專(zhuān)利名稱(chēng)：用新外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及經(jīng)新外植體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及體細(xì)胞胚胎再生將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入棉花的方法。
背景棉花是紡織工業(yè)中最廣泛應(yīng)用的天然纖維，其在世界范圍內(nèi)的年產(chǎn)量超過(guò)1億包(bales)，價(jià)值為450億美元。棉絨或種子纖維是來(lái)自錦葵科棉屬的50多個(gè)物種的終末分化的單表皮細(xì)胞，其被歸類(lèi)為天然的、纖維素類(lèi)、單細(xì)胞和常產(chǎn)纖維。已被栽培了5000多年的棉花栽培品種均來(lái)自?xún)蓚€(gè)二倍體(2n＝2x＝26)(G.herbaceum和G.arboreum)和兩個(gè)異源四倍體(2n＝4x＝52)(G.hirsutum L.，Upland；和G.barbadense L.，Sea Island)。在1997年，世界棉花生產(chǎn)國(guó)前5名是美國(guó)、中國(guó)、印度、巴基斯坦和烏茨別克斯坦，共產(chǎn)出約6千3百萬(wàn)包。
在下個(gè)世紀(jì)，大多數(shù)作物包括谷類(lèi)、油料作物、水果、蔬菜和其它經(jīng)濟(jì)重要作物將被遺傳工程化，以具有添加的或改變的性狀，從產(chǎn)量和品質(zhì)的改良直至除草劑抗性和害蟲(chóng)抗性(Chappell，1996；Fraley等，1986；Herrera-Estrella等，1983；Hoekema等，1983；Horsch等，1985；Jefferson，1987；Ryals，1996)。在棉花中，將應(yīng)用新技術(shù)以增加產(chǎn)量、改善纖維品質(zhì)和產(chǎn)生抗除草劑、害蟲(chóng)、線蟲(chóng)和疾病的新品種(John，1996；John & Keller，1996；John & Stewart，1992；Murray等，1993；Rajasekaran等，1996；Schell，1997；Stewart，1992)。
1、棉花的組織培養(yǎng)1935年，Skovsted報(bào)道了棉花的第一個(gè)胚胎培養(yǎng)物。Beasley(1971)報(bào)道了棉花中愈傷組織的形成，其在MS培養(yǎng)基上從受精胚珠的珠孔端長(zhǎng)出。從G.klotzschianum的懸浮培養(yǎng)物實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Prive & Smith，1979)。1983年，Davidonis & Hamilton在兩年栽培后首次成功地從愈傷組織中有效及可重復(fù)地再生出棉花(G.hirsutum L.)植物。從此棉花植物從不同的外植體經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生而再生(Zhang & Feng，1992；Zhang，1994)，這些外植體包括子葉(Davinonis等，1987；Davidonis &Hamilton，1983；Finer，1988；Firoozabady等，1987)，胚軸(Cousins等，1991；Rangan & Zavala，1984；Rangan & Rajasekaran，1996；Trolinder & Goodin，1988；Umbeck等，1987，1989)，莖(Altman等，1990；Finer & Smith，1984)，莖尖(Bajaj等，1985；Gould等，1991；Turaev & Shamina，1986)，未成熟胚胎(Beasley，1971；Eid等，1973；Stewart & Hsu，1977，1978)，葉柄(Finer & Smith，1984；Gawel等，1986；Gawel & Robacker，1990)，葉(Finer & Smith，1984；Gawel &Robacker，1986)，根(Chen & Xia，1991；Kuo等，1989)，愈傷組織(Finer & McMullen，1986；Trolinder等，1991)和原生質(zhì)體(Chen等，1989)。
2、棉花轉(zhuǎn)化外植體(如胚軸、子葉、從胚軸和子葉產(chǎn)生的愈傷組織、以及未成熟胚胎)已被用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和粒子轟擊(de Framond等，1983；Finer & McMullen，1990；Firoozabady等，1987；Perlak等，1990；Rangan & Rajasekaran，1996；Rajasekaran等，1996；Trolinder等，1991；Umbeck等，1987，1989，1992)。另外，切下的胚軸的分生組織也已用于經(jīng)粒子轟擊進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化(Chlan等，1995；John，1996；John & Keller，1996；McCabe & Martinell，1993)。Zhou等(1983)通過(guò)將DNA注射進(jìn)自體受粉一天后的中軸胎座而轉(zhuǎn)化了棉花。但是，棉花轉(zhuǎn)化高度依賴(lài)于基因型(Trolinder，1985a，1985b，1986；Trolinder & Goodin，1987，1988a，1988b)。除了少數(shù)栽培品種如Gossypium hirsutum cv.Coker312和G.hirsutum Jin 7是可再生和可轉(zhuǎn)化的之外，大多數(shù)重要的精銳商業(yè)栽培品種如Gossypium hirsutum cv.D &P5415和G.hirsutum cv.Zhongmian12是不可通過(guò)這些方法再生和轉(zhuǎn)化的。
