通過顯微圖像自動(dòng)識(shí)別全血樣品中血小板的方法和設(shè)備的制作方法
【專利摘要】一種識(shí)別全血樣品中的血小板的方法和設(shè)備。該方法包括步驟：a)將至少一種著色劑添加到全血樣品中，該著色劑用于標(biāo)記血小板；b)將所述全血樣品置于由至少一個(gè)透明板限定的腔中；c)將靜止地位于該腔內(nèi)的所述樣品的至少一部分進(jìn)行成像以形成一個(gè)或多個(gè)圖像；和d)采用分析儀識(shí)別所述樣品中的一個(gè)或多個(gè)血小板，該分析儀適于基于所述圖像中可定量確定的特征使用分析儀識(shí)別血小板，所述可定量確定的特征包括強(qiáng)度差異。
【專利說明】通過顯微圖像自動(dòng)識(shí)別全血樣品中血小板的方法和設(shè)備
[0001] 本申請(qǐng)要求2011年12月30日遞交的序列號(hào)為61/581，887的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng) 的權(quán)益，其所公開的基本主題通過引用并入文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明總體涉及通過顯微圖像對(duì)全血樣品進(jìn)行分析的方法和設(shè)備，尤其涉及自動(dòng) 分析血小板的方法和設(shè)備。

【背景技術(shù)】
[0003] 醫(yī)療診斷通常包括分析病人的全血樣品。較流行的診斷之一是全血細(xì)胞計(jì)數(shù)（被 稱為"CBC"），其中，全血細(xì)胞計(jì)數(shù)為一系列包括"血小板計(jì)數(shù)"（即，凝血細(xì)胞計(jì)數(shù)）的測(cè) 試。該血小板計(jì)數(shù)實(shí)際上是一種濃度測(cè)定，即，單位體積中的血小板數(shù)量。在一個(gè)成年人體 內(nèi)，正常的血小板計(jì)數(shù)通常約為每微升血液內(nèi)有150000到450000個(gè)血小板。異常的血小 板計(jì)數(shù)成為健康問題的一個(gè)指標(biāo)，如，如感染、疾病等。如果血小板水平降低到每微升20000 以下，則可能發(fā)生自發(fā)性出血，并且，這被認(rèn)為具有威脅生命的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 以前，通過在載玻片上涂抹少量的未稀釋血液或流式細(xì)胞術(shù)而實(shí)施血小板計(jì)數(shù)。 對(duì)于涂片而言，該樣品被涂覆到載玻片上，并且對(duì)位于該涂片內(nèi)的血小板和其它的成分進(jìn) 行計(jì)數(shù)?；谠摌悠分械南嚓P(guān)成分來估算血小板計(jì)數(shù)（即，該樣品內(nèi)每單位體積的血小 板）。
[0005] 通過電阻抗或光學(xué)流式細(xì)胞術(shù)分析儀來執(zhí)行血小板計(jì)數(shù)，該血液樣品必須被稀釋 然后穿過一個(gè)小容器，其中，當(dāng)組成細(xì)胞連續(xù)地通過該容器時(shí)，電阻抗或者光學(xué)傳感器可以 估算樣品中的組成細(xì)胞。根據(jù)樣品內(nèi)存在的成分，這些儀器的準(zhǔn)確性可能會(huì)受到影響。在 一個(gè)阻抗式計(jì)數(shù)儀中，例如，紅細(xì)胞碎片可以被認(rèn)為和視作血小板，而且巨大血小板可以被 認(rèn)為和視作紅細(xì)胞（RBC)。在這兩種情況下，自動(dòng)的血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性都會(huì)受到影響。另 夕卜，樣品的稀釋必須精確，或者說，精度受到負(fù)面影響，并且已稀釋的樣品必須被妥善地進(jìn) 行事后分析處理。所需的處理稀釋后的樣品的內(nèi)部管道經(jīng)常需要維護(hù)，并且至多對(duì)設(shè)備的 復(fù)雜度和成本明顯有利。
[0006] 所需要的是，用于對(duì)全血樣品執(zhí)行包括血小板計(jì)數(shù)的自動(dòng)分析的裝置和方法，其 可克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性，該局限性包括用于執(zhí)行該分析所需的時(shí)間、用于執(zhí)行該分析所 需的操作員技術(shù)水平；并且，該裝置和方法比已知的現(xiàn)有技術(shù)的方法和裝置能夠提供更廣 泛的適用性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種識(shí)別全血樣品中的血小板的方法。該方法包 括步驟：a)將至少一種著色劑添加到該全血樣品中，該著色劑用于標(biāo)記血小板；b)將該全 血樣品置于由至少一個(gè)透明板限定的腔中；c)將靜止地位于該腔內(nèi)的所述樣品的至少一 部分成像以形成一個(gè)或多個(gè)圖像；并且d)采用分析儀識(shí)別樣品中的一個(gè)或多個(gè)血小板，該 分析儀適于基于該圖像中可定量確定的特征識(shí)別血小板，該可定量確定的特征包括強(qiáng)度差 異。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種識(shí)別全血樣品中的血小板的設(shè)備。該設(shè)備包 括一個(gè)分析盒和一個(gè)分析裝置。該分析盒包括一個(gè)帶有一對(duì)平面構(gòu)件的分析腔，該平面構(gòu) 件中的至少一個(gè)是透明的。將至少一種著色劑添加到該全血樣品中（如，在分析盒內(nèi)），該 著色劑用于標(biāo)記血小板。該腔可操作地保持該樣品靜止地位于這兩個(gè)平面構(gòu)件之間。該分 析裝置用于使靜止地位于該腔內(nèi)的該樣品的至少一部分成像。該分析裝置適于基于圖像內(nèi) 的可定量確定的特征識(shí)別血小板，該可定量確定的特征包括強(qiáng)度差異。