)的變化。 在指示時(shí)間點(diǎn)對小鼠采血和分析PBMC的人⑶45 (h⑶45)和小鼠⑶45 (mCD45)。（16A，16B 和16C)根據(jù)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算的活細(xì)胞數(shù)和從流式細(xì)胞分析獲得的相應(yīng)細(xì)胞群的百 分比之間的相關(guān)性計(jì)算不同細(xì)胞譜系的絕對數(shù)。（16D)顯示了按照流式細(xì)胞分析，門控于人 ⑶45上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分比的比較，（16E和16F)門控于活細(xì)胞上的h⑶45 和mCD45的百分比的比較和（16G)門控于來自小鼠 PBMC的⑶45+⑶3+細(xì)胞上的⑶4+和 ⑶8+的百分比的比較。（16H)人⑶45+細(xì)胞重構(gòu)的水平的比較。通過Kruskal-Wallis檢 驗(yàn)（非參數(shù)AN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P彡0· 05 ;#P彡0· 005 彡0· 0001。
[0029] 圖17:向未用IL-15和FLT3L人類細(xì)胞因子質(zhì)粒處理的人源化小鼠注射 TGN1412-IgG4未伴隨全身性細(xì)胞因子釋放。在處理前48小時(shí)、注射后2和24小時(shí)，在 TGN1412-IgG4處理組的血清中測量細(xì)胞因子的產(chǎn)生。也將值與鹽水注射的對照組進(jìn)行比 較。通過8〇?4〇541*四7分析測定1111^-2、11正^^、11比-6、11比-8、1^嚦-〇、}1比-10和1111^-4 的量。每個(gè)符號(hào)代表一只小鼠。相同的符號(hào)表不在不同時(shí)間點(diǎn)的相同的小鼠。η值表不在 每一組中使用的小鼠的數(shù)目，來自單一的實(shí)驗(yàn)。
[0030] 圖18A-18H :在未用IL-15和FLT3L細(xì)胞因子處理的人源化小鼠的TGN1412處理 后注意到T、B和NK細(xì)胞的百分比和絕對數(shù)的變化。在指示時(shí)間點(diǎn)對小鼠采血和分析PBMC 的人CD45(hCD45)。（18A，18B和18C)如前所述計(jì)算不同細(xì)胞譜系的絕對數(shù)。（18D)顯示了 按照流式細(xì)胞分析，門控于人⑶45上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、⑶56+的百分比的比較，（18E和 18F)門控于活細(xì)胞上的hCD45和mCD45的百分比的比較和（18G)門控于來自小鼠 PBMC的 ⑶45+⑶3+細(xì)胞上的⑶4+和⑶8+的百分比的比較。（18H)人⑶45+細(xì)胞重構(gòu)的水平的比 較。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（非參數(shù)AN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P彡0. 05 ;**P彡0. 005。
[0031] 圖19 :向用M-CSF細(xì)胞因子處理的小鼠注射TGN1412和0KT3增加了全身性IL-6 和IL-8的產(chǎn)生。在處理前48小時(shí)、注射后2和24小時(shí)，在TGN1412-IgG4和0ΚΤ 3處理組 的血清中測量細(xì)胞因子的產(chǎn)生。也將值與鹽水注射的對照組進(jìn)行比較。如前面所述地測定 人細(xì)胞因子的量。每個(gè)符號(hào)代表一只小鼠。η值表示在每一組中使用的小鼠的數(shù)目，來自至 少三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（非參數(shù)AN0VA)和配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析：*P < 0· 05 ;**P < 0· 005 ;***P < 0· 0001。
[0032] 圖20A-20H :注射了 M-CSF人細(xì)胞因子質(zhì)粒的小鼠用TGN1412-IgG和0KT3T處理 后注意到T、NK和B細(xì)胞的細(xì)胞百分比和絕對數(shù)的變化。在指示時(shí)間點(diǎn)對小鼠采血和分析 PBMC的人⑶45 (h⑶45)和小鼠⑶45 (mCD45)。（20A，20B和20C)按前面所述計(jì)算不同細(xì)胞 譜系的絕對數(shù)。（20D)顯示了按照流式細(xì)胞儀分析，門控于人⑶45上的⑶3+、⑶14+、⑶19+、 ⑶56+的百分比的比較，（20E和20F)門控于活細(xì)胞上的h⑶45和mCD45的百分比的比較和 (20G)門控于來自小鼠 PBMC上的⑶45+⑶3+的⑶4+和⑶8+細(xì)胞的百分比的比較。（20H) 人⑶45+細(xì)胞重構(gòu)的水平的比較。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（非參數(shù)AN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析：*P < 0· 05 ;**P < 0· 005。
[0033] 圖21 :向用IL-15和FLT3L或M-CSF人細(xì)胞因子質(zhì)粒處理的小鼠注射TGN1412和 0KT3引起小鼠 mIL-6而非mIL-2或mIFN-γ的輕微增加。在用于人細(xì)胞因子的同一時(shí)間 點(diǎn)測量血清中的細(xì)胞因子產(chǎn)生。通過BD FACSArray分析測定mIL-2、mIFN-Y和mIL-6的 量。每個(gè)符號(hào)代表一只小鼠。η值表示在每一組中使用的小鼠的數(shù)目，來自至少兩個(gè)獨(dú)立的 實(shí)驗(yàn)。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（非參數(shù)AN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*Ρ彡0. 05。
[0034] 圖22A-22D :向用細(xì)胞因子處理的小鼠（22Α，22Β)和未處理的小鼠（22C，22D) 施用TGN1412-IgG4、TGN1412-AA、0KT3、阿侖單抗和利妥昔單抗后檢測肝酶。（22A，22B) TGN1412-IgG4的施用與處理后24小時(shí)天門冬氨酸和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST和ALT)水平 的升高相關(guān)。注射TGN1412-AA只與ALT的升高有關(guān)。施用0KT3、阿侖單抗和利妥昔單抗 沒有引起任何被測試的肝酶的顯著增加。（22C，22D)施用TGN1412-IgG4沒有引起任何測 試的肝酶的增強(qiáng)。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（非參數(shù)AN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P < 0. 05 ; **P < 0. 005。
[0035] 圖23A-23B :從2個(gè)對照的人源化小鼠的脾臟中分離的細(xì)用人抗體染色，并用流式 細(xì)胞術(shù)分析。示意圖顯示在（23A)⑶45+⑶3+⑶8+和⑶45+⑶3+⑶4+人類細(xì)胞和（23B)天 然的、效應(yīng)和記憶⑶4+細(xì)胞上的⑶28的表達(dá)。
[0036] 圖24 :對從對照、TGN1214-IgG4和TGN1214-AA的脾臟中分離的總細(xì)胞計(jì)數(shù)和用不 同人抗體染色。
[0037] 圖25 :對從對照、TGN1214_IgG4的脾臟中分離的總細(xì)胞計(jì)數(shù)和用不同人抗體染 色。
[0038] 發(fā)明詳沭
[0039] 如本文所述，產(chǎn)生經(jīng)細(xì)胞因子處理的人源化（CTH)小鼠并評價(jià)其預(yù)測藥劑（例如， 治療劑）在例如臨床中觀察的免疫毒性的能力。經(jīng)細(xì)胞因子處理的人源化小鼠注射不同 的治療性抗體，TGN1412(抗-⑶28)、0KT3(抗-⑶3)、阿侖單抗（抗⑶S2)和利妥昔單抗 (抗-CD20)，和通過細(xì)胞免疫表型分型、細(xì)胞因子和肝酶測量分析副作用。四種抗體在人源 化小鼠中的治療效果和副作用可與臨床觀察相比。TGN1412和0ΚΤ3處理的小鼠都表現(xiàn)出主 要炎性細(xì)胞因子的顯著增加，伴隨Τ細(xì)胞的耗盡、ΝΚ細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低和肝酶增加。阿侖單 抗處理的小鼠表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞的急劇耗盡，但細(xì)胞因子水平僅 略微提高（對IL-8顯著）。這些反應(yīng)在利妥昔單抗處理的小鼠中不存在，其中注意到Β細(xì) 胞的耗盡。非細(xì)胞因子處理的小鼠的施用沒有引起細(xì)胞因子反應(yīng)。這些結(jié)果表明，CTH小 鼠可以以高的保真度和精確性預(yù)測藥劑如治療劑的免疫毒性。
[0040] 因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種確定（一種或多種）藥劑是否會(huì)在人類中引 起毒性的方法。該方法包括向已移植人造血干細(xì)胞（HSC)和施用一種或多種人細(xì)胞因子的 非人類哺乳動(dòng)物施用該藥劑；以及確定藥劑是否在非人類哺乳動(dòng)物中引起毒性，其中，如果 所述藥劑在非人類哺乳動(dòng)物中引起毒性，則所述藥劑在人類中引起毒性。
[0041] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種確定（一種或多種）藥劑是否會(huì)在人類中引起免 疫毒性的方法。該方法包括向已移植人造血干細(xì)胞（HSC)和施用一種或多種人細(xì)胞因子的 非人類哺乳動(dòng)物施用該藥劑；以及確定所述藥劑是否在非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫毒性， 其中，如果所述藥劑在非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫毒性，則該藥劑在人類中引起毒性。
[0042] 如本文所用，如果藥劑對個(gè)體（例如，人）引起損傷或損害，則藥劑是毒性的或引 起毒性的。毒性可以是，例如，急性的或慢性的。在具體的方面，本發(fā)明涉及確定由在人源 化的非人類哺乳動(dòng)物如人源化的小鼠（例如，細(xì)胞因子處理的人源化小鼠）中重構(gòu)的人免 疫細(xì)胞引起的毒性的方法。使用如本文所述的人源化小鼠的優(yōu)點(diǎn)在于，它允許探究或確定 由人免疫系統(tǒng)（于非人類哺乳動(dòng)物如小鼠中重構(gòu)的）對藥劑如治療劑的反應(yīng)引起的體內(nèi)毒 性。
[0043] 免疫毒性指的是藥劑對個(gè)體免疫系統(tǒng)功能作用的不良的/非有意的效果。參見， 例如，Weir, A, Journal of Immunotoxicology, 5:3-10(2008) ;Gribble，EJ.等，Expert Opinion Drug Metab Toxicol,3 (2) (2007)。