基于以前的報(bào)道和本發(fā)明人自己的實(shí)驗(yàn)資料，用胚軸作物外植體可實(shí)現(xiàn)高效愈傷組織誘導(dǎo)(60％)。但是，轉(zhuǎn)化率僅為20％(Firoozabady等，1987；Umbeck等，1987)。幾種因素可導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化愈傷組織的突破，或?qū)е轮饕煞寝D(zhuǎn)化細(xì)胞組成的嵌合愈傷組織的突破(1)低卡那霉素水平(高水平卡那霉素對(duì)于棉花外植體和愈傷組織是毒性的)；(2)在愈傷組織增殖的后期階段的依賴(lài)于經(jīng)驗(yàn)的選擇；和(3)使用僅于選擇培養(yǎng)基(Firoozabady等，1987)部分接觸的外植體如胚軸。當(dāng)子葉用作外植體時(shí)，雖然轉(zhuǎn)化率比使用胚軸高，但是其在隨后的培養(yǎng)中經(jīng)常很難除去農(nóng)桿菌(Jiao G.-L.和Chen，Z.-X.，個(gè)人通訊；Umbeck等，1987，1989)。經(jīng)粒子轟擊進(jìn)行的分生組織的轉(zhuǎn)化率與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化相比非常低(0.02％-0.22％)。
因此，目前仍需要提供高轉(zhuǎn)化率以及在再生的體細(xì)胞胚胎中高轉(zhuǎn)化子率的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花植物的方法。
本發(fā)明方法與采用胚軸和子葉組織的先前技術(shù)相比提供了改善的轉(zhuǎn)化率，據(jù)信本發(fā)明方法對(duì)于各種棉花品種有廣泛適用性。
圖2示出質(zhì)粒pVIP96，通過(guò)將螢光素酶基因插入其中而衍生出pBK9。
詳細(xì)描述為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)并提高轉(zhuǎn)化效率，使用須根外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化。盡管在擬南芥屬中，用須根外植體實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的高轉(zhuǎn)化效率(Valvekens等，1988)，但是已報(bào)道在含2.0mg/L IAA，0.02-0.04mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上來(lái)自棉花的嫩須根會(huì)分化(Kuo，C.C.等，1989)，文獻(xiàn)中沒(méi)有報(bào)道用須根作為外植體進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化。
本文中須根成功地用作外植體以進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和植物再生。在本方法中使用改良的籽苗培養(yǎng)用培養(yǎng)基，以及胚胎愈傷組織的再生和分化。
用于培養(yǎng)籽苗獲得外植體材料的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)成使根的褐變最小化(褐變負(fù)面影響外植體在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)及形成愈傷組織的能力)，并且促進(jìn)完整健壯根的生長(zhǎng)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，MET(多效三唑，農(nóng)業(yè)中用于促進(jìn)根生長(zhǎng)的化學(xué)試劑)和NAA(α-萘乙酸)一起用于籽苗培養(yǎng)基中以降低褐變根的比例并增加愈傷組織發(fā)生率。MET優(yōu)選地以約0.05mg/l-0.2mg/l的濃度應(yīng)用，最優(yōu)選約0.1mg/l。NAA優(yōu)選地以約0.01mg/l-0.2mg/l的濃度應(yīng)用，最優(yōu)選約0.05mg/l。MET和NAA還優(yōu)選地以類(lèi)似于用于籽苗培養(yǎng)基的量用于從愈傷組織再生的根轉(zhuǎn)基因籽苗的培養(yǎng)基。在愈傷組織形成培養(yǎng)基的一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用維生素B5，2，4-D((2，4-二氯苯氧基)乙酸)，MgCl2和葡萄糖，優(yōu)選地約0.05mg/l-0.15mg/l 2，4-D，約0.4mg/l-1.2mg/l MgCl2，和約1％-5％葡萄糖，最優(yōu)選地約0.1mg/l 2，4-D，約0.8mg/l MgCl2，和約3％葡萄糖。在在愈傷組織形成培養(yǎng)基的一替代優(yōu)選實(shí)施方案中，使用肌醇、維生素B1和二甲基烯丙基(氨基)嘌呤，優(yōu)選地約50mg/l-約150mg/l肌醇，約1mg/l-約10mg/維生素B1和約0.1mg/l-約7.5mg/l二甲基烯丙基(氨基)嘌呤，最優(yōu)選地約100mg/l肌醇，約0.4mg/l維生素B1和約5mg/l二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。