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，確定了在圖像中局部區(qū)域內(nèi)的強(qiáng)度差異。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，獲取了血漿的圖像強(qiáng)度。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，使用強(qiáng)度差異的定向?qū)Ρ榷仍u(píng)估了血小板的候選者。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，評(píng)估了該圖像以確定該樣品中存在一個(gè)或多個(gè)血小板簇。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，識(shí)別該圖像內(nèi)的血小板候選者、并采用基于規(guī)則的分類器 分析該圖像內(nèi)的血小板候選者，該分類器使用多個(gè)定量特征。
[0014] 上面描述的本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方式可以單獨(dú)或組合使用，且本發(fā)明不限于 任何特定的配置。如附圖所示，根據(jù)下面提供的本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的這些和其它的 方面、實(shí)施方式、特征以及優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為根據(jù)本發(fā)明的可操作地執(zhí)行血小板分析的分析裝置的示意圖；
[0016] 圖2為根據(jù)本發(fā)明的可使用的具有分析腔的分析盒的透視圖；
[0017] 圖3為圖2所示的盒的分解圖；
[0018] 圖4為支承分析腔的托盤的頂部平面視圖；
[0019] 圖5為分析腔的示意性剖面圖；
[0020] 圖6為顯示熒光成像下的樣品中的血小板和白細(xì)胞的圖像；
[0021] 圖7為顯示膠線/樣品的界面的圖像；
[0022] 圖8為顯不樣品/空氣的界面的圖像；
[0023] 圖9為腔的樣品入口區(qū)域的圖像；
[0024] 圖10是血小板內(nèi)的強(qiáng)度定向?qū)Ρ榷鹊氖疽鈭D解；
[0025] 圖11a-圖11c是血小板候選者內(nèi)的圖像強(qiáng)度高斯分布的示意圖；
[0026] 圖12是顯示在熒光成像下的樣品內(nèi)的小珠的圖像；
[0027] 圖13是正交網(wǎng)格的邊界框內(nèi)的血小板候選者的示意圖；
[0028] 圖14是當(dāng)前置于一個(gè)凸殼內(nèi)的圖14中顯示的一個(gè)血小板候選者的示意圖；
[0029] 圖15為示出用于通過樣品圖像識(shí)別在樣品內(nèi)的血小板的本發(fā)明方法的實(shí)施方式 的流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 參見圖1和圖2,本發(fā)明的各方面包括用于識(shí)別和枚舉靜止地位于分析腔內(nèi)的血 液樣品中的血小板的方法和設(shè)備。分析腔通常容納在盒20內(nèi)，該盒被配置成與自動(dòng)化分析 裝置22 -起使用，其中，該自動(dòng)化分析裝置具有成像硬件和程控分析儀，該程控分析儀適 于獲取和分析該樣品的圖像，從而識(shí)別和計(jì)數(shù)該樣品中的血小板。
[0031] 參閱圖2至圖5,本發(fā)明不限于任意使用特定分析腔的實(shí)施方式。在美國(guó)專利 No. 7, 850, 916 以及美國(guó)專利申請(qǐng) No. 12/971，860、No. 13/341，618 和 No. 13/594, 439 中描 述了可接受的分析腔（和附帶的盒）的例子，其全部?jī)?nèi)容均被引用并入本文中。為了該公 開內(nèi)容，本發(fā)明將描述成使用美國(guó)專利申請(qǐng)No. 13/594,439中描述的盒和分析腔。在專利 申請(qǐng)No. 13/594, 439中公開的分析腔24包括一個(gè)上平面構(gòu)件26和一個(gè)附接在托盤30上 的底部平面構(gòu)件28,托盤30可拆卸地安裝在盒20內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)分離小珠 31 (如大小一致的小珠）被置于上平面構(gòu)件26和底部平面構(gòu)件28之間，且通常是與這些平 面構(gòu)件相對(duì)的表面接觸。圖2示出了組裝的形式的盒20。圖3示出盒20的分解圖，盒20 包括分析腔24和托盤30。圖4是安裝在托盤30上的分析腔24的頂視圖，并示出腔24的 X-Y平面視圖。圖5為腔24的示意性截面圖，示出腔24的Z-X平面視圖。腔24的高度32 沿Z-軸延伸，并在這兩個(gè)平面構(gòu)件的相對(duì)的內(nèi)表面34和內(nèi)表面36之間延伸。對(duì)于全血樣 品分析而言，腔24的高度32優(yōu)選地大約4微米（4 μ m)，但是腔24并不限于這一高度。
[0032] 參照?qǐng)D1，與上述腔24可一起操作使用的分析裝置22,通常包括物鏡34、盒定位器 36、一個(gè)或多個(gè)樣品照明器38, 一個(gè)或多個(gè)析像管40和程控分析儀42。物鏡34和盒定位 器36中的一個(gè)或兩個(gè)可朝向彼此移動(dòng)或可移動(dòng)彼此遠(yuǎn)離，從而改變分析裝置相對(duì)于腔24 以及置于腔24內(nèi)的樣品的相對(duì)焦點(diǎn)位置。