[0044] 在某些情況下，免疫毒性可以在個(gè)體中產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴、細(xì) 胞因子釋放綜合征或輸液反應(yīng)是通常在第一次接觸藥劑（例如，治療性mAb)時(shí)看到的 不良事件。它特征在于幾種炎性細(xì)胞因子的全身性釋放。癥狀的范圍從輕微到嚴(yán)重，包 括疲勞、頭痛、蕁麻疹、瘙癢、支氣管痙攣、呼吸困難、舌或咽喉腫痛感、鼻炎、惡心、嘔吐、 面色潮紅、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、低血壓、心動(dòng)過速和虛弱。參見，例如，Wing, M.等，Journal of Immunotoxicology, 5:11-15 (2008)和 Wang, Η·等，American Journal of Emergency Medicine, 26:711-715(2008)。
[0045] 因此，在又另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種確定施用（一種或多種）藥劑是否會(huì)在需 要的個(gè)體（例如，人類）中引起細(xì)胞因子釋放綜合征的方法。該方法包括向已移植人造血 干細(xì)胞（HSC)和施用一種或多種人細(xì)胞因子的非人類哺乳動(dòng)物施用該藥劑；以及確定所述 藥劑是否在非人類哺乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征，其中，如果所述藥劑在非人類哺 乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征，則該藥劑在人類中引起細(xì)胞因子釋放綜合征。
[0046] 如本文所用，HSC(例如，人HSC)是自我更新的干細(xì)胞，其在被移植到受體中時(shí)， "重新定殖"或"重構(gòu)"移植受體（例如，非人類哺乳動(dòng)物；免疫缺陷的非人類哺乳動(dòng)物）的 造血系統(tǒng)，和維持（例如，長期）受體中的造血作用。因此，當(dāng)人HSC移植到非人類哺乳動(dòng) 物中時(shí)，人HSC以人HSC重新定殖非人類哺乳動(dòng)物的造血系統(tǒng)。
[0047] 造血干細(xì)胞是產(chǎn)生（分化成）包括骨髓（例如，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì) 胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹突細(xì)胞）和淋巴譜系（例 如，T細(xì)胞、B-細(xì)胞、NK-細(xì)胞）的血細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞。重構(gòu)的人造血干細(xì)胞可以在 非人類哺乳動(dòng)物中分化成人NK細(xì)胞、人單核細(xì)胞、人巨噬細(xì)胞、人樹突細(xì)胞、人紅細(xì)胞、人B 細(xì)胞、人T細(xì)胞或它們的組合。
[0048] 造血干細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞標(biāo)志物⑶34并通常被稱為"⑶34+"。如本領(lǐng)域技術(shù)人員 所理解的，造血干細(xì)胞也可以表達(dá)其他細(xì)胞標(biāo)志物，如⑶133和/或⑶90 ( "⑶133+"， "⑶90+"）。在一些情況下，造血干細(xì)胞的特征在于不表達(dá)的標(biāo)志物，例如，⑶38。因此， 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在本文所述的方法中使用的人造血干細(xì)胞是CD34+、CD90+、 CD133+、CD34+CD38-、CD34+CD90+、CD34+CD133+CD38-、CD133+CD38-、CD133+CD90+CD38-、 ⑶34+⑶133+⑶90+⑶38-或它們的任意組合。在特定的實(shí)施方式中，造血干細(xì)胞為 CD34( "CD34+"）和CD133+( "CD133+"），在此也稱為"雙陽性"或"DP"細(xì)胞或者"DPC"。在 另一個(gè)實(shí)施方式中，造血干細(xì)胞是⑶34+⑶133+，并且可以進(jìn)一步包含⑶38-和/或⑶90+。
[0049] 造血干細(xì)胞存在于骨髓中，如在供體（例如，脊椎動(dòng)物如哺乳動(dòng)物，包括人類、靈 長類動(dòng)物、豬、小鼠等）的股骨、髖骨、肋骨、胸骨和其他骨骼中。用于臨床和科研用途的造 血干細(xì)胞的其他來源包括臍帶血、胎盤、胎肝、動(dòng)員的外周血、非動(dòng)員（或未動(dòng)員的）外周 血、胎兒肝、胎脾、胚胎干細(xì)胞和主動(dòng)脈-性腺-中腎（AGM)或它們的組合。
[0050] 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的，動(dòng)員的外周血指的是富集造血干細(xì)胞（例如， CD34+細(xì)胞）的外周血。施用如化學(xué)治療劑和/或G-CSF的藥劑從骨髓動(dòng)員干細(xì)胞到外周 循環(huán)中。例如，施用粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)至少或約5天動(dòng)員CD34+細(xì)胞到外周血。 在開始施用G-CSF后第5日觀察到發(fā)生30倍富集的循環(huán)⑶34+細(xì)胞的峰值。未經(jīng)外周血 的動(dòng)員，循環(huán)⑶34+細(xì)胞的數(shù)量非常低，估計(jì)在總單核血細(xì)胞的0. 01至0. 05%之間。
[0051] 在該方法中使用的人造血干細(xì)胞可以從單一供體或多個(gè)供體獲得。另外，在本文 描述的方法中使用的造血干細(xì)胞可以是新分離的造血干細(xì)胞、凍存的造血干細(xì)胞或它們的 組合。
[0052] 如本領(lǐng)域已知的，可以使用多種本領(lǐng)域已知的方法從這些來源獲得造血干細(xì)胞。 例如，可以使用針和注射器，通過從骨髓（例如髖骨、股骨中等）移取直接獲得造血干細(xì)胞， 或用誘導(dǎo)細(xì)胞從骨髓腔中釋放的細(xì)胞因子如粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)預(yù)處理供體后 從血液獲得造血干細(xì)胞。
[0053] 在本發(fā)明的方法中使用的造血干細(xì)胞可以如獲得的（例如，未擴(kuò)增的）直接 引入到非人類哺乳動(dòng)物中，或者在將造血干細(xì)胞引入到非人類哺乳動(dòng)物中之前被操縱 (例如，擴(kuò)增）。在一個(gè)實(shí)施方式中，在將造血干細(xì)胞引入到非人類哺乳動(dòng)物中之前擴(kuò) 增造血干細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，有多種方法可以用來擴(kuò)增造血干細(xì)胞（參 見，例如，Zhang, Y·，等人，Tissue Engineering, 12(8) :2161-2170(2006) ;Zhang CC， 等，Blood, 111 (7) :3415-3423(2008))。在特定的實(shí)施方式中，通過在生長因子（例如， 血管生成素樣5(Angplt5)生長因子、IGF結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、干細(xì)胞因子（SCF)、成 纖維細(xì)胞生長因子（FGF)、血小板生成素（TP0)或它們的組合）存在下，將造血干細(xì)胞 與間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)共培養(yǎng)以產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物而擴(kuò)增造血干細(xì)胞群體。細(xì)胞培養(yǎng) 物被保持在其中產(chǎn)生擴(kuò)增的造血干細(xì)胞群體的條件下（例如，見Khoury，M, Stem Cell Dev. ,2(8):1371-1381 (2011)和TO 2010/138873號(hào)國際申請，其在此引入作為參考）。
[0054] 在本文所述的方法中，藥劑被施用于已移植人造血干細(xì)胞及施用一種或多種人細(xì) 胞因子的非人類哺乳動(dòng)物。被施用于非人類哺乳動(dòng)物的一種或多種人細(xì)胞因子可以是（一 種或多種）細(xì)胞因子蛋白和/或（一種或多種）編碼一種或多種人細(xì)胞因子的核酸（例如， DNA，RNA)。該人細(xì)胞因子被施用于或引入到非人類哺乳動(dòng)物中以誘導(dǎo)人造血干細(xì)胞分化為 功能性人細(xì)胞（例如，功能性人血細(xì)胞譜系）。如本領(lǐng)域中已知的，細(xì)胞因子是刺激或抑制 免疫細(xì)胞的分化、增殖或功能的蛋白質(zhì)。許多人細(xì)胞因子蛋白和編碼人細(xì)胞因子的核酸序 列也是本領(lǐng)域中已知的和可獲得的（見，例如，WWW. ncbi. nlm. nih. gov)。用來獲得人細(xì)胞 因子蛋白和/或編碼一種或多種人細(xì)胞因子的核酸的方法是本領(lǐng)域中常規(guī)的且包括從各 種來源（例如血清）中分離蛋白質(zhì)或核酸（例如，克?。?、重組地產(chǎn)生蛋白質(zhì)或核酸或從商 業(yè)來源獲得蛋白質(zhì)或核酸。
[0055] 有各種各樣的人細(xì)胞因子可以在本發(fā)明的方法中使用。這樣的人細(xì)胞因子的實(shí) 例包括白介素-12(IL-12)、白介素15(IL-15)、Fms相關(guān)的酪氨酸激酶3配體（Flt3L)、 Flt3L/Flk2配體（FL)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、白介 素-3 (IL-3)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF)、促紅細(xì)胞生成素（ΕΡ0)、白介素23 (IL-23)、 白介素-3 (IL-3)、白介素9 (IL-9)、干細(xì)胞因子、白介素-7 (IL-7)、白17 (IL-17)和它們的組 合。被引入到非人類哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞因子的類型和細(xì)胞因子的數(shù)量將取決于，當(dāng)在非人 類哺乳動(dòng)物中發(fā)生人造血干細(xì)胞的分化時(shí)，那些人血細(xì)胞譜系被重構(gòu)。