在用抗生素選擇的過(guò)程中也可使用用于誘導(dǎo)愈傷組織的相同培養(yǎng)基，例如含300-400mg/L頭孢噻肟或15-30mg/L卡那霉素。存在高濃度(優(yōu)選地約1900mg/l-約5700mg/l、最優(yōu)選地約3800mg/l)硝酸鹽(優(yōu)選地NaNO3)對(duì)于分化培養(yǎng)基的觀察到的有效性是關(guān)鍵的。用須根作為外植體雖然愈傷組織誘導(dǎo)率比子葉和下胚軸作外植體時(shí)低，但是能達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率。
將外源基因?qū)朕r(nóng)桿菌從而使其穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移進(jìn)與農(nóng)桿菌接觸的植物或植物組織中的技術(shù)是熟知的現(xiàn)有技術(shù)，而不是本發(fā)明的一部分。有利的是使用所謂的“去毒(disarmed)”農(nóng)桿菌菌株或Ti質(zhì)粒，即在這種菌株或質(zhì)粒中負(fù)責(zé)形成由野生型農(nóng)桿菌導(dǎo)致的冠癭病的腫瘤特征的基因已被去除或失活。文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)許多去毒農(nóng)桿菌菌株的例子(例如，pAL4404，pEHA101和pEH105(Walkerpeach & Veltern，1994))。還有利的是使用所謂的雙向載體系統(tǒng)，如美國(guó)專(zhuān)利4,940,838和5,464,763所述(Schilperoort等)和Hoekema等，1983。雙向載體系統(tǒng)使得可以在大腸桿菌中操作攜帶欲導(dǎo)入植物的外源基因的質(zhì)粒，從而使得載體構(gòu)建過(guò)程更易于進(jìn)行。
類(lèi)似地，載體構(gòu)建、包括包含希望導(dǎo)入植物的外源基因的嵌合基因的構(gòu)建可用現(xiàn)有技術(shù)熟知的技術(shù)進(jìn)行，其不是本發(fā)明的組成部分。嵌合基因應(yīng)包含在希望表達(dá)的宿主中有活性的啟動(dòng)子。例如，有利的是包含一系列選擇標(biāo)記以便在轉(zhuǎn)化方法的不同階段選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。與在細(xì)菌中有活性的啟動(dòng)子相連的一個(gè)選擇標(biāo)記(例如賦予抗生素如卡那霉素、頭孢噻肟或鏈霉素抗性的基因)使得能選擇含有該標(biāo)記的細(xì)菌(即轉(zhuǎn)化子)。與植物活性啟動(dòng)子(如CaMV 35S啟動(dòng)子或一種T-DNA啟動(dòng)子如NPT II NOS啟動(dòng)子)相連的另一選擇標(biāo)記使得可選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。希望導(dǎo)入植物細(xì)胞的外源基因應(yīng)包含與編碼序列功能相關(guān)植物活性啟動(dòng)子，從而該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因在轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)。同樣，植物活性啟動(dòng)子如CaMV 35S啟動(dòng)子，NPT II NOS啟動(dòng)子或任何組織特異性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域熟知的，且合適啟動(dòng)子的選擇屬于本領(lǐng)域常識(shí)。
本發(fā)明方法可用于產(chǎn)生表達(dá)任何外源基因的轉(zhuǎn)基因植物，而不限于所選的基因。所需外源基因的選擇取決于研究者的目的，現(xiàn)有技術(shù)中已知許多可用于本發(fā)明的所需基因的例子(例如，蘇云金芽孢桿菌毒素基因家族，除草劑抗性基因如賦予草甘磷抗性的莽草酸合酶基因，美國(guó)專(zhuān)利5,188,642，或賦予2，4-D抗性的2，4-D單加氧酶基因，Bayley等，理論和應(yīng)用遺傳學(xué)，82卷，645-49頁(yè)，雄性不育基因如美國(guó)專(zhuān)利5,741,684(Fabijanski等)的反義基因，或甚至是美國(guó)專(zhuān)利5,123,765(Oliver等)描述的精制作物保護(hù)系統(tǒng))。
現(xiàn)有技術(shù)中認(rèn)為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化是高度依賴(lài)于品種的。已證實(shí)Coker系列的棉花品種相對(duì)易于轉(zhuǎn)化。但是，DP5412，Zhongmain 12和許多其它品種的轉(zhuǎn)化仍有困難。G.barbadense和其它雙倍體物種的情況也是如此。理論上，粒子轟擊、DNA注射和用農(nóng)桿菌感染分生組織上可用于轉(zhuǎn)化所有棉花品種的一些替代方法。這些方法相關(guān)的問(wèn)題為轉(zhuǎn)化效率低以及結(jié)果不穩(wěn)定/不可靠。據(jù)信本發(fā)明方法在棉花品種轉(zhuǎn)化方面具有廣泛的適用性，因?yàn)樗ㄟ^(guò)應(yīng)用須根外植體克服或減輕了以前研究中遇到的與棉花轉(zhuǎn)化相關(guān)的幾個(gè)問(wèn)題(如未轉(zhuǎn)化愈傷組織的貫穿、外植體生長(zhǎng)不良以及低轉(zhuǎn)化率、體細(xì)胞再生差)。