[0033] 樣品照明器38使用沿著預(yù)定波長(zhǎng)的光照射樣品。例如，樣品照明器38可包括落射 熒光光源和透射光源。如下文將解釋的，諸如吖啶橙（也稱為"堿性橙15"或"AC0"）的著 色劑當(dāng)與全血混合且處于落射熒光光源（該光源通常發(fā)出在約450nm至490nm的范圍內(nèi)的 光）發(fā)出的激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，發(fā)出具有特定波長(zhǎng)的光。約470nm的激發(fā)波長(zhǎng)是尤其有用的。例 如，透射光源可操作地產(chǎn)生與紅光和綠光中相關(guān)的波長(zhǎng)的光。產(chǎn)生的紅光通常在約600nm 至700nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選地紅光約為660nm。產(chǎn)生的綠光通常在約515nm至570nm的范圍 內(nèi)，優(yōu)選地綠光約為540nm。使用析像管40捕獲穿過樣品傳輸?shù)墓饣蛘邩悠钒l(fā)出的熒光， 并且，代表所捕獲的光的信號(hào)被發(fā)送至程控分析儀42,在程控分析儀處信號(hào)被處理成圖像。 以這樣的方式制作圖像：允許在每單位基礎(chǔ)上確定圖像內(nèi)所捕獲的透光率或熒光強(qiáng)度；例 如"每單位基礎(chǔ)"為增加的單位，其中樣品圖像可被分割（例如像素）。
[0034] 可接受的析像管40的示例為電荷耦合器件（CCD)型圖像傳感器，該圖像傳感器使 穿過樣品的光（或來自樣品的光）轉(zhuǎn)化成電子數(shù)據(jù)格式圖像?；パa(bǔ)性金屬氧化物半導(dǎo)體 ("CMOS"）型圖像傳感器為可使用的圖像傳感器的另一示例。來自析像管40的信號(hào)為圖 像的每一像素提供信息，該信息包括或者可被推導(dǎo)出包括強(qiáng)度、波長(zhǎng)和光密度。為強(qiáng)度值賦 予例如0單位至4095單位（"IVU"）中的任意數(shù)值范圍。光密度（"0D"）為相對(duì)于穿過 基質(zhì)傳輸?shù)墓饬浚盏墓饬康亩攘?；例如?0D"值越高，則在透射期間所吸收的光量越 大。可以光密度單位（"0DU"）或其分?jǐn)?shù)定量描述0D ;例如，毫0DU為0DU的千分之一。一 個(gè)"0D"單位降低90%的光強(qiáng)度。作為定量值的"0DU"或"毫0DU"可用于通過透射光所獲 得的圖像或通過透射光所衍生的圖像。來自析像管40的信息被分成多個(gè)通道。例如，來自 析像管40的信息可被分成三個(gè)通道。然而，本發(fā)明不限于三通道的實(shí)施方式。三個(gè)通道中 的第一通道可針對(duì)與樣品發(fā)出的第一波長(zhǎng)（例如，540nm，呈現(xiàn)綠色）的光有關(guān)的信息。第 二通道可針對(duì)與樣品發(fā)出的第二波長(zhǎng)（例如，660nm，呈現(xiàn)紅色）的光有關(guān)的信息。第三通 道可針對(duì)與穿過樣品的第三波長(zhǎng)（例如，413nm，該波長(zhǎng)用于確定藍(lán)光密度-"0D"）的光有 關(guān)的信息。本發(fā)明不限于這些特定的波長(zhǎng)或通道數(shù)目。
[0035] 程控分析儀42包括中央處理單元（CPU)，且與盒定位器36、樣品照明器38和析像 管40進(jìn)行通信。程控分析儀42適于（例如，被程控）發(fā)送和接收來自盒定位器36、樣品照 明器38和析像管40中的一個(gè)或多個(gè)的信號(hào)。例如，該程控分析儀42適于：1)發(fā)送和接收 來自盒定位器36的信號(hào)以相對(duì)于光學(xué)器件、照明器38和析像管40中的一個(gè)或多個(gè)而定位 盒和腔24 ;2)將信號(hào)發(fā)送給樣品照明器38以產(chǎn)生規(guī)定波長(zhǎng)（或可替選地多個(gè)波長(zhǎng)）的光； 和3)發(fā)送和接收來自析像管40的信號(hào)以捕獲規(guī)定的時(shí)間段的光。應(yīng)當(dāng)注意，使用硬件、軟 件、固件或其組合可實(shí)現(xiàn)程控分析儀42的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠?qū)μ幚韱卧炭匾?執(zhí)行本文所描述的功能，而不需過多的實(shí)驗(yàn)。
[0036] 程控分析儀42進(jìn)一步適于根據(jù)識(shí)別樣品圖像中的血小板的算法，處理從析像管 40接收到的信號(hào)，并從與血小板類似但不是血小板的圖像特征以及使得血小板模糊的背景 特征中區(qū)分出血小板。
[0037] 分析裝置22適于對(duì)置于分析腔24內(nèi)的基本上未稀釋全血樣品進(jìn)行成像。該樣品 與一定量的用于染色該樣品中包含的血小板的熒光染料（或其它著色劑）混合。向樣品中 添加和混合該染料可以發(fā)生在使樣品成像前的任意時(shí)間；如，在通過毛細(xì)管流經(jīng)過腔24之 前在盒的通道內(nèi)混合。染料滲過血小板并染色各個(gè)血小板。當(dāng)激發(fā)時(shí)，染料產(chǎn)生與特定顏 色相關(guān)的特定波長(zhǎng)的熒光發(fā)射。血小板中的染料發(fā)出的光的具體顏色和強(qiáng)度通常是一系列 因素的函數(shù)，包括：血小板中染料的濃度和血小板的pH。如下文即將描述的，熒光發(fā)射產(chǎn)生 表示血小板的局部峰值發(fā)射區(qū)域，其從血小板發(fā)射出。
[0038] 當(dāng)對(duì)全血樣品執(zhí)行LDC時(shí)，可使用的可接受的著色劑的一個(gè)示例為吖啶橙 ("ACO"）。AC0為熒光染料，當(dāng)其與全血樣品混合時(shí)，對(duì)樣品內(nèi)的血小板（以及WBC(白 細(xì)胞）50和網(wǎng)狀細(xì)胞）染色。本發(fā)明不限于使用AC0;可使用其它染料（例如堿性橙）代 替AC0,或者結(jié)合AC0使用其它染料。以AC0作為示例，如果樣品經(jīng)受在470nm波長(zhǎng)或大約 470nm波長(zhǎng)的激發(fā)光照射，則血小板內(nèi)的AC0將發(fā)射大約540nm的光（呈現(xiàn)綠色）以及大約 660nm的光（呈現(xiàn)紅色）。