[0056] 在一些方面，至少（包括）一種細(xì)胞因子、至少2種細(xì)胞因子、至少3種細(xì)胞因子、 至少4種細(xì)胞因子、至少5種細(xì)胞因子、至少6種細(xì)胞因子、至少7種細(xì)胞因子、至少8種細(xì) 胞因子、至少9種細(xì)胞因子、至少10種細(xì)胞因子、至少11種細(xì)胞因子、至少12種細(xì)胞因子、 至少13種細(xì)胞因子、至少14種細(xì)胞因子、至少15種細(xì)胞因子、至少16種細(xì)胞因子、至少17 種細(xì)胞因子、至少18種細(xì)胞因子、至少19種細(xì)胞因子或至少20種細(xì)胞因子被引入到非人 類哺乳動(dòng)物中。在其它方面中，僅（由其組成，基本上由其組成）一種細(xì)胞因子、2種細(xì)胞因 子、3種細(xì)胞因子、4種細(xì)胞因子、5種細(xì)胞因子、6種細(xì)胞因子、7種細(xì)胞因子、8種細(xì)胞因子、 9種細(xì)胞因子、10種細(xì)胞因子、11種細(xì)胞因子、12種細(xì)胞因子、13種細(xì)胞因子、14種細(xì)胞因 子、15種細(xì)胞因子、16種細(xì)胞因子、17種細(xì)胞因子、18種細(xì)胞因子、19種細(xì)胞因子或20種細(xì) 胞因子被引入到非人類哺乳動(dòng)物中。每種細(xì)胞因子蛋白質(zhì)和/或編碼各種人細(xì)胞因子的核 酸可以同時(shí)或相繼被引入（例如，在其中在非人類哺乳動(dòng)物中將表達(dá)超過一種細(xì)胞因子的 情況下，編碼各種細(xì)胞因子的各種核酸可以在其自己的單一質(zhì)?；蜉d體中被引入，或者可 以在多個(gè)質(zhì)?；蜉d體中被引入；或者，將被引入的所有編碼細(xì)胞因子的核酸可以在單一質(zhì) ?；蜉d體中被引入）。
[0057] 在本發(fā)明的方法中，人造血干細(xì)胞和人細(xì)胞因子蛋白和/或編碼一種或多種人細(xì) 胞因子的核酸被引入到非人類哺乳動(dòng)物中。如本文所用，術(shù)語"哺乳動(dòng)物"和"哺乳動(dòng)物的" 是指是指哺乳其幼崽并且生育活的幼體（真獸亞綱（eutharian)或胎盤哺乳動(dòng)物）或產(chǎn)卵 (后獸亞綱（metatharian)或非胎盤哺乳動(dòng)物）的任何脊椎動(dòng)物，其中包括單孔類動(dòng)物、有 袋類動(dòng)物和有胎盤哺乳動(dòng)物?？梢栽诒疚拿枋龅姆椒ㄖ惺褂玫牟溉閯?dòng)物物種的實(shí)例包括非 人類靈長類動(dòng)物（例如，猴和黑猩猩）、嚙齒動(dòng)物（例如，大鼠、小鼠、豚鼠）、犬科動(dòng)物、貓科 動(dòng)物和反芻動(dòng)物（如牛，豬，馬）。在一個(gè)實(shí)施方式中，非人類哺乳動(dòng)物是小鼠。在本文所述 方法中使用的非人類哺乳動(dòng)物可以是成年的、新生的（例如，〈48小時(shí)齡；幼仔）或子宮內(nèi) 的。
[0058] 在具體的實(shí)施方式中，非人類哺乳動(dòng)物是免疫缺陷的非人類哺乳動(dòng)物，也就是說， 在其免疫系統(tǒng)中具有一種或多種缺陷的非人類哺乳動(dòng)物（例如，NSG或NOD scidY (N0D. Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ)小鼠），并且其結(jié)果，允許在人造血干細(xì)胞引入時(shí)人血 細(xì)胞譜系的重構(gòu)。例如，非人類哺乳動(dòng)物缺乏其自身T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞或它們的組 合。在具體的實(shí)施方式中，非人類哺乳動(dòng)物是免疫缺陷小鼠；如攜帶重癥聯(lián)合免疫缺陷突 變的非肥胖型糖尿病小鼠（NOD/scid小鼠）、攜帶重癥聯(lián)合免疫缺陷突變并缺乏細(xì)胞因 子受體Y鏈的基因的非肥胖型糖尿病小鼠（NOD/scid IL2RY-/-小鼠）和Balb/c小鼠 rag_/_ γ c_/_ 小鼠。
[0059] 免疫缺陷小鼠的其它具體實(shí)例包括，但不限于，重癥聯(lián)合免疫缺陷（scid)小鼠、 非肥胖型糖尿?。∟OD)-scid小鼠、IL2rg+小鼠（例如，NOD/LySz-scid IL2rg+小鼠、N0D/ 511；[-8(^(111^2找/小鼠（腸6小鼠）、1^1^/(3-1^8/11^2找 /小鼠、!12<1-1^8/11^2找/小鼠）、 N0D/Rag+IL2rg+ 小鼠。
[0060] 在一些實(shí)施方式中，在引入人造血干細(xì)胞和人細(xì)胞因子（例如，蛋白質(zhì)和/或編碼 一種或多種人細(xì)胞因子的核酸，以進(jìn)一步提高人造血干細(xì)胞的重構(gòu)）之前處理或操作非人 類哺乳動(dòng)物。例如，非人類哺乳動(dòng)物可以被操作以進(jìn)一步增強(qiáng)人造血干細(xì)胞的移植和/或 重構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在引入造血干細(xì)胞和人細(xì)胞因子之前照射非人類哺乳動(dòng)物。在 另一個(gè)實(shí)施方式中，在引入造血干細(xì)胞和人細(xì)胞因子之前向非人類哺乳動(dòng)物施用一種或多 種化學(xué)治療劑。
[0061] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，有多種方式將造血干細(xì)胞、人細(xì)胞因子蛋白和編碼細(xì) 胞因子的核酸引入非人類哺乳動(dòng)物中。這種方法的例子包括，但不限于，皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜 內(nèi)、眼內(nèi)、股骨內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、心內(nèi)、肝內(nèi)、骨髓內(nèi)、皮下、局部、口服和鼻內(nèi) 施用途徑。其他合適的引入方法還可以包括，子宮內(nèi)注射、流體動(dòng)力學(xué)基因遞送、基因治療、 可再裝填或可生物降解的裝置、粒子加速裝置（"基因槍"）和緩釋的聚合物裝置。
[0062] 可以使用任何這樣的施用路徑等將造血干細(xì)胞引入到非人類中。在特定的實(shí)施方 式中，將造血干細(xì)胞心內(nèi)注射到非人類哺乳動(dòng)物中。
[0063] 也可以使用任何這樣的施用路徑引入一種或多種人細(xì)胞因子蛋白和/或編碼一 種或多種人細(xì)胞因子的核酸。在其中引入核酸的實(shí)施方式中，只要核酸在非人類哺乳動(dòng)物 中表達(dá)，可使用任何施用途徑。例如，編碼一種或多種細(xì)胞因子的核酸可以作為裸核酸（裸 DNA)、在質(zhì)粒（如，pcDNA3. 1(+))中或在病毒載體（例如，腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、逆 轉(zhuǎn)錄病毒等）中被引入。在特定實(shí)施方式中，使用高壓注射（hydrodynamic injection) (例如，注射至非人類哺乳動(dòng)物的尾靜脈中）將質(zhì)粒中的編碼一種或多種細(xì)胞因子的核酸 引入。
[0064] 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，可以使用替代的方法將一種或多種人細(xì)胞因子 引入非人類哺乳動(dòng)物中。例如，可以使用敲入方法。在分子克隆和生物學(xué)中，敲入（或 基因嵌入）指的是包括將蛋白質(zhì)編碼cDNA序列插入到生物體染色體的特定基因座的 基因工程方法。通常，這被用在小鼠中，因?yàn)橛糜谠撨^程的技術(shù)更精細(xì)，而且因?yàn)樾∈笈?胎干細(xì)胞很容易被操作。人細(xì)胞因子敲入小鼠是在其中特定的小鼠細(xì)胞因子基因座被 人細(xì)胞因子替換的小鼠，這使得該小鼠產(chǎn)生這些特定的人細(xì)胞因子而不是小鼠細(xì)胞因 子。見。例如，Willinger，T.等，PNAS, 108(6) :2390-2395(2011)和 Rongvaux，A.等， PNAS，108(6) :2378-2383(2011)。
[0065] 此外，可以使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一種或多種人細(xì)胞因子引入到非人類哺乳動(dòng)物中。 轉(zhuǎn)基因小鼠已插入源自人類或其他物種的DNA。敲入技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的區(qū)別在于敲入 涉及將基因插入到特定的基因座，因而是"靶向的"插入。見，例如，Billerb eck，E.等， Blood, 117(11) (2011)。
[0066] 造血干細(xì)胞、人細(xì)胞因子蛋白和/或編碼一種或多種人細(xì)胞因子的核酸同時(shí)或相 繼引入。在特定的方面，人造血干細(xì)胞被引入到非人類哺乳動(dòng)物中和該非人類哺乳動(dòng)物被 保持在其中人造血干細(xì)胞被重新定殖非人類哺乳動(dòng)物的造血系統(tǒng)的條件下。在用人造血干 細(xì)胞重構(gòu)非人類哺乳動(dòng)物的造血系統(tǒng)后，隨后將人細(xì)胞因子引入到非人類哺乳動(dòng)物中。在 特定的實(shí)施方式中，人造血干細(xì)胞被引入新生幼仔（例如，約48小時(shí)齡）中且在約1個(gè)月、 約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4個(gè)月、約5個(gè)月、約6個(gè)月、約7個(gè)月、約8個(gè)月、約9個(gè)月、約10 個(gè)月、約11個(gè)月、約12個(gè)月后引入人細(xì)胞因子蛋白和/或編碼一種或多種人細(xì)胞因子的核 酸。
[0067] 一旦引入造血干細(xì)胞和一種或多種人細(xì)胞因子，將非人類哺乳動(dòng)物保持在其中非 人類哺乳動(dòng)物用人造血干細(xì)胞重構(gòu)和細(xì)胞因子在非人類哺乳動(dòng)物中刺激人免疫細(xì)胞的分 化、增殖和/或功能的條件下。本發(fā)明的非人類動(dòng)物被保持在其中的這樣的條件包括符合 如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的哺乳動(dòng)物的基本需求（例如，食物，水，光）。
[0068] 本文描述的方法可以進(jìn)一步包括確定所述編碼一種或多種人細(xì)胞因子的核酸是 否被表達(dá)，人類造血干細(xì)胞是否存在和/或人造血干細(xì)胞是否分化為一種或多種人血液譜 系細(xì)胞。本文提供了用于確定核酸是否表達(dá)和/或非人類哺乳動(dòng)物是否被造血干細(xì)胞重構(gòu) 的方法，且這些方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。例如，使用對于人造血干細(xì)胞的細(xì)胞表面 標(biāo)志物特異性的抗體的流式細(xì)胞分析可用于檢測非人類哺乳動(dòng)物中人造血干細(xì)胞的存在。 此外，可從非人類哺乳動(dòng)物中收集血清并分析人細(xì)胞因子的存在。也可以使用用來評估分 化的造血干細(xì)胞（例如，NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞） 的功能的測定法。見，例如，W0 2011/002727號(hào)公開的國際申請，本文通過引用引入其整體。 [0069] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，除了細(xì)胞因子，可以在該方法中使用其它的蛋白質(zhì)和/ 或編碼其它蛋白質(zhì)（例如，人蛋白質(zhì)、人分泌蛋白）如生長因子的核酸、類固醇和/或小分 子，來提高血液譜系細(xì)胞之外的人細(xì)胞的重構(gòu)和/或功能。例如，可以將一種或多種人細(xì)胞 因子的激動(dòng)劑引入到非人類哺乳動(dòng)物中以增強(qiáng)造血干細(xì)胞的重構(gòu)。
