專利名稱：一種制劑在控制一種靶基因表達(dá)上應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種制劑作為對一種靶基因在諸如植物這樣的有機(jī)體中的表達(dá)的控制機(jī)制的應(yīng)用以及有用于該途徑的特定制劑。
基因表達(dá)由蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的上游區(qū)域來控制，該區(qū)域通常稱為“啟動子”。啟動子可以是組成型的，組織特異的，發(fā)育程控的或誘導(dǎo)型的。
對農(nóng)作物進(jìn)行操控以改良其性狀(如產(chǎn)量或質(zhì)量)需要在植物組織中表達(dá)外來或外源的基因。因此這樣的遺傳操控依賴于控制所需基因的方法的存在；例如，依賴于在植物中有效的合適的啟動子的存在與使用。有多種不同的啟動子的可供選擇以便于為特定的基因、結(jié)構(gòu)體、細(xì)胞、組織、植物或環(huán)境選出最適合的啟動子是有益的。一批啟動子已知在植物中是有效的。
術(shù)語“誘導(dǎo)型啟動子”包括可以化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子。特別有用的啟動子為由外部化學(xué)刺激控制的啟動子。外部化學(xué)刺激可以是農(nóng)業(yè)上可接受的化學(xué)物，適于農(nóng)業(yè)實(shí)用的化學(xué)物的使用不對哺乳類或植物造成危害。這樣可以在植物生長或發(fā)育的特定的階段控制特定的基因的表達(dá)，該控制通過一種可以施用于植物或種子的的化學(xué)物的存在與否來進(jìn)行，例如，通過噴霧或使用已知的種子包被技術(shù)。這些啟動子被認(rèn)為是基因“開關(guān)”啟動子。
在誘導(dǎo)型啟動子控制下的基因可以是提高/所需的形狀或表型的基因自身，或者該誘導(dǎo)型啟動子可以控制一種阻遏蛋白的表達(dá)，該蛋白抑制一種靶基因的表達(dá)，例如通過與該靶基因上游的一種操縱基因序列相互作用來阻止該基因的表達(dá)(如已知的細(xì)菌tet和lac操縱基因/阻遏系統(tǒng))。在進(jìn)一步的替代方案中，誘導(dǎo)型啟動子控制下的基因可以表達(dá)一種與其它蛋白相作用以抑制其活性的蛋白，例如芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑系統(tǒng)，該系統(tǒng)中芽孢桿菌RNA酶抑制或殺死缺乏芽孢桿菌RNA酶抑制劑的細(xì)胞。
這一類型的基因開關(guān)已知于很多種的應(yīng)用。這包括可回復(fù)的雄性不育的產(chǎn)生，該特性在雜交植物的生產(chǎn)中非常需要，描述例見WO90/08830。這些啟動子的其它應(yīng)用包括在種質(zhì)保護(hù)中的應(yīng)用，其中特定農(nóng)作物特別是轉(zhuǎn)基因植物的防范，和自生自長植物的控制非常必要，其應(yīng)用還包括在防止收割前發(fā)芽中的應(yīng)用，如WO 94/03619所述。
許多有機(jī)體具有使其能夠代謝諸如醇或酮這樣的化學(xué)物的機(jī)制，例如通過產(chǎn)生乙醇脫氫酶。由于該啟動子可以通過靶醇或酮的存在而誘導(dǎo)，這些系統(tǒng)的啟動子可能有用于基因開關(guān)。
一個(gè)這樣的例子可見于真菌A nidulans，該真菌只有在各種醇或酮存在生長的情況下表達(dá)乙醇脫氫酶I(ADHI)，該酶由alcA基因編碼。該誘導(dǎo)通過調(diào)節(jié)蛋白傳遞，該蛋白由組成型表達(dá)的alcR基因編碼。在誘導(dǎo)劑(醇或酮)存在的情況下，該調(diào)節(jié)蛋白激活alcA基因的表達(dá)。該調(diào)節(jié)蛋白還誘導(dǎo)劑存在的情況下刺激其本身的表達(dá)。這意味著在誘導(dǎo)條件下(即，當(dāng)存在醇或酮的情況下)高水平的ADH1被產(chǎn)生。相反，在缺乏誘導(dǎo)劑的情況下alcA及其產(chǎn)物ADH1不被表達(dá)。alcA的表達(dá)和該酶的生產(chǎn)在葡萄糖存在的情況下也被抑制。
因此，alcA基因啟動子是一種誘導(dǎo)型啟動子，該啟動子在存在誘導(dǎo)劑的情況下由alcR調(diào)節(jié)蛋白(即，通過蛋白/醇或蛋白/酮)激活。該alcR和alcA基因(包括各自的啟動子)已被克隆并測序(Lockington RA et al.，1985，Gene，33137-149；Felenbok B etal.，1988，Gene，73385-396；Gwynne et al.，1987，Gene，51205-216)。
乙醇脫氫酶(adh)基因已在特定的植物中被實(shí)驗(yàn)。在玉米或其它谷類中它們通過無氧條件被啟動。玉米的adh基因的啟動子區(qū)域含有一個(gè)300bp的調(diào)控子元件，該元件對于在無氧條件下的表達(dá)是必需的。但是，在任何植物中都沒有發(fā)現(xiàn)alcR調(diào)節(jié)蛋白的等效物。因此在植物中未知alcR/alcA類型的調(diào)節(jié)基因系統(tǒng)。alcR在植物細(xì)胞中的組成型表達(dá)并不引起外源adh活性的激活。