下述縮寫(xiě)用于表示本發(fā)明所用的培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(10g bacto胰胨+5g bacto酵母膏+10g NaCl)；B5培養(yǎng)基(Gamborg等，1968；Sigma，目錄號(hào)G-5768)；MS培養(yǎng)基(Murashige等，1962；Sigma，目錄號(hào)M-5524)；SH培養(yǎng)基(Stewart & Hsu，1977，Planta 137，113-117)；CB-1.1(1/2MS+1/2B5維生素+0.1mg/L NAA)；CB-1.2(1/2B5培養(yǎng)基)；CB-2.1(MS macro+B5 micro+0.05mg/L 2，4-D+0.1mg/L細(xì)胞分裂素+3％葡萄糖+2g/L吉蘭糖膠(PhytaGelTM，Sigma)+0.93mg/LMgCl2·6H2O，pH5.8)；CB-2.2(MS macro+100mg/L肌醇+0.4mg/L維生素B1+5mg/L2iP(6-(γ-二甲基烯丙基(氨基)嘌呤)+0.2mg/L NAA+3％葡萄糖+2g/L吉蘭糖膠(PhytaGelTM，Sigma)+0.93mg/L MgCl2·6H2O，pH5.8)；CB-3.1(CB-2.1+500mg/L頭孢噻肟+50mg/L卡那霉素)；CB-3.2(CB-2.2+500mg/L頭孢噻肟+50mg/L卡那霉素)；CB-4(含有250mg/L頭孢噻肟和20mg/L卡那霉素的通過(guò)加入雙倍量的KNO3并除去NH4NO3而改進(jìn)的CB-3.1或CB-3.2)；CB-5(SH+1.5％蔗糖+2g/L吉蘭糖膠(PhytaGelTM，Sigma)+0.93g/L MgCl2，pH7.0)。
下述實(shí)施例旨在描述本發(fā)明而非限制其范圍，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書(shū)限定。實(shí)施例1從根組織培養(yǎng)物中再生棉花植物制備根外植體棉花種子在70％乙醇中消毒10-15分鐘，然后用10％H2O2處理30-120分鐘。處理的種子在28℃于無(wú)菌水中濕潤(rùn)24小時(shí)，然后在28-30℃、16小時(shí)光照(60-90μE m-2s-1)下于CB-1.1培養(yǎng)基或CB-1.2培養(yǎng)基上萌發(fā)。7-10天后，用如此生長(zhǎng)的無(wú)菌籽苗用于制備外植體。發(fā)現(xiàn)用CB-1.1培養(yǎng)基獲得白色多發(fā)健康根(較長(zhǎng)且較粗)，而用CB-1.2培養(yǎng)基獲得灰色至棕色的較短且較細(xì)的根。因此，選擇CB-1.1進(jìn)行進(jìn)一步工作。
愈傷組織的誘導(dǎo)從籽苗中切下須根并于28-30℃在CB-2.1或CB-2.2培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，光照為16小時(shí)(60-90μE m-2s-1)。根外植體的最佳大小為5-7mm。在短至3天即在根段的切割部位出現(xiàn)少量小愈傷組織。通常，轉(zhuǎn)化的胚軸或子葉外植體在培養(yǎng)3天后在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上開(kāi)始長(zhǎng)出愈傷組織。但是，在本發(fā)明之前，通常發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的根外植體在培養(yǎng)10天后才出現(xiàn)愈傷組織。根外植體是白色的。一周后，從根段的其它部分也出現(xiàn)小愈傷組織。根外植體的變?yōu)榛疑踔磷厣?。在培養(yǎng)2周后，愈傷組織出現(xiàn)于全部根外植體并生長(zhǎng)良好。對(duì)于2種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)CB-2.2能誘導(dǎo)良好的愈傷組織形成，而CB-2.1不能。在CB-2.2培養(yǎng)基上根外植體生長(zhǎng)良好，在外植體的切割部位出現(xiàn)微型愈傷組織。約有10％的根外植體在培養(yǎng)基上僅3天后即出現(xiàn)愈傷組織。另一方面，盡管CB-2.1培養(yǎng)基很好地支持根外植體的生長(zhǎng)，但是在切割部位未出現(xiàn)愈傷組織。在CB-2.2培養(yǎng)基上根外植體形成愈傷組織的效率為10％，其比胚軸或子葉外植體形成愈傷組織的效率(20-30％)低。下表1示出了愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化效率的結(jié)果。