[0070] 本文所描述的方法可被用于評估多種藥劑在人類中的毒性。例如，藥劑可以是小 分子量的有機(jī)或無機(jī)分子、治療劑、診斷劑、美容劑和/或食品添加劑。藥劑的具體實(shí)例包 括抗體（例如，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體等）、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、月旨 多糖、脂蛋白、脂質(zhì)、疫苗接種劑（例如，微生物抗原）、納米顆粒等。
[0071] 可以使用多種施用途徑中的任一種將藥劑施用于非人類哺乳動(dòng)物。施用途徑的 例子包括皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)、股骨內(nèi)、心室內(nèi)、頡內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、心臟內(nèi)、肝內(nèi)、骨髓 內(nèi)、皮下、局部、口服和鼻內(nèi)施用途徑。其他合適的引入方法還可以包括，流體動(dòng)力學(xué)基因遞 送、基因治療、可再裝填或可生物降解的裝置、粒子加速裝置（"基因槍"）和緩釋的聚合物 裝直。
[0072] 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的，有多種方法可以用來確定藥劑是否在非人類哺乳動(dòng) 物中引起毒性、免疫毒性和/或細(xì)胞因子風(fēng)暴。例如，通過在施用藥劑后測定出現(xiàn)在非人類 哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞表面標(biāo)志物、免疫細(xì)胞表型（例如，作為例如人類中的毒性（免疫毒性） 的指示的免疫細(xì)胞表型）、一種或多種肝酶的表達(dá)增加、一種或多種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá) 增加或它們的組合來確定該藥劑是否在非人類哺乳動(dòng)物中引起毒性。
[0073] 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的，可以用各種方式來確定免疫細(xì)胞的表型。例如，可以 通過確定在非人類哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的一種或多種免疫細(xì)胞的增殖（提高；降低）和/或活 化（提高；降低）來測定免疫細(xì)胞的表型。免疫細(xì)胞可以是人免疫細(xì)胞、小鼠免疫細(xì)胞或它 們的組合。在具體的實(shí)施方式中，免疫細(xì)胞表型是通過確定在非人類哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的一 種或多種人免疫細(xì)胞的增殖（提高；降低）和/或活化（提高；降低）而測定的。免疫細(xì)胞 (人；小鼠）的例子包括淋巴細(xì)胞（如Τ細(xì)胞、Β細(xì)胞）、自然殺傷（ΝΚ)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨 噬細(xì)胞、⑶45. Γ細(xì)胞等。
[0074] Τ細(xì)胞的增殖可以通過測定表達(dá)⑶3+的細(xì)胞來確定，Β細(xì)胞的增殖可以通過測定 表達(dá)⑶19+的細(xì)胞來確定，ΝΚ細(xì)胞的增殖可以通過測定表達(dá)⑶56+的細(xì)胞來確定，和單核細(xì) 胞/巨噬細(xì)胞的增殖可以通過測定表達(dá)CD14+的細(xì)胞來確定。此外，Τ細(xì)胞的增殖可以通 過測定表達(dá)⑶45+⑶3+的細(xì)胞來確定，Β細(xì)胞的增殖可以通過測定表達(dá)⑶45+⑶19+的細(xì)胞 來確定，ΝΚ細(xì)胞的增殖可以通過測定表達(dá)CD45+CD56+的細(xì)胞來確定，淋巴細(xì)胞的增殖可以 通過測定表達(dá)⑶45+⑶56+的細(xì)胞來確定，和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的增殖可以通過測定表達(dá) ⑶45+⑶14+的細(xì)胞來確定。
[0075] 與這些免疫細(xì)胞的標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體可被用于檢測。此外，或可選地，免疫 組織化學(xué)可用于檢測表達(dá)這些標(biāo)記的人類細(xì)胞對非人類哺乳動(dòng)物中一種或多種器官的浸 潤。免疫細(xì)胞的分離也可用于定量不同的免疫細(xì)胞類型。
[0076] 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的，免疫細(xì)胞（例如，人或小鼠免疫細(xì)胞）的活化也可以 用于確定藥劑是否引起毒性。例如，⑶69、⑶25、⑶44的表達(dá)增加和⑶62L抗原的表達(dá)降低 指示活化的Τ細(xì)胞。
[0077] 用來檢測或測定一種或多種肝酶（鼠或人）在非人類哺乳動(dòng)物中的表達(dá)增加的方 法也是本領(lǐng)域已知的。例如，已知的方法包括那些檢測天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和/或丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶的方法。
[0078] 類似地，用于測定一種或多種促炎性細(xì)胞因子（人或小鼠）的表達(dá)增加的方法也 是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。促炎性人細(xì)胞因子包括白介素-2(IL-2)、IL-6、IL-8、IL-1 β、 IL-4、γ干擾素（IFN-γ)、腫瘤壞死因子a (TNF-a)、IL_10或它們的組合。
[0079] 可以如本文所述地使用流式細(xì)胞術(shù)來確定促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加。具體地， 使用BD Cytometric Bead Array(CBA)(BD Biosciences，美國）檢測血清中的促炎細(xì)胞 因子。本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)制造商的建議進(jìn)行的，并用FCAP陣列軟件（Soft Flow Hungary, BD Biosciences)分析結(jié)果?？蛇x地，可以使用基于抗體的方法和/或酶聯(lián)免疫吸附測定法。
[0080] 測定非人類哺乳動(dòng)物中的毒性（例如，免疫毒性）的其他方法包括獲得體重測量 和/或分析組織切片（肝、腎和肺）、血液參數(shù)（肌酐、高靈敏度CRP (CRPHS)、白蛋白和血液 尿素氮（BUN)，測量血小板（減少）以及DD二聚體增加（增加）。
[0081] 可以在向非人類哺乳動(dòng)物施用藥劑后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定該藥劑是否在非 人類哺乳動(dòng)物中引起毒性。例如，可以在施用藥劑之后的一小時(shí)或多小時(shí)（例如，約1小時(shí)、 2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13 小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16個(gè)小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22個(gè)小時(shí)、23 小時(shí)、24小時(shí)），一天或多天（例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、 12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、 25天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、34天、35天、 36天、37天、38天、39天、40天），一周或多周（例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8 周、9周、10周、11周、12周），一個(gè)月或多個(gè)月（如1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6 個(gè)月）或者1年或多年（例如，1年、2年）等確定藥劑是否在非人類哺乳動(dòng)物中引起毒性。 [0082] 本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括將已施用了該藥劑的非人類哺乳動(dòng)物中的效應(yīng)與 合適的對照比較。例如，合適的對照是已經(jīng)移植人造血干細(xì)胞并用人細(xì)胞因子處理（施用； 引入）但未施用藥劑的非人類哺乳動(dòng)物。
[0083] 到目前為止，存在幾種使用來自人的全血或PBMC篩選細(xì)胞因子釋放綜合征的體 外分析方法。單克隆抗體在水溶液中測試，或者通過直接空氣干燥或濕法涂布直接地固定 或通過抗Fc捕獲間接地固定在塑料板上。在刺激大細(xì)胞因子釋放的方面，最成功的應(yīng)用方 法是在板上mAb的空氣干燥或向具有內(nèi)皮細(xì)胞單層的培養(yǎng)物加入可溶性mAb。利用人源化 的小鼠更接近地模擬人體環(huán)境，從而不僅測定細(xì)胞因子的釋放，而且測定其他免疫學(xué)參數(shù)， 如不同亞型的免疫細(xì)胞的免疫表型分型、增殖、活化信生物化學(xué)參數(shù)，并且因此應(yīng)當(dāng)提供更 加接近地重組在mAb給予患者時(shí)所發(fā)生的事情，并因此具有良好的預(yù)測價(jià)值。
[0084] 目前在志愿者上的新藥臨床試驗(yàn)導(dǎo)致90%的藥物失敗。這種失敗往往是由于在 臨床前研究中未暴露出來的毒性，這主要應(yīng)歸因于現(xiàn)有的動(dòng)物和靈長類動(dòng)物模型的不足， 因?yàn)樵谌祟惡蛣?dòng)物/靈長類動(dòng)物之間免疫系統(tǒng)存在差異。對于投資風(fēng)險(xiǎn)評估，可以準(zhǔn)確地 預(yù)測這些副作用的動(dòng)物模型的商業(yè)價(jià)值是巨大的。此外，已經(jīng)成功地通過了所有體外和臨 床前試驗(yàn)的許多候選藥物沒有達(dá)到臨床試驗(yàn)階段，因?yàn)樗麄儫o法獲得適當(dāng)?shù)馁Y助。在這 方面，本文所描述的人源化模型可以用作以高準(zhǔn)確度確定大量臨床相關(guān)候選者用于臨床 評價(jià)的優(yōu)先級的平臺(tái)。本文提供了證明細(xì)胞因子處理的人源化小鼠呈現(xiàn)了用于藥物免疫 毒性測試的強(qiáng)大預(yù)測工具的有力證據(jù)?；谌缭诙拘匝芯恐袦y定的"無可見不良作用水 平"（N0AEL)和"最小預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)水平"（MABEL)，本文所述的方法有助于首次人體實(shí)驗(yàn) (first-dose-in-man)的評估和建立。另一個(gè)應(yīng)用是鑒定副作用所依據(jù)的不同機(jī)制和確定用 于人體中的細(xì)胞因子釋放綜合征的最靈敏的和預(yù)測性的常見生物標(biāo)志物。如本文所示，人 源化小鼠不僅能顯示特定單克隆抗體的預(yù)期的副作用，也證實(shí)了其相應(yīng)的期望的效果（例 如，T細(xì)胞或B細(xì)胞的耗盡）。這些優(yōu)勢指明了超出藥品安全性的應(yīng)用，而且還指向靶向免 疫系統(tǒng)的分子的標(biāo)準(zhǔn)藥物測試。本文提供的模型是臨床前和臨床試驗(yàn)之間缺少的環(huán)節(jié)。該 模型整合到藥物開發(fā)模式中具有促進(jìn)進(jìn)入首次人體臨床試驗(yàn)和加快新療法應(yīng)用于患者的 過程的潛力。