WO 93/21334描述了含有一種基因開關(guān)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)。該文件具體描述了一種化學(xué)誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)框，該框含有的第一種啟動子可操作地連接于一個(gè)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列編碼一種調(diào)節(jié)蛋白，該框還含有一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，在存在一種有效的外來誘導(dǎo)劑的情況下該誘導(dǎo)型啟動子被該調(diào)節(jié)蛋白激活，由此該誘導(dǎo)劑的施用導(dǎo)致了該靶基因的表達(dá)。特別地，該alcR/alcA系統(tǒng)被用于結(jié)構(gòu)體。在這一情況下使用的外源的化學(xué)誘導(dǎo)劑包括Creaser et al..J.Biochem.(1984)225，449-454所描述的化學(xué)物，例如丁-2-酮(乙基甲基甲酮)，環(huán)己酮，丙酮，丁-2-醇，3-氧代丁酸，2-丙醇和乙醇。
對于農(nóng)業(yè)目的，簡單的醇的應(yīng)用較為優(yōu)選，這是由于這些化學(xué)物相對廉價(jià)并易于降解。因此它們帶來了較低的環(huán)境負(fù)擔(dān)。但是，這樣的化學(xué)物一般具高揮發(fā)性并且因此而在農(nóng)業(yè)設(shè)備條件下操作不便，在噴灑中可能損失大量的化學(xué)物。因此，與已知的誘導(dǎo)物的使用相伴隨的問題之一為它們在被植物吸收前迅速揮發(fā)的能力。
因此，非常需要使用一種化學(xué)誘導(dǎo)劑，該誘導(dǎo)劑與已知的誘導(dǎo)劑相比可被植物更有效地吸收由此可以更好地控制靶基因的表達(dá)。
因此，本發(fā)明希望能通過制備化學(xué)誘導(dǎo)劑來克服這一先前工藝所伴生的問題。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，在此提供了一種制劑的使用，該制劑包括以下組分(a)一種揮發(fā)性的化學(xué)誘導(dǎo)劑；(b)一種聚乙氧基化的C10～C20醇或一種三硅氧烷聚乙氧基化物和(c)一種稀釋劑該制劑用于在一種具有化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)框的有機(jī)體中控制一種靶基因的表達(dá)，該框含有一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，其中通過向該有機(jī)體應(yīng)用上述的(a)來誘導(dǎo)該誘導(dǎo)型啟動子。
在適當(dāng)?shù)那闆r下，該有機(jī)體為一種植物，如一種農(nóng)作物。
稀釋劑(c)可以是，例如，水。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，在此提供了一種用于在一種諸如植物這樣的有機(jī)體中控制一種靶基因表達(dá)的方法，該方法包括以化學(xué)誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)框?qū)υ撚袡C(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該框含有一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，其中通過向該有機(jī)體應(yīng)用上述的制劑來誘導(dǎo)該誘導(dǎo)型啟動子。
在適當(dāng)?shù)那闆r下，該表達(dá)系統(tǒng)利用了一種調(diào)節(jié)蛋白。
這樣，根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，在此提供了一種用于在植物中控制一種靶基因表達(dá)的方法，該方法包括以化學(xué)誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)框?qū)υ撚袡C(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該框含有的第一種啟動子可操作地連接于一個(gè)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列編碼一種調(diào)節(jié)蛋白，該框還含有一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，在存在一種上文定義的制劑的情況下該誘導(dǎo)型啟動子被該調(diào)節(jié)蛋白激活，該方法包括對植物施用一種上文定義的制劑，由此該誘導(dǎo)制劑的施用導(dǎo)致了該靶基因的表達(dá)。