根愈傷組織的再生一個(gè)月后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基上以在CB-2.1或CB-2.2培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)2個(gè)月后，將成熟愈傷組織轉(zhuǎn)移至CB-4(不合抗生素)以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎。分別以0.5mg/L或0.2mg/L的量加入谷氨酰胺和L-天冬酰胺以促進(jìn)胚胎發(fā)生。培養(yǎng)2個(gè)月后在胚胎發(fā)生愈傷組織上形成初級(jí)體細(xì)胞胚胎，其間在相同培養(yǎng)基上進(jìn)行2次傳代培養(yǎng)。一些體細(xì)胞胚胎發(fā)育成小植物，將這些小植物轉(zhuǎn)移至CB-5培養(yǎng)基以誘導(dǎo)根。當(dāng)小植物在CB-5培養(yǎng)基上產(chǎn)生根時(shí)(4-6周)，將其轉(zhuǎn)移至土壤中并在高濕度下于28℃、16小時(shí)光照(60-90μE m-2s-1)下在溫箱中保持，然后轉(zhuǎn)移至溫室中有土壤的大陶罐中。實(shí)施例2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)通過(guò)將來(lái)自質(zhì)粒pGEMluc的BamHI/StuI片段的luc編碼序列克隆進(jìn)質(zhì)粒pVIP96(見(jiàn)圖2)的平端StuI位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pBK9(35SLUC)(見(jiàn)


圖1)。
將-80℃的在Eppendorf管中的制備的感受態(tài)細(xì)胞(400微升)置于冰上融化，將質(zhì)粒DNA加入到細(xì)胞中。溫和混合后，將混合物在冰上保溫45分鐘。含有混合物的Eppendorf管置于液氮中1分鐘，之后在水浴(37℃)中3分鐘。保溫后，將800微升LB培養(yǎng)基(不含抗生素)加入到混合物中，含有混合物的管在28℃保溫3小時(shí)。在12000rpm短暫離心后，除去800微升上清。將其余的培養(yǎng)基與細(xì)胞沉淀完全混合并將混合物涂布于含100mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素的LB平板上。在28°培養(yǎng)約48小時(shí)，成功轉(zhuǎn)化的LBA4404細(xì)胞在平板上形成菌落。攜帶質(zhì)粒pBK9(35SLUC)的農(nóng)桿菌菌株LB4404在含有卡那霉素(50mg/L)、鏈霉素(50mg/L)和refamycin(50mg/L)的LB平板上培養(yǎng)，用一個(gè)單個(gè)菌落接種不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在28℃于旋轉(zhuǎn)搖床上過(guò)夜培養(yǎng)約18小時(shí)。在使用前用液體LB培養(yǎng)基將光密度調(diào)整至0.1-0.4。實(shí)施例3根外植體組織的轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因棉花植物的再生如實(shí)施例1所述在CB-1.1培養(yǎng)基上培養(yǎng)消毒的棉花種子以獲得根外植體。從籽苗上切下須根并在CB-2.2上培養(yǎng)2天，16小時(shí)光照(60-90μE m-2s-1)。隨后將須根切成小段(5-10mm)并與實(shí)施例2的攜帶質(zhì)粒pBK9(35SLUC)的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物(A600＝0.1-0.6)保溫15分鐘。吸去細(xì)菌溶液后，將根外植體在28℃、16小時(shí)光照(60-90μE m-2s-1)下培養(yǎng)2天。相對(duì)于根外植體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404的最佳濃度(A600＝0.1-0.4)低于相對(duì)于胚軸和子葉外植體的濃度(A600＝0.3-0.6)。最佳細(xì)菌濃度不影響根外植體的生長(zhǎng)以及隨后的愈傷組織誘導(dǎo)。
用無(wú)菌蒸餾水清洗共培養(yǎng)的外植體2次并將其轉(zhuǎn)移至CB-3.1或CB-3.2培養(yǎng)基上以在28℃、16小時(shí)光照(60-90μEm-2s-1)下培養(yǎng)。
4周后，選擇卡那霉素抗性愈傷組織并在相同培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)以進(jìn)行第二次選擇。同時(shí)，選擇一些愈傷組織用螢光素酶熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)LUC表達(dá)(見(jiàn)實(shí)施例4)。誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程進(jìn)行2個(gè)月。根外植體誘導(dǎo)愈傷組織的效率低于胚軸和子葉外植體。
將卡那霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至CB-4培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)胚胎發(fā)生愈傷組織和體細(xì)胞胚胎。傳代一次培養(yǎng)4-6周后，在愈傷組織上出現(xiàn)成熟體細(xì)胞胚胎。之后從一些胚胎中發(fā)育小植物，然后將綠色小植物轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(CB-5)以誘導(dǎo)根。當(dāng)小植物長(zhǎng)出根后，將其轉(zhuǎn)移至土壤中并在高濕度下于28℃、16小時(shí)光照(60-90μE m-2s-1)下在溫箱中保持3-4周，然后轉(zhuǎn)移至溫室中有土壤的大陶罐中。實(shí)施例4螢光素酶活性檢測(cè)植物材料(如愈傷組織、葉和整個(gè)小植物)用含有0.5nM螢光素鉀和0.01％(w/v)聚環(huán)氧乙烷山梨聚糖單月桂酸酯(Tween-20)的溶液噴灑并放置30分鐘。用購(gòu)自Prinston儀器公司(3660 QuakerbridgeRoad，Trenton，NJ08619)的增強(qiáng)成像照相機(jī)和光子計(jì)數(shù)圖像處理器觀察來(lái)自植物材料的螢光素酶熒光。曝光時(shí)間為6分鐘。將電子圖像轉(zhuǎn)為Microsoft Powerpoint TIEF文件并從標(biāo)準(zhǔn)彩色打印機(jī)打印。