[0039] 為了執(zhí)行血小板計(jì)數(shù)，分析儀42適于（如通過算法被程序控制）以引導(dǎo)樣品照明 器38利用激發(fā)光（如約為470nm的光）和透射光（如約為413nm和660nm的光）照射靜 止地置于樣品中的樣品。當(dāng)遇到激發(fā)光時(shí)，每個(gè)血小板中的熒光染料發(fā)射約為540nm的綠 光和約為660nm的紅光。使用析像管40捕獲從該樣品中發(fā)射出的熒光和通過該樣品的透 射光，將代表捕獲光的信號(hào)發(fā)送到程控分析儀42,在此處將該信號(hào)處理成圖像。以這樣的方 式生成圖像：允許在每個(gè)單位基礎(chǔ)上確定圖像內(nèi)捕獲的熒光強(qiáng)度和透射強(qiáng)度。
[0040] 程控分析儀42適于從析像管40中收集圖像數(shù)據(jù)信號(hào)和處理這些圖像數(shù)據(jù)信號(hào)以 促進(jìn)識(shí)別圖像中顯示的血小板。程控分析儀42還適于確定靜止地置于所述分析腔24內(nèi)的 樣品的體積。例如，算法適于識(shí)別分析腔24內(nèi)的樣品的邊界，例如膠線44/樣品46的界面 (如，參見圖7)和通常存在于樣品46的邊緣且未碰到膠線44的樣品46/空氣48的界面 49 (如，參見圖8)，其中，膠線44形成腔24的橫向邊界。腔24的高度32是已知的或可確 定的。一旦確定被樣品46占用的腔24的面積（如，圖像的各個(gè)像素具有相關(guān)的腔面積）， 使用樣品面積和與腔24的相關(guān)高度可以確定樣品的體積。
[0041] 在一些實(shí)施方式中，通過平滑算法對(duì)圖像數(shù)據(jù)信號(hào)進(jìn)行初始處理，該平滑算法過 濾這些信號(hào)以使圖像的背景部分更加均勻。可接受的平滑算法的一個(gè)示例為將形貌濾波器 (如，圖像打開濾波器）應(yīng)用到圖像數(shù)據(jù)。濾波器可用于減輕一些背景變化，且可用于去除 圖像中的大型明亮的物體，如白細(xì)胞50( "WBC"）。由于WBC 50內(nèi)包含的材料，WBC 50(如 RNA、DNA)可呈現(xiàn)為強(qiáng)度峰值，所述材料被用于增強(qiáng)血小板亮度的著色劑而加亮顯示。圖6 示出圖像內(nèi)的血小板52和WBC 50。然而，基于WBC 50相對(duì)于血小板52的大的光強(qiáng)度，WBC 50可以與血小板52區(qū)分開來。從圖像中消除WBC 50(如，通過分割處理）有助于血小板 52的識(shí)別。
[0042] 也可以分析圖像數(shù)據(jù)以識(shí)別局部強(qiáng)度峰值。該局部峰值識(shí)別過程可以在"平滑" 過程之前或之后執(zhí)行，但是在確定局部峰值強(qiáng)度之前執(zhí)行該平滑步驟首先消除一些潛在誤 差源。然而無需這種平滑步驟?？梢允褂酶鞣N不同的技術(shù)執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)規(guī)定的波長(zhǎng)下的 局部強(qiáng)度峰值的識(shí)別。如下描述的，圖像強(qiáng)度可以基本上在整個(gè)樣品中變化，其中，變化可 歸因于多種因素，如血漿強(qiáng)度變化、膠線近似、WBC濃度、RBC濃度等。可以通過定量地評(píng)估 在局部基礎(chǔ)上的強(qiáng)度差異（如峰值）來提高血小板識(shí)別的準(zhǔn)確度。在此使用的術(shù)語"局部" 是指靜止地置于腔24內(nèi)的樣品內(nèi)的限定的小區(qū)域，其中，這些小區(qū)域可根據(jù)預(yù)定的像素區(qū) 域來限定，如一個(gè)5x5平方像素。一個(gè)5x5平方像素在評(píng)估血小板52時(shí)是有用的，因?yàn)樵?用于成像的分辨率下通常約2-3 μ m大小的血小板31處于5x5平方像素的范圍內(nèi)。然而， 本發(fā)明不限于這種特定大小的"局部區(qū)域"。在這些局部區(qū)域的每一區(qū)域中，確定最大樣品 圖像強(qiáng)度值。例如，樣品可受到熒光激發(fā)光和所獲得的樣品圖像的影響，該樣品圖像包括發(fā) 射光強(qiáng)度；如在綠色熒光通道內(nèi)的發(fā)射光強(qiáng)度。一旦確定了各個(gè)局部區(qū)域內(nèi)的圖像強(qiáng)度峰 值，則可以用全局閾值消除低于該全局閾值的那些強(qiáng)度峰值（如，最大值）。這一識(shí)別過程 建立了圖像內(nèi)的潛在表示血小板31的所有部分，這些部分在下文中分別被稱為"血小板候 選者"。一旦識(shí)別出所有的潛在血小板候選者，那么就可以進(jìn)一步分析圖像數(shù)據(jù)來消除這些 不是血小板52的候選者，并識(shí)別出在圖像內(nèi)可能存在的血小板凝塊。
[0043] 與分析腔膠線44和樣品/空氣的界面49相鄰的樣品圖像部分的圖像強(qiáng)度可以通 過由膠線44和樣品/空氣的界面49引起的光強(qiáng)度效應(yīng)而被污染。例如，從圖7中可看出， 當(dāng)該樣品被照亮?xí)r，膠線44呈現(xiàn)為明亮的且具有高圖像強(qiáng)度。該膠線44的高圖像強(qiáng)度引發(fā) 相鄰的區(qū)域比它們?cè)揪哂懈蟮膹?qiáng)度，繼而增高了弄錯(cuò)血小板識(shí)別的可能性，或者由于 整體強(qiáng)度而丟失血小板52的可能性。從圖8中也可以看出，某些程度上同樣的效應(yīng)也發(fā)生 在了樣品/空氣的界面49上?？梢杂煞治鰞x42通過算法實(shí)施以解釋在相鄰圖像部分內(nèi)的 強(qiáng)度污染（即，異常區(qū)域）的一種技術(shù)是，從血小板計(jì)數(shù)的考慮中去除這些相鄰圖像部分； 如通過遮蓋等。例如，通過估算相關(guān)歷史數(shù)據(jù)確定去除多少樣品圖像。例如，去除與膠線相 鄰的約100像素行的樣品圖像通常適于足以清除由于膠線44造成的強(qiáng)度污染。類似地，與 樣品/空氣的界面49相鄰的約80像素行的樣品圖像通常適于足以清除由于該界面造成的 強(qiáng)度污染。為了說明已清除的樣品圖像部分中存在的血小板52,可以基于在已清除區(qū)域局 部的樣品圖像區(qū)域中確定的相對(duì)數(shù)量，來估算在這一區(qū)域內(nèi)的血小板數(shù)量。