在上述制劑中組分(a)的性質(zhì)取決于存在于該表達(dá)系統(tǒng)中的誘導(dǎo)型啟動子的特性。但是，組分(a)的一個(gè)特定的例子為C1～C6醇或C3～C6酮，在優(yōu)選的情況下為乙醇或丙-2-醇。這些組分可作為誘導(dǎo)劑作用，例如，作為下文詳述的alc系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑。
上文描述的所用的組分(b)在優(yōu)選的情況下為聚乙氧基化的油醇、月桂醇、硬脂酰醇或鯨蠟醇。在更優(yōu)選的情況下為一種聚氧乙烯-油醇，該醇具有的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為0-35，在更優(yōu)選的情況下為2-20。在最優(yōu)選的情況下該醇為聚氧乙烯-(2)-油醇，聚氧乙烯-(10)-油醇或聚氧乙烯-(20)-油醇。然而，組分(b)優(yōu)選地為聚氧乙烯-(20)-油醇(括號中的數(shù)字表示的是平均每分子的環(huán)氧乙烷含量)這樣的產(chǎn)物可購得如BRIJ92TM，BRIJ97TM和BRIJ98TM。
在優(yōu)選的情況下，該制劑的組分(b)的濃度為約0.5％wt/wt或更低。在優(yōu)選的情況下濃度為約0.2％wt/wt到0.5％wt/wt。
在一個(gè)替代方案中，用于本發(fā)明的方法的制劑包括的組分(b)為一種以氫或甲基進(jìn)行封端的三硅氧烷基聚乙氧基化物。特別地，組分(b)為甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。該甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物在優(yōu)選的情況下具有的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為4到12每分子，最優(yōu)選的情況下為8個(gè)每分子。這樣的化合物可購得如SILWET 77TM(SILWET為Witco的商標(biāo))。
在優(yōu)選的情況下，甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物濃度為約0.5％wt/wt或更低。在優(yōu)選的情況下濃度為約0.2％wt/wt到0.5％wt/wt。
在優(yōu)選的情況下，上述實(shí)施方案中所用的制劑的組分(a)的濃度為約5％wt/wt或更低。在優(yōu)選的情況下濃度為約2％wt/wt到5％wt/wt。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案，該誘導(dǎo)型啟動子為alcA誘導(dǎo)型啟動子序列并且該調(diào)節(jié)序列編碼alcR調(diào)節(jié)蛋白。
制劑的組分(c)的濃度在優(yōu)選的情況下為約90％到98％wt/wt。
根據(jù)上述方法，所使用的特定制劑為全新的制劑，它們提供了本發(fā)明的進(jìn)一步方面。
這樣，根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，在此提供了一種農(nóng)用制劑，該制劑包括以下組分(a)一種誘導(dǎo)型啟動子的一種揮發(fā)性的化學(xué)誘導(dǎo)劑；(b)一種三硅氧烷聚乙氧基化物；以及(c)一種稀釋劑如上所述，組分(b)在適當(dāng)?shù)那闆r下為一種以氫或甲基進(jìn)行封端的三硅氧烷聚乙氧基化物，在優(yōu)選的情況下為一種甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。在適當(dāng)?shù)那闆r下，該甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物具有的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為4到12每分子，例如8個(gè)每分子。在適當(dāng)?shù)那闆r下，組分(a)的濃度為約2％到5％wt/wt。
這樣，根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，在此提供了一種農(nóng)用制劑，該制劑包括以下組分(a)一種誘導(dǎo)型啟動子的一種C1～C6醇誘導(dǎo)劑，含量低于5％wt/wt；(b)一種聚乙氧基化的C10～C20醇；以及(c)水在這一情況下，該制劑的組分(b)在適宜情況下為聚乙氧基化的油醇、月桂醇、硬脂酰醇或鯨蠟醇，在更優(yōu)選的情況下為一種聚氧乙烯-油醇。在適當(dāng)?shù)那闆r下，該醇具有的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為2-20，例如聚氧乙烯-(2)-油醇，聚氧乙烯-(10)-油醇或聚氧乙烯-(20)-油醇。對于組分(a)，其在優(yōu)選的情況下乙醇或丙-2-醇，在適當(dāng)?shù)那闆r下該組分為約2％到5％wt/wt。組分(b)的含量在優(yōu)選的情況下為約0.5％或更低。
根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)方面，在此提供了一種農(nóng)用制劑，該制劑包括以下組分(a)一種C3～C9酮，該酮可作為一種誘導(dǎo)型啟動子的化學(xué)誘導(dǎo)劑；(b)一種聚乙氧基化的C10～C20醇；以及(c)一種稀釋劑。
