利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除動(dòng)物myostatin基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程和遺傳修飾領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種利用CRISPR_Cas9 系統(tǒng)敲除動(dòng)物myostatin基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自上世紀(jì)80年代基因工程興起以來(lái)，大量基因編輯技術(shù)出現(xiàn)以滿足科研需要，其 中的基因打靶技術(shù)是一種在高等動(dòng)物中對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)精細(xì)修飾的技術(shù)。傳統(tǒng)基因打靶技 術(shù)依賴體內(nèi)自發(fā)的同源重組（HR,homologousrecombination)，效率大約只有1/106。近年 來(lái)為了解決同源重組效率低下的問題，人們通過人工構(gòu)建的雜合分子對(duì)特定的DNA序列進(jìn) 行切割，以此來(lái)提高基因打靶的效率，其中以核酸內(nèi)切酶為核心的人工復(fù)合分子最受關(guān)注。
[0003] Myostatin基因（⑶F8)是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子超家族的成員，它在動(dòng)物體內(nèi)作為肌肉 生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在肌肉的形成及分化發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。自然界中天然存在 myostatin基因的自然突變型動(dòng)物，如比利時(shí)藍(lán)牛、皮爾蒙特牛等，它們都具有肌肉極端發(fā) 達(dá)的表型，因此在生產(chǎn)領(lǐng)域具有極為重要的實(shí)用價(jià)值。而通過傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)對(duì)哺乳 動(dòng)物，尤其是大動(dòng)物進(jìn)行myostatin基因進(jìn)行敲除存在很大的技術(shù)難度，因而一直以來(lái)大 動(dòng)物的myostatin基因敲除效率非常低下。
[0004] CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括一個(gè)具備DNA結(jié)合和切割的Cas9蛋白以及負(fù)責(zé)特異性識(shí)別 DNA序列并引導(dǎo)Cas9蛋白特異性結(jié)合到目的DNA位點(diǎn)的sgRNA。在動(dòng)物體內(nèi)，Cas9蛋白與 sgRNA首先結(jié)合成一個(gè)蛋白復(fù)合體，然后通過sgRNA的特異性識(shí)別作用，在基因組中識(shí)別到 特定的目標(biāo)DNA序列并一到蛋白復(fù)合體結(jié)合到DNA鏈上。然后通過Cas9的核酸內(nèi)切酶活 性在目標(biāo)位點(diǎn)將DNA切開，形成一個(gè)DNA雙鏈斷裂（DSB)。通過誘導(dǎo)自體的DNA修復(fù)機(jī)制發(fā) 揮作用，如同源重組或非同源末端連接（NHEJ，Non-homologousendjoining)，從而在該位 點(diǎn)產(chǎn)生基因突變，從而到達(dá)基因打靶的目的。
[0005] 與傳統(tǒng)的同源重組介導(dǎo)的基因打靶相比較，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn) 行基因打靶具有操作簡(jiǎn)便，效率高，適用物種廣泛等優(yōu)點(diǎn)，尤其可以一次性的實(shí)現(xiàn)多基因打 靶，這在動(dòng)物遺傳修飾及疾病模型研宄中都有極其廣闊的應(yīng)用前景。
[0006] 傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)依賴生物體內(nèi)自發(fā)的同源重組現(xiàn)象，因而效率很低，隨著技 術(shù)發(fā)展后來(lái)便出現(xiàn)了鋅指核酸酶（ZFNs，zincfingernucleases)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子 介導(dǎo)核酸酶（TALENs，transcriptionactivator-likeeffectornucleases)。這兩種系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)比較相似，每個(gè)蛋白分子都是由Folkl核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu) 成，通過每個(gè)蛋白分子中的特異性DNA識(shí)別域識(shí)別基因組中的特定目的序列，從而將Folkl 內(nèi)切酶定位至靶位點(diǎn)。由于Folkl核酸內(nèi)切酶需要在DNA雙鏈上形成二聚體形式才能發(fā)揮 核酸內(nèi)切酶的功能，因而ZFNs和TALENs在基因打靶時(shí)都需要兩個(gè)分子分別定位在靶位點(diǎn) 的兩條DNA鏈上，才可以發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的作用，對(duì)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB).