[0085] 雖然已經(jīng)利用IL-15和Flt-3L處理的人源化小鼠舉例證明了本發(fā)明用于藥物免 疫毒性試驗(yàn)的強(qiáng)大預(yù)測工具，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以使用其他細(xì)胞因子，例如，為了 增強(qiáng)T細(xì)胞的反應(yīng)，可以利用GMCSF和IL-4來處理小鼠，或者為了增加單核細(xì)胞的數(shù)目，可 以利用MCSF來處理小鼠，因?yàn)榧?xì)胞因子釋放綜合征的發(fā)生也通過對非靶細(xì)胞上的Fc受體 的mAb Fc端以引起細(xì)胞因子釋放，或與Fc受體的結(jié)合引起通過靶細(xì)胞的聚集和信號(hào)傳導(dǎo)。
[0086] 示例件說明
[0087] 實(shí)施例1
[0088] 方法
[0089] 胎肝⑶34+(HSC)細(xì)胞的分離
[0090] 按照研究倫理指南從妊娠15-23周的流產(chǎn)胎兒獲得人胎肝。所有的女性都給出 了捐贈(zèng)胎兒組織用于研究的書面知情同意。在妊娠終止2小時(shí)內(nèi)在無菌條件下收集胎兒。 最初將來自胎兒的肝臟組織切成小塊，然后用在37°C下用在DMEM中制備的2mg/ml膠原 酶IV消化15分鐘，伴隨定期攪拌。然后，通過將消化組織通過100 μ m的細(xì)胞過濾器（BD Biosciences)制備單細(xì)胞懸浮液。通過用臺(tái)盼藍(lán)排除死細(xì)胞來計(jì)數(shù)活細(xì)胞。利用⑶34陽 性篩選試劑盒（Stem Cell Technologies,Canada)在無菌條件下進(jìn)行細(xì)胞分離程序。通過 流式細(xì)胞術(shù)測定⑶34+細(xì)胞的純度且純度評定在80至95%之間。
[0091] 人源化小鼠的構(gòu)建和流體動(dòng)力學(xué)基因遞送
[0092] NSG小鼠購自Jackson實(shí)驗(yàn)室并飼養(yǎng)在新加坡南洋理工大學(xué)和新加坡國立大學(xué)的 動(dòng)物設(shè)施的特定無菌條件下。為了小鼠重構(gòu)，使用伽瑪射線源以l〇〇cGy照射新生幼崽（少 于48小時(shí)齡），并用⑶34+⑶133+細(xì)胞心內(nèi)注射（1 X 105個(gè)細(xì)胞/受體）。如前所述地（Chen Q 等（2009) Proc Natl Acad Sci, USA, 106:21783-21788)單獨(dú)地將人 IL-15 和人 Fltr-3 配 體克隆到pcDNA3. 1(+)載體（Invitrogen，USA)中。對于流體動(dòng)力學(xué)基因遞送，用27號(hào)針 頭在7秒內(nèi)將總量為2ml生理鹽水中50 μ g的各質(zhì)粒注射12周齡的人源化小鼠（humice)。 所有用人類樣品和小鼠進(jìn)行的研究遵守倫理指南。
[0093] 人單克隆抗體的注射
[0094] 在細(xì)胞因子處理后7天采樣的血液被用作用于設(shè)定不同細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平及 人細(xì)胞絕對數(shù)和百分比的基線的時(shí)間點(diǎn)（-48小時(shí)）。兩天后（0小時(shí)），小鼠然后用重懸 浮于200 μ 1的臨床級（0. 9% )的氯化鈉溶液（Braun)中的相應(yīng)單克隆抗體（mAb)之一， TGN1412-IgG4(在本文中也稱為 TGN1412-AA)(抗-CD28, JN Bioscences LLC，USA 定制生 產(chǎn)）、0KT3 (抗 0)3, Biolegend)、CampathX (阿侖單抗、抗⑶52, Genzyme Corporation, Cambridge, ΜΑ)或Mabthera? (利妥昔單抗、抗⑶20, Hoffmann-La Roche)靜脈內(nèi)注射 (25 μ g/小鼠）。mAb處理后2小時(shí)和24小時(shí)收集血樣，且于24小時(shí)對所有注射的動(dòng)物實(shí) 施安樂死。
[0095] 單細(xì)胞制備，細(xì)胞因子檢測，抗體和流式細(xì)胞術(shù)
[0096] 通過標(biāo)準(zhǔn)方法從脾臟制備單細(xì)胞懸浮液。下面的人偶聯(lián)抗體被用于流式細(xì)胞術(shù) 染色：CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、CD45、CD45R0、CCR7,來自 Biolegend ;CD14 和 CD56,來自 BD Biosciences(BD Biosciences，USA)和小鼠 CD45. 1，來自 eBioscience。在含有 0.2% BSA和0.05 %疊氮化鈉的100 μ 1 PBS中在冰上用適當(dāng)?shù)目贵w染色細(xì)胞30分鐘。使用 FACSDiva軟件（BD，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，在LSRII流式細(xì)胞儀上執(zhí)行流式細(xì)胞分析，以及 使用Flowjo軟件分析樣品。對于細(xì)胞因子檢測，使用BD Cytometric Bead Array(CBA) (BD Biosciences，USA)在血清中測定人 IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-iP、TNF-a 和 IFN-γ 的濃度。本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)制造商的建議進(jìn)行，且用FCAP陣列軟件（Soft Flow Hungary，BD Biosciences)對結(jié)果進(jìn)行分析。
[0097] 統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0098] 使用 GraphPad Prism 5. 0 (Graph-Pad Softwares Inc. , CA，USA)對結(jié)果進(jìn)行分 析。
[0099] 結(jié)果
[0100] 如本文所述，對移植人造血干細(xì)胞和人細(xì)胞因子處理的免疫缺失小鼠（例如，NSG 小鼠）是否增強(qiáng)免疫系統(tǒng)并能作為用于分析和預(yù)測在人體中的毒性的準(zhǔn)確和可靠的系統(tǒng) 進(jìn)行了研究。對于⑶28、⑶3、⑶52和⑶20特異性的四種單克隆抗體被用來驗(yàn)證該系統(tǒng)， 因?yàn)橐阎@些抗體在人體中顯示出了不同的副作用。主要的副作用是"細(xì)胞因子風(fēng)暴"。測 定了處理的小鼠中的細(xì)胞因子釋放，并與臨床數(shù)據(jù)的分泌譜相比較。TGN1412注射后，小鼠 顯示出人IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-8血清水平的顯著增加。這在那些沒有用人細(xì)胞因 子處理的人源化小鼠中未觀察到。細(xì)胞因子處理用于獲得上述的細(xì)胞因子反應(yīng)。細(xì)胞因子 產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)與在臨床試驗(yàn)中描繪的表達(dá)曲線良好符合，其中所有6個(gè)志愿者表現(xiàn)出類似 的趨勢。然而，6名征募者中只有2名顯示出IL-4水平升高和對于IL-1 β，6名征募者中3 名顯示出水平升高。類似地，9只小鼠中只有2只表現(xiàn)出增加的IL-4水平，但在IL-Ιβ水 平中沒有變化。除了在細(xì)胞因子水平上觀察到的相似性外，人類和人源化小鼠兩者中Τ細(xì) 胞數(shù)量顯著減少，和CD4+細(xì)胞似乎受到更加深刻地影響，大概是因?yàn)樗麄儽憩F(xiàn)出了 CD28的 較高表達(dá)。注意到的唯一差異是單核細(xì)胞計(jì)數(shù)只在臨床試驗(yàn)中降低；這可能與人源化小鼠 和人類之間單核細(xì)胞數(shù)的初始差異有關(guān)。值得一提的是臨床試驗(yàn)前在野生型小鼠的初步研 究中沒有檢測到任何這些癥狀。在細(xì)胞因子處理的人源化的小鼠中鑒別了 CD4+效應(yīng)記憶 細(xì)胞⑶4+⑶45R0+CCR7⑶28+，并發(fā)現(xiàn)其負(fù)責(zé)在TGN1412刺激后產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子。該子 集是人類特有的和不存在于非人類靈長類動(dòng)物和野生型小鼠中，并能解釋在常規(guī)模型中檢 測不到顯著的副作用。
[0101] 類似于用TGNI412獲得的結(jié)果，在細(xì)胞因子處理的人源化小鼠中施用0ΚΤ3導(dǎo)致人 IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ細(xì)胞因子升高。這些結(jié)果與0ΚΤ3治療的腎移植患者中報(bào)道的 結(jié)果相當(dāng)。注意到的Τ細(xì)胞耗竭也與其中在注射后兩小時(shí)明顯淋巴細(xì)胞減少和中性粒細(xì)胞 減少的患者中的結(jié)果一致。
[0102] 還測試了已知在患者中引起較溫和的細(xì)胞因子風(fēng)暴的阿侖單抗。對細(xì)胞因子處理 的人源化小鼠施用阿侖單抗在2小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)人IL-2、IL-6、IL-8和LL-1 β水平的升高，但 在24小時(shí)時(shí)恢復(fù)到基線水平，除了 IL-1 β。注射后2小時(shí)觀察到Β和Τ細(xì)胞、ΝΚ細(xì)胞和單 核細(xì)胞的嚴(yán)重減小。所有這些結(jié)果與在用阿侖單抗治療的患者中所觀察到的相似。
[0103] 也對利妥昔單抗進(jìn)行了測試，其為已知在患者中僅具有很少或沒有炎性細(xì)胞因子 釋放的單克隆抗體，這與對于TGN1214和0KT3描述的嚴(yán)重副反應(yīng)相反。在1項(xiàng)臨床研究中， 證明在施用利妥昔單抗之后，一些白血病患者顯示輕微的IL-6(約80pg/ml)和TNF-β (約 870pg/ml)水平的上升，而IL-2、IL-4和IFN-γ具有最小變化，與基線水平相比。細(xì)胞因 子釋放是瞬間的，因?yàn)閮煞N細(xì)胞因子水平在完成最初的利妥昔單抗輸注后回到基線。這種 誘導(dǎo)的表達(dá)與具有大量B淋巴細(xì)胞的白血病患者相關(guān)。在本文所描述的研究中缺乏細(xì)胞因 子釋放可能與相對于慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者相比CD20+淋巴細(xì)胞數(shù)目較低有關(guān)。然而， 本文描述的模型更與在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中觀察到的結(jié)果相當(dāng)，其中觀察到了外周血B細(xì) 胞的耗竭。雖然在注射mAb后2小時(shí)和24小時(shí)觀察到T細(xì)胞數(shù)目的減少，這與描述了利妥 昔單抗輸注后外周T細(xì)胞計(jì)數(shù)的短暫下降的臨床試驗(yàn)的結(jié)果一致。