在優(yōu)選的情況下，在這些制劑中，組分(a)的濃度為約2％到5％wt/wt。同上文，組分(b)在可以為聚乙氧基化的油醇、月桂醇、硬脂酰醇或鯨蠟醇，在更優(yōu)選的情況下為一種聚氧乙烯-油醇，該醇具有的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為2-20。組分(b)的特定例子有聚氧乙烯-(2)-油醇，聚氧乙烯-(10)-油醇或聚氧乙烯-(20)-油醇。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案為一種含有以下組分的制劑，a.乙醇；b.聚氧乙烯-(20)-油醇；c.一種稀釋劑，其中組分(a)的濃度為2％wt/wt，組分(b)的濃度為0.5％wt/wt。
本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案為一種含有以下組分的制劑，a.乙醇；b.甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物，該化合物具有的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為8；c.一種稀釋劑，其中組分(a)的濃度為2％wt/wt，組分(b)的濃度為0.5％wt/wt。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為同單獨(dú)使用已知的誘導(dǎo)劑相比，該制劑可以被諸如植物這樣的有機(jī)體更有效地吸收。因此，本發(fā)明的制劑提高了乙醇作為alcA/alcR啟動子的誘導(dǎo)劑的效能。
令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，聚氧乙烯油醇表面活性劑和/或甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物佐劑同已知的化學(xué)誘導(dǎo)劑的聯(lián)合使用顯著提高了植物對該制劑的吸收，由此可以對靶基因進(jìn)行更好的控制，該靶基因同誘導(dǎo)性啟動子可操作地連接。
也可加入其它的添加劑，如抗菌化合物，分散劑，加濕化合物和防揮發(fā)劑。
本發(fā)明特別可用于一種植物表達(dá)系統(tǒng)中，該系統(tǒng)含有(i)第一種啟動子，該啟動子可操作地連接于一個(gè)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列編碼一種調(diào)節(jié)蛋白，以及(ii)一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，在存在一種有效的外源誘導(dǎo)劑的情況下該誘導(dǎo)型啟動子被該調(diào)節(jié)蛋白激活，該誘導(dǎo)劑為上文定義的制劑，由此該誘導(dǎo)制劑的應(yīng)用導(dǎo)致了該靶基因的表達(dá)。
這樣的基因表達(dá)系統(tǒng)可以包含于一種植物細(xì)胞以及植物組織或含有上文定義的植物細(xì)胞的一種植物，還可包含于一些植物或種子，及其衍生物。
術(shù)語“揮發(fā)性的化學(xué)誘導(dǎo)劑”指的是任何可以誘導(dǎo)一種化學(xué)誘導(dǎo)性啟動子系統(tǒng)并且可以在被植物有效吸收前快速揮發(fā)的化學(xué)物。
術(shù)語“C1～C6醇”包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、正己醇和環(huán)己醇以及其不飽和類似物。
術(shù)語“C3～C9酮”包括丙酮、丁酮、戊酮、環(huán)己酮、庚酮、辛酮、壬酮和芳香酮，例如苯乙酮。
本發(fā)明所用的術(shù)語“靶基因”指的是任何目的基因。它包括任何需要被引入一種植物以調(diào)整其特性的基因。該靶基因可以是一種外源的植物基因或外來基因，可以是單個(gè)基因或一系列基因。該靶基因序列可以至少編碼一種功能性蛋白質(zhì)的部分或一種反義序列。因此，一種誘導(dǎo)性啟動子當(dāng)與一種外源或外來基因可操作地連接并通過轉(zhuǎn)化引入一種真核生物時(shí)，該啟動子提供了一種對該基因的表達(dá)進(jìn)行外部調(diào)控的途徑。
術(shù)語“表達(dá)框”與術(shù)語“結(jié)構(gòu)體”，“雜合體”和“連接物”同義，它包括一種目的基因，該基因與一種誘導(dǎo)型啟動子直接或間接地連接。間接連接的一個(gè)例子是在啟動子和靶基因之間提供一種適當(dāng)?shù)拈g隔群體，例如一種內(nèi)含子序列。這同樣適用于與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“融合的”，它包括直接和間接連接。這樣的結(jié)構(gòu)體還包括適于轉(zhuǎn)化目的細(xì)胞的質(zhì)?；蚴删w。本發(fā)明的表達(dá)框還可以包括額外的組分，例如一種與其它啟動子可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)蛋白在一種外源誘導(dǎo)劑存在的情況下激活該誘導(dǎo)型啟動子。