[0007] 雖然ZFNs和TALENs相比于傳統(tǒng)的同源重組具有打靶效率高的優(yōu)點(diǎn)，但是它們依 然存在很多的缺陷，主要包括：1、ZFNs和TALENs的DNA切割結(jié)構(gòu)域均為Folkl，它必須以二 聚體形式發(fā)揮作用，因而對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行基因打靶時(shí)至少要采用兩個(gè)DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)，這在 細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率有更高的要求；2、ZFNs的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)相對(duì)復(fù)雜，成本較高，應(yīng)用 于大量的哺乳動(dòng)物基因打靶時(shí)成本難以控制在可以承受的范圍；3、ZFNs和TALENs的DNA 識(shí)別規(guī)則和設(shè)計(jì)要求較為嚴(yán)格，可能出現(xiàn)靶基因序列中無(wú)法找到合適的ZFNs、TALENs識(shí)別 區(qū)，從而無(wú)法應(yīng)用其進(jìn)行基因打靶的情況；4、針對(duì)不同基因或者不同物種的同一基因進(jìn)行 基因打靶時(shí)，都需要從新設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的ZFNs、TALENs表達(dá)質(zhì)?；騧RNA，操作繁復(fù)；5、ZFNs 和TALENs在進(jìn)行多基因打靶時(shí)，受載體和mRNA分子大小的限制，很難獲得較高的打靶效 率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種CRISPR_Cas9系統(tǒng)敲除動(dòng)物myostatin基因的方法。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供特異性革E1向myostatin基因的sgRNA。
[0010] 本發(fā)明首先比對(duì)了不同物種（人類，小鼠，豬，牛，綿羊，山羊）的myostatin基 因序列，從中找到了一個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域，在這個(gè)區(qū)域中進(jìn)行sgRNA的設(shè)計(jì)并獲得了一條 sgRNA的序列信息。該特異性靶向myostatin基因第二外顯子的sgRNA，其DNA序列如SEQ IDNO. 1所示。本發(fā)明提供了該特異性祀向myostatin基因第二外顯子的sgRNA在敲除動(dòng) 物myostatin基因中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還提供了含有上述sgRNA的DNA序列的載體。
[0012] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，提供的上述載體為PX330-M2。
[0013] 具體地，PX330-M2的構(gòu)建方法為：（1)設(shè)計(jì)并合成識(shí)別myostatin第二外顯子的 sgRNA識(shí)別區(qū)DNA序列，如SEQIDNO. 1所示；（2)合成后的sgRNA序列進(jìn)行磷酸化后梯度降 溫退火，具體步驟為將合成的oligoDNA與10XT4LigationBuffer和T4PNK以2:2:1的比 例混合后再加入3倍體積的水補(bǔ)齊體系，然后37°C孵育30min，再95°C5min變性，之后在以 5°C每分鐘的速率降溫至25°C完成反應(yīng)以產(chǎn)生磷酸化粘性末端，同時(shí)Bbsl酶切載體pX330 產(chǎn)生粘性末端；（3)以T4連接酶將這個(gè)片段與pX330進(jìn)行連接，獲得真核CRISPR-Cas9系 統(tǒng)載體PX330-M2。
[0014] 本發(fā)明還提供了體外轉(zhuǎn)錄載體PIVT-M2-T載體。
[0015] 所述體外轉(zhuǎn)錄載體PIVT-M2-T的構(gòu)建方法為：設(shè)計(jì)含有17啟動(dòng)子的上游引物，序 列如SEQIDNO. 2所示和與其匹配的下游引物，序列如SEQIDNO. 3所示，以載體pX330-M2 為模板PCR擴(kuò)增獲得可以用于體外轉(zhuǎn)錄的IVT-M2片段，再以TA克隆的方式將該片段插入 PMD18-T載體中，獲得用于體外轉(zhuǎn)錄的載體pIVT-M2-T。
[0016] 本發(fā)明提供了用于敲除動(dòng)物myostatin基因的CRISPR_Cas9系統(tǒng)，含有特異性靶 向myostatin基因第二外顯子的sgRNA的表達(dá)載體和Cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體。
[0017] 本發(fā)明的實(shí)施例中，所述含有特異性革E1向myostatin基因第二外顯子的sgRNA的 表達(dá)載體為PIVT-M2-T，Cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體為pCas9-puro3。
[0018] 其中，pCas9_puro3是通過以下方法構(gòu)建得到的：（1)以內(nèi)切酶Agel和Notl酶切 載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 獲得pX330 載體中的Cas9 表達(dá)區(qū)段；（2)以Agel 和Notl線性化載體pIRES-pur〇3 ;(3)將步驟（1)的Cas9表達(dá)區(qū)段與步驟（2)的線性化載 體pIRES_puro3進(jìn)行連接獲得終載體pCas9_puro3。