[0104] 總之，這些結(jié)果表明，細(xì)胞因子處理的人源化小鼠可預(yù)測包括單克隆抗體和其它 蛋白質(zhì)治療劑的生物治療劑的急性免疫毒性。
[0105] 實(shí)例例2
[0106] 下面提供的是實(shí)施例1中描述的實(shí)驗(yàn)的另外的數(shù)據(jù)和再分析，其中對細(xì)胞因子處 理的人源化小鼠是否能夠準(zhǔn)確預(yù)測抗體治療劑的免疫毒性進(jìn)行了評價(jià)。如實(shí)施例1中描述 的，選擇在人類中具有不同程度副作用的四種單克隆抗體用于分析。
[0107] 除了 TGN1412, 0KT3(用于抑制腎同種異體移植排斥反應(yīng)的抗人⑶3的小鼠 mAb) 已知引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，包括細(xì)胞因子釋放綜合征和急性或嚴(yán)重流感樣綜合征。阿侖單 抗（一種用于治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病和預(yù)防移植物抗宿主病的人源化抗CD52抗體） 也已知誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的釋放。⑶52是在基本上所有正常和惡性T和B淋巴細(xì)胞、大部 分單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的表面上表達(dá)的糖蛋白。在首次劑量的阿侖單抗后 也觀察到炎性細(xì)胞因子釋放。在患有復(fù)發(fā)性或難治性B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的患者 中，那些有重大淋巴結(jié)病的患者更容易發(fā)生細(xì)胞因子釋放綜合征。利妥昔單抗是鼠-人嵌 合抗體，其結(jié)合主要位于前B和成熟B淋巴細(xì)胞上的CD20。利妥昔單抗導(dǎo)致自身免疫性疾 病的有效調(diào)控，并且也用于白血病和淋巴瘤的治療，顯示出輕度至沒有副作用，主要取決于 腫瘤的性質(zhì)和重要性。本文中所描述的研究表明，人源化小鼠的結(jié)果準(zhǔn)確地預(yù)測四種抗體 治療劑在人類中的免疫毒性。
[0108] 材料與方法
[0109] 胎肝⑶34+細(xì)胞分離
[0110] 按照研究倫理指南（Polkinhorne)從妊娠15-23周的流產(chǎn)胎兒獲得人胎肝。所有 的女性都給出了捐贈(zèng)胎兒組織用于研究的書面知情同意。在妊娠終止2小時(shí)內(nèi)在無菌條件 下收集胎兒。最初將來自胎兒的肝臟組織切成小塊，然后在37°C下用在DMEM中制備的2mg/ ml膠原酶IV消化15分鐘，隨隨定期攪拌。然后，通過將消化的組織通過100 μ m的細(xì)胞過 濾器（BD Biosciences)制備單細(xì)胞懸浮液。通過用臺(tái)盼藍(lán)排除死細(xì)胞來計(jì)數(shù)活細(xì)胞。利 用⑶34陽性篩選試劑盒（Stem Cell Technologies, Canada)在無菌條件下進(jìn)行細(xì)胞分離 程序。通過流式細(xì)胞術(shù)測定⑶34+細(xì)胞的純度和純度評定在90至98%之間。
[0111] 人源化小鼠的構(gòu)建和流體動(dòng)力學(xué)基因遞送
[0112] NSG小鼠購自Jackson實(shí)驗(yàn)室并被飼養(yǎng)在新加坡南洋理工大學(xué)和新加坡國立大學(xué) 的動(dòng)物設(shè)施的特定無菌條件下。為了小鼠重構(gòu)，使用伽瑪射線源以l〇〇cGy照射新生幼崽 (少于48小時(shí)齡），并用⑶34+⑶133+細(xì)胞心內(nèi)注射（1 X 105個(gè)細(xì)胞/受體）。如前所述地 單獨(dú)地將人IL-15和人Fltr-3配體克隆到pcDNA3. 1(+)載體（Invitrogen，USA)中。對于 流體動(dòng)力學(xué)基因遞送，用27號(hào)針頭在7秒內(nèi)將總量2ml的鹽水中的50 μ g各質(zhì)粒注射12 周齡的人源化小鼠。所有人類樣品和小鼠的研究遵守倫理指南
[0113] 人單克隆抗體的注射
[0114] 在細(xì)胞因子處理后7天采樣的血液被用作用于設(shè)定不同細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平和 人細(xì)胞絕對數(shù)和百分比的基線的時(shí)間點(diǎn)（-48小時(shí)）。兩天后（0小時(shí)），小鼠然后用懸浮 于200 μ 1的臨床級（0. 9 % )氯化鈉溶液（Braun)中的相應(yīng)的單克隆抗體（mAb)之一， TGN1412-IgG4 或 TGN1412-AA (抗-CD28, JN Bioscences LLC，USA 定制生產(chǎn)）、0KT3(抗 CD3, Biolegend)'Campath1*'(阿侖單抗、抗 CD52，Genzyme Corporation，Cambridge，ΜΑ) 或Mabthera4 (利妥昔單抗、抗CD20, Hoffmann-La Roche)靜脈內(nèi)注射（25yg/小鼠）。 mAb處理后2小時(shí)和24小時(shí)收集血樣，且于24小時(shí)時(shí)對所有注射的動(dòng)物實(shí)施安樂死。
[0115] 單細(xì)胞制備，細(xì)胞因子檢測，抗體和流式細(xì)胞術(shù)。
[0116] 通過標(biāo)準(zhǔn)方法從脾臟制備單細(xì)胞懸浮液。下面的人偶聯(lián)抗體被用于流式細(xì)胞術(shù)染 色：CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、CD45、CD45R0、CCR7,來自 Biolegend ;CD14 和 CD56,來自 BD Biosciences (BD Biosciences，USA)和小鼠 CD45. 1，來自 eBioscience。在含有0· 2% BSA和 0. 05%疊氮化鈉的100 μ 1 PBS中在冰上用適當(dāng)?shù)目贵w染色細(xì)胞30分鐘。使用FACSDiva軟 件（BD，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)在LSRII流式細(xì)胞儀上執(zhí)行流式細(xì)胞分析，以及使用Flowjo軟 件分析樣品。對于細(xì)胞因子檢測，使用BD Cytometric Bead Array(CBA)(BD Biosciences， USA)在血清中測定人 IL-2、IL-6、IL-8、IL-1P、TNF-a 和 IFN-γ 和小鼠 IL-2、IL-6、IL-8 的濃度。本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)制造商的建議進(jìn)行，且用FCAP陣列軟件（Soft Flow Hungary，BD Biosciences)對結(jié)果進(jìn)行分析。
[0117] 統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0118] 使用 GraphPad Prism 5. 0 (Graph-Pad Softwares Inc. , CA，USA)對結(jié)果進(jìn)行分 析。
[0119] 結(jié)果
[0120] TGN1412在細(xì)胞因子處理的人源化小鼠中誘導(dǎo)與在人類中類似的不良副作用
[0121] 對細(xì)胞因子處理的人源化小鼠模型是否可以預(yù)測TGN1412抗體的嚴(yán)重副作用進(jìn) 行了測試。通過用人造血干細(xì)胞移植入NSG初生幼仔來構(gòu)建人源化小鼠。為了增強(qiáng)人免疫 反應(yīng)，用編碼人IL-15和Flt-3L的質(zhì)粒高壓注射重構(gòu)的小鼠。注射細(xì)胞因子質(zhì)粒后七天， 用lmg/kg的TGN1412-IgG4或FcR-非結(jié)合的突變形式（TGN1412-AA)靜脈注射產(chǎn)生的細(xì)胞 因子處理的人源化小鼠。在注射后2小時(shí)，與對照（鹽水）組相比，來自兩個(gè)處理組的小鼠 表現(xiàn)出人IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-8血清水平的顯著增加。相比于TGN1412-AA-處理 的小鼠，在TGN1412-IgG4處理的小鼠中IL-2的水平略低。雖然在24小時(shí)后IL-2水平返 回到處理前的程度，IL-6、IL-8和IFN-γ的水平保持升高（圖15)。具有提高水平的細(xì)胞 因子產(chǎn)生的小鼠呈現(xiàn)虛弱的臨床癥狀，伴隨著活動(dòng)力性急劇下降。然而未用編碼人IL-15 和Flt-3L的質(zhì)粒注射的重構(gòu)小鼠在注射TGN1412-IgG42小時(shí)和24小時(shí)后沒有顯示出在 細(xì)胞因子血清水平的顯著變化（圖17)。也在注射人M-CSF質(zhì)粒以增加人單核細(xì)胞和巨噬 細(xì)胞數(shù)量后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，目的是增加 TGN1412-IgG注射后細(xì)胞因子的釋放（圖19)。盡管在 TGN1412-IgG4和FcR-非結(jié)合的突變形式（TGN1412-AA)之間觀察到相似的細(xì)胞因子釋放 量，但體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生在TGN1412結(jié)合于塑料培養(yǎng)板后增加。分析 了如先前在體外研究中報(bào)道的與FcR的結(jié)合有助于細(xì)胞因子的釋放的程度，即使已知IgG4 與Fc受體的結(jié)合效率較低。在注射后2小時(shí)，用M-CSF質(zhì)粒處理的小鼠與IL-15和Flt-3L 處理的小鼠比較，顯示出人IL-6(36. 8比173. 8pg/ml)和IL-8(131.8比234. Opg/ml)血清 水平的增加（圖15和圖19)。這些結(jié)果證實(shí)在細(xì)胞因子處理的人源化小鼠模型中人細(xì)胞因 子風(fēng)暴的產(chǎn)生。
[0122] 在細(xì)胞因子處理的人源化小鼠中，細(xì)胞的定量揭示，T細(xì)胞數(shù)降低最多，其次是NK 細(xì)胞，而B細(xì)胞（除M-CSF處理的小鼠）和單核細(xì)胞的數(shù)量保持不變（圖16A和20A)。在 注射細(xì)胞因子后2小時(shí)，注射了 TGN1412-IgG4的小鼠與TGN1412-AA處理相比，表現(xiàn)出外周 血中更明顯的循環(huán)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的下降（圖16A)。無論細(xì)胞因子水平，觀察到與未經(jīng) 細(xì)胞因子處理的人源化小鼠相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，盡管注射TGN1412-IgG4后24小時(shí)注意到B細(xì)胞 絕對數(shù)的縮減（圖18A，18C)。在注射后24小時(shí)，用編碼人IL-15和Flt-3L的質(zhì)粒處理的 或未處理的小鼠的脾中觀察到類似的趨勢（圖24和25)。注意到的T細(xì)胞減少與失敗的 臨床試驗(yàn)中觀察到的下降相當(dāng)。此外，與CD3+CD8+細(xì)胞相比，在CD3+CD4+子集中觀察到明 顯得多的降低。雖然所有的⑶3+細(xì)胞表達(dá)⑶28,⑶4+細(xì)胞上的⑶28平均熒光強(qiáng)度（MFI) 高于CD8+子集上的2倍（圖23A-23B)。此外，CD4+群體內(nèi)CD28的表達(dá)在記憶（中央和效 應(yīng)）T細(xì)胞上比天然T細(xì)胞高3倍（圖23A-23B)。最后，肝毒性生物標(biāo)志物：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨 酶（AST)(圖22A，22B)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT)的水平僅在處理組（圖22C，22D)的血液中 顯著升高。