選擇在所選的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1個(gè)月的愈傷組織用視覺(jué)成像系統(tǒng)測(cè)試LUC表達(dá)。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化的愈傷組織有白色斑點(diǎn)而未轉(zhuǎn)化的愈傷組織沒(méi)有。在139個(gè)卡那霉素抗性愈傷組織中有49個(gè)呈LUC活性陽(yáng)性。因此轉(zhuǎn)化成功率為35％，其比用子葉或胚軸作為外植體觀察到的轉(zhuǎn)化成功率(20％)要高得多。表1 用根作外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的結(jié)果概述

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權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花植物的方法，包括如下步驟(a)獲得棉花須根外植體，(b)培養(yǎng)須根外植體以誘導(dǎo)愈傷組織形成，(c)將根愈傷組織與攜帶含外源基因和選擇標(biāo)記的載體的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物接觸，所述農(nóng)桿菌能使該外源基因和選擇因子抗性基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)移進(jìn)愈傷組織細(xì)胞的基因組，(d)在所述選擇因子抗性基因賦予針對(duì)其的抗性的選擇因子存在下培養(yǎng)愈傷組織以選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，(e)在所選的愈傷組織培養(yǎng)物中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎形成，以及(f)將誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚胎再生成完整的轉(zhuǎn)基因棉花植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中棉花須根外植體是通過(guò)在多效三唑存在下培養(yǎng)棉花籽苗而獲得。
3.權(quán)利要求2的方法，其中多效三唑的濃度為約0.05mg/l-0.2mg/l。
4.權(quán)利要求3的方法，其中多效三唑的濃度為約0.1mg/l。
5.權(quán)利要求2的方法，其中棉花籽苗在還存在α-萘乙酸的條件下培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中α-萘乙酸的濃度為約0.01mg/l-0.2mg/l。
7.權(quán)利要求6的方法，其中α-萘乙酸的濃度為約0.05mg/l。
8.權(quán)利要求1的方法，其中體細(xì)胞胚胎再生步驟在多效三唑存在下進(jìn)行。
9.權(quán)利要求8的方法，其中其中多效三唑的濃度為約0.05mg/l-0.2mg/l。
10.權(quán)利要求9的方法，其中多效三唑的濃度為約0.1mg/l。
11.權(quán)利要求8的方法，其中體細(xì)胞胚胎再生步驟在還存在α-萘乙酸的條件下培養(yǎng)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中α-萘乙酸的濃度為約0.01mg/l-0.2mg/l。
13.權(quán)利要求12的方法，其中α-萘乙酸的濃度為約0.05mg/l。
14.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)愈傷組織形成的步驟在包含肌醇、維生素B1和二甲基烯丙基(氨基)嘌呤的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行。
15.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎形成的步驟在包含肌醇、維生素B1和二甲基烯丙基(氨基)嘌呤的體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行。
16.權(quán)利要求14的方法，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含50mg/L-150mg/L的肌醇，0.2-10mg/L的維生素B1和0.1-7.5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
17.權(quán)利要求16的方法，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含100mg/L的肌醇，0.4mg/L的維生素B1和5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