術(shù)語“表達(dá)系統(tǒng)”指的是上文所定義的系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)體、組織、細(xì)胞或介質(zhì)中表達(dá)。在此方面，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可以含有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)框并且可以含有額外的組分，該組分可以確保通過使用該誘導(dǎo)型啟動子提高靶基因的表達(dá)。
任何適用于靶植物或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法均可使用，這包括通過含有重組Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行感染，電穿孔，細(xì)胞或原生質(zhì)體的微注射，微粒子轟擊，細(xì)菌轟擊，特別包括“fibre”或“whisker”方法以及花粉管轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞隨即在適當(dāng)?shù)那闆r下被重新產(chǎn)生成完全的植物體，在該植物中新的核酸物質(zhì)已經(jīng)穩(wěn)定地整合入基因組。以此方法可獲得單子葉或雙子葉植物。文獻(xiàn)中可獲得已知詳細(xì)方法的參考。
可產(chǎn)生的遺傳修飾植物的例子包括雙子葉和單子葉植物，例如田間作物、谷類、水果以及蔬菜如canola、向日葵、煙草、甜菜、棉花、大豆、玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、番茄、芒果、桃、蘋果、梨、草莓、香蕉、瓜類、馬鈴薯、胡羅卜、萵苣、甘藍(lán)、洋蔥。
本發(fā)明的多種優(yōu)選的特征和實(shí)施方案將在此通過非限制性的實(shí)施例以及所引用的圖表來描述，在圖表中


圖1所示為通過對葉噴霧進(jìn)行的CAT誘導(dǎo)(每次處理重復(fù)5次)，噴霧使用單獨(dú)的乙醇(2％wt/wt)和乙醇(2％wt/wt)同BRIJ92，97，98TM(0.5％wt/wt)制劑組合使用；圖2所示為在溫室葉噴霧測試中2％wt/wt的乙醇的單獨(dú)使用以及使用2％wt/wt的乙醇和增加濃度的SILWET L-77TM佐劑(0.2％wt/wt到0.5％wt/wt)同CAT活性的關(guān)系；圖3所示為對Alc-GUS油菜進(jìn)行的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)通過對油菜的葉片上表面使用5％wt/wt的乙醇和0.5％wt/wt的制劑來進(jìn)行(‘T’＝靶葉片，‘A’＝同株植物的臨近葉片)；以及圖4所示為Silwett L-77的結(jié)構(gòu)。
下表給出了實(shí)施例中所描述的各表面活性劑/佐劑的詳細(xì)組分。
實(shí)施例1組分含量a.乙醇 1.99gb.BRIJ 92TM0.51gc.水97.86g在瓶中將99.86g的20％wt/wt的乙醇溶液(20.01的乙醇溶于980.56g的水)同0.51g的Brij 92TM混合。同前振蕩樣品。實(shí)施例2組分 含量a.乙醇 2.00gb.BRIJ 97TM0.52gc.水 98.05g在瓶中將100.05g的20％wt/wt的乙醇溶液(20.01的乙醇溶于980.56g的水)同0.52g的Brij 97TM混合。同前振蕩樣品。
經(jīng)發(fā)現(xiàn)，聚氧乙烯-(20)-油醇(BRIJ 98TM)的作為表面活性劑的使用使得CAT報(bào)告基因的表達(dá)高于單獨(dú)使用乙醇。然而，與聚氧乙烯-(20)-油醇(BRIJ 9TM)同乙醇的聯(lián)合使用相比，具有的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為每分子8的甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物(SILWET L-77TM)與乙醇的聯(lián)合使用可以在更大的程度上提高報(bào)告基因CAT的表達(dá)。特別地，當(dāng)在同14C的乙醇(濃度為1％到5％wt/wt)的混合物中被應(yīng)用于葉片的上表面時(shí)，BRIJ 98TM和SILWET L-77TM在0.2％wt/wt和0.5％wt/wt濃度下的使用顯著地提高了報(bào)告基因的表達(dá)和在AlcCAT煙草中的吸收。磷成像研究(phosphoimage study)被用于檢測14C的乙醇的吸收。
據(jù)發(fā)現(xiàn)，乙醇的單獨(dú)使用導(dǎo)致煙草對其2.1％的吸收。從0.2％到0.5％wt/wt的提高含量的SILWET L-77TM的加入導(dǎo)致與單獨(dú)使用濃度為5％wt/wt的乙醇相比CAT表達(dá)提高了61％到78％。同單獨(dú)使用乙醇相比對，在以BRIJ98TM進(jìn)行的14C-乙醇研究中乙醇的吸收提高了68％。