[0044] 在一些實(shí)施方式中，處理器42內(nèi)使用的算法可以進(jìn)一步適于辨認(rèn)血小板識(shí)別有 問題的其他區(qū)域。例如，在一些情況下，分析腔24的區(qū)域可以具有抑制精確體積測(cè)定的差 異。在這樣的情況下，在那樣的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行精確的血小板計(jì)數(shù)（是一個(gè)體積函數(shù)）的能力 可被折中。例如，圖9顯示了腔入口區(qū)域由于在該區(qū)域內(nèi)樣品過多造成的圖像異常58。為 了解釋這種異常，該區(qū)域內(nèi)的血小板52的數(shù)量可以基于位于該問題區(qū)域的樣品區(qū)域中的 血小板計(jì)數(shù)來估算。
[0045] 另一個(gè)可以由分析儀42通過算法實(shí)施的促進(jìn)血小板52識(shí)別的技術(shù)，是消除初始 獲取的圖像中存在的背景。例如，可將濾波器應(yīng)用于圖像數(shù)據(jù)信號(hào)，以去除在強(qiáng)度上（如， 綠光強(qiáng)度）低于預(yù)設(shè)全局閾值的變化?？赡鼙徽J(rèn)為是血小板52的低于全局閾值的局部強(qiáng) 度最大值可以被消除，從而消除將那些強(qiáng)度峰值被誤認(rèn)為血小板52的可能性。例如，分割 技術(shù)可作為一種清除背景的機(jī)制。本發(fā)明不限于任意特定的分割技術(shù)，可根據(jù)目前的應(yīng)用 而選擇一種具體的技術(shù)。本發(fā)明也不限于使用分割技術(shù)來消除背景，也可以使用選擇（即 "拾取"）像素或者區(qū)別具有特定屬性的像素的其他技術(shù)。
[0046] 另一種可以由分析儀42通過算法實(shí)施的促進(jìn)識(shí)別血小板52的技術(shù)包含獲取 (如，估算）樣品局部區(qū)域內(nèi)的血漿圖像強(qiáng)度。血漿通常比RBC更亮（S卩，更高的圖像強(qiáng) 度），但是沒有血小板52亮。添加到樣品中的至少一些熒光染料位于該血漿中，結(jié)果通過激 發(fā)光照亮樣品，在血漿內(nèi)形成某種程度的發(fā)射光強(qiáng)度。然而，血漿中染料的分布在整個(gè)樣品 中可能不是均勻的。因此，在分析腔24內(nèi)設(shè)置的樣品中，血漿的圖像強(qiáng)度可能會(huì)有很大變 化。例如，表示樣品的第一區(qū)域內(nèi)的血漿的圖像強(qiáng)度的成像數(shù)據(jù)與樣品的第二區(qū)域內(nèi)的血 漿的圖像強(qiáng)度的成像數(shù)據(jù)相比，可以差異高達(dá)30% -40%。在血漿強(qiáng)度中的均勻性的缺乏， 使得在沒有負(fù)面地影響血小板識(shí)別過程的情況下，難于統(tǒng)一獲取血漿強(qiáng)度。在樣品存在大 量RBC 54的區(qū)域中，血漿強(qiáng)度的非均勻性特別有問題。如果不考慮血漿強(qiáng)度，則RBC區(qū)域 內(nèi)可見的小的血漿區(qū)域可呈現(xiàn)為局部強(qiáng)度峰值，其可能會(huì)被錯(cuò)誤識(shí)別成血小板52。為了解 決這一問題，該算法可適于在RBC區(qū)域內(nèi)應(yīng)用RBC遮蓋來將RBC 54分割出來（或者從圖像 中將它們?nèi)コ粝率Ｓ嗟难獫{區(qū)域。例如，RBC 54在圖像信號(hào)數(shù)據(jù)的紅色通道中沒有表 達(dá)。因此，使用紅色通道遮蓋形成的圖像將會(huì)只顯示血漿的強(qiáng)度和在RBC區(qū)域內(nèi)的任意血 小板52的強(qiáng)度。根據(jù)兩種樣品成分之間的強(qiáng)度上的差異（如，比周圍像素高約20%的那些 像素），可定量地從局部血漿中區(qū)分出血小板52。在那些沒有足夠血漿的面積以不允許這 類比較分析的RBC區(qū)域中，可以基于RBC 54本身的圖像強(qiáng)度使用可替選的技術(shù)。例如，在 那些區(qū)域內(nèi)的估算的血漿圖像強(qiáng)度可以基于下述估算：(RBC平均圖像強(qiáng)度）+3*(RBC圖像 強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差）=估算的血漿強(qiáng)度。本方法不限于這種特定的可替選技術(shù)。
[0047] 在將一個(gè)或多個(gè)上面描述的技術(shù)應(yīng)用于血小板候選者以及不考慮非血小板候選 者（根據(jù)它們被識(shí)別的程度）后，可以通過評(píng)估每個(gè)獨(dú)立候選者的特征來進(jìn)一步分析剩余 的候選者。可以由分析儀42通過算法實(shí)施的第一技術(shù)包括評(píng)估給定區(qū)域內(nèi)候選者的強(qiáng)度 峰值的方向?qū)Ρ榷?。該區(qū)域可以根據(jù)強(qiáng)度峰值周圍的像素進(jìn)行限定。例如，使用對(duì)于全血分 析有用的分辨率（如，〇. 5 μ m/5像素），潛在地代表血小板候選者的區(qū)域可被限定為，從強(qiáng) 度峰值向外直到約三或四個(gè)（3或4)像素，四（4)個(gè)像素外的區(qū)域被限定為血小板候選者 外的區(qū)域。本發(fā)明不限于這些區(qū)域限定，且可以被選擇以適于當(dāng)前的應(yīng)用。在限定區(qū)域內(nèi)， 血小板52具有強(qiáng)度的方向?qū)Ρ榷龋渲?，在朝向區(qū)域的邊界的方向上，強(qiáng)度從區(qū)域的中心 向外減?。?，從強(qiáng)度峰值向外，圖10中概要地示出）。例如，峰值強(qiáng)度在中心為最大值，并 且朝向該區(qū)域邊界沿著向外延伸的斜坡減少。