[0019] 本發(fā)明提供了利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除動(dòng)物myostatin基因的方法，包括以下 步驟：
[0020] (1)構(gòu)建特異性革E1向myostatin基因第二外顯子的sgRNA的表達(dá)載體；通過體外 轉(zhuǎn)錄表達(dá)得到myostatin基因第二外顯子sgRNA;
[0021] (2)構(gòu)建Cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體，得到Cas9mRNA;
[0022] (3)將步驟⑴的sgRNA和步驟⑵的Cas9mRNA純化后，混合，注射入動(dòng)物受精卵 細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，經(jīng)體外短時(shí)培養(yǎng)后移植入同種雌性動(dòng)物輸卵管中，或體外培養(yǎng)至囊胚 期再移植到同種雌性動(dòng)物子宮中，以生產(chǎn)敲除myostatin基因的動(dòng)物。所述短時(shí)培養(yǎng)是指 30min-48h〇
[0023] 本發(fā)明方法中，步驟（1)特異性祀向myostatin基因第二外顯子的sgRNA的表達(dá) 載體為PIVT-M2-T。步驟（2)的Cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體為pCas9-puro3。
[0024] 步驟（1)和⑵轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA進(jìn)行吸附柱純化，將純化后的mRNA利用分光光 度計(jì)測(cè)定濃度。在本發(fā)明的實(shí)施例中獲得的sgRNA濃度為103ng/y1，Cas9mRNA的濃度為 775ng/y1，并按照，使混合后sgRNA和Cas9mRNA終濃度分別為20ng/y1和150ng/y1。
[0025] 步驟（3)中，sgRNA與Cas9mRNA混合前，sgRNA的濃度范圍為100?200ng/y1， Cas9mRNA的濃度范圍為500?2000ng/y1，sgRNA和Cas9mRNA混合后的質(zhì)量比為1:10? 1:2混合。
[0026] 優(yōu)選地，二者混合后的質(zhì)量比為1:7. 5。
[0027] 本發(fā)明還提供了上述方法在制備敲除myostatin基因的動(dòng)物中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)進(jìn)行哺乳動(dòng)物基因打靶，其優(yōu)點(diǎn)是：l、sgRNA特異性 識(shí)別DNA序列中的NGG三個(gè)堿基對(duì)，識(shí)別規(guī)則簡(jiǎn)單且易分析，在靶基因中可以同時(shí)找到多個(gè) sgRNA識(shí)別位點(diǎn)，從而可以根據(jù)打靶要求進(jìn)行選擇，適用性廣泛；2、相比于ZFNs和TALENs 的復(fù)雜表達(dá)結(jié)構(gòu)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的Cas9表達(dá)結(jié)構(gòu)是固定不變的，針對(duì)不同基因只需 要將23bp的識(shí)別序列插入sgRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)中即可完成系統(tǒng)組建，操作簡(jiǎn)單，成本低，適用于 大規(guī)模的哺乳動(dòng)物基因打靶工作；3、利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)繼續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，由于sgRNA表 達(dá)結(jié)構(gòu)很短，所以可以大大提高轉(zhuǎn)染效率，也可以將Cas9和sgRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)整合到一個(gè)載 體中，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率，這都是ZFNs和TALENs很難做到的；4、針對(duì)同一家族的不同基 因或不同物種的同一基因進(jìn)行基因打靶時(shí)，可以選擇基因中的保守區(qū)進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)，從 而實(shí)現(xiàn)同一條sgRNA對(duì)多個(gè)基因的打靶或修飾，相比其他技術(shù)更加簡(jiǎn)便、高效；5、可以通過 向哺乳動(dòng)物中同時(shí)導(dǎo)入一個(gè)Cas9表達(dá)結(jié)構(gòu)和多個(gè)sgRNA的方式輕松實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)打靶， 無(wú)論從打靶效率還是操作簡(jiǎn)便程度上都是其他技術(shù)無(wú)法比擬的。
[0029] 本發(fā)明通過構(gòu)建特異性革E1向myostatin基因第二外顯子的sgRNA的表達(dá)載體和 Cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體，獲得了革巴向myostatin基因第二外顯子的sgRNA和Cas9蛋白的 mRNA，將其混合后注入動(dòng)物受精卵細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，經(jīng)體外短時(shí)培養(yǎng)或培養(yǎng)數(shù)天后移植 到同種雌性動(dòng)物輸卵管或子宮中，能夠生產(chǎn)得到敲除myos