[0123] 0KT3在細(xì)胞因子處理的人源化小鼠中與在人類中一樣誘導(dǎo)相似的不良副作用
[0124] 在類似用于TGN1412測試的實(shí)驗(yàn)方法后，對人源化小鼠的0KT3處理的效果進(jìn)行了 評估。向細(xì)胞因子處理的人源化小鼠注射lmg/kg的0KT3,并在2和24小時(shí)取血樣。與人 mAb注射之前的基線水平相比，在早至注射后2小時(shí)觀察到IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ的 循環(huán)水平的顯著增加（圖15)。雖然注射后24小時(shí)IL-2的表達(dá)減少，注射后24小時(shí)其它 細(xì)胞因子保持升高。值得注意的是，與TGN1412處理的小鼠相比，0KT3治療的小鼠中細(xì)胞 因子的濃度高3至10倍。在注射后2小時(shí)，與用TGN1412觀察到的一樣，用M-CSF質(zhì)粒處 理的小鼠與IL-15和Flt-3L處理的小鼠比較表現(xiàn)出增加的人IL-6(131. 8比1512. 8pg/ml) 和IL-8 (266. 5. 8比722. 6pg/ml)血清水平（圖15和19)。此外，在注射后2和24小時(shí)都 注意到T細(xì)胞的完全耗盡（圖16A，16D)。與TGN1412處理的小鼠相當(dāng)，在0KT3處理后觀察 到NK細(xì)胞的相對數(shù)量和絕對數(shù)量的瞬時(shí)下降（圖16A，16D)。與TGN1412處理相反，0KT3 注射在注射后2小時(shí)誘導(dǎo)⑶14+細(xì)胞的4倍降低（圖16A)。
[0125] 阿侖單抗在人源化小鼠中誘導(dǎo)某些人炎性細(xì)胞因子，但淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核 細(xì)胞急劇耗盡
[0126] 用lmg/kg的阿侖單抗注射細(xì)胞因子處理的人源化小鼠。與基線水平相比，在注射 后2小時(shí)檢測到IL-2、IL-6、IL-8和IL-1 β血清水平的增加（圖15)。然而除IL-1 β夕卜， 大多數(shù)細(xì)胞因子在注射后24小時(shí)已恢復(fù)到基線水平。該觀察與先前研究的PBMC對在水相 中孵育的阿侖單抗的 IL_2(31. 6 比 14. Opg/ml)、IL-6(19. 2 比 88pg/ml)和 IL-8(224. 1 比 6050pg/ml)反應(yīng)相當(dāng)。此外，⑶52注射后觀察到淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞的完全耗盡 (圖16A，16B)。對于阿侖單抗和0KT3注射的細(xì)胞因子處理人源化小鼠觀察到小鼠 IL-6細(xì) 胞因子的增加，最可能與小鼠單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的Fc受體的結(jié)合有關(guān)（圖21)。
[0127] 利妥昔單抗不引起任何顯著副作用
[0128] 用利妥昔單抗（lmg/kg)靜脈內(nèi)注射細(xì)胞因子處理的人源化小鼠，并與鹽水注射 的對照組進(jìn)行比較。在利妥昔單抗處理后測定的細(xì)胞因子的表達(dá)與用TNG1412和0KT3看到 的反應(yīng)顯著不同，因?yàn)闆]有觀察到任何所測量的細(xì)胞因子（IL-1 β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、 IFNi、TNF-α )的釋放（圖15)。此外，注射的小鼠沒有表現(xiàn)出任何虛弱或危困的跡象。 正如預(yù)期的那樣，在不同的細(xì)胞譜系間，受影響的細(xì)胞類型是B細(xì)胞（百分比和總數(shù)），因 為大多數(shù)細(xì)胞在注射2小時(shí)后耗盡（圖16A，16B)。雖然mAb注射后2和24小時(shí)也觀察到 T細(xì)胞數(shù)的減少，這與描述輸注利妥昔單抗后外周T細(xì)胞計(jì)數(shù)的短暫下降的臨床試驗(yàn)結(jié)果 一致（方案號(hào)：WA17042)。此外，肝酶水平（AST和ALT)在單克隆抗體處理后保持不變（圖 22A-22D)。
[0129] 討論
[0130] 由于主要副作用導(dǎo)致臨床試驗(yàn)中止反映出傳統(tǒng)的臨床前系統(tǒng)未能準(zhǔn)確地預(yù)測在 人體中的這種不良反應(yīng)。如本文中所描述的，研究了移植人造血干細(xì)胞和細(xì)胞因子處理以 增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的NSG小鼠是否能夠用作用于分析和預(yù)測在人體中的免疫毒性的準(zhǔn)確和可 靠的系統(tǒng)。使用對于⑶28、⑶3、⑶52和⑶20特異性的四種單克隆抗體來驗(yàn)證該系統(tǒng)，因?yàn)?已知這些抗體在人體中顯示出不同的副作用。主要的副作用是"細(xì)胞因子風(fēng)暴";測定了在 處理的小鼠中的細(xì)胞因子釋放，并將分泌特征與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。注射TGN1412后，小鼠 顯示出人IL-2、IFN-Y、TNF-a和IL-8血清水平的的顯著增加。細(xì)胞因子產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)與 在臨床試驗(yàn)中描繪的表達(dá)曲線一致，其中所有6個(gè)志愿者表現(xiàn)出類似的趨勢。然而，6名征 募者中只有2名顯示出升高的IL-4水平和對于IL-1 β，6名征募者中3名顯示出升高的水 平。類似地，9只小鼠中只有2只表現(xiàn)出增加的IL-4水平，但I(xiàn)L-1 β水平?jīng)]有變化。除了在 細(xì)胞因子水平上觀察到的相似性，Τ細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少在人類和人源化小鼠中都顯著降低， 并且CD4+細(xì)胞似乎受到更加深刻的影響，大概是因?yàn)樗麄儽憩F(xiàn)出CD28的較高表達(dá)。注意到 的唯一差別是單核細(xì)胞計(jì)數(shù)只在臨床試驗(yàn)中下降；這可能與小鼠和人類之間的單核細(xì)胞數(shù) 量的初始差異相關(guān)。值得一提的是臨床試驗(yàn)前在野生型小鼠的初步研究中沒有檢測到這些 癥狀。在細(xì)胞因子處理的人源化小鼠中確定了⑶4+效應(yīng)記憶細(xì)胞⑶4+⑶45R0+CCR7-⑶28+ 造成TGN1412刺激后促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。該子集是人類特有的和不存在于非人類靈長 類動(dòng)物和野生型小鼠中，并能解釋在常規(guī)模型中檢測不到顯著的副作用?？偟膩碚f，如果在 藥物開發(fā)過程中正確的時(shí)間執(zhí)行，本文所描述的模型所取得的結(jié)果能夠警示在人體試驗(yàn)中 使用這種分子的危害，并因此防止在失敗的臨床試驗(yàn)中看到的災(zāi)難性事件。
[0131] 類似于用TGNI412獲得的結(jié)果，在細(xì)胞因子處理的人源化小鼠中施用0ΚΤ3導(dǎo)致人 IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ細(xì)胞因子的升高。這些發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的0ΚΤ3治療的腎移植患者 的結(jié)果一致。
[0132] 注意到的Τ細(xì)胞耗竭也與患者中的結(jié)果一致，其中在注射后兩小時(shí)淋巴細(xì)胞減少 和中性粒細(xì)胞減少明顯。還測試了已知在患者中引起細(xì)胞因子風(fēng)暴的阿侖單抗。對細(xì)胞因 子處理的人源化小鼠施用阿侖單抗在2小時(shí)誘導(dǎo)人IL-2、IL-6、IL-8和LL-1 β水平的升 高，但在24小時(shí)時(shí)恢復(fù)到基線水平，除了 IL-Ιβ。注射后2小時(shí)觀察到嚴(yán)重的B和T細(xì)胞、 ΝΚ細(xì)胞和單核細(xì)胞的減少，在24小時(shí)時(shí)只有殘留的單核細(xì)胞保留。所有這些結(jié)果與在用阿 侖單抗治療的患者中所觀察到的相似。
[0133] 也對利妥昔單抗進(jìn)行了試驗(yàn)，其已知是一種在患者中僅具有很少或沒有炎性細(xì)胞 因子釋放的單克隆抗體，這與對于TGN1214和0ΚΤ3描述的嚴(yán)重不良反應(yīng)相反。在1項(xiàng)臨床 研究中，結(jié)果表明施用利妥昔單抗之后，一些白血病患者顯示輕微的IL_6(約80pg/ml)和 TNF-β (約870pg/ml)水平的上升，與基線水平相比IL-2、IL-4和IFNi具有很小變化。細(xì) 胞因子釋放是瞬時(shí)的，因?yàn)閮烧呒?xì)胞因子水平在完成最初的利妥昔單抗輸注后回到基線。 該誘導(dǎo)的表達(dá)與具有大量B淋巴細(xì)胞的白血病患者相關(guān)。在本文所描述的研究中缺乏細(xì) 胞因子釋放可能與相對于慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者較低的CD20+淋巴細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。然 而，本文描述的模型與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中觀察到的結(jié)果更相當(dāng)，其中僅觀察到了外周血B 細(xì)胞的耗竭?？赡苡欣氖窃谄浒腥四[瘤細(xì)胞存在下在人源化小鼠中測試?yán)孜魡慰?。?知T細(xì)胞是在注射0KT3和TGN1412后炎性細(xì)胞因子的主要產(chǎn)生者，雖然對于不具有內(nèi)在的 T細(xì)胞活化潛力的利妥昔單抗和阿侖單抗，它們可以造成臨床相關(guān)的細(xì)胞因子釋放，最可能 是通過其他細(xì)胞因子產(chǎn)生者，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合。
[0134] 最后，本文中給出強(qiáng)有力的證據(jù)顯示細(xì)胞因子處理的人源化小鼠提供了用于藥物 免疫毒性測試的強(qiáng)有力的預(yù)測工具。該系統(tǒng)有助于基于如在毒性研究中確定的"無可見不 良效應(yīng)水平"（N0AEL)和"最小預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)水平"（MABEL)評估和建立首次人體實(shí)驗(yàn)。 此外，另一種應(yīng)用是確定副作用所依據(jù)的不同機(jī)制，并確定用于在人體中的細(xì)胞因子釋放 綜合征的最靈敏的和預(yù)測性的常見生物標(biāo)志物。