對(duì)于按照形成圖像的像素而被逐步分割的圖 像，每個(gè)像素在朝區(qū)域邊界的方向上具有強(qiáng)度的減少。這種強(qiáng)度遞減存在于在該區(qū)域中心 的最大強(qiáng)度值之外的多個(gè)方向上，但是并不是必須存在于所有方向上。該強(qiáng)度方向?qū)Ρ榷?的周向均勻性，可以通過定量地評(píng)估圍繞該候選者的強(qiáng)度峰值每旋轉(zhuǎn)"Y"度（如，每30度） 時(shí)的像素的圖像強(qiáng)度來評(píng)估。每像素強(qiáng)度降低的比率，也可以變化以適應(yīng)當(dāng)前應(yīng)用。另外， 第一強(qiáng)度減少百分比可用于樣品的第一區(qū)域，第二較高的強(qiáng)度減少百分比可用于樣品的血 小板識(shí)別較為困難的其他區(qū)域；例如，在較高的血漿強(qiáng)度區(qū)域或RBC區(qū)域，使用較高的強(qiáng)度 減少百分比。圖10概略地描述了血小板候選者的強(qiáng)度峰值，其示出在朝向區(qū)域邊界的單一 方向上從區(qū)域中心向外的強(qiáng)度遞減。
[0048] 另一種通過算法評(píng)估單個(gè)候選者的特征的技術(shù)包括：定量確定在給定區(qū)域（根據(jù) 方向?qū)Ρ榷热缟舷薅ǖ膮^(qū)域）中圍繞候選者強(qiáng)度峰值的強(qiáng)度遞減的高斯分布。圖11a至 圖11c概略地說明了強(qiáng)度峰值周圍強(qiáng)度的三種不同的高斯分布。在圖11a中，一種清晰地 限定的強(qiáng)度峰值位于區(qū)域中心，且該強(qiáng)度分布均勻地遠(yuǎn)離該中心峰值減少；逐像素減少約 4%的強(qiáng)度。這種強(qiáng)度分布在血小板圖像中非常典型，且具有這種分布的血小板候選者被接 受作為血小板圖像。在圖lib中，這種分布說明了在被近似相同的強(qiáng)度區(qū)域（例如，該中心 像素之間的強(qiáng)度變化低于3% )包圍的該區(qū)域中心內(nèi)的強(qiáng)度峰值，該近似相同的區(qū)域反而 被在向外方向上有相對(duì)大的強(qiáng)度減少的區(qū)域包圍。這種強(qiáng)度分布（作為具有大強(qiáng)度峰值區(qū) 域出現(xiàn)）在血小板圖像中不太典型，且可能會(huì)作為被過分曝光的圖像的函數(shù)?；谠搱D像 的情況，具有這種類型的高斯分布的血小板候選者可以被接受作為血小板；如，在它們有利 地與局部血小板強(qiáng)度值等比較時(shí)，被接受作為血小板。在圖11c中，該分布說明了一種在該 區(qū)域中心內(nèi)的相對(duì)清晰的強(qiáng)度峰值，該區(qū)域環(huán)繞沿外方向的強(qiáng)度驟減。這種強(qiáng)度分布不是 血小板的象征，且這些血小板候選者也沒有被接受作為血小板52。可以對(duì)血小板候選者執(zhí) 行高斯分布分析和方向?qū)Ρ榷确治鲋械囊环N或兩種分析。
[0049] 在基本上未稀釋的全血樣品中，血小板52可以聚集成簇，在圖像中作為具有多個(gè) 強(qiáng)度峰值的團(tuán)顯示出來。如果簇僅被視為單個(gè)血小板，則識(shí)別出的血小板52的數(shù)目將會(huì)比 簇中實(shí)際存在的血小板的數(shù)目少。為了避免這種類型的錯(cuò)誤，分析儀42可以在算法上適于 識(shí)別血小板簇和將它們與單個(gè)血小板52區(qū)分開來。一種識(shí)別和區(qū)分出簇的方法包括上面 描述的高斯分布分析。這種技術(shù)使用高斯分布分析內(nèi)被定義為血小板候選者的區(qū)域（如， 半徑為"X"像素內(nèi)的區(qū)域）的外部區(qū)域。為了識(shí)別簇，對(duì)比邊界處像素的圖像強(qiáng)度與局部 血漿強(qiáng)度。如果一些候選者邊界像素（如，50%)分別具有比局部血漿圖像強(qiáng)度大的預(yù)定 百分比的圖像強(qiáng)度，則那么該候選者就被認(rèn)為是簇。這是識(shí)別簇的一種方法的示例，本發(fā)明 不限于這種特定實(shí)例。
[0050] -旦識(shí)別出簇，則可以使用多種技術(shù)來確定該簇中血小板52的數(shù)量。例如，可以 應(yīng)用算法以確定對(duì)于簇內(nèi)的每個(gè)峰值的閾值圖像強(qiáng)度值（T h)。該閾值圖像強(qiáng)度值（Th)基 于那個(gè)特定峰值的圖像強(qiáng)度和局部血漿強(qiáng)度值進(jìn)行確定。該閾值圖像強(qiáng)度值（T h)比各個(gè) 峰值強(qiáng)度值小，但是比局部背景強(qiáng)度值大。為了確定給定簇內(nèi)血小板52的數(shù)量，通過算法 應(yīng)用一種"生長(zhǎng)"技術(shù)以識(shí)別簇。在這種生長(zhǎng)技術(shù)下，圖像單元（如，像素）與峰值強(qiáng)度圖 像單元相鄰且具有等于或大于閾值圖像強(qiáng)度值（T h)的強(qiáng)度值，被識(shí)別作為簇的一部分。然 后這一過程將同一閾值評(píng)估，應(yīng)用到與被識(shí)別為簇的一部分的像素相鄰的像素。重復(fù)這一 過程，直到?jīng)]有發(fā)現(xiàn)額外的具有比該閾值等級(jí)（T h)高的強(qiáng)度等級(jí)的相鄰像素出現(xiàn)。
[0051] 一旦該簇"成熟"了，確定在該簇內(nèi)與每個(gè)成熟的血小板（即，各個(gè)個(gè)體從上面描 述的圖像強(qiáng)度峰值向外延伸）相關(guān)聯(lián)的面積，并確定這些延伸區(qū)域的平均面積值（PLT Ti_ is面積）。然后，對(duì)比該平均面積值（PLT平均成υ面積）與已知的平均正吊血小板面積（PLT平均正常面 w)。如果平均成熟面積（PLT￥JasMJiR)大于平均人類血小板面積的多倍（如，α*人類血 τ ，其中α可能等于1.x)，則可以由簇的總面積（Α#)除以平均人類血小板面積（如， Ag/PLT^gg^)來限定該簇內(nèi)的血小板52的數(shù)量。如果平均成熟面積（PLTTJasMiR)小 于上述平均人類血小板面積的多倍，則可以由簇的總面積（A#)除以平均成熟血小板面積 (如，A簇/PLT TOM_/D、）來限定簇內(nèi)的血小板52的數(shù)量。