報(bào)告基因的顯著激活還可見于以這些制劑對馬鈴薯和油菜的處理中。
本發(fā)明的其它調(diào)整對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很明顯的，這些調(diào)整并不超出本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種制劑的使用，該制劑含有以下組分(a)一種揮發(fā)性的化學(xué)誘導(dǎo)劑；(b)一種聚乙氧基化的C10～C20醇或一種三硅氧烷聚乙氧基化物和(c)一種稀釋劑該制劑用于在一種具有化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)框的有機(jī)體中控制一種靶基因的表達(dá)，該框含有一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，其中通過向該有機(jī)體施用上述的(a)來誘導(dǎo)該誘導(dǎo)型啟動子。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中該有機(jī)體為一種植物
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中組分(a)為一種C1～C6醇或一種C3～C9酮。
4.權(quán)利要求1到3任意一個(gè)的應(yīng)用，其中組分(a)為乙醇或丙-2-醇。
5.權(quán)利要求1到4任意一個(gè)的應(yīng)用，其中組分(b)為一種聚乙氧基化的油醇、月桂醇、硬脂酰醇或鯨蠟醇。
6.任意一個(gè)前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中組分(b)為一種聚氧乙烯油醇。
7.任意一個(gè)前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中組分(b)為一種聚氧乙烯油醇，該聚氧乙烯油醇的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為2-20。
8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中組分(b)為聚氧乙烯-(2)-油醇，聚氧乙烯-(10)-油醇或聚氧乙烯-(20)-油醇。
9.權(quán)利要求1到8任意一個(gè)的應(yīng)用，其中組分(b)的濃度為約0.5％wt/wt或更低。
10.權(quán)利要求1到4任意一個(gè)的應(yīng)用，其中組分(b)為以氫或甲基進(jìn)行封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。
11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中組分(b)為甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。
12.權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中組分(b)為甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物，其平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為每分子4到12。
13.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中組分(b)為甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物，其平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為每分子8。
14.權(quán)利要求10到13任意一個(gè)的應(yīng)用，其中組分(b)的濃度為約0.5％wt/wt或更低。
15.權(quán)利要求1到14任意一個(gè)的應(yīng)用，其中組分(a)的濃度為約2％wt/wt到5％wt/wt。
16.在一種有機(jī)體中對一種靶基因進(jìn)行有控制地表達(dá)的方法，該方法包括以化學(xué)誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)框?qū)υ撚袡C(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該框含有一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，其中該誘導(dǎo)型啟動子通過對該有機(jī)體應(yīng)用權(quán)利要求1到15之任一所定義的制劑而被誘導(dǎo)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該有機(jī)體為一種植物。