[0135] 本文所引用的所有專利、公開的申請和參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)本文通過引用以其整體并 入。
[0136] 雖然參考其示例性的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了具體地表示和描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠理解，其中可以在形式和細(xì)節(jié)上做出各種變化而不背離所附權(quán)利要求所涵蓋的本發(fā) 明的范圍和精神。
【權(quán)利要求】
1. 一種確定藥劑是否在人類中引起免疫毒性的方法，包括： a) 向已移植人造血干細(xì)胞（HSC)和施用一種或多種人細(xì)胞因子的非人類哺乳動(dòng)物施 用該藥劑；和 b) 確定該藥劑是否在該非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫毒性， 其中，如果所述藥劑在該非人類哺乳動(dòng)物中引起免疫毒性，則所述藥劑在人類中引起 毒性。
2. 如權(quán)利要求1的方法，其中所述非人類哺乳動(dòng)物是小鼠。
3. 如權(quán)利要求2的方法，其中所述小鼠是免疫缺陷小鼠。
4. 如權(quán)利要求3的方法，其中所述免疫缺陷的小鼠的免疫系統(tǒng)被人T細(xì)胞占據(jù)。
5. 如權(quán)利要求2、3或4的方法，其中所述免疫缺陷小鼠是NOD. Cg-Prkdcsc;id 112rgtmlWj1/ SzJ(N0D Scidy)小鼠。
6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一種或多種人細(xì)胞因子包含白介 素-15 (IL-15)、IL-4、Fms-相關(guān)的酪氨酸激酶3配體（Flt-3L)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺 激因子（GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF)、干細(xì)胞生長因子、IL-3或它們的組合。
7. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述非人類哺乳動(dòng)物用兩種細(xì)胞因子處理。
8. 如權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞因子是IL-15和Flt-3L。
9. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑是治療劑。
10. 如權(quán)利要求9的方法，其中所述治療劑是抗體、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂多糖、脂蛋 白、脂質(zhì)、微生物抗原或納米顆粒。
11. 如權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
12. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥劑是否在所述非人類哺乳動(dòng)物 中引起免疫毒性通過測定在施用所述藥劑后在所述非人類哺乳動(dòng)物中發(fā)生的免疫細(xì)胞的 表型、一種或多種肝酶的表達(dá)的增加、一種或多種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)的增加或它們的 組合來確定。
13. 如權(quán)利要求12的方法，其中免疫細(xì)胞的表型是通過確定一種或多種免疫細(xì)胞的細(xì) 胞表面標(biāo)志物、增殖、活化作用或它們的組合而測定的。
14. 如權(quán)利要求13的方法，其中所述一種或多種免疫細(xì)胞包含T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺 傷（NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、CD45. Γ細(xì)胞或它們的組合。
15. 如權(quán)利要求14的方法，其中T細(xì)胞通過測定表達(dá)CD3+的細(xì)胞確定，B細(xì)胞通過測 定表達(dá)CD19+的細(xì)胞確定，NK細(xì)胞是通過測定表達(dá)CD56+的細(xì)胞確定，和單核細(xì)胞/巨噬細(xì) 胞通過測定表達(dá)⑶14+的細(xì)胞確定。
16. 如權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種促炎性人細(xì)胞因子包含白介 素-2 (IL-2)、IL-6、IL-8、IL-1 β、IL-4、γ 干擾素（IFN- γ )、腫瘤壞死因子 a (TNF- α )或 它們的組合。
17. 如權(quán)利要求16的方法，其中所述一種或多種促炎性細(xì)胞因子使用熒光激活細(xì)胞分 選法測定。
18. 如權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種肝酶包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶或它們的組合。
19. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中該藥劑是否在所述非人類哺乳動(dòng)物中引起 毒性是在施用藥劑后的一小時(shí)或多小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年內(nèi)確定。
20. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，還包括比較所述藥劑是否在對照中引起毒性。
21. -種確定對人類施用藥劑是否在人類中引起細(xì)胞因子釋放綜合征的方法，包括： a) 向已移植人造血干細(xì)胞（HSC)和施用一種或多種人細(xì)胞因子的非人類哺乳動(dòng)物施 用該藥劑；和 b) 確定所述藥劑是否在所述非人類哺乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征， 其中，如果所述藥劑在所述非人類哺乳動(dòng)物中引起細(xì)胞因子釋放綜合征，則該藥劑在 人類中引起細(xì)胞因子釋放綜合征。
22. 如權(quán)利要求21的方法，其中所述非人類哺乳動(dòng)物是小鼠。
23. 如權(quán)利要求22的方法，其中所述小鼠是免疫缺陷小鼠。
24. 如權(quán)利要求23的方法，其中所述免疫缺陷小鼠的免疫系統(tǒng)被人T細(xì)胞占據(jù)。
25. 如權(quán)利要求22、23或24的方法，其中所述免疫缺陷小鼠是NOD. Cg-Prkdcseid 112rgtn'師/SzJ(N0D Scidy)小鼠。
26. 如權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種人細(xì)胞因子包括白介 素-15 (IL-15)、IL-4、Fms-相關(guān)酪氨酸激酶3配體（Flt-3L)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激 因子（GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF)、干細(xì)胞生長因子、IL-3或它們的組合。
27. 如權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述非人類哺乳動(dòng)物用兩種細(xì)胞因子處 理。
28. 如權(quán)利要求27的方法，其中所述細(xì)胞因子是IL-15和Flt-3L。
29. 如權(quán)利要求21-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑是治療劑。
30. 如權(quán)利要求29的方法，其中所述治療劑是抗體、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂多糖、脂蛋 白、脂質(zhì)、微生物抗原或納米顆粒。
31. 如權(quán)利要求30的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
32. 如權(quán)利要求21-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑是否在所述非人類哺乳動(dòng)物中 引起細(xì)胞因子釋放綜合征通過測定在施用所述藥劑后所述非人類哺乳動(dòng)物中發(fā)生的免疫 細(xì)胞表型、一種或多種肝酶的表達(dá)的增加、一種或多種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)的增加或它 們的組合來確定。
33. 如權(quán)利要求32的方法，其中所述免疫細(xì)胞表型通過確定一種或多種免疫細(xì)胞的細(xì) 胞表面標(biāo)志物、增殖、活化作用或它們的組合而測定。
34. 如權(quán)利要求33的方法，其中所述一種或多種免疫細(xì)胞包含T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺 傷（NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、CD45. Γ細(xì)胞或它們的組合。
35. 如權(quán)利要求34的方法，其中T細(xì)胞通過測定表達(dá)CD3+的細(xì)胞確定，B細(xì)胞是通過 測定表達(dá)CD19+的細(xì)胞確定，NK細(xì)胞是通過測定表達(dá)CD56+的細(xì)胞確定，和單核細(xì)胞/巨噬 細(xì)胞通過測定表達(dá)⑶14+的細(xì)胞確定。
36. 如權(quán)利要求32的方法，其中所述一種或多種促炎性細(xì)胞因子包括白介 素-2(IL-2)、IL-6、IL-8、IL-lb、IL-4、γ 干擾素（IFN-γ)、腫瘤壞死因子 α (TNF-α)或 它們的組合。
37. 如權(quán)利要求36的方法，其中所述一種或多種促炎性細(xì)胞因子使用熒光激活細(xì)胞分 選法測定。
38. 如權(quán)利要求32的方法，其中所述一種或多種肝酶包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶或它們的組合。
39. 如權(quán)利要求21-38中任一項(xiàng)的方法，其中該藥劑是否在所述非人類哺乳動(dòng)物中引 起毒性在施用藥劑后的一小時(shí)或多小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年內(nèi)確定。
40. 如權(quán)利要求21-39中任一項(xiàng)的方法，還包括比較所述藥劑是否在對照中引起毒性。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104160272SQ201280068970
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月6日
【發(fā)明者】S·鮑格爾莫哈, M·庫利, 陳清風(fēng), 陳建竹 申請人:麻省理工學(xué)院