[0052] 對(duì)于那些使用分析腔24的血小板分析，該分析腔24(例如在'114申請(qǐng)中公開的 腔）具有在其內(nèi)設(shè)置的小珠31，小珠31可以這樣出現(xiàn)在圖像中：其具有圍繞其邊界的亮 環(huán)，即，圖像內(nèi)高強(qiáng)度的環(huán)。圖12顯示的圖像包括多個(gè)小珠31，每個(gè)小珠31具有在其邊界 小珠31周圍的高圖像強(qiáng)度的環(huán)。
[0053] 為了避免與小珠31相關(guān)的可能的血小板識(shí)別誤差（如，在亮環(huán)內(nèi)、或者非常接近 環(huán)、或者在環(huán)內(nèi)），分析儀42可用于使用基于規(guī)則的分類器基于多個(gè)特征評(píng)估與小珠31相 關(guān)的強(qiáng)度峰值。然而，為了分析用于血小板52的小珠相鄰區(qū)域，本發(fā)明不限于單獨(dú)使用該 分析儀。
[0054] 作為初始步驟，在圖像樣品中識(shí)別小珠31。例如，在所形成的樣品圖像內(nèi)可識(shí)別小 珠31以確定樣品體積，在該圖像中小珠呈現(xiàn)為暗斑；如，在一些情況下，識(shí)別出來的小珠可 以被遮蓋以更清楚地呈現(xiàn)為暗斑，從而促進(jìn)分析。然而，本發(fā)明不限于識(shí)別小珠31的這一 技術(shù)。
[0055] -旦識(shí)別出小珠31，則識(shí)別小珠區(qū)域內(nèi)的每個(gè)圖像強(qiáng)度峰值，并將其視作血小板 候選者。為了進(jìn)一步評(píng)估血小板候選者，然后候選者可受到如上所述的"生長(zhǎng)"技術(shù)的影響， 以確定該候選者是否是血小板候選者或者可能是血小板族。
[0056] 對(duì)于被識(shí)別作為血小板候選者的每個(gè)強(qiáng)度峰值（例如，定位最靠近小珠31)，該候 選者可使用基于規(guī)則的分類器進(jìn)一步評(píng)估候選者。在該基于規(guī)則的分類器的步驟中，使用 多個(gè)定量特征中的至少一些特征來分析每個(gè)血小板候選者，多個(gè)定量特征中包括：面積、標(biāo) 準(zhǔn)化峰值強(qiáng)度值、標(biāo)準(zhǔn)化平均強(qiáng)度值、標(biāo)準(zhǔn)化估算血漿強(qiáng)度、圓度、范圍（Extent)、堅(jiān)實(shí)度 (Solidity)、偏心率、長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和短軸長(zhǎng)度。這些定量特征是基于規(guī)則的分類器內(nèi)可以使用 的特征的例子，但本發(fā)明不限于這些特定特征。此外，本發(fā)明不限于使用任何特定數(shù)量的這 些特征或這些特征的任意特定結(jié)合；如，在一些情況下，基于規(guī)則的分類器在分類過程中可 以使用少到一個(gè)特征或多到所有特征。
[0057] 例如，為了評(píng)估特定的血小板候選者，該分類器可以先考慮候選者面積。可以基于 該圖像中候選者血小板占用的像素的數(shù)目來分配該候選者面積的定量值。
[0058] 基于規(guī)則的分類器也適于考慮代表血小板候選者的標(biāo)準(zhǔn)化峰值強(qiáng)度值的定量值。 例如，如上文所述，圖像強(qiáng)度值可被賦予例如0單位至4095單位（"IVU"）中的任意數(shù)值范 圍的值。在這種特征中，將所確定的值除以4095可對(duì)峰值圖像強(qiáng)度值標(biāo)準(zhǔn)化。如上所述， 該0-4095的強(qiáng)度范圍是一種任意范圍，且本發(fā)明不限于這種特定范圍。
[0059] 基于規(guī)則的分類器也適于考慮代表血小板候選者的標(biāo)準(zhǔn)化平均強(qiáng)度值的定量值。 在這種特征中，將所確定的值除以4095來平均和標(biāo)準(zhǔn)化血小板候選者內(nèi)的像素的圖像強(qiáng) 度值。這里再次地，該0-4095的強(qiáng)度范圍是一種任意范圍，且本發(fā)明不限于這種特定范圍。
[0060] 基于規(guī)則的分類器也適于考慮代表對(duì)于血小板候選者局部的血漿的標(biāo)準(zhǔn)化估算 血漿強(qiáng)度的定量值。在這種特征下，以如上描述的方式相同或類似的方式，識(shí)別局部血漿區(qū) 域，并確定那些血漿區(qū)域的代表性圖像強(qiáng)度值；如，確定局部血漿區(qū)域的平均強(qiáng)度值。采用 例如上面描述的方式，標(biāo)準(zhǔn)化局部血漿區(qū)域的代表性圖像強(qiáng)度值；例如，將該值除以4095。
[0061] 該基于規(guī)則的分類器還適于考慮代表血小板候選者的圓度的定量值。一種確定血 小板候選者的圓度的方法包括使用下述等式：
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于識(shí)別全血樣品中的血小板的方法，包括如下步驟： 將至少一種著色劑添加到所述全血樣品中，該著色劑用于標(biāo)記血小板； 將所述全血樣品置于由至少一個(gè)透明面板限定的腔中； 將靜止地置于所述腔中的所述樣品的至少一部分進(jìn)行成像以形成一個(gè)或多個(gè)圖像；和 采用分析儀識(shí)別所述樣品中的一個(gè)或多個(gè)血小板，所述分析儀適于基于所述圖像內(nèi)可 定量確定的特征，使用分析儀來識(shí)別所述血小板，該可定量確定的特征包括強(qiáng)度差異。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述識(shí)別步驟包括：確定所述圖像內(nèi)的局部區(qū)域內(nèi) 的強(qiáng)度差異。