18.權(quán)利要求15的方法，其中體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含50mg/L-100mg/L的肌醇，0.2-10mg/L的維生素B1和0.01-0.5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
19.權(quán)利要求18的方法，其中體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含100mg/L的肌醇，0.4mg/L的維生素Bl和5mg/L的二甲基烯丙基(氨基)嘌呤。
20.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)愈傷組織形成的步驟在包含維生素B5、(2，4-二氯苯氧基)乙酸、MgCl2和葡萄糖的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行。
21.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎形成的步驟在包含維生素B5、(2，4-二氯苯氧基)乙酸、MgCl2和葡萄糖的體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行。
22.權(quán)利要求20的方法，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含0.2mg/L-10mg/L維生素B5、0.05mg/L-0.15mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.4mg/L-1.2mg/L MgCl2和1％-5％葡萄糖。
23.權(quán)利要求22的方法，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含0.4mg/L維生素B5、0.1mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.8mg/L MgCl2和3％葡萄糖。
24.權(quán)利要求21的方法，其中體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含0.2mg/L-10mg/L維生素B5、0.05mg/L-0.15mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.4mg/L-1.2mg/L MgCl2和1％-5％葡萄糖。
25.權(quán)利要求24的方法，其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含0.4mg/L維生素B5、0.1mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.8mg/L MgCl2和3％葡萄糖。
26.權(quán)利要求14-25任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含吉蘭糖膠。
27.權(quán)利要求26的方法，其中吉蘭糖膠的量為1.0g/L-3.0g/L。
28.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)物的步驟在包含1900mg/L-5700mg/L硝酸鹽的體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行。
29.權(quán)利要求28的方法，其中體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含3800mg/L硝酸鹽。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中硝酸鹽是NaNO3。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花植物的方法,包括如下步驟:(a)獲得棉花須根外植體,(b)培養(yǎng)須根外植體以誘導(dǎo)愈傷組織形成,(c)將根愈傷組織與一種根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物接觸,所述根癌農(nóng)桿菌攜帶包含一外源基因和一選擇標(biāo)記的載體,所述農(nóng)桿菌能將該外源基因和選擇因子抗性基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)移進(jìn)所述外植體細(xì)胞的基因組中,(d)在選擇因子抗性基因賦予針對(duì)其的抗性的選擇因子的存在下培養(yǎng)所述愈傷組織,以選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,(e)在所選擇的愈傷組織培養(yǎng)物中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎形成,以及(f)將所誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚胎再生成完整轉(zhuǎn)基因棉花植物。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1338001SQ9981645
公開(kāi)日2002年2月27日 申請(qǐng)日期1999年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月10日
發(fā)明者焦蓋麗, 劉建偉 申請(qǐng)人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院