18.在一種有機(jī)體中控制一種靶基因進(jìn)行表達(dá)的方法，該方法包括以化學(xué)誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)框?qū)υ撚袡C(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該框含有的第一種啟動子可操作地連接于一個(gè)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列編碼一種調(diào)節(jié)蛋白，該框還含有一個(gè)與靶基因可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子，其中該誘導(dǎo)型啟動子在存在權(quán)利要求1到15所定義的制劑的情況下被該調(diào)節(jié)蛋白激活，該方法包括對該植物應(yīng)用權(quán)利要求1到15所定義的制劑，由此該誘導(dǎo)制劑的施用導(dǎo)致了該靶基因的表達(dá)。
19.權(quán)利要求16到18任意一個(gè)的方法，其中該誘導(dǎo)型啟動子為alcA誘導(dǎo)型啟動子序列，該調(diào)節(jié)序列編碼alcR調(diào)節(jié)蛋白。
20.一種農(nóng)用制劑，該制劑包括以下組分(a)一種誘導(dǎo)型啟動子的一種揮發(fā)性的化學(xué)誘導(dǎo)劑；(b)一種三硅氧烷聚乙氧基化物；以及(c)一種稀釋劑。
21.權(quán)利要求20的制劑，其中組分(b)為氫或甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。
22.權(quán)利要求21的制劑，其中組分(b)為甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。
23.權(quán)利要求21或22的制劑，其中組分(b)為甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物，其平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為每分子4到12。
24.權(quán)利要求23的制劑，其中組分(b)為甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物，其平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為每分子8。
25.權(quán)利要求20到24任意一個(gè)的制劑，其中組分(a)的濃度為約2％wt/wt到5％wt/wt。
26.一種農(nóng)用制劑，該制劑包括以下組分(a)一種誘導(dǎo)型啟動子的一種C1～C6醇誘導(dǎo)劑，含量低于5％wt/wt；(b)一種聚乙氧基化的C10～C20醇；以及(c)水。
27.權(quán)利要求26的制劑，其中組分(b)為一種聚乙氧基化的油醇、月桂醇、硬脂酰醇或鯨蠟醇。
28.權(quán)利要求26或27任意一個(gè)的制劑，其中組分(b)為一種聚氧乙烯油醇。
29.任意一個(gè)20到28任意一個(gè)的制劑，其中組分(b)為一種聚氧乙烯油醇，該聚氧乙烯油醇的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為2-20。
30.權(quán)利要求29的制劑，其中組分(b)為聚氧乙烯-(2)-油醇。
31.權(quán)利要求29的制劑，其中組分(b)為聚氧乙烯-(10)-油醇。
32.權(quán)利要求29的制劑，其中組分(b)為聚氧乙烯-(20)-油醇。
33.權(quán)利要求26到32任意一個(gè)的制劑，其中組分(a)的濃度為約2％wt/wt到低于5％wt/wt。
34.權(quán)利要求20到33任意一個(gè)的制劑，其中組分(b)的濃度為約0.5％wt/wt或更低。
35.權(quán)利要求20到34任意一個(gè)的制劑，其中組分(a)為乙醇或丙-2-醇。
36.一種農(nóng)用制劑，該制劑包括以下組分(a)一種C3～C9酮，該酮可作為一種誘導(dǎo)型啟動子的化學(xué)誘導(dǎo)劑；(b)一種聚乙氧基化的C10～C20醇；以及(c)一種稀釋劑。
37.權(quán)利要求36的制劑，其中組分(a)的濃度為2％wt/wt到5％wt/wt。
38.權(quán)利要求36或37的制劑，其中組分(b)為一種聚乙氧基化的油醇、月桂醇、硬脂酰醇或鯨蠟醇。
39.權(quán)利要求38的制劑，其中組分(b)為一種聚氧乙烯油醇。
40.權(quán)利要求39的制劑，其中組分(b)為一種聚氧乙烯油醇，該聚氧乙烯油醇的平均環(huán)氧乙烷摩爾含量為2-20。
41.權(quán)利要求40的制劑，其中組分(b)為聚氧乙烯-(2)-油醇。
42.權(quán)利要求40的制劑，其中組分(b)為聚氧乙烯-(10)-油醇。
43.權(quán)利要求40的制劑，其中組分(b)為聚氧乙烯-(20)-油醇。
全文摘要
一種制劑的使用,該制劑含有以下組分(a)一種揮發(fā)性的誘導(dǎo)劑;(b)一種聚乙氧基化的C
文檔編號A01N25/30GK1334700SQ9981596
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月1日
發(fā)明者D·K·羅德哈姆, P·泰勒 申請人:辛甄塔有限公司