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述識(shí)別步驟包括將全局閾值應(yīng)用于所述圖像內(nèi) 的強(qiáng)度差異。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，還包括識(shí)別異常圖像部分和估算在所述異常圖像部分內(nèi) 的血小板數(shù)量。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述識(shí)別步驟包括獲取血漿的圖像強(qiáng)度。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述識(shí)別步驟包括使用強(qiáng)度差異的方向?qū)Ρ榷葋?評(píng)估血小板候選者。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，還包括確定峰值強(qiáng)度差異和確定在所述圖像內(nèi)在遠(yuǎn)離所 述峰值延伸的方向上強(qiáng)度遞減的值。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，還包括確定所述強(qiáng)度遞減的周向均勻性。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，還包括確定所述強(qiáng)度遞減的高斯分布。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述識(shí)別步驟包括評(píng)估所述圖像以確定所述樣品 中的一個(gè)或多個(gè)血小板簇的存在。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述識(shí)別步驟包括識(shí)別所述圖像中的血小板候選 者和使用基于規(guī)則的分類器分析一個(gè)或多個(gè)所述血小板候選者，所述基于規(guī)則的分類器使 用多個(gè)定量特征。
12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述強(qiáng)度差異為所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度差異。
13. -種用于識(shí)別全血樣品中的血小板的設(shè)備，包括： 分析盒，所述分析盒包括帶有一對(duì)平面構(gòu)件的分析腔，所述平面構(gòu)件中的至少一個(gè)是 透明的，所述盒用于將至少一種著色劑添加到所述全血樣品中，所述著色劑用于標(biāo)記血小 板，且所述腔用于保持所述樣品靜止地置于平面構(gòu)件之間；和 分析裝置，所述分析裝置用于將所述靜止地置于所述腔內(nèi)的樣品的至少一部分進(jìn)行成 像，該分析裝置適于基于所述圖像內(nèi)的可定量確定的特征來識(shí)別所述血小板，該可定量確 定的特征包括強(qiáng)度差異。
14. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于確定所述圖像內(nèi)的局部區(qū)域 內(nèi)的強(qiáng)度差異。
15. 如權(quán)利要求14所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于將全局閾值應(yīng)用于所述圖像 內(nèi)的強(qiáng)度差異。
16. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于識(shí)別異常圖像部分和估算所 述異常圖像部分的血小板數(shù)量。
17. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于獲取血漿的圖像強(qiáng)度。
18. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于使用強(qiáng)度差異的方向?qū)Ρ榷?來評(píng)估血小板候選者。
19. 如權(quán)利要求18所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于確定峰值強(qiáng)度差異和確定在 所述圖像內(nèi)在遠(yuǎn)離所述峰值延伸的方向上強(qiáng)度遞減的值。
20. 如權(quán)利要求19所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于確定所述強(qiáng)度遞減的周向均 勻性。
21. 如權(quán)利要求19所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于確定所述強(qiáng)度遞減的高斯分 布。
22. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于評(píng)估所述圖像以確定所述樣 品中一個(gè)或多個(gè)血小板簇的存在。
23. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中，所述分析裝置適于識(shí)別所述圖像中的血小板候 選者和使用基于規(guī)則的分類器分析一個(gè)或多個(gè)所述血小板候選者，所述基于規(guī)則的分類器 使用多個(gè)定量特征。
24. 如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中，所述強(qiáng)度差異為所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度差異。
【文檔編號(hào)】G01N33/52GK104094118SQ201280068915
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月30日
【發(fā)明者】于常華, 謝敏, 吳一鳴 申請(qǐng)人:艾博特健康公司